İRAN DA KOYUN VE KEÇİLERDE PESTE DES PETİTS RUMİNANTS VİRUS (PPRV) ENFEKSİYONUNUN EPİDEMİYOLOJİSİ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İRAN DA KOYUN VE KEÇİLERDE PESTE DES PETİTS RUMİNANTS VİRUS (PPRV) ENFEKSİYONUNUN EPİDEMİYOLOJİSİ Ali Reza FARAJİ MAJARASHİN VİROLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Seval BİLGE DAĞALP İKİNCİ DANIŞMAN Doç. Dr. Mohammadreza MAHZOUNİEH 2013-ANKARA

2 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İRAN DA KOYUN VE KEÇİLERDE PESTE DES PETİTS RUMİNANTS VİRUS (PPRV) ENFEKSİYONUNUN EPİDEMİYOLOJİSİ Ali Reza FARAJİ MAJARASHİN VİROLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Seval BİLGE DAĞALP İKİNCİ DANIŞMAN Doç. Dr. Mohammadreza MAHZOUNİEH 2013-ANKARA

3 iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Çizelgeler ii iii vi viii x xi 1. GİRİŞ Tarihçe Etiyoloji Enfeksiyonun Coğrafik Dağılımı Epidemiyoloji Bulaşma Konakçı Duyarlılığı Klinik Semptomlar Patogenez ve Patoloji İmmunoloji Teşhis Virus İzolasyonu Viral Antijen Tespiti Nükleik asit tespiti Seroloji Korunma ve Kontrol Enfeksiyonunun İran daki Durumu Tezin Amacı GEREÇ VE YÖNTEM Gereç 26

4 iv Örneklenen İşletmeler Serum Örnekleri ELISA Kitleri Virolojik Çalışmada Kullanılan Materyaller Virus RT- real time PCR, Klonlama ve Standart Oluşturma Konvansiyonel RT-PCR Dizin Analizi ve Filogenetik Analiz Yöntem Serolojik Çalışma Kan Serum Örneklerinin Hazırlanması PPR C-ELISA Virolojik Çalışma Tanı Materyallerinin Hazırlanması Viral RNA İzolasyonu Viral RNA nın Ters Transkripsiyonu RT-Real Time PCR Konvansiyonel RT-PCR PPRV Kantitasyonu Amacıyla PCR Ürünlerinin Klonlanması ve Standart Oluşturma Konvansiyonel PCR Ürünlerinin Saflaştırılması Dizin Analizi Dizin Analizi Sonuçlarının Değerlendirilmesi ve Filogenetik Analiz BULGULAR Serolojik Çalışma Sonuçları Virolojik Çalışma Sonuçları RT-Real Time PCR 43

5 v Klonlama ve Standart Oluşturma RT-Real Time PCR Konvansiyonel RT-PCR Dizin Analizi ve Filogenetik Analiz TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER 65 ÖZET 68 SUMMARY 69 KAYNAKLAR 70 EK-1 Çalışmada kullanılan saha materyallerinin Türkiye ye girişi için Gıda,Tarım ve Hayvancılık Bakanlığından alınan izin belgesi 84 EK-2 Etik kurul kararı 85 ÖZGEÇMİŞ 86

6 vi ÖNSÖZ Keçi ve koyun yaygın olarak yetiştirilen, kırsal ekonomide oldukça önemli rol oynayan hayvan türleridir. Küçük ruminantlar entansif ya da ekstansif üretim sisteminde beslenmektedirler. Klinik ve subklinik düzeyde Peste des Petits Ruminants Virus (PPRV) enfeksiyonu ağırlık kaybı, gelişmenin durması, süt ve et üretiminin azalması, yüksek veteriner harcamalar ve genç hayvanlarda ölümler nedeniyle, küçük ruminant üretimini sınırlayan önemli faktörlerden biri olarak kabul edilmiştir. Bugüne kadar PPRV enfeksiyonuna ilgili olarak İran da yapılan çalışmaların sınırlı sayıda olduğu bilinmektedir. Özellikle yılları arasında artan oranda salgınlar bildirilmiştir. Enfeksiyonun kontrol ve eradikasyonu amacıyla etkili tedbirlerin alınmaması nedeniyle, enfeksiyonun yaygınlaşması ve enfeksiyona bağlı oluşan ekonomik kayıplar gün geçtikçe artmaktadır. Bu durum, Türkiye gibi ülkenin sınır komşularını da yakından ilgilendirmektedir. Bu noktadan hareketle planlanan bu çalışmada, İran ın farklı illerinde yetiştirilen klinik olarak PPRV enfeksiyonu şüpheli koyun ve keçilerden sağlanan örneklerde Reverse Transkriptaz real time Polymerase Chain Reaction (RT-rtPCR) kullanılarak, sağlıklı görünümlü hayvanlarda ise C-ELISA ile enfeksiyonun seroprevalansı sorgulanarak enfeksiyonun epidemiyolojisine ilgili güncel verilere ulaşılması hedeflenmiştir. Ayrıca, çalışmada tespit edilecek virusların N proteini kodlayan gen bölgesi hedef alınarak moleküler karakterizasyonlarının yapılması ve son yıllarda sirküle olan viruslar ve genetik yakınlıkları tespit edilerek epidemiyolojik anlamda önemli bilgilere ulaşılmaya çalışılacaktır. Bu çalışma süresince özveri, sabır ve yapıcı eleştirilerinden dolayı, Danışman Hocam Prof. Dr. Seval BİLGE DAĞALP e, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı nın tüm olanaklarından faydalanmamı sağlayan Prof. Dr.

7 vii İbrahim BURGU ve Viroloji Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Yılmaz AKÇA ya; yardım ve desteklerini esirgemeyen, Viroloji Anabilim Dalı öğretim üyeleri Prof. Dr. Feray ALKAN, Prof. Dr. Aykut ÖZKUL, Doç. Dr. M. Taner KARAOĞLU ve Doç. Dr. T. Çiğdem OĞUZOĞLU ile tez izleme komitesi üyesi Prof. Dr. Mehmet ÇABALAR ve Prof. Dr. Hakan YARDIMCI ya, tez çalışmamda büyük katkıları olan ikinci danışman hocam Doç. Dr. Mohammadreza MAHZOUNİEH ye, doktora programım boyunca birlikte çalıştığım doktora öğrencisi ve araştırma görevlisi arkadaşlarıma, her zaman destek ve anlayışları için aileme en içten teşekkürlerimi sunarım.

8 viii SİMGELER VE KISALTMALAR AGP : Antigenome promoter ATCC : American type cell culture Bp : Base pair cdna : Complementary DNA C-ELISA : Competitive enzyme linked immunosorbent assay CIEP : Counter immunoelectrophoresis CPE : Cytopathic effect Ct : Cycle threshold DTCS : Dye Termination Cycle Sequencing dntp : Deoksinükleotid triphosphat EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay IAEA : International Atomic Energy Agency GP : Genome promoter H : Hemaglütinin IC-ELISA: Immuno capture enzyme-linked immunosorbent assay MDBK : Madine Darby Bovine Kidney MgCl 2 : Magnesium Chlorur mrna : messenger Ribonucleic Acid OIE : World Organization for Animal Health OD : Optical density ORF : open reading frame PBMC : Peripheral Blood Mononuclear Cells PBS: Phosphate Buffered Saline PCR: Polymerase chain reaction RT-rtPCR : Reverse transkriptaz real time PCR RNA : Ribonucleic acid RPV : Rinderpest virus

9 ix RT-PCR : Reverse Transcriptase PCR Taq : Thermus aquaticus TCID 50 : Tissue culture infectious dose Vero : African green monkey kidney

10 x ŞEKİLLER Şekil 1.1. N proteinine dayalı morbilliviruslarda genetik ilişkiler 3 Şekil 1.2. Morbillivirus virion ve genom yapısının şematik görüntüsü 4 Şekil 1.3. PPRV enfeksiyonunun dünya haritasındaki dağılımı 7 Şekil 1.4. PPR virusun 4 farklı genetik hattının coğrafik dağılımı 8 Şekil 1.5. PPR virusun F proteini kodlayan gene dayalı filogenetik ilişkisi 9 Şekil 1.6. İran siyasi haritası 24 Şekil 2.1. İran haritası üzerinde örnekleme yapılan iller 26 Şekil 2.2. Kontrol PPRV N gen bölgesine yönelik RT-rtPCR reaksiyonun amplifikasyon grafiği 35 Şekil 3.1. PPRV N geni içeren plazmid DNA nın logaritma 10 tabanına göre sulandırmalarının rtpcr da amplifikasyon görüntüsü 44 Şekil 3.2. PPRV N geni içeren plazmid DNA nın logaritma 10 tabanına göre sulandırmalarının rtpcr da oluşturduğu standart eğri 45 Şekil 3.3. RT-rtPCR a alınan örneklerin eşik değerlerinin belirlenmesi 45 Şekil 3.4. RT-rtPCR a alınan saha örneklerinin standart eğri üzerinde yerleşimi 46 Şekil 3.5. Konvansiyonel RT-PCR a alınan saha örneklerinin agaroz jel görüntüleri 47 Şekil 3.6. PPRV N geni kısmi dizinlerinin kendi aralarında ve Gen Bankasında verileri bulunan dizinler ile nükleotid düzeyinde karşılaştırılması 50 Şekil 3.6. nın devamı 51 Şekil 3.7. PPRV N geni kısmi dizinlerinin amino asit düzeyinde hizalanması 54 Şekil 3.8. PPRV N geni kısmi dizinlerinin kendi aralarında ve Gen Bankasındaki diğer PPRV dizinler ile ikincil yapı incelenmesi 55 Şekil 3.9. PPRV dizinlerinin N gen bölgesi yönünden Maksimum- Likelihood (ML) ve Neighbour-Joining (NJ) metodu ile filogenetik ilişkisi 57

11 xi ÇİZELGELER Çizelge 1.1. PPRV enfeksiyonu saptanan yabani hayvan türleri 12 Çizelge 2.1. Serolojik ve virolojik kontrol amacıyla alınan koyun ve keçi örneklerinin illere göre dağılımı 28 Çizelge 2.2. PPRV N genine dayalı RT-rtPCR da kullanılan primer ve prob 29 Çizelge 2.3. PPRV N genine dayalı RT-PCR da kullanılan primerler 30 Çizelge 2.4. PPR C-ELISA değerlendirme tablosu 32 Çizelge 2.5. RT-rtPCR karışım bileşenleri ve programı 35 Çizelge 2.6. Konvansiyonel RT-PCR karışım bileşenleri ve programı 36 Çizelge 2.7. Dye Termination Cycle Sequencing (DTCS) kit karışımı 40 Çizelge 2.8. DNA dizin analizi reaksiyon bileşenleri ve programı 40 Çizelge 3.1. İllere göre PPRV enfeksiyonunun prevalansı 42 Çizelge 3.2. PPRV N geni içeren plazmid DNA nın logaritma 10 tabanına göre sulandırmalarının rtpcr da eşik değerleri ve kopya sayıları 44 Çizelge 3.3. PPRV RT-rtPCR ve konvansiyonel RT- PCR da pozitif bulunan örneklere ilişkin bilgiler 47 Çizelge 3.4. Dizin analizi gerçekleştirilen örneklere ilgili veriler 49 Çizelge 3.5. PPRV N geni dizinlerinin kendi aralarında ve diğer PPRV dizinleri ile nükleotid benzerlik/farklılık oranları 52

12 1 1. GİRİŞ Peste des Petits Ruminants (PPR) enfeksiyonu koyun ve keçi gibi evcil ruminantların yanı sıra vahşi ruminantlarda da görülen ateş, iştahsızlık, nasal akıntı, hemoraji, ağız mukozasında (dil, dudak, damak ) erozyonlar, stomatitis, konjunktivitis, diarrhea ve bronchopneumonie ile karakterize subakut ya da akut viral bir hastalıktır (Diallo 1988; Scott 1990; Kwiatek ve ark., 2007). Enfeksiyon Afrika, Arap Yarımadası, Orta Doğu, Türkiye ve Güneydoğu Asya da (Abu Elzein ve ark., 1990; El hag Ali ve Taylor 1984; Nanda ve ark., 1996; Ozkul ve ark., 2002; Al-Majali ve ark., 2008; Kwiatek ve ark., 2007) yaygın olarak görülmektedir. Karantina tedbirlerinin yeterince uygulanmaması ve sınırlarda hayvan hareketlerinin kontrol edilememesi nedeniyle, PPRV enfeksiyonunun kontrol ve eradikasyonu birçok ülkede problem olmuştur. PPRV Measles Virus (MV), Canine Distemper Virus (CDV) ve Rinderpest Viruslarına (RPV) göre daha sonra morbillivirus genusuna eklenmiştir. PPRV ve RPV, morbillivirus genusuna dahil 5 virus (canine distemper virus, measles virus, dolphin distemper virus, phocine distemper virus ve porpoise distemper virus) ile birlikte aynı ailede yer almaktadır (Barrett ve ark., 1993; Domingo ve ark., 1990; McCullough ve ark., 1991). World Organization for Animal Health (OIE) tarafından 1994 yılında başlatılan Uluslararası sığır vebası (RP) kontrol eradikasyon kampanyası (GREP) dahilinde yapılan yoğun aşılama çalışmaları, Haziran 2011 yılında hastalığın yeryüzünden eradike edildiğinin bildirilmesi ile son bulmuştur. Ancak, PPRV enfeksiyonu Afrika, Asya, Ortadoğu ve Türkiye de yayılmaya devam etmektedir.

13 Tarihçe PPR, özellikle koyun ve keçi gibi evcil ruminantların yanı sıra yabani ruminantlarda da görülen çok bulaşıcı ve büyük ekonomik kayıplara neden olan bir viral enfeksiyondur (Dhar ve ark., 2002). Kata, pseudo sığır vebası, pnömoenteritis kompleksi ve stomatitis sendromu (Braide, 1981) olarak da adlandırılan PPR, ilk defa 1942 yılında Batı Afrika da Fildişi sahillerinde tanımlanmıştır (Gargadennec ve Lalanne, 1942). PPRV, diğer üç morbillivirusun (Measles virusu, Canine Distemper virusu, Sığır vebası virusu) izolasyonundan yaklaşık 10 yıl sonra 1950 lerin başında hücre kültüründe izole edilmiştir. PPR kendi başına önemli bir hastalık olmasının yanı sıra, sığır vebasına (RP) klinik benzerliği nedeniyle de sorunlar oluşturmaktadır (Gilbert ve Monnier, 1962). Hastalığın uzun yıllar Afrika kıtasının bir kısmında sınırlı olduğu düşünülmüştür yılında Sudan da keçilerde görülen ve RP tanısı konulan enfeksiyonun, PPR olduğu belirlenmiştir (Diallo, 1988). Enfeksiyonun, Hindistan ile birlikte Batı ve Güney Asya nın diğer bölgelerinde de ortaya çıkışı giderek yaygınlaştığını ortaya koymaktadır (Shaila ve ark., 1996). Enfeksiyon sonucu oluşan ekonomik kayıplar, yaygınlığı (Lefèvre ve Diallo, 1990) ve başarıya ulaşan global RP eradikasyon programında ve epidemiyosürveyans programlarında oynadığı rolü PPR enfeksiyonunun önemini ortaya koymaktadır (Couacy-Hymann ve ark., 2002) Etiyoloji PPRV uzun bir süre RP virusunun küçük ruminantlara adapte olmuş bir varyantı olarak kabul edilmiştir. Virusun çapraz nötralizasyon ve elektron mikroskopi çalışmaları ile biyolojik ve antijenik olarak RP virusu ile ilişkili olduğu ortaya konmasına rağmen, fizikokimyasal özellikleri açısından farklı bir morbillivirus olduğu gösterilmiştir. Aynı zamanda her iki virusun enzootik olduğu alanlarda immunolojik olarak farklı bir virus olduğu da görülmüştür (Taylor, 1979a). Spesifik nükleik asit probları kullanılarak yapılan hibridizasyon çalışmaları ve genom dizin analizi çalışmaları da, PPR virusun RP virusundan oldukça farklı olduğunu ortaya koymuştur (Diallo ve ark., 1989a). PPRV, Paramyxoviridae ailesinin Morbillivirus

14 3 genusunda yer alır (Gibbs ve ark., 1979). Aynı zamanda morbillivirus genusu measles virusu (MV), sığır vebası virusu (RPV), canine distemper virusu (CDV), phocine morbillivirusu (PMV), porpoise distemper virusu (PDV) ve dolphin morbillivirusu (DMV) içerir (Barrett ve ark., 1993a: Barrett, 2001). Nükleokapsit proteini (N) kodlayan gen bölgesi dizinlerine dayanarak morbilliviruslarda genetik ilişkiler Şekil 1.1 de gösterilmiştir. Şekil 1.1. N proteinine dayalı morbilliviruslarda genetik ilişkiler (Field Virology, 5th edition, 2007) Elektron mikroskopide morbilliviruslar, Paramyxoviridae familyasının tipik özelliği olan helikal nükleokapsidi çevreleyen zarf ve pleomorfik yapı gösterirler (Gibbs ve ark., 1979). Morbilliviruslar linear, segmentsiz, tek iplikçikli, negatif polariteli yaklaşık olarak kb büyüklüğünde ve 200 nm çapında genoma sahip RNA viruslarıdır (Norrby ve Oxman, 1990). Tüm genom dizini MV (Cattaneo ve ark., 1989), RPV (Baron ve Barrett, 1995), CDV (Barrett ve ark., 1987), PPRV (Bailey ark., 2005) ve DMV (Rima ve ark., 2003) için mevcuttur. Bu veriler, negatif polariteli RNA virus çalışmaları için hayati bir teknoloji olan revers genetik çalışmaların oluşturulmasında kullanılmaktadır (Nagai, 1999; Neumann ve ark., 2002). Dizin analizi verileri karşılaştırıldığında görülen benzerlikler, morbillivirusların aynı genom organizasyonuna sahip olduklarını ortaya koymaktadır (Barrett ve ark., 1991; Banyard ve ark., 2005). Genom iki yapısal olmayan (V ve C proteini) ve 6 yapısal proteini kodlayan 6 transkripsiyonel üniteden (sırasıyla 3 -N-

15 4 P/C/V-M-F-H-L-5 ) oluşur (Barrett, 1999; Baron ve Barrett, 1995; Diallo, 1990). Morbillivirus genomunun tüm uzunluğu M ve F genleri arasındaki birleşimin değişken boyutlarından dolayı farklılık göstermektedir. Bu birleşim yüksek GC (%65) içeriğine sahiptir fakat replikasyondaki rolü tam olarak açıklanamamıştır (Liermann ve ark., 1998; Radecke ve ark., 1995). Virus proteinleri biyolojik fonksiyonları ve özelliklerine göre 2 gruba ayrılır. Birinci grupta viral yapısal proteinlerini oluşturan (N, P, L) internal polipeptid kompleks yer alır ve viral genom ile birlikte nükleokapsidi oluşturur. İkinci grupta virus zarf proteinleri (M, F, H) bulunmaktadır. N, M, F, L proteinleri virusun en iyi korunmuş proteinleridir (Rima, 1983; Abraham, 2005). Şekil 1.2. de morbillivirus virionu ve genomu gösterilmiştir. Şekil 1.2. Morbillivirus virionu ve genom yapısının şematik görüntüsü ( ( Nüklekapsid proteini (N): Viral nükleik asidi saran N proteini hem virion, hem de enfekte hücrelerde en çok bulunan viral proteindir (Diallo ve ark., 1987). Nükleokapsid ve viral genomun şekillenmesinde etkilidir. N geni 3 ucunda ilk

16 5 kodonun yukarısında kodlanmayan bir bölge ve baz uzunluğunda lider diziyi içeren tek bir transkripsiyon promotoruna sahiptir (Billeter ve ark.,1984; Crowley ve ark., 1988; Ray ve ark., 1991). Lider dizin için replikasyonu başlatmak, pozitif iplikçikli RNA oluşumu ve konak hücre transkripsiyonunu azaltmak gibi çeşitli görevler düşünülmektedir (Norrby ve Oxman, 1990; Walpita, 2004; Ray ve ark., 1991). Morbilliviruslarda transkripsiyon ve replikasyon genomun 3 ve 5 ucundaki genom (GP) ve antigenom (AGP) promotorları olarak bilinen kodlanmayan bölgeler (UTRs) tarafından kontrol edilir (Lamb ve Kolakofsky, 2001). Hem GP hem de AGP nin 3 ucunda nükleotitten oluşan korunmuş bir bölgenin, promotor aktivite için gerekli domainler olduğu gösterilmiştir. PPR virusda GP (1-107 nt) ve AGP ( nt) dizinleri oldukça iyi korunmuştur (Mioulet ve ark., 2001). Korunmuş dizinler, GP ve N geninin başlangıcındaki birleşme noktasında aynı zamanda transkripsiyon için gerekli olan interjenik triplet içerir (Mioulet ve ark., 2001). İnterjenik bölgeler bir yarı korunmuş polyadenilasyon sinyalı, bir yüksek düzeyde korunmuş GAA dizini, bir sonraki gen için yarı korunmuş başlangıç sinyalı ve degişken uzunlukta 5 ve 3 ucundaki kodlanmayan bölgeler (UTRs) olarak 4 birimden oluşur (Barrett ve ark., 1991). Polymerase associated proteini (P) ve yapısal olmayan C ve V proteinleri: PPRV genomunun ikinci transkripsiyonel ünitesi olan P geninin açık okuma çerçevesinden, RNA editing mekanizmasıyla translasyonu gerçekleşen iki adet yapısal olmayan protein (C ve V) sentezlenir (Cattaneo et al., 1989; Mahapatra et al., 2003). Morbillivirusların P proteini, N ve L proteinleri ile karşılıklı etkileşerek viral replikasyonda görev alır (Kalokofsky ve ark.,1998; Mahapatara ve ark,. 2003). P geninin düzenleme bölgesindeki hekzamer fazının bu süreçte önemli rol oynadığı gösterilmiştir (Kolakofsky ve ark., 1998). P proteini proteolitik enzimlere karşı duyarlı olup, yapısal olarak fosfoprotein yapısındadır (Barrett,1999). Paramyxovirusların C ve V proteinlerinin, yapısal olmamalarına rağmen enfeksiyonda kritik rol aldığı bildirilmiştir. Bu proteinlerin RPV replikasyonu için önemli olduğu gösterilmiştir (Baron ve Barrett, 2000). Ayrıca Paramyxovirusların C

17 6 ve V proteinleri interferon antagonistleri gibi hareket ederek, enfeksiyona karşı hücresel immun yanıtı değiştirirler (Gotoh ve ark., 2001; Horvath, 2004). Matrix proteini (M): Temel membran proteini olan M proteini, lipid yapıdaki zarfın yüzey glikoproteinlerinin altında yer almaktadır. M proteini Paramyxoviridae ailesinde iyi korunmuş proteinlerden biridir. M proteininin virion morfogenezisinde önemli rol oynaması iyi korunması ile ilgilidir. Virionun konak hücre membranından tomurcuklanması sırasında zarf oluşumunda rolü olduğu düşünülen bir non-glikozil proteindir (Kingsbury, 1990). M proteini, hem N proteini hem de F ve H glikoproteinlerinin sitoplazmik uzantıları ile etkileşimdedir. Füzyon proteini (F): F proteini iyi korunan proteinlerden biridir. Paramyxoviruslar inaktif bir prekürsör (F0) oluştururlar. F0 konak hücre enzimleri ile parçalanarak bir aktif disülfid (F1-F2) proteinlerini oluşturmaktadır (Lamb and Kolakofsky, 2001). F proteini peplomerler ve yüzey çıkıntılarını oluşturan glikozillenmiş iki zarf proteininden biridir. Bir öncü olarak sentezlenen F0, daha sonra hücresel proteazlar tarafından F1 ve F2 olarak iki disülfit bağlı polipeptidlere parçalanır (Sato ve ark., 1988). F proteininin biyolojik aktivitesi için proteolitik parçalanmanın gerekli olduğuna inanılmaktadır. Hemaglütinin proteini (H): H proteini virusun konak hücreye bağlanmasından sorumludur (Choppin ve Scheid, 1980, Lamb ve Kolakofsky, 2001). H proteininin biyolojik aktivitesi Paramyxoviruslar için bir sınıflandırma kriteridir. Bu protein çok değişkendir (Blixenkrone- Moller ve ark.,1996). Morbilliviruslara ait proteinler içinde P proteini ile birlikte en az korunmuş proteinlerdendir. Paramyxovirus genusuna ait virusların (örneğin NDV) H proteininin, hem hemaglütinin hem de nöyroaminidaz özelliği (Scheid and Choppin, 1974), morbillivirus genusuna ait virusların sadece hemaglütinin özelliği bulunmaktadır. Pneumovirus genusuna ait virusların (RSV) ise, ne hemaglütinin ne de nöyrominidaz aktiviteleri bulunmaktadır (Kingsbury ve ark., 1978).

18 7 Large Proteini (L): L proteini morbillivirusların en büyük polipeptidi olarak bilinmektedir (Rima, 1983). Viral transkripsiyon ve replikasyonun enzimatik bileşeni ve en son transkribe edilen proteinidir. Multifonksiyonel olan bu proteinin RNA polimeraz aktivitesine ek olarak, metilasyon ve polyadenilasyon aktivitesi de bulunmaktadır. (Lamb and Kolakofsky, 2001). Morbillivirus L proteini A, B ve C olarak adlandırılan 3 iyi korunmuş domaine sahiptir. Bunlardan iki domain morbilliviruslar arasında büyük farklılık göstermektedir (McIlhatton ve ark., 1997) Enfeksiyonun Coğrafik Dağılımı PPR Batı Afrika da 1942 yılında tanımlandıktan sonra subtropikal Afrika ya, Arabistan a, Orta Doğu ve Güney Asya ya yayılmıştır. Son yıllarda ise Türkiye ve Hindistan da bildirilen önemli salgınlar, hastalığın küresel insidansında belirgin bir artış olduğunu göstermektedir (Nanda ve ark., 1996; Özkul ve ark., 2002; Shaila ve ark., 1996). PPR enfeksiyonunun dünyadaki yayılımı Şekil 1.3. de gösterilmiştir (World Organisation for Animal Health, OIE, 2011). Şekil 1.3. PPRV enfeksiyonunun dünya haritasındaki dağılımı (OIE-2011) PPR virusu Nijerya (Taylor ve Abegunde, 1979), Sudan (ElHag ve Taylor, 1984), Suudi Arabistan (Abu Elzein ve ark., 1990), Hindistan (Shaila ve ark., 1989; Nanda

19 8 ve ark., 1996) ve Türkiye de (Ozkul ve ark., 2002) izole edilmiştir. Suriye, Nijer, Etiyopya ve Ürdün de (Abraham ve ark., 2005) serolojik olarak tespit edilirken, virusun varlığı Eritrea da (Sumption ve ark., 1998) cdna prob ile doğrulanmıştır. Farklı coğrafik bölgelerden elde edilen PPRV izolatlarına F proteini gen bölgesi düzeyinde yapılan dizin analizlerinde, 4 farklı genetik hat (lineage) belirlenmiştir (Shaila ve ark.,1996; Dhar ve ark., 2002) (Şekil 1.4., Şekil 1.5.). Hat 1, 1970 li yıllarda Afrika dan izole edilen virusları (Nijerya 1975/1, 1975/2, 1975/3, 1976/1 ve Senegal) hat 2 ise, 1980 li yıllarda Batı Afrika da (Fildişi Sahilleri ve Gine) izole edilen virusları içerir. Bu viruslar sadece Afrika da bulunmaktadır. Kızıldeniz i aşarak Asya ya yayılmamıştır. Hat 3, Sudan (Diallo, 1988) ve Etiyopya da (Roeder ve ark., 1994) ortak bulunan virusları, hat 4 ise Asya viruslarını (İsrail 94, Iran 94, Nepal 95, Bangladeş 93, Hindistan, Pakistan 94, Suudi Arabistan 94, Türkiye 96, Türkiye 00) içermektedir (Shaila ve ark., 1996; Ozkul ve ark., 2002). Asya genetik hatlarının yanında belirgin olarak iki Afrika hattının varlığı hastalığın ticaret yolu ile yayılmasının göstergesi olarak kabul edilebilir. Bir araştırmada (Banyard ve ark., 2010), Katar da keçilerde sirküle eden virusların hem hat III, hem de hat IV de yer aldığı belirlenmiştir. Son zamanlarda ise yabani geyik populasyonlarında saptanan PPRV enfeksiyonu, Katar da durumun daha komplike hale geldiğini göstermektedir (Kinne ve ark., 2010). Şekil 1.4. PPR virusun 4 farklı genetik hattının coğrafik dağılımı (Dhar ve ark., 2002)

20 9 Şekil 1.5. PPR virusun F proteini kodlayan gene dayalı filogenetik ilişkisi (Özkul ve ark., 2002) 1.4. Epidemiyoloji Bulaşma PPRV konak dışında çabuk inaktif hale geldiğinden enfeksiyonun en önemli bulaşma yolu, sürü içerisinde bulunan viremi dönemindeki hayvanların diğer duyarlı hayvanlarla yakın temasıdır. Enfekte hayvanların oral, nazal, konjunktival akıntıları ve gaitasında bol miktarda virus bulunur. Duyarlı hayvanlar, enfekte hayvanların

21 10 öksürme ve aksırması sonucunda havada bulunan enfektif damlacıkları solunum sırasında alabilirler (Abegunde ve Adu, 1977; Bundza ve ark., 1988; Taylor, 1984). Hastalığın en önemli bulaşma yolu yakın temas olmasına karşın, enfekte olmuş hayvan yatakları, su ve yem gibi çeşitli malzemeler de etkenin geçişinde indirekt olarak rol oynayabilir. Uzun mesafelerden aerosol yolla gelen etkenlerin bulaşmadaki rolü azdır. Çevre şartlarına oldukça duyarlı olan PPRV ısı, ultraviole ışını ve yağ çözücülerle kolaylıkla inaktive olduğundan dolayı enfeksiyonun bulaşmasında hayvanların yakın temasta olmaları şarttır (Lefèvre ve Diallo, 1990). Mevsimin soğuk ve yağmurlu olduğu dönemlerde PPRV enfeksiyonunun epizootik formu gelişir ve %80-90 morbiditeyi takiben %50-80 mortalite görülür. Afrika da PPR salgınları genelde yağışlı mevsimde görülmesine rağmen, kurak dönemde de PPR salgınlarına rastlanmıştır (Opasina ve Putt, 1985). Suudi Arabistan da da %90 morbidite ve %70 mortaliteyle seyreden PPR salgınları bildirilmiştir (Abu Elzein ve ark., 1990). PPRV için herhangi bir persiste durum bilinmemektedir. Hayvan ticaretinde farklı bölgelerden gelen hayvanların birbirleriyle yakın temasta olduğu pazarlarda enfeksiyonun bulaşması çok yüksek düzeyde olmaktadır Konakçı Duyarlılığı PPR özellikle küçük ruminantların hastalığıdır. Keçiler enfeksiyondan ağır etkilenirken, koyunlarda genellikle hafif form görünür (Lefèvre ve Diallo, 1990). Türler arasında duyarlılık farkları olduğu gibi, farklı ırklar arasında da enfeksiyonun sonucunun ve epidemiyolojisinin farklı olduğu bildirilmiştir (El Hag Ali ve Taylor, 1984; Diop ve ark., 2005). Batı Afrika keçilerinde PPRV enfeksiyonu daha ağır seyretmesine rağmen, Avrupa keçilerinde daha hafif seyretmektedir. Son yıllarda Batı Afrika keçileri arasında ırk yatkınlığı açısından farklılıklar bildirilmiştir (Diop ve ark., 2005). Taylor (1984), koyunların PPRV enfeksiyonuna karşı genetik olarak dirençli olmalarına rağmen, bazen saha suşları tarafından bu genetik direncin aşılarak yüksek mortaliteye neden olan salgınların oluşabildiğini bildirmiştir. Hindistan ve

22 11 Orta Doğu da çıkan salgınlarda hem keçilerde, hem de koyunlarda benzer sonuçlar görülmüştür. Hindistan da yerli koyun ırklarında morbidite %25, mortalite oranı %10 a ulaşmıştır (Shaila ve ark., 1989). Yeşilbağ ve ark, (2005) Bursa ve çevresinde yaptıkları çalışmada PPR enfeksiyonundan keçilere oranla koyunların daha çok etkilendiğini bildirmiş ve bölgede koyun yetiştiriciliğinin daha yaygın olmasının bu durumun nedeni olabileceğini belirtmişlerdir. Aşılı ya da aşısız olan sığırlar, PPRV ile enfekte koyun ve keçilerle temas sonrasında klinik tablo göstermemektedirler. Deneysel enfeksiyonlarda ise hafif ya da subklinik enfeksiyon geçirmeleri, sığırların PPR virusun virulent suşlarına karşı korunduğunu göstermektedir. Domuzlarda klinik bulgu görülmeksizin antikor yanıtı saptanmıştır (Gibbs ve ark., 1979; Dardiri ve ark., 1976; Taylor ve Abegunde, 1979). PPRV hem doğal yaşam ortamında, hem de deneysel olarak yabani hayvanlarda enfeksiyon oluşturmaktadır. Develerde PPRV antikorlarının varlığı %4.2 olarak saptanmıştır (Ismail ve ark., 1995). Khalafalla ve ark.(2010) Sudan da develerde %0-50 oranında mortalite ile seyreden bir PPR salgınını bildirmişlerdir. Yabani hayvanlardan antilop, geyik, yabani koyun ve keçilerde doğal PPR enfeksiyonlarına rastlanmaktadır. Bu hayvan türlerinde PPRV enfeksiyonu yüksek mortalite ile seyretmektedir. Ceylanlar ve beyaz kuyruklu geyiklerde oluşturulan deneysel PPRV enfeksiyonlarında ise, sözkonusu hayvanların enfeksiyona duyarlı olduğu gösterilmiştir (Hamdy ve ark., 1976; Lefevre ve Diallo, 1990; Ogunsanmi ve ark., 2003). Ceylanlar ve geyiklerde Suudi Arabistan da klinik ve serolojik olarak PPR rapor edilmiştir (Kinne ve ark., 2010). Yabani hayvan türlerinde saptanan PPRV Çizelge 1.1. de gösterilmiştir.

23 12 Çizelge 1.1. PPRV enfeksiyonu saptanan yabani hayvan türleri (Banyard ve ark., 2010) Tür Latin Adı Referans Laristan koyunu Ovis gmelini laristanica Furley et al. (1987) Güney Afrika ceylanı Oryx gazella Furley et al. (1987) Dorcas ceylanı Gazella dorcas Furley et al. (1987) Thompson ceylanı Eudorcas thomsonii Abu-Elzein et al. (2004) Nubian keçisi Capra nubiana Furley et al. (1987) Hindistan bizonu Bubalus bubalus Govindarajan et al. (1997) Afrika gri dukier Sylvicapra grimma Ogunsanmi et al. (2003) Arab antilopu Oryx leukoryx Fro lich et al. (2005) Afrika antilopu Alcelaphus buselaphus Couacy-Hymann et al. (2005) Bizon Syncerus caffer Couacy-Hymann et al. (2005) Defassa waterbuck Kobus defassa Couacy-Hymann et al. (2005) Kobs Kobus kob Couacy-Hymann et al. (2005) Arab dağ ceylanı Gazella gazella cora Kinne et al. (2010) Springbuck Antidorcas marsupialis Kinne et al. (2010) Arab ceylanı Gazella gazella Kinne et al. (2010) Berber koyunu Ammotragus lervia Kinne et al. (2010) Bushbucks Tragelaphus scriptus Kinne et al. (2010) Impala Aepyceros melampus Kinne et al. (2010) Rheem ceylanı Gazella subguttorosa marica Kinne et al. (2010) Afgan keçisi Capra falconeri Kinne et al. (2010) 1.5. Klinik Semptomlar PPRV enfeksiyonunda hayvanın türü, yaşı, alınan virusun virulensi ve miktarı ile sekonder enfeksiyonların gelişimine bağlı olarak perakut, akut ve subakuta kadar değişen farklı klinik tablolar görülmektedir. Hastalığın sürüye girişinde aşağıdaki faktörlerden herhangi biri rol oynayabilir (Gülyaz ve Özkul, 2005; Abraham, 2005): Değişik yaş gruplarındaki koyun ve keçilerin beraber otlaması ve sürüdeki hayvanların yakın çevredeki sürüler ile temasta bulunması; Sürüye yeni hayvan girişi, satılmak amacıyla pazara sunulan hayvanların satılmadan geri getirilmesi; İklim şartlarının değişikliği (yağışlı, nemli, sıcak) ve yetiştirme şeklinde yapılan değişiklikler. Virus, organizmaya girdikten sonra 3-4 günlük inkubasyon periyodu sırasında oro-farengial lenf yumrularında çoğalır; ardından kan ve lenf yoluyla doku ve organlara yayılır. Hastalığın en ağır formu akut formdur. Belirgin klinik semptomlar

24 13 beden ısısının aniden 39,5-41 C ye yükselmesiyle başlar. Etkilenen hayvanlarda nefes darlığı, bazen hızlı ve hırıltılı torakaabdominal bir solunum görünür. Ağır vakalarda solunum güçlüğüne bağlı olarak baş ve boynu ileri uzatma, burun deliklerini açma, dili dışarı çıkarma ve hafif iniltili bir öksürük gözlemlenir. Bunlar pnömoninin belirgin bulgularıdır. Başlangıçta seröz karakterde olan oral, nazal ve konjunktival akıntılar sekonder bakteriyel kontaminasyonla birlikte sarı ve irinli bir yapıya dönüşür. Bu akıntılar çeneyi ve gözün altındaki tüyleri ıslatabilir, bunların kurumasıyla göz kapaklarının yapışması, burnun tıkanması ve nefes almada güçlük şekillenir. PPR enfeksiyonunda, sığır vebasının aksine solunum sisteminde belirgin bir enfeksiyon tablosu oluşmaktadır (Bundza ve ark., 1988; Brown ve ark., 1991). Ateşin ortaya çıkmasından 1-2 gün sonra göz ve ağızdaki mukoz membranlar kızarır. Dilin üst kısmında, yanakların iç tarafında, dudak, damak ve diş etlerinde gri renkte peteşiyal tarzda epitelyal nekroz alanları görülür. Zamanla bu lezyonların sayısı ve alanı artarak birleşirler. Ağız mukozasının görünümü tamamen değişir. Mukoza solgun görünümlü ve ölü hücreler ile kaplı, bazı durumlarda adeta koyu peynirimsi bir tabaka ile kaplı görünürler. Bu ölü hücrelerin altında çok derine inmeyen erozyonlar vardır. Bir parmak yardımıyla damak ve diş etinden sıyrılan ince epitel tabaka, oldukça pis kokuludur (Braide, 1981). Yüksek ateş yaklaşık 5-8 gün sürer, sonra yavaş yavaş normale döner veya ölüm öncesi düşer. Erken ya da hafif formlu olgularda yüksek ateşin gelişmesinden 2-3 gün sonra genellikle ishal görülür. İlk başlarda yumuşak olan gaita daha sonra sulu ve kötü kokulu bir hale dönüşür. İçinde kan ve bağırsak epitelleri bulunur. İshalin oluşmadığı durumlarda, rektal swap örneğinde yumuşak gaita ve kan görülür. Dehidrasyona bağlı olarak göz küreleri çöker ve bu hayvanlar ilk klinik belirtilerin görülmesinden 7-10 gün sonra ölürler. Bu dönemi atlatan hayvanlar ise iyileşirler. Sekonder enfeksiyonlar aynı zamanda sahada önemli sorundur. Hastalıktan etkilenen hayvanlarda lenfositopeni görülür. Ayrıca toplam hücre hacmi (PCV) %35-45 olması gerekirken, %60 ın üzerine çıkar. Hemoglobin ve akyuvar (WBC) sayısı normal değerlerde olmasına karşın, alyuvar (RBC) sayısı çok yükselir (Furley ve ark., 1987). PPR ın abort, vulvovaginitis ve sinirsel semptomlarla ortaya çıkan atipik formu da görülebilir (Wosu, 1994).

25 14 PPR enfeksiyonunun subklinik formunda, akut formda olduğu gibi belirgin bir klinik belirti tespit edilemez. Bu belirtilerin şiddeti hayvanın yaşı, türü ve bireysel direncine göre değişir. Hastalık gün sürer. Subklinik formun son evresinde ağız, diş etleri, dil, burun mukozası ve yanak papillarında papülöz ve püstülöz patolojik deşişiklikler gözlenir. Bazen bu papül benzeri lezyonlara derinin kılsız bölgelerinde de rastlanır. Sub-akut hastalığın ilerleyen dönemlerinde dudak ve burun çevresindeki deride nodüler lezyonlar oluşur. Bunun kesin sebebi belirlenememiştir (Lefevre ve Diallo, 1990; Gül ve ark., 2006) Patogenez ve Patoloji PPRV diğer morbilliviruslar gibi lenfotropik ve epiteliyotropik karakterdedir (Scott, 1981). Dolayısıyla en ağır lezyonlar lenfoid ve epitelyum dokudan zengin olan organlarda görülür. Virus solunum yolu ile vücuda girer ve buradan diğer doku ve organlara yayılır. Virus solunum sistemine girdikten sonra farengial ve mandibular lenf yumruları ile tonsillalarda çoğalır. Enfeksiyonda klinik belirtiler ortaya çıkmadan 1-2 gün önce viremi fazı oluşur. Daha sonra virusun dalak, kemik iliği, gastro-intestinal mukoza ve solunum sistemine yayılımı ile viremi sonuçlanır. Bu dönemde nasal, konjunktival akıntı ve idrar ile virus saçılır. Ayrıca ishal semptomlu koyunlarda gaitadan virus saçılımı olur (Scott, 1981; Abraham, 2005; Gülyaz ve Özkul, 2005). Nekropsi Bulguları: PPRV enfeksiyonundan ölen hayvanlarda karkas genellikle çok zayıftır. Perianal bölge sulu bir dışkı ile kirlenmiştir. Göz küreleri göz yuvarlağı içine çökmüştür. Göz ve burunda kurumuş akıntılar mevcuttur. Dudaklarda şişlikler ve erozyon görülür. İlerlemiş vakalarda kabuk bağlamış yara ve nodüller görülebilir. Burun boşluğunda konjesyonla beraber açık veya sarı renkte eksudat ve erozyon vardır. Özefagus, yanak, dil, diş etleri, sert ve yumuşak damakta kabuk bağlamış erozyonlar dikkati çeker. Akciğerin çoğunlukla anterior ve kardial lobları koyu kırmızı ya da mor renkte görülür ve dokunulduğunda sert kıvam hissedilir. Özellikle

26 15 mezenteriyal ve mediastinal lenf yumruları (akciğer ve bağırsaklar ile birlikte) yumuşak ve şişkindir. Abomasumda konjesyon alanları vardır (Abraham, 2005). PPRV enfeksiyonundan kaynaklanan bir patolojide ağız ve gastro-intestinal sistemde nekrotik ve ülseratif lezyonlar hakimdir (Roeder ve ark., 1994). Ağız boşluğundaki erozyonlar kalıcı özelliktedir. Rumen, retikulum ve omasumda nadiren lezyona rastlanır. Bazen rumen papillaları arasında erozyon olabilir. Omasumda çizgisel tarzda, düzenli, genellikle de kanla sıvanmış yaygın erozyonlara rastlanır. Genellikle ince barsaklardaki lezyonlar şiddetli değildir. Sınırlı hemorajik çizgiler görülür. Bazen ileumun başlangıcında ve duodenumun ilk kısmında erozyonlar görülebilir. Kalın barsaklarda özellikle ileosekal kapak, sekokolik bağlantı ve rektumda kanama odaklarına rastlanır. Rektum ve kolonun son kısmında mukoza katmanlarında zebra çizgileri olarak tanımlanan sınırlı kanama çizgileri görülür. Solunum sisteminde, burun mukozası, larenks ve tracheada gözle görülebilen peteşiyel kanamalar ve erozyonlar görülür. Konsolidasyon ve atelaktazi ile karakterize bronchopneumoni şekillenir (Brown ve ark., 1991; Losos, 1994; Abraham, 2005). Tüm morbillivirusların geçici olarak doğal konakçının merkezi sinir sisteminde (MSS) enfeksiyon oluşturması mümkündür; ancak enfeksiyonun gelişmesi immun yanıta, virusun MSS ye girişi için virus-spesifik reseptörlerin varlığı ve transnöronal yayılıma bağlıdır. Genç hayvanların beyinlerinde viral replikasyonun varolduğunu düşündüren bazı yayınlar bildirilmiş olmasına rağmen, MSS bozuklukları RPV ve PPRV enfeksiyonu ile ilişkilendirilmemiştir. Ancak, PPR virusunun MSS de enfeksiyon oluşturmasına ilişkin daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır (Cosby ve ark., 2002). Histopatoloji: PPRV sindirim ve solunum sistemi mukozasında, eozinofilik intranüklear ve intrastoplazmik inklüzyon cisimcikleri ile karakterize epitelyal nekroza neden olur. Enfekte tüm epitel hücrelerinde çok çekirdekli sinsityal dev

27 16 hücresi görülür (Brown ve ark., 1991; Aruni ve ark., 1998; Toplu, 2004; Yener ve ark., 2004). Virusun dalak, tonsil ve lenf yumrularında neden olduğu lenfositik nekroz sonucunda piknotik nukleus ve karyoreksis gelişir (Rowland ve ark., 1971). Sağlam ve ark. (2009) yaptıkları çalışmada immunohistokimyasal metot kullanarak trachea, bronşiyol, bronşiyo-epitelyal hücre, sinsityal hücreler ve alveolar makrofajların hem çekirdek hem de sitoplazmalarında PPRV antijenlerini saptamışlardır İmmunoloji Morbillivirusların, H ve F yüzey glikoproteinleri oldukça immunojen olup, bağışıklıktan sorumludur. PPR virusun antijenik olarak RPV ile yakın ilişkili olmasından dolayı, iki virus arasında çapraz nötralizasyon vardır (Taylor, 1979a). RP virusunun H ve F glikoproteinlerini eksprese eden ikili rekombinant aşının keçileri PPRV enfeksiyonuna karşı koruduğu gösterilmiştir (Jones ve ark., 1993). Fakat bağışıklık sağlanan hayvanlarda sadece RP virusuna karşı nötralizan antikor varlığı saptanmıştır. H genine yönelik elde edilen rekombinant aşı, F geni içeren rekombinant aşıdan daha yüksek titrede antikor oluşturmuştur (Romero ve ark., 1995; Berhe ve ark., 2003). Bu sonuçlar hücresel immun yanıtın korunmada önemli bir rol oynadığını göstermektedir. H glikoproteinini eksprese eden rekombinant baculovirus ile yapılan immunizasyonda, keçilerde hem humoral hem de hücresel bağışıklık oluşturulmuştur. Deneysel çalışmalarda keçilerde rekombinant baculovirus aşısı ile, PPRV-H proteinine karşı immun yanıt oluşturulmuş, aynı zamanda RPV-H proteinine karşı çapraz reaksiyonun varolduğu düşünülmüştür. Hayvanlarda PPRV-H ve RPV-H antijenlerine karşı lenfoproliferatif bir yanıt oluşumu ortaya konulmuştur. PPRV enfeksiyonunu geçiren koyun ve keçiler bir daha bu enfeksiyona yakalanmamaktadır (Taylor, 1984). Anneleri enfeksiyonu geçirmiş veya aşılanmış kuzu ve oğlaklar kolostrum yoluyla maternal antikorları alırlar ve yaklaşık 3-4 ay enfeksiyona karşı bağışık olurlar (Libeau ve ark., 1992). Kızamık aşısı PPR virusuna

28 17 karşı koruma sağlamamaktadır ancak PPRV ile CDV arasında bir dereceye kadar çapraz koruma gösterilmiştir (Gibbs ve ark., 1979) Teşhis Koyun ve keçiler RP ve PPR virusları ile enfekte olabilirler. Ayrıca şap, pastorellosis, ektima, çiçek, keçi plöyropnöymonisi, mavidil, koksidiosis ve pestivirus enfeksiyonları gibi hastalıklar ile semptomlar karışabilmektedir. Bu nedenle klinik tanının laboratuvar analizleri ile doğrulanması gereklidir. PPRV enfeksiyonunun laboratuvar teşhisi 4 temel esasa dayanır: 1) Virus izolasyonu 2) Viral antijen tespiti 3) Nükleik asit tespiti ve dizin analizi 4) Seroloji Virus İzolasyonu Duyarlı hücre kültürlerinde virus izolasyonu mümkün olmakla birlikte, zahmetli ve zaman alıcı olması nedeniyle rutin teşhiste kullanılabilecek bir yöntem değildir. Ancak araştırma amaçlı ve sonraki çalışmalarda virusun kullanımı açısından önemlidir (OIE, 2012). Virus izolasyonu canlı hayvanlardan viremi fazında alınan ve soğuk zincir altında laboratuvara ulaştırılan antikoagulanlı kan, nazal ve oküler swap örnekleri, ölü hayvanlarda ise tonsil, lenf yumrusu, dalak, kolon ve akciğerden alınan örnekler ile yapılmaktadır (Lefevre, 1987). Primer kuzu böbrek, koyun derisi (Gilbert ve Monnier, 1962; Laurent, 1968; Taylor ve Abegunde, 1979) ve African Green Monkey Kidney (Vero) hücre kültürleri virus izolasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır (Hamdy ve ark., 1976). Primer kuzu ve keçi böbrek hücre kültürlerinde virus izolasyon şansı daha yüksektir (Taylor, 1984). Ancak, Vero hücre kültürü devamlı bir hücre kültürü

29 18 olması, daha az kontaminasyon riski taşıması ve yüksek titrede virus elde edilmesini sağlaması gibi avantajları nedeniyle birçok laboratuvarda PPRV ve RPV için daha çok tercih edilmektedir. Ayrıca PPRV izolasyonu için Madine Darby Bovine Kidney (MDBK) ve Baby Hamster Kidney-21 (BHK-21) gibi diğer devamlı hücre kültürleri de adaptasyondan sonra kullanılabilmektedir (Lefevre, 1987; Brindha ve ark., 2001; Özkul ve ark., 2002; OIE, 2004; Gülyaz ve Özkul, 2005). Hücre kültürlerinde virusun inokulasyonundan 8-10 gün sonra veya bir kaç kör pasaj sonrası sitopatolojik etki (CPE) görülmektedir. Vero hücre kültürlerinde CPE görünümü hücre yuvarlaklaşması, tipik üzüm salkımı benzeri kümeler, sinsityum oluşumu ve uzun ince hücreler ile karakterizedir. Diğer morbilliviruslar gibi, PPRV hem primer hem de devamlı hücre kültürlerinde, eozinofilik intrasitoplazmik ve intranükleer inklüzyon cisimcikleri oluşturmaktadır (Hamdy ve ark., 1976). Ayrıca, Theileria Parva dan transforme edilen T-lenfoblast hücre hattında, diğer hücre kültürlerine oranla daha kısa sürede PPR ve RP viruslarının izole edilebileceği de bildirilmiştir (Rossiter, 1994). Hücre kültürlerinde izolasyon sonrası identifikasyon için aşağıdaki 3 yöntemden birisi uygulanabilir: Hayvan inokulasyonu: Koyun ve keçilerde klinik hastalığa neden olur (Gibss ve ark., 1979) Çapraz nötralizasyon: Hem PPR hem de RPV referans serum ile nötralize edilir fakat homolog serumda yüksek titre ile nötralizasyon gerçekleşir (Taylor and Abegunde and, 1979, Taylor, 1979a). Moleküler teknikler: cdna prob, Poliakrilamid jel elektroforezis (PAGE) ve RT-PCR (Pandey et al., 1992; Couacy-Hymann et al., 2002).

30 Viral Antijen Tespiti Agar Jel Immunodifüzyon (AGID): Bu test, PPR enfeksiyonunun tespitinde oldukça spesifik (%92) olmasına rağmen, PPR ve RP arasında ayrım yapamamaktadır. Ayrıca AGID testi sensitivitesi düşük olduğundan hafif seyreden PPR olgularında, düşük miktardaki viral antijenleri tespit etmede başarısızdır (Obi, 1984; Abraham ve Berhan, 2001). Counter Immuno Elektroforezis (CIEP): CIEP testinin prensibi AGID testi ile aynı olup, ek olarak sadece testin hassasiyetini arttırmak için elektrikle yüklü jel kullanılmaktadır. Bu test PPRV ve RPV yi birbirinden ayırt edebilir (FAO, 1999). ELISA: Spesifik monoklonal antikorların kullanıldığı sandwich ELISA (s-elisa) yönteminde enfekte keçilerden alınan sekret ve dokularda antijen tespit edilmiştir (Saliki ve ark, 1994). Antijen ELISA nın gittikçe yaygınlaşarak kullanıldığı diğer bir metot ise immuncapture ELISA dır (IC-ELISA). Bu yöntemde direkt monoklonal antikorlara (MAb) karşı nükleokapsid (N) proteini kullanılmaktadır. Bu yöntem ile 2 saat içerisinde güvenilir bir sonuç verilebilir (Libeau ve ark., 1994). IC-ELISA, PPR ve RP viruslarının ayırıcı tanısını sağlamaktadır; iki hastalığın benzer coğrafik dağılım ve aynı hayvan türlerini etkilediği düşünüldüğünde, bu teknik oldukça değerli bir tanı yöntemi olarak uygulanmaktadır. IC-ELISA tekniğinde kullanılan monoklonal antikorlar direkt PPR ve RP viruslarının N- proteininin iki ayrı domainine karşı yapılmıştır. Ancak capture antikorda her iki hastalığa karşı genel bir epitop tespit edilir (Libeau ve ark., 1994). Bu testin önemli avantajları; Hızlılık (2 saat içinde yapılabilir) Spesifiklik Sensitivite (ideal şartlarda muhafaza edilmeyen numuneler içinde kullanabilir) IC-ELISA, oküler ve nasal swap gibi saha örneklerinde PPR ve RPV enfeksiyonlarının rutin teşhisinde uygun bulunmuştur.

31 20 cdna Probları: PPRV ve RPV yi izole etmeden ve aynı zamanda iki virus arasındaki ayrımı sağlamak için, N proteini kodlayan genden hazırlanmış P 32 ile işaretlenmiş cdna probları teşhiste kullanılmıştır. M, F, P genlerine karşı cdna probları daha büyük ölçüde çapraz hibridizasyon için uygun bulunmuştur. Ancak ayırıcı problar olarak uygun değildir (Diallo ve ark., 1989a). Fakat bu hibridizasyon tekniği, P 32 nin yarı ömrünün kısa olması ve izotopların getirdiği sınırlamalar nedeniyle taze numuneler için yaygın olarak kullanılamamıştır. Dolayısıyla radyoaktif olmayan biotin ya da dioksin gibi maddelerle işaretlenmiş cdna problar geliştirilmiştir. Biotin ile işaretlenmiş cdna problar radyoaktif problardan daha spesifik olması ve PPR ile RP arasındaki ayırıcı tanı konusunda hızlı sonuç verebilmesi gibi avantajlarına rağmen, radyoaktif problar kadar duyarlı değildir (Pandey ve ark.,1992; Diallo ve ark., 1995) Nükleik asit Tespiti Morbillivirus enfeksiyonlarının teşhisinde, genellikle virus izolasyonu ve klasik seroloji teknikleri tanı laboratuvarlarına gönderilen materyallere uygulanmaktadır. Bununla birlikte, bu teknikler bozulmaya başlayan doku materyallerinin teşhisinde uygun bulunmamıştır. Polymerase Chain Reaction (PCR) yöntemi viral yükü az ve bozulmaya başlayan materyallerde teşhis olanağı sağlamasıyla, izolasyon ve seroloji tekniklerine üstünlük sağlamıştır. Bu üstünlük, Reverse Transcriptase PCR (RT- PCR) tekniğini moleküler biyolojide önemli bir teknik olarak gündeme getirmiştir. Dolayısıyla tanı laboratuvarlarında geniş bir kullanım olanağı bulmuştur. Konvansiyonel RT-PCR ve son zamanlarda geliştirilen quantitative real time RT- PCR (qrtrt PCR) ise, tanı materyallerinde morbillivirus enfeksiyonunun teşhisinde spesifik, hızlı ve enfeksiyonların ayrımını sağlaması açısından oldukça duyarlı bulunmuştur (Shaila ve ark., 1996; Grant ve ark., 2009). Real time RT-PCR tekniği, konvansiyonel RT-PCR dan 10 kez daha duyarlı sonuç vermesinin yanı sıra, testte kontaminasyon riskinin minimum seviyelere inmesi bakımından da oldukça avantajlıdır. Günümüzde bu amaçla kullanılan N ve M genini hedefleyen iki farklı rtrt-pcr tekniği geliştirilmiştir (Bao ve ark., 2008; Kwiatek ve ark., 2010 ve

32 21 Balamurugan ve ark., 2010). Özellikle N geninin tespitine dayalı çalışmalar, bu bölgenin rtrt-pcr da yüksek duyarlılıkta olduğunu göstermektedir (Couacy- Hymann ve ark., 2002; Geoarge, 2002). N geni, internal yapısal proteini kodlaması ve mrna oranının en fazla bulunduğu bölge olması nedeniyle PPRV enfeksiyonunun tanısında duyarlı bulunmuştur (Kerur ve ark., 2008) Seroloji PPRV enfeksiyonuna karşı oluşan spesifik antikorların tespitinde Virus Nötralizasyon (VN), AGID, CIEP, son zamanlarda ise blocking ve Competetive ELISA teknikleri kullanılmaktadır. Virus Nötralizasyon Testi (VNT): Virus nötralizasyon testi duyarlı ve spesifik olmasına rağmen, maliyetli ve zaman alıcıdır. Standart nötralizasyon testi primer kuzu böbrek ya da Vero hücre kültürleri kullanılarak yapılır. Morbilliviruslara karşı antikorların saptanmasında VNT en güvenilir testtir (Rossitter, 1994). Serumdaki PPR ve RP antikorlardan dolayı her iki virus da nötralize olabilir fakat homolog virus heterolog virusa göre daha yüksek titrede nötralize olur. Dolayısıyla, ayırıcı teşhis için çapraz nötralizasyon testi kullanılmaktadır (Taylor ve Abegunde, 1979). Antikor ELISA : C-ELISA ve blocking ELISA (b-elisa) tekniğinde, N proteini ve H proteinine karşı elde edilen spesifik MAb yardımıyla kan serumlarında antikor tespiti yapılmaktadır (Libeau ve ark.,1995; Saliki ve ark., 1993; Anderson ve McKay, 1994; Singh ve ark., 2004). N-proteini C-ELISA tekniğinde, serumdaki antikorlar ve MAb lar rekombinant baculovirusdan elde edilen N proteinin üzerindeki spesifik epitop için yarışmaktadırlar (Libeau ve ark., 1995). C-ELISA ve VNT karşılaştırıldığında, C-ELISA nın sensitivite oranı %94.5 iken, spesifitesi %99.4 olarak bulunmuştur. C-ELISA, spesifitesi ve sensitivitesi yüksek olduğundan PPR virusun serolojik teşhisi için en uygun metot olarak görülmektedir (Al-Moslih, M., 2012). Hem C-ELISA hem de b-elisa, H-proteinine karşı anti H MAb lar ile serum antikorları arasında yarışma esasına dayanmaktadır. Saliki ve ark.(1993)

33 22 blocking ELISA nın spesifitesini %98.9, sensitivitesini ise %90.4 olarak bildirmişlerdir. ELISA ve nötralizasyon testi karşılaştırıldığında ELISA nın spesifitesi %98.4, sensitivitesi ise %92.2 olarak belirlenmiştir (Singh ve ark., 2004). Ismail ve ark. (1995) sadece N proteinini kullanarak, çapraz test kullanmadan PPR antikorlarının tespit edilebileceğini bildirmişlerdir Koruma ve Kontrol PPRV enfeksiyonu için spesifik bir tedavi bulunmamaktadır. Ari ülkeler enfeksiyonun kontrolünde, enfekte alanlardan hayvan ithalatının sınırlandırılması, karantina, zorunlu kesim, karkasların uygun bir biçimde imha edilmesi, enfekte alanların dezenfeksiyonu gibi klasik kontrol metotlarını kullanarak başarıya ulaşmışlardır. PPR salgınlarının kontrolünde, özellikle yüksek risk taşıyan bölgelerde karantina tedbirlerinin yanı sıra, aşılama ve koruyucu immunizasyonun (hiperimmun serum uygulaması) birlikte yürütülmesi gereklidir. Özellikle kara sınırları uzun ve enfeksiyon potansiyeli yüksek komşuları bulunan ülkelerde, karantina tedbirleri çok önemlidir (Abubakar ve ark., 2011). Aşılama PPR enfeksiyonunun kontrolünde en temel yol olarak kabul edilir (Diallo, 2003). Yakın zamanlara kadar PPR enfeksiyonuna karşı immunizasyonda RP virusunun hücre kültürüne adapte edilmiş aşı suşu kullanılmıştır. PPR enfeksiyonuna karşı attenüe RPV aşısı ile koruma uzun zaman devam etmiştir. Araştırıcılar tarafından geliştirilen DKID 50 dozdaki attenüe RP doku kültürü aşısı, keçileri 12 ay boyunca PPRV enfeksiyonuna karşı korumaktadır (Taylor, 1979a; Abraham, 2005). Aşı koyun (Barber ve De Boer, 1965), gebe koyun, (Murty ve Sharma, 1974) ve keçilerde (Adu ve Nawath, 1981) güvenle kullanılmaktadır. Her ne kadar hayvanların virulent bir virus ile karşılaştıktan sonra, konjunktival swaplarında antijen tespit edilmişse de, virusu yaymadığı kabul edilmektedir (Gibbs ve ark., 1979; Taylor, 1979b; Bonniwell, 1980). Ancak virusun, fötal kuzu böbrek hücre kültürlerinde 32., 42. ve 65. pasajdan sonra bile virulens kazandığı bildirilmektedir (Taylor, 1979b). Bu aşı PPRV enfeksiyonunun kontrolünde Batı Afrika da yeralan birçok ülkede başarıyla kullanılmıştır (Lefevre ve Diallo, 1990). Küçük ruminantlarda seropozitifliğin, doğal enfeksiyondan mı yoksa aşıdan mı kaynaklandığını tespit etmek mümkün

34 23 olmadığından dolayı bu aşının kullanımı Pan-Afrika RP kampanyası (PARC) tarafından kaldırılmıştır. Bu nedenle küçük ruminantları PPRV enfeksiyonuna karşı korumak için homolog PPRV aşısı üretimine geçilmiş ve PPRV Nijerya 75/1 patojen suşunun Vero hücre kültürlerinde 63. pasajdan sonra attenüasyon işlemi tamamlanmıştır. Sahada kullanılan aşı 3 yıl süre ile çok iyi bağışıklık sağlamaktadır (Diallo ve ark., 1989b; Diallo ve ark., 1995; Durajoiye ve Lefevre, 1996). Homolog PPR aşısının saha denemelerinde oldukça güvenli olduğu, gebe hayvanlarda bile rahatlıkla kullanılabileceği ve %98 oranında bağışıklık sağladığı bildirilmektedir (Diallo ve ark., 1995). Homolog PPR aşısı ile RP virusuna karşı da sığırlarda oldukça etkili bir bağışıklık oluşmaktadır (Couacy-Hymann ve ark., 1995). Virus konak dışında dört gün kadar canlılığını sürdürebilmektedir. Enfeksiyonun kontrolünde dezenfeksiyon ve virusun çevre şartlarında hızlı inaktivasyonu önemlidir. Çeşitli dezenfektanlar kullanılarak virusun inaktivasyonu gerçekleştirilebilir. Bu dezenfektanlar alkaliler (sodyum karbonat, sodyum hidroksit), halojenler (sodyum hipoklorit), fenolik bileşikler, sitrik asit, alkoller ve iyodoforlar olarak sayılabilir (Gibbs ve ark.,1979; Scott, 1990) Enfeksiyonun İran daki Durumu İran, 1,648,000 km² lik yüzölçümü ile Türkiye nin komşuları arasında yüzölçümü Türkiye den büyük olan tek ülkedir. Ülkenin yüzölçümü kabaca İngiltere, Fransa, İspanya ve Almanya nın yüzölçümlerinin toplamlarına eşittir. İran, kuzeybatıda Azerbaycan ve Ermenistan, kuzeyde Hazar Denizi, kuzeydoğuda Türkmenistan, doğuda Pakistan ve Afganistan, batıda Türkiye ve Irak, güneyde ise Arap Körfezi ve Umman Körfezi ile çevrilmiştir (Şekil 1.6.).

35 24 Şekil 1.6. İran siyasi haritası ( 2008) İran daki keçi ve koyun populasyonu OIE nin 2010 yılı verilerine göre 77,637,000 olarak rapor edilmiştir. Keçi ve koyun yaygın olarak yetiştirilen ve kırsal ekonomide oldukça önemli rol oynayan hayvan türleri olup (Devendra and Mcleroy 1988; Peacock 2005) entansif ya da ekstansif üretim sisteminde beslenmektedirler (Kusiluka and Kambarage 1996). İran da PPRV enfeksiyonu üzerine yapılmış çalışmalar sınırlı sayıdadır. Hessami ve ark.(1994) İran da klinik semptom göstermeyen koyun ve keçi serumlarında PPR virusuna karşı %13 oranında seropozitiflik saptamışlardır. İlk kez 1995 yılında, Irak sınırına yakın İlam ilinde klinik, patolojik ve serolojik olarak PPRV enfeksiyonu salgını bildirilmiştir. Nouri ve ark. (1997) İran ın batısında koyun ve keçilerde bir RP salgınının olduğunu bildirmişlerdir. Daha sonra İran Veteriner Kurumu Referans Laboratuvarında PPR enfeksiyonu varlığı belirlenmiştir. Sonraki yıllar ( ), duyarlı hayvanların RPV aşısıyla aşılanması ve bazı kontrol tedbirlerine rağmen İran ın farklı illerinde değişen oranlarda PPRV enfeksiyonu varlığı tespit edilmiştir (Bazarghani ve ark., 2006). Abdoullahpour ve ark. (2006) İran da 2004 yılında oluşan salgında koyunlarda yüksek oranda ölüm görüldüğünü bildirmişlerdir. Esmailzade ve ark. (2009) PPRV F proteinine dayalı yapılan filogenetik analizde, İran da tespit edilen virusların IV. genetik hatta yer aldığını göstermişlerdir.

36 Tezin Amacı PPR klinik ve subklinik hastalıklar ile ağırlık kaybı, gelişmenin durması, süt ve et üretiminin azalması ve genç hayvanlarda ölümlere neden olması bakımından küçük ruminant üretimini sınırlayan önemli enfeksiyöz faktörlerden biridir (Sumberg ve Mack, 1985; Kusiluka and Kambarage 1996). Bugüne kadar PPRV enfeksiyonu ile ilgili olarak İran da yapılan çalışmaların sınırlı sayıda olduğu bilinmektedir. Özellikle yılları arasında artan oranda salgınlar bildirilmiştir (Hessami ve ark.,1994; Bazargani ve ark., 2006; Abdoullahpour ve ark., 2006). Enfeksiyonun kontrol ve eradikasyonu amacıyla etkili tedbirlerin alınmaması nedeniyle, enfeksiyonun yaygınlaşması ve enfeksiyona bağlı oluşan ekonomik kayıplar gün geçtikçe artmaktadır. Bu durum, Türkiye gibi ülkenin sınır komşularını da yakından ilgilendirmektedir. Bu çalışmada İran ın farklı illerinde yetiştirilen koyun ve keçilerde PPRV enfeksiyonun seroprevalansı ve enfeksiyonun moleküler epidemiyolojisine ilgili güncel verilere ulaşmak hedeflenmiştir. Ülkede son yıllarda sirküle eden saha viruslarının N geni düzeyinde RT-rtPCR ve konvansiyonel RT-PCR teknikleri kullanarak tespitinin ardından, dizin analizi ve filogenetik analiz ile değerlendirilmesi enfeksiyonun epidemiyolojisine ilgili önemli verilerin elde edilmesi açısından oldukça değerli olacaktır. Araştırmadan elde edilecek veriler, İran da PPR enfeksiyonunun epidemiyolojisine ilgili veriler olmakla birlikte, özellikle kontrolsüz hayvan hareketleri nedeniyle gelişebilecek olası enfekte hayvan girişlerine bağlı olarak Türkiye de enfeksiyonun epidemiyolojisinin izlenmesi ve kontrol çalışmaları için de önemli katkı sağlayacak niteliktedir.

37 26 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Gereç Örneklenen İşletmeler Bu araştırmada, yılları arasında İran ın farklı bölgelerinde bulunan, özellikle Türkiye ve diğer komşularına sınır olan 13 ilde yer alan halk elindeki işletmelerde barındırılan 6 ay yaşın üzerindeki koyun ve keçilerden serolojik ve virolojik kontrol amacıyla örnekleme yapıldı. Ayrıca, yine aynı zaman aralığında Shahrekord Üniversitesi Tanı Laboratuvarına PPRV enfeksiyonu şüphesi ile getirilen ancak örnekleme yerlerine ilişkin bilgileri kesin olmayan materyaller de tezde serolojik ve virolojik kontrol amacıyla kullanıldı (Şekil 2.1.). Sözkonusu işletmelerde PPRV enfeksiyonuna karşı aşılama yapılmadığı öğrenildi. Şekil 2.1. İran haritası üzerinde örnekleme yapılan iller (yeşil renk)

38 Serum Örnekleri PPRV spesifik antikor varlığını belirlemek amacıyla, 9 farklı ilde bulunan ve Shahrekord Üniversitesi Tanı laboratuvarına getirilen 444 koyun ve 58 keçiden alınan toplam 502 kan serum örneği C-ELISA ile test edildi (Çizelge 2.1.) ELISA Kitleri PPRV N-proteinine karşı spesifik antikorların tespiti amacıyla ticari olarak temin edilen PPR C-ELISA (ID Screen PPR Competition, Product code: PPRC, France) kiti kullanıldı Virolojik Çalışmada kullanılan Materyaller Bu amaçla, 12 farklı ilde bulunan ve Shahrekord Üniversitesi Tanı Laboratuvarına getirilen PPRV enfeksiyonu şüpheli 271 koyun ve 70 keçiden 296 adet antikoagulanlı kan, 5 nasal swap, enfeksiyon şüphesiyle kesilen veya ölen hayvanlardan 40 organ örneği (2 dalak, 2 akciğer, 2 böbrek, 34 lenf yumrusu) olmak üzere toplam 341 tanı materyali PPRV nükleik asit varlığı yönünden test edildi (Çizelge 2.1.).

39 28 Çizelge 2.1. Serolojik ve virolojik kontrol amacıyla alınan koyun ve keçi örneklerinin illere göre dağılımı Sıra İl Tür Tanı Materyalleri Lökosit Swap Organ Serum 1 Koyun: Ardabil Keçi: Koyun: Azarbayjan-e Gharbi Keçi: Koyun: Azarbayjan-e-Sharqi Keçi: Hormozgan Koyun: Keçi: Koyun: Isfahan Keçi: Fars Koyun: Keçi: Koyun: Khorasan Keçi: Kordestan Koyun: Keçi: Koyun: Mazandaran Keçi: Gilan Koyun: Keçi: Koyun: Shahrekord Keçi: Koyun: Tahran Keçi: Koyun: Sistan ve Baluchestan Keçi: Koyun: Lab Tanı Keçi: Genel Toplam Koyun: 472 Keçi: Shahrekord Üniversitesi tanı laboratuvarında bulunan ve örnekleme yerine ilişkin bilgileri kesin olmayan örnekler Virus RT-rtPCR, konvansiyonel RT-PCR ve kantitasyon amaçlı klonlamada pozitif kontrol virus olarak Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı virus koleksiyonunda bulunan PPR virusun Nijerya 75/1 attenüe aşı suşu kullanıldı.

40 RT-rtPCR, Klonlama ve Standart Oluşturma Çalışmada, RT- rtpcr yöntemiyle PPRV N genine dayalı nükleik asit tespiti, optimizasyonu, standart eğri oluşturulması ve klonlama amacıyla kullanılan ticari kitler ve cihazlar aşağıda sunuldu: Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase, Fermentas, Litvanya Picodrop Spektrofotometre, Picodrop, UK ClonJET TM PCR Cloning Kit, Fermentas, Litvanya DNA Ladder, bp, Fermentas, Litvanya Rotor-Gene Q 6000, Qiagen, Almanya RT-real time PCR da spesifik nükleik asit tespiti amacıyla Bao ve ark. (2008) tarafından bildirilen primer ve prob kullanıldı. Prob 5 ucunda FAM, 3 ucunda ise TAMRA boyaları ile işaretlenerek modifiye edildi (Çizelge 2.2.). Çizelge 2.2. RT-rtPCR da kullanılan primer ve prob Primer/ Prob Adı Primer 5 3 FAM-TAMRA Lokalizasyon (nt) Kaynak PPRV-NF (5 -CACAGCAGAGGAAGCCAAACT-3 ) PPRV-NP (FAM -5 -CTCGGAAATCGCCTCGCAGGCT -3 -TAMRA) Bao ve ark., 2008 PPRV-NR (5 -TGTTTTGTGCTGGAGGAAGGA-3 ) Konvansiyonel RT-PCR Çalışmada konvansiyonel RT-PCR yöntemi ile PPRV nükleik asit tespiti amacıyla ticari olarak temin edilen cdna sentezi kiti, Taq polimeraz enzimi, bp DNA ladder ve kullanılan cihazlar ile ilgili bilgiler aşağıda sunuldu: RevertAid First Strand cdna Synthesis Kiti, Fermentas, Litvanya Pfu Taq DNA Polymerase, Fermentas, Litvanya DNA Ladder, bp, Fermentas, Litvanya

41 30 Termal Cycler TC 3000, Techne, UK Termal Cycler TC 312, Techne, UK Jel Görüntüleme Sistemi 100, Kodak, Japonya Konvansiyonel RT-PCR tekniği ile PPRV nükleik asit tespitinde Kerur ve ark. (2008) N genine yönelik olarak bildirdikleri primer çiftleri kullanıldı. Primer dizinleri ve primerlere ait bilgiler Çizelge 2.3. de sunuldu. Çizelge 2.3. PPRV N genine dayalı RT-PCR da kullanılan primerler Primer Adı Dizin 5 3 Lokalizasyon PPRV-N1 GATGGTCAGAAGATCTGCA PPRV-N2 CTTGTCGTTGTAGACCTGA Ürün Büyüklüğü (bp) Kaynak 464 Kerur ve ark., (2008) Çizelge 2.2. ve Çizelge 2.3. de verilen N gen bölgesine spesifik prob ve primer çiftlerine (konvansiyonel RT-PCR ve RT-rtPCR) ilişkin dizinler aşağıda sunuldu. N genine yönelik konvansiyonel RT-PCR Forward ve Revers primerleri ile RT- rt PCR Forward ve Revers primerleri ile Prob yerleşimi: GATGGTCAGAAGATCTGCAGGAAAGGTCAGCTCTGTGATTGCGGCCGAGCTCGGCAT CACAGCAGAGGAAGCCAAACTAGTCTCGGAAATCGCCTCGCAGGCTGGGGACGAA AGAACCGCTAGAGGGACTGGGCCTCGACAGGCGCAGGTCTCCTTCCTCCAGCACAAA ACAGGAGAGGGAGAGTCGTCCGCACCAGCAACCAGAGAGGGGGTCAAAGCTGCGATCC CAAACGGATCCGAAGAAAGGGACAGGAAGCAAACACGCTCAGGAAGGCCCAGAGGAG AGACCCCCAGCCAACTGCTCCTGGAAATCATGCCAGAGGATGAGGTCTCGCGAGAGTCT GGTCAAAACCCTCGTGAGGCTCAAAGATCGGCCGAGGCACTCTTCAGGCTGCAGGCCAT GGCCAAGATTCTGGAGGACCAGGAGGAGGGAGAAGACAACAGTCAGGTCTACAACGA CAAG

42 Dizin Analizi ve Filogenetik Analiz Elde edilen saflaştırılmış DNA lar Dye Terminator Cycle Sequencing (Genomelab DTCS Quick Start Kit, Kat No: S Beckman Coulter, ABD) kiti kullanılarak dizin analizine alındı. Filogenetik analiz için ise MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis software) versiyon 5.0 (Tamura ve ark. 2011) programı kullanıldı Yöntem Serolojik Çalışma Kan Serum Örneklerinin Hazırlanması Serolojik çalışma amacıyla silikonlu tüplere (Venoject, VT-109SAS) alınan toplam 502 kan serum örneği pıhtılaştıktan sonra 2000 rpm de 10 dakika santrifüj (Soğutmalı santrifüj, Sigma, ABD) edilip, serumları ayrıldı; stok tüplerine aktarılan serumlar test edilinceye kadar -20 o C de korundu PPR C-ELISA PPRV N proteinine karşı gelişen spesifik antikorların tespiti amacıyla 502 kan serum örneği ticari C-ELISA kiti (ID Screen PPR Competition, ID.VET innovative diagnostics, France) ile test edildi. C-ELISA tekniği üretici firmanın belirttiği prosedüre uygun olarak gerçekleştirildi. Kısaca, her bir serum örneği, pozitif ve negatif kontroller tablet gözlerinde sulandırma sıvısı (dilution buffer) ile 1:2 oranında sulandırıldı ve 37 C de 45± 4 dakika inkubasyona bırakıldı. İnkubasyon sonrasında 1:20 oranında hazırlanmış olan yıkama solüsyonu ile tabletler 3 kere yıkandıktan sonra, 1:10 oranında hazırlanmış olan konjugattan tüm gözlere 100μl ilave edildi ve oda derecesinde 30±3 dakika

43 32 inkubasyona bırakıldı. İnkubasyon süresi sonunda yıkama işlemi tekrarlandı ve her göze 100μl substrat solüsyonu konuldu. Tabletler karanlık bir ortamda, oda ısısında 15 dakika inkube edildikten sonra, tüm tablet gözlerine 100μl durdurma solüsyonu konularak reaksiyon sonlandırıldı. ELISA tabletleri 450 nm dalga boyuna sahip filtrenin kullanıldığı ELISA okuyucusunda (Titertek, Finlandiya) değerlendirildi. Elde edilen absorbans değerleri, sözkonusu kitin protokolünde belirtilen şekilde değerlendirildi (Çizelge 2.4.). Çizelge 2.4. PPRV C-ELISA değerlendirme tablosu Sonuç Örnek / Negatif Kontrol %50 Durum Pozitif %50 < Örnek / Negatif Kontrol %60 Şüpheli Örnek / Negatif Kontrol > %60 Negatif Virolojik Çalışma Tanı Materyallerinin Hazırlanması Kan örneklerinin hazırlanması: Virolojik çalışma amacıyla ethylen diamine tetraacetic asit (EDTA) içeren vakumlu tüplere (Greiner, Bio-One, Almanya) alınan 296 kan örneği, 1800 rpm de 4 C de 15 dk. santrifüj edildi. Üsteki plazma atılarak periferal kan mononükleer hücre (PBMC) tabakasından 400μl, steril 1.5 ml lik eppendorf tüplere alınarak, geri kalan PBMC toplandı ve 1500 rpm de 5 dk. süreyle antibiyotikli PBS ile 3 defa yıkandı. Örnekler, moleküler çalışmalarda kullanılmak üzere -80 C de saklandı.

44 33 Doku ve swap örneklerinin hazırlanması: Bu amaçla alınan 40 doku örneği, U/ml Penisilin ve 20 mg/ml Streptomisin içeren PBS (Phosphate Buffer Saline) ile 1/10 oranında homojenizatörde homojen hale getirildikten sonra, 4 o C de, 3000 rpm de, 20 dakika santrifüj edildi ve süpernatant steril bir stok tüpüne alındı. PPR şüpheli hayvanlardan alınan 5 nasal swap örneği, vorteksde (karıştırıcı) karıştırıldıktan sonra, tüp içerisindeki sıvı steril tüplere alındı ve 4 o C de 3000 rpm de, 20 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonunda nükleik asit varlığını araştırmak için, 400µl alınarak RNAase bulunmayan steril 1,5ml lik tüpe aktarıldı. Geriye kalan miktar ise, steril tüpler içerisinde -80 o C de saklandı Viral RNA İzolasyonu PPR enfeksiyonundan şüpheli 341hayvandan alınan virolojik kontrol materyalinde PPRV nükleik asit varlığını araştırmak için RNA ekstraksiyonu Chomczynski ve Sacchi (1987) tarafından bildirilen yöntemle yapıldı. Buna göre buz içinde bulunan 1.5 ml lik mikrosantrifüj ependorf tüpüne, 400μl hazırlanan örneklerden (kan, doku ve swap) konuldu. Üzerine eşit hacimde (400μl) solüsyon D eklenerek saniye vortekslendikten sonra, tüpe sırasıyla 300μl asit fenol, 300μl kloroform-izoamilalkol 49:1 ve 100μl 3M sodyum asetat (PH 5.2) eklendi. Örnekler, saniye vortekslendikten sonra rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası supernatanttan 700μl alınarak, buz üzerindeki yeni mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı. Üzerine eşit hacimde -20 C de soğutulmuş izopropil alkol ilave edilerek vortekslendi. Nükleik asit presipitasyonu için karışım -80 C de 1 saat inkubasyona bırakıldı. Süre sonunda donmuş olan karışım oda ısısında eritildikten sonra, rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Mikrosantrifüj tüpünün sıvı kısmı aspire edildikten sonra çökmüş RNA peleti, %70 etanol (-20 C de soğutulmuş) ile yıkandı ve 37 C de kurutuldu. Kurutulan peletler 50μl deiyonize su (Applichem, Almanya) ile resüspanse edildikten sonra, moleküler çalışmalarda kullanılıncaya kadar -20 C de saklandı.

45 Viral RNA nın Ters Transkripsiyonu RT-rtPCR, konvansiyonelrt-pcr ve dizin analizi amacıyla kullanılacak olan viral RNA ların komplementer DNA ya (cdna) çevrilmesi gerçekleştirildi. Bu amaçla Revertaid First Strand cdna kiti (Fermentas, Litvanya) kullanıldı. Uygulamaya başlamadan önce tüm reaksiyon bileşenleri çözüldü ve vorteks ile karıştırılarak buz üzerine alındı. PCR tüpü içerisine 3µl steril deiyonize su, 0.5µl random hekzamer primer (0.2µg/ml) ve 3µl RNA konuldu. Karışım vorteksde karıştırıldı ve çok kısa bir süre santrifüj edildi. Tüpler ısı döngü cihazına yerleştirildi ve 70 C de 5 dakika inkubasyona bırakıldı. İnkubasyon sonunda, buz üzerine alınıp soğutulan örneklere kit içinde bulunan 2.0µl 5X reaksiyon buffer, 1 µl 10mM dntp mix ve 0.5µl M - MuLV (Moloney Murine Leukemie Virus) reverse transkriptazdan (200 U/ µl ) oluşan karışımdan 3.5µl eklendi. Ardından tüpler ısı döngü cihazına yerleştirilerek 25 C de 10 dakika, 37 C de 1 saat ve 70 C de 5 dakikadan oluşan program süresince inkubasyona bırakıldı. İnkubasyon sonunda elde edilen cdna lar, real time ve konvansiyonel PCR amplifikasyonları için başlangıç materyal olarak kullanıldı RT-real time PCR (RT-rtPCR) Moleküler tanı amacıyla alınan örneklerde PPRV RNA sını RT-rtPCR yöntemi ile ortaya koyabilmek amacıyla N gen bölgesine spesifik olarak sentezlenen primerprobun kontrolü için Bao ve ark. (2008) tarafından bildirilen yöntem modifiye edilerek kullanıldı. Kontrol virus olarak Nijerya 75/1 aşı suşu kullanılarak RTrtPCR reaksiyonu gerçekleştirildi. Pozitif ve negatif ayrımında araştırma kapsamında hazırlanan plazmid kontroller paralelinde yapılan değerlendirme sonucunda oluşan eşik çizgisi kullanıldı. Bu çizgi ile kesişmeyen örnekler negatif olarak değerlendirild. Çalışma kapsamında kantitasyon yapılmadı. Optimizasyon çalışmaları sonucunda, Çizelge 2.5. de belirtilen karışım bileşenleri ve programı kullanıldı. RT-rtPCR reaksiyonu sonucunda istenilen pozitiflik grafiği elde edildi (Şekil 2.2.).

46 35 Çizelge 2.5. Çalışmada kullanılan RT-rtPCR karışım bileşenleri ve programı Bileşen Konsantrasyon Kullanılan Program Hot Start Taq DNA polymerase (5u/ µl) Hot Start 10 X Taq buffer (tampon) MgCl 2 (25 mm) 10 mm dntp mix Primer- forward (10 pmol/µl) Primer- reverse (10 pmol/µl) 0,3 µl 2,5 µl 2,5 µl 0,5 µl 0,8 µl 0,8 µl 95 0 C de 8 dk 94 0 C de 15 s 40 siklus 60 0 C de 60 s Prob- Fam-Tamra (10 pmol/ µl) Deiyonize su cdna 0,4 µl 13,2 µl 4,0 µl Toplam 25 µl Amplifikasyon PK-Nijerya75/1 NK Positive Control Negative Control Şekil 2.2. Kontrol PPRV N gen bölgesine yönelik RT-rtPCR reaksiyonun amplifikasyon grafiği

47 Konvansiyonel RT-PCR RT-rtPCR da standart oluşturmak amacıyla yapılacak klonlama ve hedef gen ürününün eldesi ve RT-rtPCR da pozitif bulunan örneklere dizin analizi amacıyla konvansiyonel RT-PCR uygulandı. Dolayısıyla PCR ürün eldesi ve sentezlenen primerin N genine spesifikliğini belirlemek için Kerur ve ark. (2008) tarafından bildirilen yöntem modifiye edilerek kontrol virus (PPRV Nijerya 75/1) RT-PCR reaksiyonuna alındı. Yapılan optimizasyon çalışmaları sonucunda Çizelge 2.6. de belirtilen karışım bileşenleri ve ısı döngü cihazı programı PCR da kullanıldı. Çizelge 2.6. Konvansiyonel RT-PCR karışım bileşenleri ve programı Bileşen Konsantrasyon Kullanılan Program Taq DNA polymerase (5u/ µl) 10 X Taq buffer (tampon) MgCl 2 (25 mm) 10 mm dntp mix 0,25 µl 3,0 µl 2,4 µl 0,5 µl 95 0 C de 5 dk 94 0 C de 1 dk Primer- forward (10 pmol/µl) 0,5 µl 50 0 C de 1 dk 35 siklus Primer- reverse (10 pmol/µl) Deiyonize su cdna 0,5 µl 19,85 µl 3,0 µl 72 0 C de 1,5 dk 72 0 C de 10 dk Toplam 30 µl PCR Ürünlerinin Agaroz Jel Elektroforezi: Amplikonların jelde görüntülenmesi amacıyla, %1 lik agaroz (Prona, EU) 0,5X Tris Asetat - Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (TAE) solusyonu içerisinde çözüldü ve ısı yardımıyla eritildi. Uygun sıcaklık değerine gelmesinden sonra üzerine 0,5µg/ml konsantrasyonundaki ethidium bromide (Sigma, ABD) ilave edilerek jel taşıyıcısına döküldü. Yaklaşık 20 dakika sonra soğuyan agarozdaki taraklar çıkarılıp, jel taşıyıcısı elektroforez tankına yerleştirildi. PCR ürünleri 6X yükleme boyası (6x Loading Dye, Fermentas, Litvanya) ile kuyucuklara yüklendi. Spesifik ürünün belirlenmesi için 1µl 100 bp lik DNA merdiveni (Fermentas, Litvanya) de yanısıra bir kuyucuğa yüklendi. 0,5 TAE

48 37 solusyonu içerisindeki jele 30 m Amp elektrik akımı, 20 dakika uygulanarak DNA göçü sağlandı ve jel görüntüleme sistemi (Kodak, Gel Logic 100, ABD) kullanılarak PCR sonucu oluşan bantlar (464 bp) görüntülendi PPRV Kantitasyonu Amacıyla PCR ürününün Klonlanması ve Standart Oluşturma Hedef Genin Amplifikasyonu: Real time RT-PCR reaksiyonu ile sahadan gelen PPRV şüpheli hayvan örneklerinin incelenmesinde standart oluşturulması amacıyla klonlama gereklidir. Bunun için PPRV/Nijerya75/1 aşı suşundan RNA izolasyonu gerçekleştirildikten sonra bölüm de anlatıldığı şekilde cdna sentezlendi. Bunu takiben N genine ait primerler kullanılarak (Çizelge 2.2. ve Çizelge 2.3.) konvansiyonel PCR ile amplikon elde edildi. PCR ile Çoğaltılan Bölgenin pjet 1.2/blunt Vektörüne Klonlanması: PCR sonucu elde edilen ürün, pjet vektörüne kit kullanım klavuzu takip edilerek yerleştirildi. Bu amaçla ilk olarak elde edilen PCR ürünü %1 lik agaroz jele yüklendikten sonra görüntülendi (464bp). PCR ürünü ticari pürifikasyon kiti (High Pure Cleanup Kit, Roche, Almanya) kullanılarak firma tarafından önerilen prosedüre uygun saflaştırıldı. Elde edilen DNA tekrar jelde yürütüldü ve klonlama aşamasına kadar 20 C de saklandı. Klonlama işlemi için daha sonra CloneJET PCR Cloning Kiti (Fermentas, Litvanya) kullanıldı. Bu amaçla 5µl 2X ligation buffer, 1µl (50 ng) pjet 1.2/blunt vectör, 1µl T4 DNA ligase ve 3µl PCR ürünü total 10 µl hacimde hazırlanıp, oda derecesinde 5 dakika inkübasyona bırakıldı. Transformasyon: Tranformasyon işlemi için hazırlanan ligasyon karışımından 2µl alınarak, 50µl JM 109 Competent E.coli hücreleri üzerine eklendi ve karıştırıldı. Buz üzerinde 20 dakika bekletilen karışım daha sonra ısı şoku için 42 C de saniye bekletildi ve tekrar buz üzerinde iki dakika daha bekletildi. Süre sonunda oda ısısına getirilmiş Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) medyumdan 950µl eklenerek 37 C de 1.5 saat 150 rpm de inkübasyona bırakıldı. Daha yüksek

49 38 koloni oranını elde etmek için kitin önerdiği 1000 g de 10 dakika santrifüj işlemi yapılarak, 200µl SOC ile pelet pipete edildi, ampicilin içeren agarlara yayıldı ve 37 C de bir gece inkübasyona bırakıldı. Plazmid İzolasyonu ve Klonların Analizi: Bir gece sonunda pleytte tespit edilen koloniler ampicilin içeren 2ml sıvı Lysogeny Broth (LB) besiyerine aktarıldı ve 37 C de bir gece 150 rpm de çalkamalı süretiyle inkubasyona bırakıldı. Onaltı saat üremeye bırakılan bakterilerden Plazmid DNA purification (Fermentas, Litvanya) kiti kullanılarak, firmanın önerdiği prosedür kullanarak plazmid DNA sı elde edildi. Plazmid DNA nın Jelde Görüntülenmesi: Agaroz jel 0,5X TAE içinde ve % 1 konsantrasyonda hazırlandı ve yürütme tankına yerleştirildi. Plazmid DNA sından 5µl hacimde alındı ve 1µl 6X yükleme boyası ile karıştırılarak kuyucuklara yüklendi. Jel 90V da 25 dakika yürütüldükten sonra UV ışık altında plazmid DNA görüntülendi. Plazmid DNA nın Restriksiyon Endonükleaz Enzim ile Kontrolü: Elde edilen plazmid DNA da klonlamanın gerçekleşip gerçekleşmediği restriksiyon endonükleaz enzimleriyle çift kesim yapılarak kontrol edildi. Buna göre 1µl BglII enzimi (Fermentas, Litvanya), 7µl 1X FastDigest Buffer, 2µl plazmid DNA reaksiyona sokuldu ve 20 dakika 37 C de inkubasyon sonrası %1 lik agaroz jelde görüntülenerek kontrol edildi. Plazmid DNA Miktarının Hesaplanması: Elde edilen plazmid DNA sı, Picodrop Spektrofotometre (Picodrop, BK) kullanılarak ölçüldü ve kopya sayısı hesaplandı (Salvi, 2008). Bu amaçla standart DNA moleküllerinin kopya sayısı için Plazmid kopya/µl = C NA/ MW 10 9 formülü kullanıldı. Bu formülde; C, spektrofotometre ile ölçülen konsantrasyon (ng/µl), NA Avogadro sayısı (6, ); MW, standart plazmidin moleküler ağırlığı; 10 9, nanomolden mole çevrim faktörü olarak tanımlanmıştır.

50 39 PPRV N Geni İçeren Plazmid DNA nın Real Time PCR da Standart Oluşturması: Elde edilen plazmid kopya sayısının kantitasyon amacıyla standart eğri oluşturabilmesi için, log 10 tabanına göre 7 basamaklı dilüsyonları yapılarak negatif kontroller ile birlikte Çizelge 2.5. de belirtilen karışım bileşenleri ve programı (Rotor-Gene Q 6000, Qiagen, Almanya) kullanılarak two step rtrt-pcr reaksiyona alındı Konvansiyonel RT-PCR Ürünlerinin Saflaştırılması PPRV nükleik asiti yönünden konvansiyonel PCR da pozitif olarak tespit edilen amplikonlar, jel görüntülerini değerlendirebilmek için, 50µl PCR ürünü ve 10µl 6 yükleme boyası olacak şekilde karıştırılıp %1 lik jelde bulunan kuyucuklara 100 bp lik DNA merdiveni rehberliğinde yüklendi. DNA göçü sonrasında görüntülenen 464 bp lik DNA bantları steril bir bistüri yardımıyla jelden kesilerek ayrıldı ve 1,5 ml lik ependorf tüplerine konuldu. Elde edilen jel parçaları ticari bir pürifikasyon kiti (High Pure PCR Clean/extraction kit, Roche, Almanya) ile üretici firmanın önerdiği yöntem kullanılarak saflaştırıldı. Elde edilen saflaştırılmış DNA lar, dizin analizinde kullanılmak üzere - 20 C de saklandı Dizin Analizi Saflaştırılmış DNA lar Dye Terminator Cycle Sequencing (Genomelab DTCS Quick Start Kit, Kat No: S Beckman Coulter, ABD) kiti kullanılarak (Çizelge 2.7. ) dizin analizine alındı. Boyalı nükleotidlerle işaretleme işlemi Çizelge 2.7. de gösterilen reaksiyon karışımı ve ısı döngülerinde gerçekleştirildi. Isı döngü programı sonucunda elde edilen DNA lar absolut ve %70 konsantrasyonda hazırlanmış etanol solusyonlarıyla yıkama işlemine tabi tutuldu. Bu işlemin ardından DNA lar etanolün uzaklaştırılması ve kuruması için karanlık bir ortamda bir gece bırakıldı. Ertesi gün işaretli ürünler kapillar elektroforetik separasyon için Beckman Coulter CEQ 8000 Genetik Analiz cihazına (Beckman, ABD) yerleştirildi. Elde

51 40 edilen veriler, üretici firma (Beckman- Coulter) tarafından sağlanan program ile değerlendirildi. Çizelge 2.7. Dye Termination Cycle Sequencing (DTCS) kit karışımı DTCS Kit Karışımı Bileşen Miktar (µl) 10X Reaksiyon Tamponu 2 dntp Karışımı 1 ddutp 2 ddgtp 1 ddctp 2 ddatp 2 DNA Polimeraz Enzimi 1 Toplam Hacim 11 Çizelge 2.8. DNA dizin analizi reaksiyon bileşenleri ve programı DNA Dizi Analizi Reaksiyon Karışımı Program ve Döngü Sayısı Bileşen Miktar (µl ) 96 C de 6 dk DNA 4 96 C de 20 sn Primer (Forward veya Reverse) 1 50 C de 20 sn 30 Siklus DTCS 4 60 C de 4 dk Sulandırıcı 1 4 C de 10 dk Toplam 10

52 Dizin Analizi Sonuçlarının Değerlendirilmesi ve Filogenetik Analiz Analiz sonrası elde edilen ham veriler, National Center Biotechnology Information (NCBI) servisinin Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) web sayfasında yer alan (BankIt: GenBank Submissions) programdan yararlanılarak analiz edildi. Dizinler Bioedit (Version ) (Hall, 1999) ve Clustral W yazılımı kullanılarak kendi aralarında karşılaştırıldı. Bu çalışmada elde edilen dizinler, aynı programın çoklu hizalama (multiple alignment) özelliğinden yararlanılarak, Gen Bankasından elde edilen referans viruslar ve diğer ülke suşları ile karşılaştırıldı. Filogenetik analizler, aşı suşları ve sirkülasyondaki diğer PPRV ülke suşları ile bu çalışmada elde edilen dizinler arasındaki genetik yakınlığın ortaya konulması amacıyla nükleik asit dizinleri baz alınarak yapıldı. Filogenetik analiz için ise MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis software) versiyon 5.0 (Tamura ve ark. 2011) programı kullanıldı. Bu amaçla fasta formatına çevrilen tüm verilere (gerek bu araştırmadan elde edilen ve gerekse Gen Bankasından sağlanan PPRV N geni dizinlerine) Neighbour-Joining metoduna göre bootstrap analizi (500 replikasyon ve 111 tesadüfi eşleme) yapıldı. Analizde Kiamura nın 2 li parametresi kullanıldı ve bootstrap değerleri filogenetik harita üzerinde gösterildi.

53 42 3. BULGULAR 3.1. Serolojik Çalışma Sonuçları PPRV spesifik antikor tespiti amacıyla yapılan C-ELISA sonucunda, PPRV enfeksiyonu için seropozitiflik oranı koyunlarda %53.60 (238/444), keçilerde ise %51.70 (30/58) olarak belirlendi. Çalışmaya dahil edilen tüm hayvanlar göz önüne alındığında seropozitiflik oranı % 53,38 (268/502) olarak tespit edildi. Kontrol edilen illerden birisi (Gilan) hariç hepsi PPRV antikorları yönünden pozitif olarak değerlendirildi. İllere göre pozitiflik oranlarının ise %12.5- %96.29 arasında değişim gösterdiği saptandı (Çizelge 3.1.). Çizelge 3.1. İllere göre PPRV enfeksiyonunun seroprevalansı İL Adı Tür Serum C-ELISA Pozitif Prevalans(%) Ardabil Koyun ,36 Keçi 4 4 Azarbayjan-e Gharbi Koyun ,5 Keçi 0 0 Azarbayjan-e-Sharqi Koyun ,33 Keçi 0 0 Hormozgan Koyun Keçi 0 0 Esfahan Koyun ,42 Keçi 4 0 Fars Koyun ,90 Keçi 10 9 Kordestan Koyun Keçi 8 7 Gilan Koyun Keçi 3 0 Shahrekord Koyun ,29 Keçi 8 6 Tanı Lab.* Koyun ,93 Keçi 21 4 Tür Toplam Koyun ,60 Keçi ,7 Genel Toplam Koyun+Keçi ,38 * Shahrekord Üniversitesi tanı laboratuvarında bulunan ve örnekleme yerine ilişkin bilgileri kesin olmayan örnekler

54 Virolojik Çalışma Sonuçları RT-Real Time PCR Klonlama ve Standart Oluşturma PPRV kantitasyonu amacıyla PCR ürününün klonlanması ve standart oluşturma çalışmaları sonucunda istenilen veriler ve grafikler Çizelge 3.2., Şekil 3.1. ve Şekil 3.2. de gösterildi.

55 44 Kantitatif Data (Amplifikasyon) Şekil 3.1. PPRV N geni içeren plazmid DNA nın logaritma 10 tabanına göre sulandırmalarının rtpcr da amplifikasyon görüntüsü Çizelge 3.2. PPRV N geni içeren plazmid DNA nın logaritma 10 tabanına göre sulandırmalarının rtpcr da hesaplanan eşik değerleri ve kopya sayıları No. Colour Name Type Ct Given Conc (Copies) Calc Conc (Copies) % Var Standard 12,49 6,00E+08 4,68E+08 22,0% Standard 15,41 6,00E+07 6,12E+07 1,9% Standard 18,45 6,00E+06 7,38E+06 23,0% Standard 21,91 6,00E+05 6,61E+05 10,1% Standard 25,23 6,00E+04 6,52E+04 8,7% Standard 28,49 6,00E+03 6,71E+03 11,8% Standard 32,34 6,00E+02 4,59E+02 23,6% 8 NC No Template Control

56 45 Standard Eğri Şekil 3.2. PPRV N geni içeren plazmid DNA nın logaritma 10 tabanına göre sulandırmalarının rtpcr sonucunda oluşturduğu standart eğri RT-rtPCR PPRV nükleik asiti tespiti amacıyla RT-rtPCR reaksiyonuna alınan 296 kan örneğinin %31,08 (92/296), 5 nazal swap örneğinden %40 (2/5) ve 40 doku örneğinden %20 (8/40) si olmak üzere toplam 102 hayvana ait örneğin içerdiği cdna molekülü kopya sayısı kantitatif standart kopya sayısına paralel olarak, PPRV N proteini kodlayan gen bölgesi yönünden pozitif bulundu (Çizelge 3.3.). Kontrol edilen tüm örnekler için, PPRV nükleik asiti yönünden pozitiflik oranı %29.91 (102/341) olarak belirlendi. Şekil 3.3. RT-rtPCR a alınan saha örneklerin eşik değerlerinin belirlenmesi

57 46 Standard Eğri Standard Örnek Şekil 3.4. RT-rtPCR a alınan saha örneklerinin standart eğri üzerinde yerleşimi Konvansiyonel RT-PCR RT-rtPCR da pozitif olduğu belirlenen toplam 102 (92 kan, 2 swap, 8 doku) saha materyalinin, N geninin tespitine dayalı konvansiyonel RT-PCR spesifik primerler ile kontrolü sonucunda kan örneklerinde %21.73 (20/92), swap örneklerinde %100 (2/2) ve doku örneklerinde %50 (4/8) oranında pozitiflik tespit edildi (Çizelge 3.3.). Konvansiyonel RT-PCR a alınan tüm örneklerde PPRV pozitiflik oranı %25.50 (26/102) olarak belirlendi. Elde edilen amplikonlara ait agaroz jel görüntüleri Şekil 3.5. de gösterildi.

58 47 Şekil 3.5. RT-PCR a alınan saha örneklerinin agaroz jel görüntüleri (M: DNA ladder 100bp, 1, 2, 3: pozitif saha örnekleri, 4: negatif kontrol, 5: pozitif kontrol) Çizelge 3.3. PPRV RT-rtPCR ve konvansiyonel RT-PCR da pozitif bulunan örneklere ilişkin bilgiler İl Tür Tanı Materyalleri RT-rtPCR RT-PCR Lökosit Swap Organ Pozitif Pozitif Ardabil Koyun Keçi Azarbayjan-e Koyun Gharbi Keçi Azarbayjan-e- Koyun Sharqi Keçi Esfahan Koyun Keçi Fars Koyun Keçi Khorasan Koyun Keçi Kordestan Koyun Keçi Mazandaran Koyun Keçi Gilan Koyun Keçi Shahrekord Koyun Keçi Tahran Koyun Keçi Sistan ve Baluchestan Koyun Keçi Tanı Lab.* Koyun Keçi Toplam * Shahrekord Üniversitesi tanı laboratuvarında bulunan ve örnekleme yerine ilişkin bilgileri kesin olmayan örnekler

59 Dizin Analizi ve Filogenetik Analiz Dizin analizi amacıyla yine N gen bölgesi hedef alınarak yapılan konvansiyonel RT- PCR sonucunda kuvvetli pozitiflik tespit edilen 16 hayvana ait örneğin (12 kan, 1 swap, 3 organ) dizin analizi gerçekleştirildi. Dizin analizi yapılan her bir örnek için Gen Bankasına kayıt yapılarak kabul numarası (JX ) alındı. Bu örneklere ilişkin bilgiler Çizelge 3.4. de sunuldu. Sözkonusu örneklerin N gen kısmi dizinlerinin ham dataları, BLAST programında kontrol edilip, Gen Bankasında yer alan diğer PPRV dizinleri ile eşleştiği görüldükten sonra, N genine dayalı hem kendi aralarında, hem de dünyadaki diğer PPR virusları ile nükleotid düzeyinde karşılaştırılarak aralarındaki benzerlik/farklılık oranları Şekil 3.6., Şekil 3.7. ve Çizelge 3.5. de gösterildi. Bu çalışmada elde edilen 2011 yılına ait PPRV kısmi N gen dizinleri kendi aralarında %96,8-100 oranında benzer bulunurken, 1998 yılında tespit edilen PPRV suşu (DQ840185) ile %95,2-95,6 oranında benzer olduğu görüldü. Bu çalışmada tespit edilen virusların Gen Bankasında yeralan yıllarında Türkiye de saptanan PPR virusları ile genetik yakınlık düzeyi ise %96,4-100 olarak belirlendi. Halen İran da enfeksiyonun kontrolü amacıyla kullanılan aşıda yeralan aşı suşu Nigeria 75/1 (HQ197753) dizini ile yapılan karşılaştırma sonucunda ise, %88,2-89 oranında nükleotid benzerliği tespit edildi.

60 49 Çizelge 3.4. Dizin analizi gerçekleştirilen örneklere ilgili veriler Dizin/kod İL Tür Materyal Accesion No IR/TBZ1/10 Azarbayjan-e Sharghi Koyun Lökosit JX IR/TBZ2/10 Azarbayjan-e Sharghi Koyun Lökosit JX IR/TBZ51/10 Azarbayjan-e Sharghi Koyun Lökosit JX IR/TBZ54/10 Azarbayjan-e Sharghi Koyun Lökosit JX IR/TBZ58/10 Azarbayjan-e Sharghi Koyun Lökosit JX IR/TBZ59/10 Azarbayjan-e Sharghi Koyun Lökosit JX IR/TBZ64/10 Azarbayjan-e Sharghi Koyun Lökosit JX IR/TBZ65/10 Azarbayjan-e Sharghi Koyun Lökosit JX IR/TBZ66/10 Azarbayjan-e Sharghi Koyun Lökosit JX IR/TBZ83/10 Azarbayjan-e Sharghi Koyun Lökosit JX IR/TBZ89/10 Azarbayjan-e Sharghi Koyun Lökosit JX IR/URM329/11 Azarbayjan-e Gharbi Koyun Lökosit JX IR/URM332/11 Azarbayjan-e Gharbi Koyun Nasal Swap JX IR/URM333/11 Azarbayjan-e Gharbi Koyun Akciğer JX IR/ZHN336/11 Zahedan Keçi Lenf Yumrusu JX IR/MSHD339/11 Khorasan Keçi Lenf Yumrusu JX898848

61 Şekil 3.6. PPRV N geni kısmi dizinlerinin kendi aralarında ve Gen Bankasında verileri bulunan dizinler ile nükleotid düzeyinde karşılaştırılması 50

62 Şekil 3.6. nın devamı 51

63 52 Çizelge 3.5. PPRV N geni dizinlerinin kendi aralarında ve diğer PPRV dizinleri ile nükleotid benzerlik-farklılık oranları

64 53 Bu çalışmada elde edilen N gen kısmi dizinlerinin kendi aralarında aminoasit bazında yapılan karşılaştırmalar sonucunda, herhangi bir amino asitte değişim saptanmadı; Turkey 2000 tam gen dizini ile yapılan karşılaştırmada üç örnek hariç (IR/TBZ89/10, IR/URM332/11, IR/URM333/11) 13 adet örnekte nt. deki A G değişimin bir amino asit (K R) değişimine neden olduğu saptandı. Nigeria 75/1 aşı suşu dizini ile amino asit düzeyinde yapılan hizalama sonucunda 19 adet amino asit değişimi olduğu tespit edildi (Şekil 3.7.).

65 54 Şekil 3.7. PPRV N geni kısmi dizinlerinin amino asit düzeyinde hizalanması Bu çalışmada N proteini kodlayan gene ait tespit edilen yaklaşık 80 amino asit uzunluğundaki bölgenin ikincil yapısı değerlendirildiğinde, Iran ve Türkiye den 2010 yılı itibariyle izole edilen viruslar arasında bariz yapı farklılıkları tespit edildi. Bu alfa-helix ve beta-yaprak yapılarındaki bu farklar Iran orijinli PPRV suşları için Urmiye de tespit edilen 2 virus (IR-URM ve IR-URM333-11) dışındaki tüm PPR virusları için benzer kalıplarda olduğu gösterildi. Türkiye de tespit edilen viruslar, yerel aşı suşu olarak kullanılan Nigeria75/1 ile N proteini açısından yüksek oranda benzerlik gösterirken, Iran PPRV suşlarının analiz edilebilen N proteinine ait yaklaşık 80 amino asittin 20 tanesinin aşı suşuna göre farklı oldukları saptandı (Şekil 3.8.).

66 55 Şekil 3.8. PPRV N geni kısmi dizinlerinin kendi aralarında ve Gen Bankasındaki diğer PPRV dizinler ile ikincil yapı incelenmesi Bu çalışmada elde edilen PPRV N geni kısmi dizinleri ve Gen Bankasında verileri bulunan diğer PPRV dizinleri kullanılarak, Maksimum - Likelihood (ML) ve Neighbour-Joining (NJ) metodu ile çizilen filogeneti ağaçta söz konusu viruslara ait dizinlerin kendi aralarında uyumlu olarak aynı kökten (IV. genetik hattı) orijin aldığı görüldü. Batı Azerbaycan dan elde edilen iki virusa ait dizinlerin (IR-URM332-11, IR-URM333-1) aynı dalda olmasına karşın Türkiye de 2010 yılı itibariyle tespit edilen viruslara ait dizinler ile daha yakın olduğu gözlendi. Diğer illerden elde edilen virusların ise İran da 1998 yılında, Türkiye de 2000 yılında ve Irak da 2011 yılında tespit edilen viruslara ait dizinler ile yakınlık gösterdiği belirlendi. Tez süresince de