TÜRKĐYE CUMHURĐYETĐ ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ

Transkript

1 TÜRKĐYE CUMHURĐYETĐ ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ LANTHANUM UN HÜCRE ĐÇĐ KALSĐYUM YANITINI ĐNHĐBE EDĐCĐ ÖZELLĐĞĐNĐN, KALSĐYUM SĐNYAL MEKANĐZMASI ÜZERĐNDEKĐ ETKĐSĐNĐN FARKLI HÜCRE TĐPLERĐNDE ĐNCELENMESĐ Ekin Özge SÜZGÜN BĐYOFĐZĐK ANABĐLĐM DALI YÜKSEK LĐSANS TEZĐ DANIŞMAN Prof. Dr. Mehmet UĞUR 28-ANKARA

2 TÜRKĐYE CUMHURĐYETĐ ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ LANTHANUM UN HÜCRE ĐÇĐ KALSĐYUM YANITINI ĐNHĐBE EDĐCĐ ÖZELLĐĞĐNĐN, KALSĐYUM SĐNYAL MEKANĐZMASI ÜZERĐNDEKĐ ETKĐSĐNĐN FARKLI HÜCRE TĐPLERĐNDE ĐNCELENMESĐ Ekin Özge SÜZGÜN BĐYOFĐZĐK ANABĐLĐM DALI YÜKSEK LĐSANS TEZĐ DANIŞMAN Prof. Dr. Mehmet UĞUR 28-ANKARA

3 ii Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Biyofizik Yüksek Lisans Programı çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma, aşağıdaki jüri tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir. Tez Savunma Tarihi: / 4 / 28 Prof. Dr. Belma TURAN Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Jüri Başkanı Prof. Dr. Nuhan PURALI Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Prof. Dr. Hakan GÜRDAL Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Prof. Dr. Mehmet UĞUR Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Doç. Dr. Aslıhan KÖKSOY Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi

4 iii ĐÇĐNDEKĐLER Kabul ve Onay Đçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller. GĐRĐŞ.. G Proteini Kenetli Reseptörler Aracılığı Đle Oluşan Hücre içi Kalsiyum Sinyali... Kalsiyum Sinyali ve Önemi..2. G Protein Kenetli Reseptörler ve Heterotrimerik G Proteinleri..3. PLC ve Đnositol,4,5-trisfosfat (IP 3 )..4. IP 3 Reseptörleri ve ER Üzerinden Ca 2+ Salımı..5. Kuantal Ca 2+ Salımı.2. Lanthanum un Ca 2+ Sinyali Üzerindeki Etkisi ve Çalışmanın Amacı 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.. Kültür Hücrelerinin Büyütülmesi 2.2. Geçici ve Kalıcı Transfeksiyon Plazmidin Oluşturulması Geçici Transfeksiyon Kalıcı Transfeksiyon 2.3. RT-PCR ve Jel Elektroforezi 2.4. Hücrelerin Fluo-3 Asetoksimetil Ester ile Yüklenmesi 2.5. Hücre Đçi Ca 2+ Derişiminin Ölçülmesi 2.6. Hücre Đçi IP 3 Derişiminin Ölçülmesi 3. BULGULAR 3.. RAT- αb Hücrelerinde PE Yanıtlarının La 3+ ile Blokajı 3.2. HEK-293 hücrelerindeki Endojen M3 Reseptörlerinin La 3+ ile Etkileşmesi ii iii v vi vii

5 iv 3.3. LTK-8 Hücrelerine Kalıcı Transfekte Edilen M 3 Reseptörüne La 3+ un Etkisi 3.4. RAT- αb Hücrelerine Kalıcı Transfekde Edilen M 3 Reseptörüne La 3+ un Etkisi 4. TARTIŞMA 5. SONUÇ VE ÖNERĐLER ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR ÖZGEÇMĐŞ

6 v ÖNSÖZ Tez çalışmamın her aşamasında bana yardımları ve destekleri için Ankara Üniversitesi, Tıp Fakültesi Biyofizik Ab.D. Öğretim Üyeleri ve Öğrencilerine, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Moleküler Biyoloji ve Teknolojileri AR-GE Birimine ve Sevgili Aileme teşekkürlerimi sunarım.

7 vi SĐMGELER ve KISALTMALAR ACh ATP DAG ER FCS GDP GPCR GTP IP 3 PE PIP 2 PKC PLC PMCA RYR ROI SERCA [Ca 2+ ] i 7-TM Asetilkolin Adenozin trifosfat Diaçilgliserol Endoplazmik Retikulum Fetal Kalf Serum Guanozin difosfat G-Protein Kenetli Reseptörler Guanozin trifosfat Đnositol,4,5-trisfosfat Fenilefrin Fosfatidilinositol 4,5-bifosfat Protein Kinaz C Fosfolipaz C Plazma Membran Ca 2+ ATPaz Ryanodin Reseptörü Region of Interest (Ölçüm için işaretlenen bölgeler) Sarkoplazmik-Endoplazmik Retikulum Ca 2+ ATPaz Sitoplazmik Ca 2+ konsantrasyonu 7-Trans Membran

8 vii ŞEKĐLLER Şekil.. Hücrede depo boşalması ile aktive olan kanalların çalışması ile ilgili hipotezler. A) CIF: Suda çözülebilir bu molekül etkisiyle depo boşalmasının ardından kanallar aktive olur. B) Ekzositoz: Depolar boşalınca kanallar ekzositoz ile plazma membranına geçer. C) Ca 2+ Düzenlemesi: Depoların boşalması ile azalan Ca 2+ sızıntısı, membrandaki kanalların aktive olmasına sebep olur. D) Konformasyonel Çiftlenim: Sinyal yolağının harekete geçmesi, bu yolakta yer alan proteinlerde konformasyonel değişikliğe neden olur. Bu değişiklikler, yeni protein-protein ilişkileri oluşmasına sebep olur. Bu protein-protein ilişkileri, hücre membranındaki Ca 2+ kanallarını aktive eder. Şekil.2. GPCR aracılı Ca 2+ sinyali. GPCR e agonist bağlandığı zaman, hücre membranının sitoplazmik tarafındaki heterotrimerik G proteininin α altünitesinde GTP/GDP değiştokuşu olur. Bu değiştokuşla aktive olan α altünitesi PLCβ yı aktive eder. PLCβ, PIP 2 yi IP 3 ve DAG e parçalar. IP 3, IP 3 R lerden Ca 2+ salımını sağlar. Salınan Ca 2+, SERCA ve PMCA tarafından sitozolden uzaklaştırılır. Deponun boşalmasıyla aktive olan TRP kanalları da hücre dışı sıvıdan hücre içerisine Ca 2+ girişi sağlayarak hücredeki Ca 2+ homeostazına katkıda bulunur. Şekil 2.. Plazmid oluşturma. Yetiştirilen her üç bakteri kolonisinde de M 3 taşıyan plazmid olduğu, mini-prep yapılan plazmidin restriksiyon enzimleri ile kesilmesiyle gösterildi. Şekil 2.2. M 3 reseptörünün plazmide düz girdiğinin gösterilmesi. Plazmid, BssHI enzimi ile, M 3 geninin hem içinden, hem dışından kesildikten sonra, jelde yürütüldü. Her üç kolonide de M 3 geninin doğru yerden kesildiği, dolayısı ile plazmide doğru girdiği görüldü. Şekil 2.3. Leica TCS-SP5 konfokal mikroskop. Bu mikroskop tarama başlığı, DMI serisi bir floresan mikroskop, lazer ünitesi, bilgisayar ve elektronik ara bağlantı parçalarından oluşmaktadır. Şekil 2.4. Konfokal Mikroskobun Çalışma Prensibi. Konfokal mikroskobu diğer mikroskoplardan ayıran temel özellik, cisimden gelen ışığın, ışını toplayan araca ulaşmadan önce, pinhole açıklığından geçmesidir. Bu sayede, istenilen fokal düzlem haricinden gelen ışıklar engellenmiş olur. Şekil 2.5. Ca 2+ ölçümü sonunda veri analizi. A) Hücrelerin sınırları, uyarı öncesi bazal floresans kullanılarak belirlendi. Bazal floresans dinlenim durumundaki sitoplazmik [Ca 2+ ] düşük olduğu için azdır. B) Hücrelerde sitoplazmik [Ca 2+ ] arttığı zaman, fluo-3 boyasının floresansı artar. Tüm deney boyunca ardışık resimler alınır. C) Hücrelerin sınırları, maximum floresans görüntülerinden ve DIC mikroskop resminden faydalanılarak doğrulandı. D) Her hücredeki ortalama intensite zamana bağlı olarak ölçüldü, başlangıç intasitesine oranlanarak normalize edildi, ve bir grafik olarak verildi. Şekil 2.6. IP 3 ölçümleri sonrası veri analizi. A) Uyarılmamış hücrelerden z- ekseni boyunca eşit zaman aralıklarıyla kesitler alındı. Bu şekilde bir zaman noktasında alınan

9 viii ardışık z- ekseni kesitleri görülmektedir. Bu hücrelerde GFP-PH PLCδC ile oluşan floresansın hücre zarına sınırlı olduğu izlenmektedir. B) Agonist uygulanması sonrası hücrelere oluşan IP 3 artışı, bu kesitlerde hücre zarına sınırlı olan floresansın sitoplazmik bölgede de artması şeklinde gözlendi. C) Bu hücrelerde en geniş sitoplazmik alana uyacak şekilde, ancak hücre zarını ve çekirdeği dışlayacak şekilde ROI ler çizildi ve ortalama floresans zaman boyunca ölçüldü. D) Bu ROI lerden ölçülen ortalama ışık şiddetinin zamanla değişim grafiği görülmektedir. Her grafik farklı bir z- kesitinde her üç ROI deki zamanla oluşan floresan değişikliğini göstermektedir. Şekil 3.. RAT- αb hücrelerinde -6 M PE yanıtları. A. α b -adrenerjik reseptör eksprese eden RAT- αb hücrelerinde -6 M PE uygulamasının ardından alınan Ca 2+ yanıtları gösterilmiştir. Şekil, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtını göstermektedir. B. α b - adrenerjik reseptör eksprese eden RAT- αb hücrelerinin, mm La +3 solüsyonunda 3 s. bekletilmesinin ardından -6 M PE uygulaması sonucu alınan Ca 2+ yanıtları görülmektedir. Şekil, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtını göstermektedir. C. mm La +3 solüsyonunda bekletilmiş veya bekletilmemiş α b -adrenerjik reseptör eksprese eden RAT- αb hücrelerinde, -6 M PE uygulaması sonucu gözlemlenen Ca +2 yanıtlarının ortalamaları gösterilmiştir. La +3 solüsyonunda bekletilip PE uygulanarak alınan yanıtlar kırmızı renk ile, sadece PE yanıtları ise mavi renkte gösterilmiştir. Deneyler aynı gün, Ca 2+ suz banyo solüsyonunda yapılmıştır. Şekil 3.2. RAT- αb hücrelerinde -4 M PE yanıtları. A. α b -adrenerjik reseptör eksprese eden RAT- αb hücrelerinde -4 M PE yanıtları gösterilmiştir. Şekilde, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. B. α b -adrenerjik reseptör eksprese eden RAT- αb hücrelerine, mm La +3 solüsyonunda 3 s. bekletildikten sonra uygulanan -4 M PE yanıtları görülmektedir. Şekilde, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. C. mm La +3 solüsyonunda bekletilmiş veya bekletilmemiş α b -adrenerjik reseptör eksprese eden RAT- αb hücrelerinde, -4 M PE uygulaması sonucu gözlemlenen Ca +2 yanıtlarının ortalamaları gösterilmiştir. La +3 solüsyonunda bekletilip PE uygulanarak alınan yanıtlar kırmızı renk ile, sadece PE yanıtları ise mavi renkte gösterilmiştir. Deneyler aynı gün, Ca 2+ suz banyo solüsyonunda yapılmıştır. Şekil 3.3. HEK-293 hücrelerinde RT-PCR sonucu elde edilen jel resmi. RT-PCR yöntemi ile, HEK-293 hücrelerindeki ACh etkili Ca 2+ yanıtını sağlayan reseptörün hangi tür muskarinik reseptör olduğuna bakıldı. Kontrol olarak Caveolin geni primerleri kullanıldı. Sonuç olarak, HEK-293 hücrelerinde M 3 reseptör alttipinin endojen olarak eksprese edildiği, M reseptörünün ise m-rna sı olmadığı gösterildi. Şekil 3.4. HEK-293 hücrelerinde -4 M ACh yanıtları. A. HEK-293 hücrelerinde -4 M ACh yanıtları gösterilmiştir. Şekilde, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. B. HEK-293 hücrelerine, mm La +3 solüsyonunda 35 s. bekletildikten sonra uygulanan -4 M ACh yanıtları görülmektedir. Şekilde, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. C. mm La +3 solüsyonunda bekletilmiş veya bekletilmemiş HEK-293 hücrelerinde, -4 M ACh uygulaması sonucu gözlemlenen Ca +2 yanıtlarının ortalamaları gösterilmiştir. La +3 solüsyonunda bekletilip ACh uygulanarak alınan yanıtlar kırmızı renk ile, sadece ACh yanıtları ise mavi renkte gösterilmiştir. Deneyler aynı gün, Ca 2+ suz banyo solüsyonunda yapılmıştır.

10 ix Şekil 3.5. HEK-293 hücrelerinde -7 M ACh yanıtları. A. HEK-293 hücrelerinde -7 M ACh yanıtları gösterilmiştir. Şekilde, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. B. HEK-293 hücrelerine, mm La +3 solüsyonunda 35 s. bekletildikten sonra uygulanan -7 M ACh yanıtları görülmektedir. Şekilde, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. C. mm La +3 solüsyonunda bekletilmiş veya bekletilmemiş HEK-293 hücrelerinde, -7 M ACh uygulaması sonucu gözlemlenen Ca +2 yanıtlarının ortalamaları gösterilmiştir. La +3 solüsyonunda bekletilip ACh uygulanarak alınan yanıtlar kırmızı renk ile, sadece ACh yanıtları ise mavi renkte gösterilmiştir. Deneyler aynı gün, Ca 2+ suz banyo solüsyonunda yapılmıştır. Şekil 3.6. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden LTK-8 hücrelerinde -5 M ACh yanıtları. A. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden LTK-8 hücrelerinde -5 M ACh yanıtları gösterilmiştir. Şekilde, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. B. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden LTK-8 hücrelerine, mm La +3 solüsyonunda 35 s. bekletildikten sonra uygulanan -5 M ACh yanıtları görülmektedir. Şekilde, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. C. mm La +3 solüsyonunda bekletilmiş veya bekletilmemiş kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden LTK-8 hücrelerinde, -5 M ACh uygulaması sonucu gözlemlenen Ca +2 yanıtlarının ortalamaları gösterilmiştir. La +3 solüsyonunda bekletilip ACh uygulanarak alınan yanıtlar kırmızı renk ile, sadece ACh yanıtları ise mavi renkte gösterilmiştir. Deneyler aynı gün, Ca 2+ suz banyo solüsyonunda yapılmıştır. Şekil 3.7. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden LTK-8 hücrelerinde -6 M ACh yanıtları. A. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden LTK-8 hücrelerinde -6 M ACh yanıtları gösterilmiştir. Şekilde, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. B. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden LTK-8 hücrelerine, mm La +3 solüsyonunda 35 s. bekletildikten sonra uygulanan -6 M ACh yanıtları görülmektedir. Şekilde, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. C. mm La +3 solüsyonunda bekletilmiş veya bekletilmemiş kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden LTK-8 hücrelerinde, -6 M ACh uygulaması sonucu gözlemlenen Ca +2 yanıtlarının ortalamaları gösterilmiştir. La +3 solüsyonunda bekletilip ACh uygulanarak alınan yanıtlar kırmızı renk ile, sadece ACh yanıtları ise mavi renkte gösterilmiştir. Deneyler aynı gün, Ca 2+ suz banyo solüsyonunda yapılmıştır. Şekil 3.8. LTK-8 hücrelerinde uzun süreli La 3+ inkübasyonu. A. M 3 reseptörü transfekte edilmiş LTK-8 hücrelerine, mm La 3+ lu solüsyonda 36 s. inkübasyonun ardından yapılan -6 M ACh uygulaması ve alınan yanıtlar şekilde görülmektedir. Şekil, deneyden alınan farklı hücrenin yanıtını içermektedir. Kimyasalların uygulama zamanları ve dozları şekil üzerinde gösterilmiştir. B. M 3 reseptörü transfekte edilmiş LTK-8 hücrelerine, mm La 3+ lu solüsyonda 36 s. inkübasyonun ardından yapılan -6 M ACh uygulaması ile alınan yanıtların tümünün ortalaması şekilde görülmektedir. Deney, aynı şartlar altında, aynı gün içerisinde, Ca 2+ suz solüsyonda yapılmıştır. Kimyasalların uygulama zamanları ve dozları şekil üzerinde gösterilmiştir. Şekil 3.9. LTK-8 hücrelerinde IP 3 ölçümü. A. Ca 2+ suz banyo solüsyonunda yapılan deneyde, M 3 reseptörü transfekte edilmiş LTK-8 hücrelerine, geçici GFP-PH PLCδC transfeksiyonu yapıldıktan iki gün sonra -4 M ACh uygulanarak, hücrelerdeki sitoplazmik IP 3 değişimine bakıldı. Şekilde, aynı deneyden alınan üç farklı hücrenin yanıtını gösterilmektedir. B. Ca 2+ suz banyo solüsyonunda yapılan deneyde, M 3 reseptörü transfekte

11 x edilmiş LTK-8 hücrelerine, geçici GFP-PH PLCδC transfeksiyonu yapıldıktan iki gün sonra, önce 3 s. mm La 3+ ile inkübe edilip ardından -4 M ACh uygulanarak, hücrelerdeki sitoplazmik IP 3 değişimine bakıldı. Şekilde, aynı deneyden alınan üç farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. C. Şekil 3.2.A ve B de görülen La +3 yokluğu ve varlığında, her iki deneyin yanıtlarının ortalamalarının karşılaştırması.deneyler aynı gün aynı şartlarda yapılmıştır. Kimyasalların uygulama zamanları şekil üzerinde gösterilmiştir. Şekil 3.. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden RAT- hücrelerinde -5 M ACh yanıtları. A. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden RAT- hücrelerinde -5 M ACh yanıtları gösterilmiştir. Şekilde, deneyden alınan hücrenin yanıtı gösterilmektedir. B. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden RAT- hücrelerine, mm La +3 solüsyonunda 35 s. bekletildikten sonra uygulanan -5 M ACh yanıtları görülmektedir. Şekilde, deneyden alınan farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. C. mm La +3 solüsyonunda bekletilmiş veya bekletilmemiş kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden RAT- hücrelerinde, -5 M ACh uygulaması sonucu gözlemlenen Ca +2 yanıtlarının ortalamaları gösterilmiştir. La +3 solüsyonunda bekletilip ACh uygulanarak alınan yanıtlar kırmızı renk ile, sadece ACh yanıtları ise mavi renkte gösterilmiştir. Deneyler aynı gün, Ca 2+ suz banyo solüsyonunda yapılmıştır. Şekil 3.. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden RAT- hücrelerinde -7 M ACh yanıtları. A. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden RAT- hücrelerinde -7 M ACh yanıtları gösterilmiştir. Şekilde, deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. B. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden RAT- hücrelerine, mm La +3 solüsyonunda 35 s. bekletildikten sonra uygulanan -7 M ACh yanıtları görülmektedir. Şekilde, deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. C. mm La +3 solüsyonunda bekletilmiş veya bekletilmemiş kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden RAT- hücrelerinde, -7 M ACh uygulaması sonucu gözlemlenen Ca +2 yanıtlarının ortalamaları gösterilmiştir. La +3 solüsyonunda bekletilip ACh uygulanarak alınan yanıtlar kırmızı renk ile, sadece ACh yanıtları ise mavi renkte gösterilmiştir. Deneyler aynı gün, Ca 2+ suz banyo solüsyonunda yapılmıştır. Şekil 3.2. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden RAT- hücrelerinde -7,5 M ACh yanıtları. A. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden RAT- hücrelerinde -7,5 M ACh yanıtları gösterilmiştir. Şekilde, deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. B. Kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden RAT- hücrelerine, mm La +3 solüsyonunda 35 s. bekletildikten sonra uygulanan -7,5 M ACh yanıtları görülmektedir. Şekilde, deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. C. mm La +3 solüsyonunda bekletilmiş veya bekletilmemiş kalıcı M 3 muskarinik reseptör eksprese eden RAT- hücrelerinde, -7,5 M ACh uygulaması sonucu gözlemlenen Ca +2 yanıtlarının ortalamaları gösterilmiştir. La +3 solüsyonunda bekletilip ACh uygulanarak alınan yanıtlar kırmızı renk ile, sadece ACh yanıtları ise mavi renkte gösterilmiştir. Deneyler aynı gün, Ca 2+ suz banyo solüsyonunda yapılmıştır. Şekil 3.3. ACh ve PE yanıtlarına La 3+ etkisinin, hücrelerin yanıt verme yüzdesine göre karşılaştırılması. A. ACh yanıtları. -4 M dozda La3+ etkisi, inhibisyon gözlenmediği için denenmedi, -8 M dozda ise hücrelerden yanıt alınamadı. B. PE yanıtları. -7 M ve altındaki dozlarda, La 3+ etkisi, inhibisyonun çok belirgin olduğu düşünülerek, denenmedi. ACh datası kalıcı M3 transfeksiyonu yapılmış RAT- hücrelerinden, PE datası ise kalıcı M3 transfeksiyonu yapılan veya yapılmayan RAT- hücrelerindeki Ca 2+ ölçümlerinin bir araya getirilmesinden oluşturulmuştur.

12 xi Şekil 3.4. ACh ve PE yanıtlarına La 3+ etkisinin, hücrelerin yanıtlarının tepe değerlerinin ortalamasına göre karşılaştırılması. A. ACh yanıtları. -4 M dozda La3+ etkisi, inhibisyon gözlenmediği için denenmedi, -8 M dozda ise hücrelerden yanıt alınamadı. B. PE yanıtları. -7 M ve altındaki dozlarda, La 3+ etkisi, inhibisyonun çok belirgin olduğu düşünülerek, denenmedi. ACh datası kalıcı M3 transfeksiyonu yapılmış RAT- hücrelerinden, PE datası ise kalıcı M 3 transfeksiyonu yapılan veya yapılmayan RAT- hücrelerindeki Ca 2+ ölçümlerinin bir araya getirilmesinden oluşturulmuştur.

13 . GĐRĐŞ.. G Proteini Kenetli Reseptörler Aracılığı ile Oluşan Hücre Đçi Kalsiyum Sinyali... Kalsiyum Sinyali ve Önemi Kalsiyum (Ca 2+ ), hücre içi sinyal iletiminde önemli görevleri olan bir iyondur. Ca 2+ un sitozoldeki konsantrasyonunun oldukça düşük ( -7 M), hücre dışı sıvıdaki ( -3 M) ve endoplazmik retikulumdaki (ER) konsantrasyonunun ise yüksek ( 5x -4 M) olmasından dolayı; hücre dışından gelen sinyallerin etkisi ile, hücre içerisinde, sitoplazmik serbest Ca 2+ derişimi ([Ca 2+ ] i ) artışı gözlenir. Ca 2+ a geçirgenliği çok az olan plazma membranı ve ER membranı, çeşitli uyarılarla Ca 2+ a geçirgen hale getirildiğinde sitoplazma ve hücre dışı sıvı ya da ER arasındaki [Ca 2+ ] gradiyenti yüzünden, Ca 2+ iyonları hızlı bir şekilde sitoplazmaya doğru difüzyon yapar. Bu olay, [Ca 2+ ] i nin önemli derecede artışına sebep olur. Bu artış da, hücrelerdeki Ca 2+ a duyarlı proteinleri aktive eder. Örneğin Ca 2+ kas hücrelerinde kasılmayı, sinir hücrelerinde nörotransmitter salımını, ve protein kinaz C (PKC) aktivasyonunu sağlar (Alberts ve ark. 22). Hücre içinde, [Ca 2+ ] nin kontrolünde görev alan elemanlar şu şekilde sınıflandırılabilir: I- Ca 2+ Kanalları Bu iyon kanalları çeşitli uyaranlar etkisiyle, Ca 2+ un plazma ve ER membranlardan geçişini sağlarlar ve dört tipte incelenebilirler:

14 2. Voltaj bağımlı Ca 2+ kanalları: Voltaj bağımlı Ca 2+ kanalları, membran depolarizasyonu sonucu hücre dışı sıvıdan hücre içine Ca 2+ girişine sebep olur. Çok sayıda farklı hücre tipinde bulunan bu kanalların temel işlevi, hücre yüzeyindeki elektrik sinyalleri, hücre içindeki fizyolojik olaylarla ilişkilendirmektir. Voltaj bağımlı Ca 2+ kanalları, on farklı aile olarak sınıflandırılmaktadır (Caterall ve ark., 25). 2. IP 3 ve Ryanodin Reseptörleri: ER ve kas hücresindeki homoloğu olan sarkoplazmik retikulum (SR), birer Ca 2+ deposudur. Bu depolardaki Ca 2+ salımı inositol,4,5-trisfosfat (IP 3 ) reseptörü (IP 3 R) veya Ryanodin Reseptörü (RYR) üzerinden olur. Bu reseptörler, depo membranına yerleşmiş multimerik proteinlerdir ve yapı bakımından birbirlerine benzerdir (Taylor ve ark.,999). IP 3 R ne IP 3 bağlanması bu reseptörün bir parçası olan iyon kanalını Ca 2+ a geçirgen hale getirir ve bu sayede depodan sitoplazmaya Ca 2+ salımı olur. RYR ise doğrudan voltaj kapılı Ca 2+ kanallarından giren Ca 2+ tarafından aktive edilir (Alberts ve ark.,22). 3. Katyon kanalları: Bu kanalların ortak özelliği Ca 2+ ile birlikte diğer katyonlara de geçirgen olmasıdır. Bu kanalların bir kısmı kendilerine bağlanan bir ligand ile doğrudan aktive olurken bir kısmı da membran potansiyeli değişikliğinden etkilenmektedir. Bu kanallara nikotinik asetilkolin reseptörleri örnek olarak verilebilir (McKay ve ark., 27). 4. Depo boşalması ile aktive olan Ca 2+ kanalları: Bu kanalların ortak özelliği depolardaki Ca 2+ un boşalması ile aktive olup hücredışı sıvıdan hücre içine Ca 2+ geçişini sağlamalarıdır. Bu kanalların aktivasyonu hakkında farklı fikirler bulunmaktadır. Yapılan araştırmalar, transient reseptor potansiyeli (TRP) kanallarının bazılarının depo boşalmasıyla aktive olan kanallar olduğunu göstermişlerdir. TRP kanalları [Ca 2+ ] i deki değişikliklere, hücre içine membrandan Ca 2+ giriş yolları oluşturarak ve yüksek ihtimalle hücre içi organellerden Ca 2+ salımını da düzenleyerek önemli bir katkıda bulunmaktadır. Depo boşalması ile aktive olan kanalların çalışması ile ilgili

15 3 çeşitli hipotezler öne sürülmüştür. Bu hipotezler Şekil. de gösterilmiştir (Putney ve ark., 2). Şekil.. Hücrede depo boşalması ile aktive olan kanalların çalışması ile ilgili hipotezler. A) CIF: Suda çözülebilir bu molekül etkisiyle depo boşalmasının ardından kanallar aktive olur. B) Ekzositoz: Depolar boşalınca kanallar ekzositoz ile plazma membranına geçer. C) Ca 2+ Düzenlemesi: Depoların boşalması ile azalan Ca 2+ sızıntısı, membrandaki kanalların aktive olmasına sebep olur. D) Konformasyonel Çiftlenim: Sinyal yolağının harekete geçmesi, bu yolakta yer alan proteinlerde konformasyonel değişikliğe neden olur. Bu değişiklikler, yeni protein-protein ilişkileri oluşmasına sebep olur. Bu protein-protein ilişkileri, hücre membranındaki Ca 2+ kanallarını aktive eder. II- Hücre Đçi Ca 2+ Depoları Tübüller ve keseciklerden oluşan karmaşık yapısıyla hücre içinde önemli bir hacim kaplayan ER un önemli fonksiyonlarından biri de Ca 2+ deposu olmasıdır. ER un Ca 2+ deposu olmasını sağlayan, organel membranının Ca 2+ geçirgenliğinin çok az olmasından dolayı bir bariyer gibi davranmasıdır. Ayrıca ER daki Ca 2+ a bağlanma özelliğine sahip kalretikulin ve kalsekestrin gibi proteinler, intraluminal serbest Ca 2+ konsantrasyonunu azaltarak, ER un Ca 2+ depolama kapasitesini arttırır.

16 4 III- Ca 2+ Taşıyan Pompa ve Değiştokuşçular Bu pompa ve değiştokuşçular, salınan Ca 2+ u depoya geri alan ER membranına yerleşmiş Ca 2+ ATPaz (SERCA; Sarkoplazmik/Endoplazmik Retikulum Ca 2+ ATPaz), sitoplazmik Ca 2+ u hücre dışına taşıyan, plazma membranında yerleşmiş Ca 2+ ATPaz (PMCA; Plasma Membrane Ca 2+ ATPase) ve yine plazma membranında yerleşmiş bulunan Na + -Ca 2+ değiştokuşcusudur. IP 3 yapımında bir artış yada plazma membranı yoluyla sitoplazmaya Ca 2+ girişine neden olan bir uyarı IP 3 ya da ryanodin reseptörleri aracılığıyla ER dan sitoplazmaya Ca 2+ salımına yol açar. Bunun sonucunda [Ca 2+ ] i artar, sitoplazmadaki Ca 2+ SERCA aktivitesi ile tekrar ER ye alınır veya PMCA ve Na + -Ca 2+ değiştokuşcusu aktivitesi ile hücre dışına atılır. Böylelikle, sitoplazmada [Ca 2+ ] i homeostazı sağlanır (Alberts ve ark.,22)...2 G Protein Kenetli Reseptörler ve Heterotrimerik G Proteinleri Plazma membran sinyal dönüştürücüleri arasındaki en geniş aile, G-protein kenetli reseptör (GPCR) ailesi, ya da yedi transmembran bölgeye sahip olmalarından dolayı bu şekilde adlandırılan yedi trans membran (7-TM) reseptörlerdir. Bu reseptör ailesi koku, ışık, metal iyonları, peptid hormonlar ve nörotransmiterler gibi belirgin çeşitlilikte fizyolojik uyaranlara karşı duyarlıdırlar. Bu reseptörlerin aktivasyonu, plazma membranı yakınında ya da hücrenin içlerinde görev yapan ikincil habercileri oluşturur. Bu ikincil habercileri efektör proteinler oluşturur. Efektör proteinler de Gα-GTP altbirimleri tarafından aktive edilir. Gα-GTP oluşturmak için GPCR ler tarafından katalizlenen döngü, günümüzde açıklığa kavuşmuş durumdadır. GPCR kompleksini oluşturan elemanlar, bir reseptör, Gα-GDP ve Gβγ altünitelerinden oluşan heterotrimerik bir G proteini, bir efektör, ve bir G protein sinyali regülatör proteinidir (RGS). GPCR lere ligand bağlanması, Gα da GDP/GTP değiştokuşunu katalizler, bunun sonucunda da Gα-GTP ve Gβγ, farklı

17 5 efektör proteinleri aktive ederler. Gα, kendisinde bulunan GTPaz özelliği ile GTPyi bir süre sonra hidroliz edip, inaktif hale gelir ve Gβγ ile yeniden birleşir. Bu da aktivasyon döngüsünün, bir sonraki aktivasyona dek, tamamlanmasını sağlar. Gα tarafından efektörlerin aktive edilmesi, dışardan gelen uyarının amplifikasyonuna, ve sonraki sinyal moleküllerinin, G proteininin tipine göre, (G s, G q veya G i gibi) aktivasyon veya inhibisyonuna sebep olur. RGS proteinleri ve efektör proteinler, GTPaz aktivatör proteini özelliği taşır (GAPs), bu sayede Gα daki GTPaz aktivitesini arttırırlar. Böylece, reseptöre agonist bağlı iken uyarının yoğunluğu kontrol altında tutulur, ve agonistin uzaklaşması sonucu uyarı bittiğinde, uyarılmış durum hızlı bir şekilde sonlandırılarak sistem dinlenim durumuna döndürülür (Kisyelov ve ark., 22)...3. PLC ve Đnositol,4,5-trisfosfat (IP 3 ) GPCR ler üzerinden Ca 2+ sinyalinin oluşmasını sağlayan; G q sınıfı α alttipinin, ya da G i yi aktive eden reseptörlerin uyarılmasıyla serbest kalan βγ alttipinin, PLCβ yı GPCR e agonist bağlanması sonucu aktive etmesidir. Bir fosfolipaz olan PLCβ, aktive olduğu zaman, bir plazma membran lipidi olan fosfatidilinositol 4,5-bifosfatı (PIP 2 ), inositol,4,5-trisfosfat (IP 3 ) ve diaçilgliserole (DAG) parçalar. IP 3, suda çözünebilen bir molekül olduğu için hızlı bir şekilde sitoplazmaya dağılarak, ER yüzeyinde bulunan IP 3 Reseptörlerine (IP 3 R) ulaşıp, bu reseptör kanallarını aktive ederek Ca 2+ a geçirgen hale getirir. Bu sayede, sitozolde ani bir Ca 2+ artışı olur. Depoların boşalması, hücre membranındaki depo boşalması ile aktive olan kanalların açılmasına sebep olur ve hücre dışından sitozole Ca 2+ girişi gözlenir. [Ca 2+ ] i artışını, SERCA ve PMCA pompalarının Ca 2+ u depoya ve hücre dışına uzaklaştırması izler. Pompa ve kanalların aktivitesi, [Ca 2+ ] i u dengeye getirir, bu da Ca 2+ sinyalini sona erdirmede önemli bir mekanizmadır.

18 6 IP 3 ün spesifik fosfatazlar tarafından hızlı bir şekilde defosforile edilip inaktif hale getirilmesi, Ca 2+ sinyalinin sona erdirilmesinde görev alan bir diğer etkendir. IP 3 ün bir kısmı ise, bir başka sinyal molekülü olduğu düşünülen IP 4 e dönüştürülür. PIP 2 nin, PLCβ tarafından hidroliz edildikten sonra kalan kısmı olan DAG ise, bir serine/threonine protein kinaz olan protein kinaz C'yi (PKC) aktive eder. PKC nin bir diğer aktivatörü de Ca 2+ dur. PKC, hücre içinde pek çok göreve sahiptir. Örneğin sinir hücrelerinde, hedef proteinlerdeki serine veya threonine rezidülerin fosforilasyonu, sinirin uyarılabilirlik özelliklerini değiştirir. PKC ayrıca bazı DNA ya bağlanan proteinleri aktive ederek, pek çok genin transkripsiyonuna yol açar (Alberts ve ark., 22). GPCR sinyali, bir bütün olarak aşağıdaki şekilde gösterilmiştir. (Şekil.2). Şekil.2. GPCR aracılı Ca 2+ sinyali. GPCR e agonist bağlandığı zaman, hücre membranının sitoplazmik tarafındaki heterotrimerik G proteininin α altünitesinde GTP/GDP değiştokuşu olur. Bu değiştokuşla aktive olan α altünitesi PLCβ yı aktive eder. PLCβ, PIP 2 yi IP 3 ve DAG e parçalar. IP 3, IP 3 R lerden Ca 2+ salımını sağlar. Salınan Ca 2+, SERCA ve PMCA tarafından sitozolden uzaklaştırılır. Deponun boşalmasıyla aktive olan TRP kanalları da hücre dışı sıvıdan hücre içerisine Ca 2+ girişi sağlayarak hücredeki Ca 2+ homeostazına katkıda bulunur (Clapham, 23).

19 7..4. IP 3 Reseptörleri ve ER Üzerinden Ca 2+ Salımı IP 3 R leri ER yüzeyinde bulunan, homo- ya da hetero-tetramerik özelliğe sahip reseptör kanallarıdır. Memelilerde 3 alttipi, ayrıca bazı alttiplerinin splice variantları bulunmaktadır. Alttiplerin ekspresyon seviyeleri hücre tipine göre farklılık göstermektedir (Taylor ve ark., 999). IP 3 R lerin ligandı IP 3 tür. IP 3, bağlanması ile birlikte reseptör kanalının aktivasyonunu sağlamakta, kanal Ca 2+ a geçirgen hale gelmektedir. Reseptörün aktivasyonu için önemli olan bir diğer etmen de Ca 2+ dur. Reseptörün sitozolik tarafındaki Ca 2+, reseptörü bifazik bir şekilde, aktive ve inhibe etmektedir (Patel ve ark., 999). Ayrıca, IP 3 ün de reseptörü önce aktive, sonra inhibe ettiğine dair çalışmalar bulunmaktadır (Dufour ve ark., 997). IP 3 reseptörünün bu şekilde aktivasyon ve inhibisyonu, Ca 2+ sinyalinin düzenlenmesinde görev alır...5. Kuantal Ca 2+ Salımı Permeabilize hücrelerde yapılan deneyler, IP 3 ün ER daki Ca 2+ u kuantal bir şekilde boşalttığını göstermiştir. Submaksimal IP 3, depolardaki Ca 2+ un tamamını boşaltamaz; ayrıca kalan Ca 2+ da, daha yüksek bir IP 3 konsantrasyonu tarafından boşaltılabilir. Bu olay, kuantal Ca 2+ salımı olarak adlandırılır. Bu kısmi boşalmayı açıklayan bellibaşlı hipotezler şunlardır: Depoların IP 3 e farklı duyrlılığı, IP 3 R ünün depo Ca 2+ una duyarlılığı, Ca 2+ pompalarının hızlı aktivasyonu, ya da IP 3 R nün Ca 2+ ile regülasyonu ve özellikle kanal ağzındaki [Ca 2+ ] dan etkilenmesi. (Dupont ve Swillens, 996)..2. Lanthanum un Ca 2+ Sinyali Üzerindeki Etkisi ve Çalışmanın Amacı Lanthanum iyonunun (La 3+ ) Ca 2+ mekanizmasında en iyi bilinen özelliği, spesifik olmayan Ca 2+ kanalı blokörü olmasıdır. Bu özelliğinden dolayı, La 3+, bu kanalların

20 8 blokajında kullanılmaktadır. Bu kanallar arasında TRP kanalları, pürinerjik P2X reseptör kanalları sayılabilir, ayrıca PMCA da La 3+ tarafından bloke edilmektedir (Xia ve ark, 23; Kwan ve ark., 99). La 3+ un daha az beklenen bir etkisi ise, GPCR ler ve IP 3 üzerinden oluşan Ca 2+ sinyalini de inhibe etmesidir. Çünkü La 3+ un bilinen hiçbir etkisi böyle bir inhibisyonu açıklamaya uygun değildir. Bu inhibisyon MDCK hücrelerinde eksprese olan pürinerjik P2Y reseptörlerinde belirgin bir şekilde gözlenmiştir. La 3+, submaksimal dozda ATP 4- yanıtını agonistten önce uygulandığında engellemekte, agonistin hemen sonrasında uygulandığında ise yanıtın süresini kısaltmaktadır (Jan ve ark., 998). Bu inhibisyona dair hipotezlerden bir tanesi, La 3+ iyonlarının, negatif yüke sahip P2Y agonisti ATP 4- ile çelasyon yapmasıdır. Bu P2Y reseptörü için olası bir açıklamadır, çünkü ATP 4- dozu arttırıldığında, La 3+ inhibisyonunun ortadan kalktığı gözlemlenmiştir. Fakat laboratuvarımızda yapılan başka bir çalışmada, La 3+ un, α b -adrenerjik reseptörünün kalıcı transfeksiyonla eksprese ettirildiği RAT- αb hücrelerinde, bu reseptörün, agonisti fenilefrin ile uyarılmasını da engellediği gözlemlenmiştir (Amber, 24). Agonist uyarısının hemen ardından verilen La 3+ un da, P2Y reseptörlerindeki duruma benzer şekilde, yanıtın sonlanmasını hızlandırdığı görülmüştür. Pozitif yüke (+) sahip fenilefrinin La 3+ ile çelasyon ihtimalinin olmaması La 3+ un inhibitör etkisinin GPCR sinyal yolağının bazı noktalarındaki etkisine bağlı olabileceğini düşündürmektedir. Bu konuda öne sürülebilecek mekanizmalar genel olarak üçe ayrılabilir: ) La 3+ un reseptöre doğrudan etkisi. 2) Reseptörlerin çalışması için Ca 2+ kanallarının (özellikle TRP benzeri kanallarının) çalışır durumda olması gerekliliği. 3) La 3+ un hücre içine girip burada sinyal iletiminde görev alan bazı elemanları etkilemesi (Xia ve ark., 23; Jan ve ark., 998). La 3+ inhibisyonuna dair bir diğer ilginç bulgu ise, laboratuvarımızda yapılan çalışmalarda M 3 tipi muskarinik asetilkolin (ACh) reseptörlerinde, La 3+ un inhibisyon etkisinin görülmemiş olmasıdır. HEK-293 hücrelerinde yapılan deneylerde, agonist olarak uygulanan ACh den önce mm La 3+ uygulamasının, Ca 2+ yanıtını engellemediği gözlenmiştir. Bu durum, La 3+ inhibisyonuna dair ilk hipotezi,

21 9 yani La 3+ un doğrudan reseptöre etki ettiği fikrini güçlendirmektedir, dolayısı ile etki reseptör tipine bağlı olabilir. Çünkü, hem çelasyon göstermeyen iki agonisten birinin yanıtları inhibe olurken (α b -adrenerjik reseptörü, RAT- hücrelerinde) diğerininki olmamıştır (M 3 muskarinik reseptörü, HEK-293 hücrelerinde), hem de HEK-293 hücrelerinde La 3+ pürinerjik reseptör yanıtlarını bloke etmekteyken, M 3 reseptör yanıtlarını bloke etmemiştir. Fakat, bu deneylerde inhibisyonun gözlendiği ve gözlenmediği hücreler aynı tip hücre değildir, aynı hücrede farklı agonistlerle yapılan gözlemden ise La 3+ un ATP 4- ile çelasyon yapıyor olma olasılığı göz ardı edilemeyeceği için kesin bir sonuç çıkartmak olanaksızdır. Dolayısı ile inhibisyon GPCR üzerinde olabileceği gibi, hücrede var olan ve yanıtın oluşumundan sorumlu başka bir protein üzerinde de olabilir. Bu zorluğu aşmak için yapılabilecek şey ise, sadece La 3+ ile çelasyon ihtimali olmayan agonistlere sahip reseptörlerle aynı hücrede çalışmaktır. Bu çalışmada La 3+ un GPCR-IP 3 aracılı hücre içi Ca 2+ artışını nasıl bloke ettiğini anlamak için izlediğimiz yol öncelikle bu inhibitör etkinin reseptör tipine mi yoksa hücre tipine mi bağlı olduğununun anlaşılmasıdır. La 3+ un inhibisyon göstermediği HEK-293 hücrelerindeki M 3 reseptörünün başka hücrelere, özellikle α b -adrenerjik reseptör yanıtının La 3+ ile inhibe olduğu RAT- hücrelerine transfeksiyonunu yaparak bu soruya cevap aradık. ACh, La 3+ ile çelasyon yapmayan bir agonisttir, dolayısı ile yanıtlarının La 3+ ile inhibe olması ekspresyonunun yapıldığı hücre tipine bağlı olarak değişiklik gösterirse etkinin reseptör üzerinde değil de, hücrede yanıta aracılık eden başka bir proteinden kaynaklandığı görüşü ağırlık kazanacaktır.

22 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.. Kültür Hücrelerinin Büyütülmesi Bu çalışmada HEK-293, LTK-8, RAT- αb kültür hücreleri kullanıldı. Kullanılan kültür hücreleri Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalından sağlandı. Hücreler % fetal calf serum (FCS) içeren DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium) (GIBCO BRL Life Tech. NY, ABD) solüsyonu içinde, 37 C de, uygun ph için %5 CO 2 içeren 75 cm 2 lik kültür flaskları içinde büyütüldüler. Hücreler yaklaşık % konfluense geldikten sonra PBS (phosphate buffered saline)-edta içinde yaklaşık 5 dakika 37 C de bekletildikten sonra mekanik etki yardımı ile kaldırılıp, önceden hazırlanmış tabanlarına 3 cm çaplı yuvarlak cam lameller yerleştirilen 6 lık flasklara eşit sayıda dağıtıldı. Hücreler burada aynı etüv koşullarında lamelin üzerine yapışarak büyütülmeye devam edildi, yeterli konfluense geldikten sonra deneye alındı. Deneyden önce hücreler, içerisinde büyütüldükleri 6 lık flaskta iken içinde bulundukları solüsyon çekilerek, içeriği 2 mm NaCl, 5 mm KCl, mm Hepes ve mm 6H 2 OMgCl 2 ve,5 mm CaCl 2 (Ca 2+ ) olan solüsyon ile (Banyo solüsyonu) bir kez yıkandılar ve floresans boya ile yüklenmeye hazır hale getirildiler. 2.2 Geçici ve Kalıcı Transfeksiyon 2.2. Plazmidin Oluşturulması Zeocin dirençli, M 3 geni taşıyan plazmid, Zeocin dirençli bir plazmid ve genetisin dirençli başka bir plazmiddeki M 3 geninin, restriksiyon enzimleri ile (BamHI ve EcoRI) kesilip, % agaroz jelde yürütülüp, jelden kesilip saflaştırıldıktan sonra, Th DNA ligaz enzimi ile birleştirilmesi ile oluşturuldu. Hazırlanan plazmidler, yüksek elektrik potansiyeli kullanılarak, önceden transformasyona uygun hale getirilmiş Escherichia coli bakterisine verildi. Bakteriler arasından 3 koloni seçilip büyütüldü.

23 Büyütülen bu kolonilerin üçünde de plasmid olduğu, Wizard Plus mini-prep kiti ile mini prep yapılıp, elde edilen plasmidin aynı restriksiyon enzimleri (BamHI ve EcoRI) ile kesilmesi ile gösterildi. (Şekil 2.) Ayrıca, plazmidin BssHI ile, M 3 geninin hem içinden, hem de dışından kesilmesiyle, genin plazmidin içine düz olarak girdiği gösterildi (Şekil 2.2). Şekil 2.. Plazmid oluşturma. Yetiştirilen her üç bakteri kolonisinde de M 3 taşıyan plazmid olduğu, mini-prep yapılan plazmidin restriksiyon enzimleri ile kesilmesiyle gösterildi. Şekil 2.2. M 3 reseptörünün plazmide düz girdiğinin gösterilmesi. Plazmid, BssHI enzimi ile, M 3 geninin hem içinden, hem dışından kesildikten sonra, jelde yürütüldü. Her üç kolonide de M 3 geninin doğru yerden kesildiği, dolayısı ile plazmide doğru girdiği görüldü Geçici Transfeksiyon Hücreler 6 lık flaskta, %6-8 konfluenste iken, geçici M 3 transfeksiyonu, Ca-PO 4 yöntemi ile yapıldı. Đki eppendorftan birine 24 µm CaCl 2 ve kuyu başına 4 µg plazmid, ötekisine ise 5 mm HEPES, 28 mm NaCl ve,5 mm Na 2 HPO 4 (2 x HBS solüsyonu), iki eppendorf eşit hacimde olacak şekilde kondu. HBS solüsyonu sürekli bir biçimde yavaş devirde karıştırılırken, CaCl 2 -plazmid solüsyonu damla damla HBS solüsyonunun üzerine eklendi. CaPO 4 kristallerinin oluşması için, karışım 3 dakika 37ºC de bekletildikten sonra, kuyulardaki hücrelerin üzerine eklendi. Hücreler, transfeksiyondan iki gün sonra deneye alındı.

24 Kalıcı Transfeksiyon Geçici transfeksiyonun ertesi günü, hücreler 6 lık flasktan alınıp, 96 lık flaska dağıtıldı. Aynı gün, hücrelere seçici medyum (zeocin, 2 µg/ml) uygulanmaya başlandı. Zeocin direnci gösteren klonlar, kuyunun içinde konfluent olduktan sonra, önce 24 lük flaska, sonra 6 lık flaska, oradan da 75 cm 2 lik flaska ekildi. 2.3 RT-PCR ve Jel Elektroforezi Önceden izole edilmiş HEK-293 total RNAsı, reverse transkriptaz enzimi kullanılarak cdnaya çevrildi. HEK-293 cdnası, ayrı ayrı M (f GCT AGG ATC CAT GAA CAC TTC AGC CCC ACC TGC TG, r GCT AGA ATT CTC AGC ATT GGC GGG AGG GAG TG), M3 (f GCT AGG ATC CAT GAC CTT GCA CAA TAA CAG TAC AAC CTC GC, r GCT AGA ATT CCT ACA AGG CCT GCT CGG GTG CG), ve cav (f AGC GGG TAC CAT GTC TGG GGG CAA ATA CGT AGA C, r ATC GGA ATT CTT ATA TTT CTT TCT GCA AGT TAG TGC G) primerleri, Rwo polimeraz enzimi, µm Nükleotid karışımı kullanılarak, PCR yöntemi ile çoğaltıldı. Kullanılan PCR protokolü: 2 dakika 94 ºC ilk denatürasyon, 35 defa 3 saniye 94 ºC denatürasyon, saniye 57 ºC yapışma, 3 saniye 6 ºC uzama döngüsü, dakika 6 ºC son uzama. Bu sayede çoğaltılan DNA lar, Ethidium bromidli % agaroz jelde V gerilim uygulanarak saat koşturuldu. Daha sonra jel, ultraviyole (UV) ışık altında incelendi. 2.4 Hücrelerin Fluo-3 Asetoksimetil Ester ile Yüklenmesi Hücreler her cam lamel için 2 µm Fluo-3 asetoksimetil ester (Fluo-3 AM) ve µl pluoronic acid (%) içeren banyo solüsyonunda 24ºC de 9 dakika bekletilmek suretiyle yüklendiler. Đnkübasyonun ardından geri plan (background) floresansını en aza indirebilmek için hücreler yine aynı solüsyon ile iki defa yıkanıp, ester

25 3 formundaki boyanın tam metabolize olmasını sağlamak amacı ile 5 dakika daha oda sıcaklığında inkübe edildi. 2.5 Hücre Đçi Ca 2+ Derişiminin Ölçülmesi Bu çalışmada yapılan deneylerde hücre içi Ca 2+ derişimi, fluo-3 Ca 2+ indikatörü kullanılarak, Leika TCS-SP5 konfokal mikroskop ile ölçüldü (Şekil 2.3). Şekil 2.3. Leica TCS-SP5 konfokal mikroskop. Bu mikroskop tarama başlığı, DMI serisi bir floresan mikroskop, lazer ünitesi, bilgisayar ve elektronik ara bağlantı parçalarından oluşmaktadır. Konfokal mikroskobun çalışma prensibi şu şekilde özetlenebilir: Konfokal mikroskobu bir floresan mikroskopi tekniğidir. Konfokal mikroskobu diğer floresan mikroskoplardan ayıran özellik, konfokal mikroskoplarda çözünürlüğü arttırmak için kullanılan pinhole açıklığıdır. Konfokal mikroskoplarda floresan boyaların uyarılması difraksiyon ile sınırlı bir noktaya odaklanan lazer ışığı ile yapılır, bu aydınlanan noktadan çıkan floresans bir pinhole açıklığından geçirilerek ölçülür. Bu şekilde emisyon ışığının sadece odak ekseninden gelen kısmı ölçülmüş olur, odak noktasının üstünde ve altına kalan düzlemlerden gelen floresan ışık dedektöre ulaşamaz (Şekil 2.4). Böylelikle preparatın sadece belirli bir z- koordinatından, kalınlığı belirli bir bölgeden gelen floresantan, bir xy- ekselerinin tanımladığı düzlem boyunca yüksek çözünürlükte optik kesitler oluşturulabilir. Bu şekilde alınan ve toplanan optik kesitler birleştirilerek üç-boyutlu gösterimler elde edilebilir. Örnek

26 4 üzerindeki odak derinliği değiştirilerek örneğin kalınlığı boyunca farklı derinliklerdeki xy düzlemlerinde resimler elde edilebilir. Pinhole açıklığı arttırıldıkça optik kesit kalınlığı artar, küçüldükçe daralır. Işık, dalga özelliğinden kaynaklı olarak, gerçek bir bir noktada değil, belirli bir elipsoid bir hacimde odaklanabilir. Bu nedenle pinhole ne kadar kısılırsa kısılsın elde edilebilecek z- eksen çözünürlüğünün bir üst sınırı vardır. Bu çözünürlüğe ulaşılan pinhole açıklığı Airy birimidir. Odak noktasının elipsoid şekilli olması nedeni ile z-eksenindeki kuramsal maksimum çözünürlük xy- düzlemine göre düşüktür. Bugün kullanılan lazer taramalı konfokal mikroskoplarının çalışma prensibi lazer ışığının aynalardan yararlanılarak örneğin üzerinde xy düzlemi boyunca taranması ve bu yolla bir görüntü elde edilmesine dayanır. Bu lazer ışını, objektif lensi yardımıyla floresan ile işaretlenmiş örnek içindeki tek bir küçük noktaya odaklanır. Tarama başlığındaki yansıtma mekanizmasının bu odağın yerini sürekli değiştirmesiyle, bu ışın bir tarama ışınına çevrilir. Bu sayede oluşturulan lazer eksitasyonu, örnekte bir floresan emisyona sebep olur. Aydınlatma ışınıyla aynı yoldan geri dönen emisyon ışığı, dikroik ayna vasıtası ile ayrıştırılıp bir detektöre yönlendirilir. Emisyon ışığının pinhole açıklığından geçebilen kısmı, detektöre ulaşır (Şekil 2.4). Lazer taramalı sistemde örnekten yayılan emisyon ışığının geldiği detektör çoğunlukla foton çoğaltıcı tüptür (PMT). Bazı sistemlerde, birden çok PMT bulunur, bu sayede farklı dalgaboylarında emisyon yapan floroforlar aynı anda gözlemlenebilir. Tarama başlığı örnek üzerindeki lazerin odaklandığı pozisyon bilgisini ve o noktadan gelen ışığın şiddetini bir bilgisayara iletir. Bilgisayar detektörden gelen her noktanın değerini depolar ve bunları birleştirerek yüksek çözünürlüklü bir monitörde bir görüntü haline getirir. Farklı bir z-ekseninde görüntü almak için ise mikroskobun odak noktası kaydırılır ve bu işlem ardışık olarak bir dizi z-ekseninde yapıldığında, alınan görüntüler birleştirilip 3-boyutlu bir görüntü elde edilebilir. Konfokal mikroskobun çalışma prensibi, Şekil 2.4. te gösterilmiştir.

27 5 Şekil2.4. Konfokal Mikroskobun Çalışma Prensibi. Konfokal mikroskobu diğer mikroskoplardan ayıran temel özellik, cisimden gelen ışığın, ışını toplayan araca ulaşmadan önce, pinhole açıklığından geçmesidir. Bu sayede, istenilen fokal düzlem haricinden gelen ışıklar engellenmiş olur. Fluo-3, Ca 2+ a bağlandığı zaman 488 nm dalgaboyunda eksite olup, 5 ile 6 nm dalgaboyu arasında emisyon yapan bir Ca 2+ indikatörüdür. Fluo-3 kullanılarak [Ca 2+ ] i ölçümü yapabilmek için, fluo-3 ile yüklenmiş hücrelerin bulunduğu camlar, sykes-moore haznesi içerisine yerleştirildi. Ca 2+ suz banyo solusyonu ile bir kez yıkanıp üzerine tekrar Ca 2+ suz banyo solusyonu eklenerek mikroskobun tablasına yerleştirildi. Hücrelerin bulunduğu yüzeye, Diferansiyel Đnterferans Kontrast (DIC) mikroskobu kullanılarak 6X büyütme ve su immersiyonu lensi ile, ya da 4X büyütme ve yağ immersiyonu lensi ile odaklanıldı. Bu odak yüzeyine, önceden %2 güçle açılmış argon lazer kaynağı ve hücrelerin yüklenme durumuna göre %2-2 arasında eksitasyon intensitesi kullanılarak, 488 nm dalgaboyunda eksitasyon ışığı, lazer tarama yöntemi ile 4 Hz tarama frekansıyla gönderildi. Eksitasyon ışığının örneğe ulaşıp, aynı yoldan geri dönen emisyon ışığının detektöre yansıtılması için, 5 nm dalgaboyundan kısa ışığı geçirip geri kalanı yansıtan RSP5 dikroik ayna kullanıldı. Hücre içindeki geniş bir derinlikten gelen emisyonu toplayabilmek için, pinhole açıklığı 5 airy birime getirildi. Bu şekilde, hücrelere yapılan uygulamalar ile

28 6 değişen [Ca 2+ ] i, floresans yoğunluğundaki değişim olarak detektör tarafından deney boyunca bilgisayara gönderilip kaydedildi ve ekranda gözlendi. Deneyler sırasında hücrelere kimyasal madde uygulamaları, bu maddelerin banyo solüsyonuna eklenmesi ile yapıldı. Deneyler boyunca, La 3+ un etki gösterdiği yerlerde Ca 2+ ile etkileşmesini engellemek için, Ca 2+ suz banyo solüsyonu kullanıldı. Deney sonunda veri analizi için LEICA nın orijinal yazılımı yardımı ile, başlangıçtaki floresans kullanılarak, her hücrenin sınırı (Region of Interest, ROI) belirlendi. Deney boyunca her ROI için piksel başına ortalama intensite, program tarafından hesaplandı. Bu belirlemede daha kesin olabilmek için, hücrelerin DIC mikroskop ile alınan görüntülerinden de faydalanıldı. Ayrıca, background floresansı da, birkaç farklı bölgeden alınarak hesaplandı (Şekil 2.5.). Şekil 2.5. Ca 2+ ölçümü sonunda veri analizi. A) Hücrelerin sınırları, uyarı öncesi bazal floresans kullanılarak belirlendi. Bazal floresans dinlenim durumundaki sitoplazmik [Ca 2+ ] düşük olduğu için azdır. B) Hücrelerde sitoplazmik [Ca 2+ ] arttığı zaman, fluo-3 boyasının floresansı artar. Tüm deney boyunca ardışık resimler alınır. C) Hücrelerin sınırları, maximum floresans görüntülerinden ve DIC mikroskop resminden faydalanılarak doğrulandı. D) Her hücredeki ortalama intensite zamana bağlı olarak ölçüldü, başlangıç intensitesine oranlanarak normalize edildi, ve bir grafik olarak verildi.

29 7 Fluo-3 ölçümünde intensite, hücre içindeki fluo-3 konsantrasyonu ile doğru orantılı olduğu için, hücrelerdeki farklı yüklenmenin etkisini ortadan kaldırmak amacıyla, tüm değerlerden background floresansı çıkartıldıktan sonra, tüm intensiteler, kendi bazal seviyelerine bölündü ve datalar bu normalizasyon kullanılarak değerlendirildi. Bu tip derişim ölçümlerine oransal olmayan ölçüm (non-ratiometric measurement) ve bu ölçümlerde kullanılan fluo-3 gibi boyalara oransal olmayan boyalar denmektedir. 2.6 Hücre Đçi IP 3 Derişiminin Ölçülmesi IP 3 derişiminin ölçümü, PLCδ de bulunan ve IP 3 e bağlanan Plekstrin Homoloji (PH) bölgesi eklenmiş yeşil fluoresant protein (GFP) kullanılarak (GFP-PH PLCδC ) yapıldı. Bu protein, hücrelere transfekte edildikten iki gün sonra, hücreler, Ca 2+ suz banyo solüsyonu içerisinde deneye alındılar. Deneyler boyunca konfokal mikroskop kullanılarak IP 3 miktarı saptandı. Hücrelerden, z-ekseni boyunca en az 3 farklı kesit alınarak, bu kesitlerde 4 Hz line frekansla lazer taraması yapıldı. Pinhole açıklığı, maksimum z-aksı çözünürlüğü sağlamak amacı ile, airy birime ( 5 µm) getirildi. IP 3 a bağlanan GFP-PH PLCδC ı eksite etmek için argon lazerle 488 nm dalgaboyunda yapılan taramada, 5-59 nm dalgaboyları arasındaki emisyon ışığı PMT tarafından toplandı. Sitoplazmadaki IP 3 miktarındaki artışı tespit etmek için, kesitlerin sitoplazmik bölümlerinde ROI ler çizildi. Bu ROI lerdeki ortalama intensite artışı, her hücre için en geniş alana sahip ROI den alındı (Şekil 2.6.). ROI lerin analizi yapılırken, her zaman noktasındaki intensitenin baseline intensitesinden farkı, maksimum intensitenin baseline intensitesinden farkına bölündü. Bu şekilde, farklı hücrelerde, farklı zamanlarda ve farklı uyarılarla yapılan deneylerdeki IP 3 oluşumu, niteliksel bir şekilde karşılaştırılabilir hale geldi.

30 8 Z Z2 Z3 Z4 Şekil 2.6. IP 3 ölçümleri sonrası veri analizi. A) Uyarılmamış hücrelerden z- ekseni boyunca eşit zaman aralıklarıyla kesitler alındı. Bu şekilde bir zaman noktasında alınan ardışık z- ekseni kesitleri görülmektedir. Bu hücrelerde GFP-PH PLCδC ile oluşan floresansın hücre zarına sınırlı olduğu izlenmektedir. B) Agonist uygulanması sonrası hücrelere oluşan IP 3 artışı, bu kesitlerde hücre zarına sınırlı olan floresansın sitoplazmik bölgede de artması şeklinde gözlendi. C) Bu hücrelerde en geniş sitoplazmik alana uyacak şekilde, ancak hücre zarını ve çekirdeği dışlayacak şekilde ROI ler çizildi ve ortalama floresans zaman boyunca ölçüldü. D) Bu ROI lerden ölçülen ortalama ışık şiddetinin zamanla değişim grafiği görülmektedir. Her grafik farklı bir z- kesitinde her üç ROI deki zamanla oluşan floresans değişikliğini göstermektedir.

31 9 3. BULGULAR Bu çalışmada yapılan deneylerde, farklı hücre tiplerinde La 3+ un hücre içi kalsiyum yanıtını inhibe edici etkisinin, Ca 2+ sinyal mekanizması üzerinde hangi aşamada oluştuğu araştırıldı. 3.. RAT- αb Hücrelerinde PE Yanıtlarının La 3+ ile Blokajı RAT- αb hücrelerinde, -6 M PE yanıtlarının La 3+ ile bloke edildiği daha önceden yapılan çalışmalar sonucu bilinmektedir (Amber, 24). La 3+ un bu bilinen hücre içi kalsiyum yanıtını inhibe edici etkisini yeniden gözleyebilmek için aynı şartlarda bu deney tekrarlandı. Kalıcı olarak α b -adrenerjik reseptör transfekte edilmiş RAT- αb hücreleri kullanıldı. α b -adrenerjik reseptör, G q/ kenetli bir reseptördür (Zhong ve Minneman, 999). Bu deneylerde α b -adrenerjik reseptör agonisti olarak fenilefrin (PE) kullanılmıştır. PE, (+) yüke sahip olduğu için, La 3+ un inhibisyon etkisi göstermesi durumunda, La 3+ ile agonist çelasyonu ihtimali böylelikle bertaraf edilmiştir. Ayrıca, Ca 2+ varlığında La 3+ un inhibisyon etkisi ortadan kalktığı bilindiği için, tüm deneyler Ca 2+ suz solüsyonda yapılmıştır. Ca 2+ bufferları La 3+ u da tamponladığı için deneyde kullanılan banyo solüsyonuna Ca 2+ bufferları eklenmemiş, nominal Ca 2+ suz solüsyon kullanılmıştır. Ca 2+ lu banyo solüsyonda fluo-3 AM ile yüklenen hücrelere, deney sırasında Ca 2+ suz banyo solüsyonu içerisinde uygulanan -6 M PE ile alınan Ca 2+ yanıtları gözlenmiştir (Şekil 3..A). Ardından, hücrelerin mm LaCl 2 (La 3+ ) solüsyonunda 35 saniye bekletilmesi sonrası uygulanan -6 M PE ile alınan Ca 2+ yanıtları gözlenmiştir (Şekil 3..B). Deneylerden elde edilen bulgular birbirleri ile karşılaştırıldığında, daha önceki çalışmalarda gösterildiği gibi, La 3+ un RAT- αb hücrelerinde Ca 2+ yanıtı üzerinde çok belirgin bir inhibisyon etkisi olduğu görüldü. mm La +3 solüsyonunda bekletilmiş ve bekletilmemiş RAT- αb hücrelerinde -6 M PE e verilen Ca +2 yanıtlarının ortalamaları karşılaştırıldı (Şekil 3..C). Bu

32 2 5 A 4 F/F 3 2 PE -6 M Zaman (s) B F/F 3 2 PE -6 M La 3+ mm Zaman (s) PE -6 M C F/F 3 2 PE -6 M La 3+ mm Zaman (s) Şekil 3.. RAT- αb hücrelerinde -6 M PE yanıtları. A. α b -adrenerjik reseptör eksprese eden RAT- αb hücrelerinde -6 M PE uygulamasının ardından alınan Ca 2+ yanıtları gösterilmiştir. Şekil, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtını göstermektedir. B. α b - adrenerjik reseptör eksprese eden RAT- αb hücrelerinin, mm La +3 solüsyonunda 35 s. bekletilmesinin ardından -6 M PE uygulaması sonucu alınan Ca 2+ yanıtları görülmektedir. Şekil, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtını göstermektedir. C. mm La +3 solüsyonunda bekletilmiş veya bekletilmemiş α b -adrenerjik reseptör eksprese eden RAT- αb hücrelerinde, -6 M PE uygulaması sonucu gözlemlenen Ca +2 yanıtlarının ortalamaları gösterilmiştir. La +3 solüsyonunda bekletilip PE uygulanarak alınan yanıtlar kırmızı renk ile, sadece PE yanıtları ise mavi renkte gösterilmiştir. Deneyler aynı gün, Ca 2+ suz banyo solüsyonunda yapılmıştır.

33 2 karşılaştırma yapıldığında, -6 M PE uygulaması sonucu gözlenen Ca +2 yanıtının, önceden mm La +3 solüsyonunda bekletilen RAT- αb hücrelerinde çok büyük oranda ortadan kalktığı sonucuna varılmıştır. RAT- αb hücrelerinde Ca 2+ suz banyo solüsyonunda mm La 3+ varlığında PE -6 M uygulaması sonucu oluşan Ca 2+ yanıtının inhibe olması, bizi benzer bir etkinin agonist konsantrasyonu arttırıldığında görünüp görünmeyeceğini incelemeye yöneltti. Agonist olarak -6 M PE kullanılarak yapılan deney, bu kez -4 M PE dozu kullanılarak tekrarlandı (Şekil 3.2.A ve B). mm La +3 varlığında uygulanan PE -6 M dozunda görülen La 3+ inhibisyonunun, PE -4 M dozunda, yanıt veren birkaç hücre olmasına rağmen, büyük oranda devam ettiği gözlendi. Deneye alınan tüm hücrelerin, mm La +3 varlığında ve yokluğunda, uygulanan PE -4 M dozuna verdikleri Ca +2 yanıtlarının ortalamaları gösterilmiştir (Şekil 3.2.C).

34 22 5 A 4 F/F Zaman (s) PE -4 M B 4 F/F Zaman (s) PE -4 M La 3+ mm 5 PE -4 M C 4 3 F/F Zaman (s) PE -4 M La 3+ mm Şekil 3.2. RAT- αb hücrelerinde -4 M PE yanıtları. A. α b -adrenerjik reseptör eksprese eden RAT- αb hücrelerinde -4 M PE yanıtları gösterilmiştir. Şekilde, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. B. α b -adrenerjik reseptör eksprese eden RAT- αb hücrelerine, mm La +3 solüsyonunda 35 s. bekletildikten sonra uygulanan -4 M PE yanıtları görülmektedir. Şekilde, aynı deneyden alınan on farklı hücrenin yanıtı gösterilmektedir. C. mm La +3 solüsyonunda bekletilmiş veya bekletilmemiş α b -adrenerjik reseptör eksprese eden RAT- αb hücrelerinde, -4 M PE uygulaması sonucu gözlemlenen Ca +2 yanıtlarının ortalamaları gösterilmiştir. La +3 solüsyonunda bekletilip PE uygulanarak alınan yanıtlar kırmızı renk ile, sadece PE yanıtları ise mavi renkte gösterilmiştir. Deneyler aynı gün, Ca 2+ suz banyo solüsyonunda yapılmıştır.

35 HEK-293 hücrelerindeki Endojen M3 Reseptörlerinin La 3+ ile Etkileşmesi Hücre içi Ca 2+ sinyalinde inhibitör etkisini gözlemlediğimiz La 3+ un, bir diğer G q/ kenetli reseptör olan M 3 reseptörü aracılı Ca 2+ sinyali oluşumu üzerinde inhibe edici bir etkisi olmadığı, daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir. Bu deney, La 3+ un, Ca 2+ sinyali üzerinde gösterdiği bu farklı etkiyi gözlemlemek için, çalışmamızda tekrarlandı. Bunun için HEK-293 hücreleri kullanıldı. HEK-293 hücreleri, asetilkolin (ACh) uygulaması sonucu Ca 2+ yanıtı vermektedir. Bu güne kadar yapılan çalışmalarda HEK-293 hücrelerindeki ACh reseptörünün muskarinik M 3 reseptörü olduğu gösterilmiştir (Ancellin ve ark., 999). Ayrıca, biz de kullandığımız HEK- 293 hücrelerinde de M 3 reseptörü m-rnası olduğunu, RT-PCR yöntemi ile tesbit ettik (Şekil 3.3). Şekil 3.3. HEK-293 hücrelerinde RT-PCR sonucu elde edilen jel resmi. RT-PCR yöntemi ile, HEK-293 hücrelerindeki ACh etkili Ca 2+ yanıtını sağlayan reseptörün hangi tür muskarinik reseptör olduğuna bakıldı. Kontrol olarak Caveolin geni primerleri kullanıldı. Sonuç olarak, HEK-293 hücrelerinde M 3 reseptör alttipinin endojen olarak eksprese edildiği, M reseptörünün ise m-rna sı olmadığı gösterildi. M 3 reseptörü üzerinden oluşan [Ca 2+ ] i yanıtının La 3+ dan nasıl etkileneceğini tespit edebilmek için, HEK-293 hücrelerinde bir dizi deney yapıldı. Öncelikle Fluo-3 Ca 2+ indikatörü ile yüklenen hücrelere, Ca 2+ suz banyo solüsyonu içerisinde -4 M ACh uygulandı, ve [Ca 2+ ] i artışı gözlemlendi. (Şekil 3.4.A). La 3+ un bu Ca 2+ yanıtlarına bir etkisi olup olmayacağını gözlemlemek için mm La 3+ lu banyo solüsyonunda 35 saniye bekletilmiş hücrelere, -4 M ACh uygulandı (Şekil 3.4 B). Ca 2+ yanıtının beklenildiği gibi La 3+ varlığında inhibe olmadığı, yanıt süresinin ise uzadığı görüldü. Bu uzama, ortalama yanıtlarda da belirgin olarak görüldü (Şekil 3.4 C). HEK-293 hücrelerinde daha önce de gözlemlenen bu olayın, konsantrasyon bağımlı olup