KAMAN 1 ve KAMAN 5 CEVİZ (Juglans regia L.) ÇEŞİTLERİNİN MİKROÇOĞALTIMI. Ebru ŞİRİN Yüksek Lisans Tezi Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı

Transkript

1 KAMAN 1 ve KAMAN 5 CEVİZ (Juglans regia L.) ÇEŞİTLERİNİN MİKROÇOĞALTIMI Ebru ŞİRİN Yüksek Lisans Tezi Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Prof. Dr. Kenan YILDIZ Yrd. Doç. Dr. Sevil SAĞLAM 2014 Her Hakkı Saklıdır.

2 T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ KAMAN 1 ve KAMAN 5 CEVİZ ÇEŞİTLERİNİN (Juglans regia L.) MİKROÇOĞALTIMI Ebru ŞİRİN TOKAT 2014 Her Hakkı Saklıdır.

3

4

5 ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR Bu çalışma, Gaziosmanpaşa Üniversitesi, Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyon Başkanlığınca desteklenen 2013/35 no lu Kaman 1 ve Kaman 5 Ceviz Çeşitlerinin (Juglans regia L.) Mikroçoğaltımı isimli proje kapsamında yürütülmüştür. Bu tez çalışmasının hazırlanmasında emeği geçen başta danışman hocam Prof. Dr. Kenan YILDIZ olmak üzere Ahi Evran Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü öğretim üyesi Yrd. Doç. Dr. Sevil SAĞLAM a ve Ahi Evran Üniversitesi Mühendislik-Mimarlık Fakültesi Genetik ve Biyomühendislik Bölümü öğretim üyesi Yrd. Doç. Dr. Meltem BAYRAKTAR a teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca hayatımın her döneminde desteklerini esirgemeyen aileme ve eşime de teşekkürlerimi sunarım.

6 ÖZET Yüksek Lisans Tezi KAMAN 1 ve KAMAN 5 CEVİZ ÇEŞİTLERİNİN (Juglans regia L.) MİKROÇOĞALTIMI Ebru ŞİRİN Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabailim Dalı I.Danışman: Prof. Dr. Kenan YILDIZ II. Danışman: Yrd. Doç. Dr. Sevil SAĞLAM Bu çalışmada Kaman 1 ve Kaman 5 ceviz çeşitlerinin koltukaltı tomurcuklarından basit ve etkili bir klonal mikroçoğaltım protokolü geliştirilmeye çalışılmıştır. Eksplantların yüzey sterilizasyonu %70'lik etanolde 1 dk. ve Tween 20 ilave edilmiş % 0.2'lik HgCl 2 de 5 dk. tutularak sağlanmıştır. Kararmayı önlemek için ortama 100 mg/l Askorbik Asit, 100 mg/l Sitrik Asit ve 100 mg/l Askorbik Asit+100 mg/l Sitrik Asit ilavesi ve 3, 24 ve 48 saat alt kültüre alma uygulamaları denenmiştir. Kaman 1 ve Kaman 5 ceviz çeşitlerinin her ikisinde de en etkin uygulamanın 100 mg/l AA mg/l SA+ 48 saat alt kültür olduğu gözlemlenmiştir. Sürgün rejenerasyonu çalışması kapsamında BAP'ın 0.5, 1.0 ve 1.5 mg/l dozları ile IBA'nın 0.5 ve 1.0 mg/l dozlarının 6 farklı kombinasyonu denenmiştir. Eksplant başına maksimum sürgün sayısı 0.5 mg/l BAP mg/l IBA içeren MS besin ortamından K1 ve K5 cevizlerinde sırasıyla 2.00 ve 0.67 adet olarak elde edilmiştir. Sürgünler 4 mg/l IBA içeren solüsyonunda 5 dk. bekletildikten sonra 1:1 oranında torf:perlit karışımı içeren saksılara dikilmiş ancak sürgünlerden köklenme sağlanamamıştır. 2014, 59 sayfa Anahtar kelimeler: Ceviz, İn vitro, Doku kültürü, Mikroçoğaltım, Rejenerasyon, i

7 ABSTRACT M.Sc. Thesis In vitro Clonal Propagation of Kaman 1 and Kaman 5 Walnut (Juglans regia L.) Varieties Ebru SİRİN Gaziosmanpasa University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Horticulture Supervisor: Prof. Dr. Kenan YILDIZ Yrd. Doç. Dr. Sevil SAĞLAM An efficient protocol for in vitro clonal propagation of Kaman 1 and Kaman 5 varieties was achieved using axillary buds. The explants were treated with 70% ethanol for 1 min. followed by surface sterilization using one drop per 100 ml of Tween 20 of 0.2 % HgCl 2 for 5 min and rinsing with sterile distilled water for 3 5 min. The explants to avoid development of phenolic acids based chlorosis were cultured for 3, 24 and 48 hours using 100 mg/l of ascorbic acid, 100 mg/l citric acid, 100 mg/l ascorbic acid plus 100 mg/l citric acid in MS medium. The explants were cultured on MS medium containing 0.5 and 1.0 mg/l of IBA plus 0.5, 1.0 and 1.5 mg/l of BAP for shoot regeneration in 100 mg/l ascorbic acid plus 100 mg/l citric acid treatment for 48 hours. The maximum number of 2.00 and 0.67 shoots on Kaman 1 and Kaman 5 walnut varieties per explant were obtained on MS medium containing 0.5 mg/l BAP plus 1.0 mg/l IBA respectively. Well developed sturdy shoots were rooted by conditioning with 4.0 mg/i IBA for 5 min. and transferred to sterile soil mixture containing peat:perlite in pots for growth development and acclimatisation. 2014, 59 pages Keywords: Walnut, In vitro, Tissue culture, Clonal propagation, Regeneration ii

8 İÇİNDEKİLER Sayfa Özet... i Abstract. ii İçindekiler. iii Simge ve Kısaltmalar iv Çizelgeler Dizini... v Şekiller Dizini... vi 1. GİRİŞ 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Yöntem Büyüme ortamları ve kültür koşulları Çalışmada kullanılan bitki büyüme düzenleyicileri, vitaminler, 20 antibiyotik ve biyositler Ceviz bitkilerinden eksplant izolasyonu Sterilizasyon Ön sterilizasyon Yüzey sterilizasyonu Kararma Rejenerasyon Farklı BAP ve IBA konsantrasyonlarının sürgün rejenarasyonuna 25 etkisi BAP ın 10 mg/l dozu ile yapılan ön muamelenin cevizin sürgün 27 rejenerasyonuna etkisi Elde edilen verilerin istatistik değerlendirilmesi BULGULAR ve TARTIŞMA Bulgular Ceviz eksplantlarının in vitro yüzey sterilizasyonu Alt kültüre alma çalışmaları Antioksidan uygulaması Bitki büyüme düzenleyicilerinin (BAP, IBA) cevizin sürgün 38 rejenerasyonuna etkisi BAP ın 10 mg/l dozu ile yapılan ön muamelenin sürgün 41 rejenerasyonuna etkisi Mikro çeliklerin köklendirilmesi Tartışma SONUÇ 52 KAYNAKLAR. 54 iii

9 SİMGELER DİZİNİ AUG: BAP : Augmentin 6-Benzilaminopurine g: Gram mg: µg: Miligram Mikrogram l: Litre ml: µl: IBA: MS: NaOH: HCl: AA: SA: HgCl 2: GA7: EBSS: Mililitre Mikrolitre İndol 3-butirik asit Murashige and Skoog Besin Ortamı Sodyum Hidroksit Hidroklorik Asit Askorbit asit Sitrik asit Civa II kolorür Magenta kabı Eksplant başına sürgün sayısı K1: Kaman 1 ceviz çeşidi K5: Kaman 5 ceviz hattı iv

10 ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 3.1. MS Kültür ortamının kimyasal bileşimleri ve miktarları. 19 Çizelge 3.2. Çizelge 3.3. Çizelge 4.1. Kullanılan bitki büyüme düzenleyicileri, vitaminler, antibiyotik ve biyositlerin dozları ve çözücüleri.. 21 Rejenerasyon çalışması kapsamında ortama ilave edilen BAP ve IBA konsantrasyonları (mg/l). 26 Farklı doz ve sürelerde sodyum hipoklorid uygulanmış Kaman 1 eksplantlarında 15. günde oluşan kontaminasyon ve kararma oranları Çizelge 4.2. Farklı Doz ve Sürelerde Sodyum Hipoklorid Uygulanmış Kaman 1 Eksplantlarında 30. Günde Oluşan Kontaminasyon ve Kararma Oranları Çizelge 4.3. Farklı Doz ve Sürelerde Sodyum Hipoklorid Uygulanmış Kaman 5 Eksplantlarında 15. Günde Oluşan Kontaminasyon ve Kararma Oranları Çizelge 4.4. Farklı Doz ve Sürelerde Sodyum Hipoklorid Uygulanmış Kaman 5 Eksplantlarında 30. Günde Oluşan Kontaminasyon ve Kararma Oranları Çizelge 4.5. Kaman 1 Ceviz Çeşidinde Uygulanan Alt Kültüre Alma Uygulaması Çizelge 4.6. Kaman 5 Ceviz Çeşidinde Uygulanan Alt Kültüre Alma Uygulaması Çizelge 4.7. Kaman 1 Ceviz Çeşidinde Antioksidan Uygulaması 36 Çizelge 4.8. Kaman 5 Ceviz Hattında Antioksidan Uygulaması.. 37 Çizelge 4.9. Kaman 1 Çeşidinde Farklı Dozlardaki Oksin (IBA) ve Sitokinin (BAP) uygulaması. 39 Çizelge Kaman 5 Ceviz Hattında Faklı Dozlardaki Oksin (IBA) ve Sitokinin (BAP) uygulaması 40 Çizelge Kaman 1 Çeşidinde Sitokinin (BAP) Uygulaması v

11 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil Kaman 1 ve Kaman 5 ceviz çeşidine ait 18 bitkiler... Şekil 3.2. Ceviz fidanlarından eksplant izolasyonu Şekil 3.3.a. Tek göz içeren eksplant izalasyonu.. 23 Şekil 3.3.b. 2-3 göz içeren ekplant izolasyonu. 23 Şekil 3.4. Ceviz eksplantlarının musluk suyu altında ön sterilizasyonu 23 işlemi... Şekil 3.5. Ceviz eksplantlarının biyogüvenlik kabini içinde yüzey 24 sterilizasyonu... Şekil 3.6. Eksplantlarda kararmayı önlemek için yapılan alt kültüre 25 alma uygulaması.... Şekil 3.7. Cevizin sürgün çoğaltımında kullanılan en az 2 tomurcuk 27 içeren 6-7 cm boyundaki koltukaltı eksplantlar Şekil 4.1. % 20 sodyum hipoklorid uygulamasında kontaminasyon 33 durumu... Şekil 4.2. % 40 sodyum hipoklorid uygulamasında kontamsiyon 34 durumu... Şekil 4.3. % 60 sodyum klorid uygulamasında kontaminasyon durumu.. 34 Şekil 4.4. Eksplantlar da kararma problemi.. 37 Şekil 4.5. Doku kültüründe elde edilen sürgünler. 40 Şekil 4.6. Kaman 1 ceviz çeşidinde ön muamele ortamına elde edilen 42 sürgün Şekil 4.7. Kloroz ve nekroz semptomları.. 43 Şekil 4.8. Sürgünlerin agardan arındırılması. 43 Şekil 4.9. Sürgünlerin sıvı IBA ile muamalesi. 43 Şekil Torf perlit karışmı bulunan saksılara dikilen üzeri poşetle kapatılan eksplantlar. 44 vi

12 1. GİRİŞ Sistematik olarak ceviz; Bitkiler Alemi, Magnoliophyta (Manolyagiller, Çiçekli Bitkiler) Bölümü, Magnoliopsida (Manolyalar, Çift Çenekliler, Dikotiledon) Sınıfı, Juglandales (Cevizgiller) Takımı, Juglandaceae (Cevizler) Familyası ve Juglans (Ceviz) Cinsine dahil edilmektedir. Ceviz 2n=32 kromozoma ve 25 türe sahip olup, bunların içerisinde en önemli ve ilk akla geleni ise Juglans regia L.'dır. Bu tür, bütün dünyada İngiliz ve İran cevizi olarak bilinmekte ve özellikle meyvesi için yaygın şekilde yetiştirilmektedir. Ceviz (Juglans regia L.) besin değeri yönünden çok zengin bir meyve türüdür. Thiamin, vitamin B6 ve Folacin'i içeren birçok vitamince zengindir. Vitaminlere ilave olarak; demir, çinko, bakır, magnezyum, fosfor ve potasyumca zengindir. Sodyum ve selüloz yönünden ise fakirdir. Meyve türlerinde gümüş içeren tek meyve türü cevizdir. İnsan vücudunda, gümüş iyonuna gereksinim duyulan tek organımız ise beyindir. Gümüş, insan beyninin sağlığının korunmasında etkilidir. Çünkü gümüş iyonu antibakteriyel özellik taşımaktadır. Diğer önemli bir elementte selenyumdur. Ceviz selenyum içeren ender gıdalar arasındadır. Selenyum, önemli antioksidan enzimler olan selenoproteinleri yapmak için proteinlere bağlanır. Selenoproteinlerin antioksidant özellikleri serbest radikaller tarafından verilen hücresel zararı önlemeye yardımcı olur. Serbest radikaller tarafından oksijen metabolizmasının doğal yan ürünleri olup, kanser ve kalp rahatsızlıkları gibi hastalıkların ilerlememesine katkıda bulunabilirler. Diğer selenoproteinler ise troid fonksiyonunun düzenlenmesine yardımcı olurlar ve bağışıklık sistemi içinde rol oynarlar. Ceviz kolesterol içermez, doymamış yağ içeriği ise yüksektir. Ceviz yağının % 58'i linoleik asit, % 12'si linolenik asitten oluşur. Bu iki yağ asidi sağlıklı yaşam için gereklidir. Ceviz, içindeki antioksidanlar, tokofenoller, selenyum ve çinko özel bir ilgi alanıdır. Yağ asitleriyle bileşik halde bulunan ceviz mineral ve vitaminleri sağlık için faydalı olup kalp damar hastalıklarına karşı koruyucu bir etkiye sahiptir. Diğer koruyucu bileşenler bitkisel protein, magnezyum, vitamin E, bakır, folik asit ve potasyum olabilir. Araştırmalar cevizin koroner kalp hastalık riskini azaltıcı bir rol oynadığını ve sağlıklı beslenmede önemli bir gıda olduğunu göstermektedir. Ceviz enerji kaynağı olarak yüksek bir meyve türdür. 100 gr ceviz, 300 1

13 gr ekmeğe, 400 gr bifteğe, 100 gr tavuğa, 950 gr süte eş değer enerji vermektedir. Ceviz düşük lisin : arginin oranı ile birlikte yüksek miktarlarda arginin, fiber, tanenler ve plolifenoller içermektedir (Akça, 2009). Türkiye birçok meyve türünün olduğu gibi cevizin de anavatanı olup ceviz üretimi açısından önemli bir potansiyele sahiptir (Şen, 2011). Henüz arzu edilen seviyelerde olmamakla beraber, ülkemiz ceviz yetiştiriciliği son yıllarda önemli gelişmeler göstermiştir. Giderek bilinçlenen tüketicinin, besin değeri yüksek ceviz meyvesine talebinin artması, üreticilerin ceviz yetiştiriciliğine ilgisinin artmasına neden olmuştur. Bunun sonucunda, her geçen gün sayıları artan kapama bahçeler sayesinde bugün ülkemizde standart ürün bulmak mümkün hale gelmiştir. TÜİK verilerine göre, 2010 yılında meyve veren ağaç sayısı meyve vermeyen ağaç sayısı toplam üretim ton'dur yılı verilerine göre, meyve veren ağaç sayısı meyve vermeyen ağaç sayısı , toplam üretim ton 'dur yılı verilerine göre meyve veren ağaç sayısı meyve vermeyen ağaç sayısı toplam üretim ise ton 'dur. TÜİK verilerine göre 2013 yılında ülkemizde toplam ton ceviz üretimi gerçekleştirilirken 4035 ton ihracat ve tonda ithalat yapılmıştır. FAO verilerine 2012 yılında dünyada en fazla üretim yapan ülkeler sırasıyla; ton ile Çin, ton ile İran, ton ile ABD ve ton ile Türkiye'dir. Ceviz yetiştiriciliği açısından önemli bir potansiyele sahip olan ülkemizde son yıllarda önemli gelişmeler olmasına rağmen gerek üretim miktarı gerekse de ihracat açısından arzu edilen seviyelere ulaşılamamıştır. Bu durumun önemli nedenlerinden bir tanesi, iyi özelliklere sahip, verimi yüksek çeşitlere ait fidan yetiştiriciliğinin yeterli olmamasıdır. Yapılan pek çok seleksiyon çalışması ile ülkemiz doğal popülasyonunda bulunan üstün özellikli tipler belirlenmiş ancak bunların çoğaltılarak yaygınlaştırılması konusunda istenen başarı yakalanamamıştır. Yine yabancı ülkelerden getirilen bazı verimli çeşitlerle az da olsa ülkemizin değişik yörelerinde kapama bahçeler bulunmaktadır. Bu üstün özelliklere sahip çeşitlerin çoğaltılması için, çeşit özelliğini muhafaza edecek vejetatif çoğaltma yöntemlerinin geliştirilmesi, iyileştirilmesi ceviz yetiştiriciliğimize önemli katkılar sağlayacaktır. 2

14 Diğer meyve türlerinde olduğu gibi, cevizde de bir çeşidi, çeşit özelliklerini koruyacak şekilde çoğaltmak, vejetatif çoğaltma yöntemlerinden birinin kullanılması ile mümkün olmaktadır. Vejetatif çoğaltma yöntemlerinde daldırmanın pratik olmaması, çelikle çoğaltmanın bitkinin anatomik ve fizyolojik yapısından kaynaklanan sorunlar nedeniyle köklenme oranının çok düşük olması; cevizin aşı dışındaki diğer vejetatif yollarla çoğaltılmasını önemli ölçüde kısıtlamaktadır (Şen, 2011). Ceviz ağaçlarının vejetatif çoğaltılması denilince akla ilk gelen aşı ile çoğaltmadır. Birçok meyve türünde olduğu gibi, aşı ile çoğaltma, ceviz ağaçlarının çoğaltılmasında da kullanılan en yaygın metottur. Cevizin aşıyla çoğaltılması diğer meyve türlerine göre biraz daha fazla özen ve tecrübe gerektirdiğinden her zaman istenen başarı düzeyi yakalanmamaktadır. Bu nedenle ülkemizde ceviz fidanı talebi yeterli ölçüde karşılanamamakta ve aşılı ceviz fidanları diğer meyve türlerine göre daha yüksek fiyattan satılmaktadır. Vejetatif çoğaltma yöntemlerinden bir diğeri doku kültürü ile çoğaltmadır. Doku kültürü, sahip olduğu avantajla istenilen hatların yoğun şekilde üretilmesine imkan sağlamaktadır. Bu nedenle çeşitli bitki türlerinde tohum, çelik, dallandırma ve aşılama gibi geleneksel çoğaltım yöntemine karşı önemli bir seçenek haline gelmektedir. Ancak meyve türleri ve özellikler sert kabuklu türlerin mikro çoğaltımı otsu bitkilerin mikro çoğaltımına göre oldukça zordur. Bu nedenle seçilmiş sert kabuklu meyve klonlarının mikro çoğaltımında uygun fizyolojik dönem ve eksplant seçimi, kültürlerde tanen ve diğer toksik bileşiklerin zararlı etkilerinin üstesinden gelinmesi, kabul edilebilir sürgün çoğaltım oranının sağlanması, köklü sürgünlerin elde edilmesi son derece önemlidir (Babaoğlu ve ark., 2002). Mikro çoğaltım (klonal çoğaltım); bir bitkiden alınan ve tam bir bitkiyi oluşturabilme potansiyeline sahip bitki kısımlarından yapay besin ortamlarında ve aseptik koşullar altında yeni bitkilerin elde edilmesidir. Bitkilerin in vitro üretiminde mikro çoğaltımın başarısı, eksplantların alındığı anaç bitkinin genotipi, sağlık durumu ve yetişme koşulları ile doğrudan ilişkilidir. Meristem ve sürgün ucu kültürlerinde bitki materyalinin fizyolojik durumu, eksplantın tipi ve büyüklüğü ile alındığı mevsim, çeşit; kültür ortamındaki mineral tuzlar, şekerler, agar, büyüme düzenleyiciler; ışık, sıcaklık, nem, fotoperiyot gibi çevre şartları başarıyı doğrudan etkileyen faktörlerden en 3

15 önemlileridir. Optimal koşullar her genotip için farklı olmaktadır (Babaoğlu ve ark., 2002). Mikro çoğaltım; hastalık ve zararlılardan arındırılmış bitkisel materyal elde edilmesinin yanı sıra kitlesel üretim sağlamaktadır. Üretilen bitkilerin fenotipik ve genotipik olarak benzerlik oluşturması, diğer yöntemlerden daha kısa kültür süresi, zor üretilen türlerin daha kolay üretimi, seçilen belirli/üstün genotiplerin hızlı üretimi, üretimde daha az bitki materyali kullanılması, somaklonal varyasyondan dolayı yeni çeşitlerin/genotiplerin elde edilmesi gibi birçok önemli avantajlara sahiptir. Bu yöntemlerin kullanılmasıyla üretim için temiz materyaller sağlanmakla birlikte, üretim için gerekli süre kısaltılarak üretim esnasında hız ve yoğunluk sağlanmaktadır. Bir tek bitkiden vejetatif olarak çoğaltılan ve aynı genotipi taşıyan bitkiler grubu bir "klon" oluşturmaktadırlar. Çok küçük bitki parçaları (eksplantlar) kullanılarak, laboratuvarda steril koşularda yapılan vejetatif üretim "in vitro çoğaltım yada mikro üretim olarak adlandırılmaktadır. Geleneksel yöntemlerle vejetatif üretimi yavaş, zor hatta imkansız olan bazı bitkilerin klonal çoğaltımı in vitro kültürlerde sağlanabilmektedir. Ayrıca, mikro üretim mevsime bağlı olmadan kontrollü koşularda yıl boyunca yapılabilmektedir. Çoğaltım potansiyelinin fazlalığı, stok bitkilerin muhafaza edilebilmesi, yer ihtiyacının az olması, olumsuz hava koşularında, hastalık ve zararlılara karşı korunma gibi avantajları da vardır. (Emiroğlu ve Gürel, 2005). Klonal çoğaltımda genotipi korumak esas olduğundan in vitro üretimde apikal ve koltuk meristemlerinin yada uygulanması daha kolay olan gelişmesi yine mersitemle sağlanan sürgün uçlarının (tepe tomurcukları) veya aksiller (koltukaltı) tomurcukların kullanılması meristem dokularının genotip bakımından stabil olduğunun bilinmesinden dolayı önemlidir. Bu durum, meristematik hücrelerin DNA sentezi-mitoz düzeninin tam kontrol altında olması, dolayısıyla somatik poiploidiye yol açan ekstra DNA duplikasyonlarının olmaması ve hücrelerin çoğalma yeteneğine zarar veren spontan kromozom yapısı değişikliklerini ve diğer genetik bozuklukları en azından kısmen elimine eden sürekli hücre bölünmesinin olması özelliklerinden kaynaklanmaktadır (Emiroğlu ve Gürel, 2005; D'Amato, 1977). 4

16 Bitki doku kültürlerinde kontaminasyonun sebepleri arasında etkisiz yüzeysel sterilizasyonun neden olduğu akut kontaminasyon ve eksplant içinde gizli olan mikroorganizmaların veya alt kültür sırasında yerleşen mikroorganizmaların neden olduğu kontaminasyon sayılabilir. Ayrıca uzun bir steril kültür döneminden sonra doğal olarak da kronik kontaminasyon meydana gelebilmektedir (Babaoğlu ve ark., 2002). İn vitro doku kültüründe en önemli nokta sterilizasyon işlemidir. Bakteriler en yaygın kontaminasyon kaynağıdır. Bu tür mekanizmalar bitki materyalleriyle gelirler ve iyi yüzey sterilizasyonu yapılmadığı müddetçe problem olurlar. Besin ortamının üzerinde veya içinde beyaz, krem, pembe veya sarı renkte genellikle şeffaf koloniler halinde ortaya çıkarlar. Ayrıca bakteri sporları % alkolde yaşamlarını sürdürebilirler. Funguslar, eksplantla gelebileceği gibi, kültür sonrası hava kaynaklı olabilirler veya afitler tarafından bulaştırılabilirler. Değişik renkte (beyaz, gri, mavi) ve lifli (misel) görünümünde olup genellikle besin ortamının ve kültürlerinin üzerini ağ gibi sararlar. Virüsler ve mikoplazma türü organizmalara kolaylıkla tespit edilemezler. Bu nedenle en tehlikeli olanlarıdır. Çünkü tespit edilemeden kültürden kültüre geçebilirler ve çok uzun süreli bir çalışma başarısızlıkla sonuçlanabilir.. Akut bakteriyel veya fungal kontaminantlar kültürden bir kaç gün sonra ortaya çıkabilir. Bu nedenle sterilizasyon işlemi bütün labaratuvar düzeyinde ele alınmalıdır. Yüzey sterilizasyonu doku kültürü işlemleri sırasında kullanılan en önemli maddeler etil alkol, sodyum veya kalsiyum hipoklorit, civa klorür, gümüş nitrat ve hidrojen peroksittir (Babaoğlu ve ark., 2002) Bitki besin ortamlarında yer alan komponentler kullanım sıklığına göre sırasıyla su, makro elementler, mikro elementler, vitaminler, şekerler, yarı katılaştırıcılar (agar, agaroz), bitki büyüme düzenleyicileridir. Şekerler besin ortamının komponentleri arasındadır. Kültüre alınan bitki hücre ve dokuları yeterli miktarlarda karbonhidrat sentezi yapamadıklarından enerji kaynağı olarak kullanılmaktadır (Babaoğlu ve ark., 2002). İn vitro besi ortamına ilave edilen büyümeyi düzenleyiciler (2,4-D, IBA, IAA, Kinetin, BAP,...vb.) gelişmeyi önemli ölçüde etkilemektedir. Oksinler, doku kültürlerinde tek başına kullanıldıklarında kallus uyarımını, hücre süspansiyonlarının elde edilmesini ve somatik embriyo oluşumunun uyarımını, sitokininlerle birlikte yine kallus oluşumunu, 5

17 sürgün rejenerasyonunu ve somatik embriyo oluşumunun uyarılmasını sağlayabilirler. Ayrıca elde edilen sürgünlerin köklendirilmesinde vazgeçilmez bir kullanıma sahiptirler (Babaoğlu ve ark., 2002). Birçok odunsu bitkide olduğu gibi cevizin doku kültürü ile çoğaltılmasında karşılaşılan en önemli problem kültür ortamında ortaya çıkan kararmalardır. Kararma eksplantın kesim yüzeyinden sızan fenollerin oksidasyonu sonucunda oluşmaktadır. Bu sorunun üstesinde gelmek için ortama polivinil pirrolidone (PVP), sitrik asit, askorbik asit, aktif kömür, tiyoüre, L-sisteine, glutamine, aspargine, argenine gibi antioksidant maddeler ilave edilmekte veya sık sık alt kültüre alma yoluna gidilmektedir (Rout ve ark, 1999; Pierik., 1987). Fenollerin oksitlenmesinde rol alan polifenol oksidaz enzim aktivitesinin ışık tarafından teşvik edildiği göz önüne alınarak, inokülasyondan sonra, kültürleri 1 veya 2 gün tam karanlıkta bekletmenin kararmayı engellemede etkili olabileceği de bildirilmiştir (Pittet ve Moncousin, 1981). Cevizin yetiştiriciliğinin gelişmiş olduğu ülkelerde cevizin doku kültürü ile çoğaltılması konusunda çok sayıda çalışma yapılmış ve önemli bilgi birikimleri elde edilmiştir. Bu çalışmaların çoğunda kültür ortamına ilave edilecek uygun gelişme düzenleyici konsantrasyonu üzerinde durulmuştur (Revilla ve ark. 1989; Penuela ve ark. 1988; Rodriguez ve ark. 1993). Bazı araştırıcılar cevizin doku kültürü ile çoğaltılmasında karşılaşılan en önemli problemlerden birisinin fenolik maddelerden kaynaklanan kararmanın olduğunu ifade etmişlerdir (Claudot ve ark., 1992; Leslie ve McGranahan, 1992). Navatel and Bourrain (2001), sürgün oluşum oranı ve sürgün uzunluğu açısından genotipler arasında önemli farklılıkların oluştuğunu bildirmiştir. Ceviz gibi ekonomik değeri yüksek olan bir meyve türünün doku kültürü ile çoğaltılması konusunda yurt dışında çok sayıda çalışma yapılmış olmasına karşılık ülkemizde bu konuda yapılmış yeterli sayıda çalışma bulunmamaktadır. Yapılmış olan çok az sayıdaki çalışmada ise istenen başarının yakalanamadığı bildirilmiştir (Fidancı 2005). Ceviz yetiştiriciliğinin gelişmiş olduğu bazı ülkelerde de başlangıçta başarısız sonuçlar alınmasına rağmen, ısrarla çalışmalara devam edilmiş ve bugün cevizin doku kültürü ile çoğaltılması konusunda belli bir başarı seviyesi yakalanmıştır. Benzer 6

18 şekilde ülkemizde de bu konuda yapılacak farklı çalışmalardan elde edilecek sonuçlarla pratikte kullanılabilecek bir başarı düzeyine ulaşılabilir. Bu gerçekler göz önüne alınarak bu çalışmada ülkemiz ceviz yetiştiriciliğinde önemli bir yere sahip olan Kaman1 ceviz çeşidi ve Kaman 5 cevizinin doku kültürü ile çoğaltılabilme olanaklarının belirlenmesi amaçlanmıştır. 7

19 2. KAYNAK ÖZETLERİ Strode ve Abner (1986), in vitro koşullarda yapılan mikro çoğaltma ekolojik koşullardan bağımsız olarak yapılmakta ve klasik yöntemlerle çoğaltmaya alternatif bir yaklaşım sağlamaktadır. Bu ise büyük boyutlarda yapılan mikro üretim çalışmalarıyla yüksek potansiyelde hız, zaman ve yerden kazanç sağlamaktadır. Kyte (1987), Doku kültüründe en önemli aşama sterilizasyon işlemidir. Bakteriler en yaygın kontaminasyon kaynağıdır. Bu mikroorganizmalar bitki materyalleri ile gelirler. Benzer şekilde funguslar da explantlarla kültür ortamına taşınabilir. İyi yüzey sterilizasyonu yapılmadığı müddetçe bu mikroorganizmalar kültür ortamında ciddi problemlere neden olurlar. Doku kültürü çalışmalarında, bitki kısımlarının yüzeysel olarak bakteri, mantar ve benzeri organizmalardan temizlenebilmesi için gerekli olan optimum dezenfektan türleri, konsantrasyonları ve kullanım süreleri birbirinden farklılık göstermektedir. Bundan dolayı, bir sterilizasyon çalışmasında en etkili ve en düşük seviyede dezenfektan dozunun belirlenmesi önemlidir. Robert ve Phiplipse (1990), J.regia, J. cinerea, J.nigra türleri ile hibrit Paradox anaçları ile yaptıkları çalışmalarında, henüz odunlaşmammış genç sürgünlerin 5-7 cm lik nodal segmentlerini akan musluk suyu altında 4 saat yıkanmışlar ve eksplantları % 0,1'lik tween-20 eklenmiş % 9-11'lik kalsiyum hipoklorit solüsyonu ile dakika süresince steril edilmişlerdir. En sonunda eksplantları distile su ile çalkalanmışlardır. Gotea ve ark. (2012), Chandler, Franquette ve Jupaneşti ceviz çeşitleri ile yaptıkları çalışmada, 2-3 yıllık genç ağaçlardan aldıkları tek nodlu eksplantları (1 ve 1.2 cm) deterjanlı su ile yıkadıktan sonra iyice durulamışlar ve alkolle muamele ettikten sonra %5'lik sodyum hipoklorit ile steril edip steril saf su ile yıkamışlardır. Fidancı (2005), ceviz eksplantlarını önce musluk suyu, daha sonra içerisine konan sıvı bulaşık deterjanı (10-20 ml/l) ile 3-5 dakika yıkanmış ve köpükten arınıncaya kadar yıkama işlemine devam edilmiştir. Yıkama işleminden sonra eksplantları %96'lık alkol ile 2-3 dakika kadar muamale ettikten sonra tekrar 3-4 defa bidistile su ile yıkanmıştır. Son olarak bir kaç damla twen -20 damlatılan %10'luk sodyum hipoklorit solüsyonda 20 dakika zaman zaman karıştırılarak bekletilmiş ve 3-4 dakika bi distile su ile yıkanmıştır. 8

20 Rios Leal ve ark. (2007), olgun ceviz ağaçlarından alınan eksplanatlarla yapılan çoğaltmada bünyesel kontaminasyonun önemli bir problem olduğu, diğer taraftan yüzey sterilizasyonu aşamasında dokularda meydana gelen oksidasyonun düşük oranda sürgün oluşumuna neden olduğu; bu sorunun, dezenfeksiyon işlemine daha dayanıklı, yarı odunlaşmış sürgün parçaları seçilerek aşılabileceği kaydedilmektedir Robert ve Phiplipse (1990), eksplant kaynağı olarak kullanılan bitkisel materyalin yetiştiği koşulların önemli olduğu vurgulamış ve sera ortamından ve fidanlıklardan alınan eksplantları sterilizasyon başarısı açısından değerlendirmişlerdir. Sera ortamından alınan J.regia ve J nigra eskplantlarında hiç kontaminasyon gözlenmemiş, J. cinerea'da sadece %13.6 oranında kontaminasyon oluşmuştur. Ancak fidanlıktan alınan Paradox çeşidinde %67.8 oranında yüksek kontaminasyon meydana gelmiş. Ellialtıoğlu (1999), bitki hücrelerinden eksplant hazırlama işlemi sırasında yapılan kesimler nedeniyle, okside olan ve ortamın kararması veya eksplantın kahverengileşmesine neden olabilen bileşiklerin açığa çıkması söz konusu olmaktadır. In vivo koşullarda bu maddelerin, zarar görmüş dokuları çeşitli hastalıklardan koruyucu işlevleri bulunabilir. In vitro koşullarda ise, oksidasyon ürünleri, eksplantlara otoinhibitör etkisi yapmakta, atık maddelere benzer bir nitelik taşımaktadır Birçok türde, özellikle odunsu bitkilerde eksplantın dikiminden sonraki ilk dakika, saat veya günler içerisinde besin ortamının içerisine doğru gelişen kararmalar ortaya çıkabilmektedir. Eğer önlem alınmazsa, bu kahverengileşmeler öldürücü boyutlara ulaşabilmektedir. Rios Leal ve ark (2007) cevizin mikro çoğaltımında en önemli problemin kültür ortamında kararmaya neden olan fenolik madde akıntısının olduğunu bildirmişlerdir. Lenartowicz ve Millikan (1977), ceviz (Juglans nigra L.) eksplantlarının büyüklüğü, başlangıçtakinin 8 katına ulaştığında, öldürücü kahverengileşmenin ortaya çıktığından bahsetmektedir. Rodriguez R.,(1982), Juglans nigra türünde, doku kültüründe kallus oluşumu sağlamış, ancak çok fazla tanen oluşumu nedeniyle bu kalluslardan organ oluşumunun mümkün olamadığını belirmiştir. Ellialtıoğlu (1999), ana bitkinin yaşı ve eksplantın alındığı gövde yeri, in vitro koşullarda dokuların ilk gelişim aşamaları üzerinde çok etkilidir. Kararmaya neden olan 9

21 fenollerin konsantrasyonu, yaşlı gövdelerde (çoğunlukla bazal kısımlarda), genç gövdelere (çoğunlukla apikal kısımlarda) göre çok daha yüksektir. Ayrıca yaşlı kısımlar, gençlere göre fenolik bileşiklerin çok çeşitli tiplerini içermektedir. Muhitch ve Fletcher (1984), Paul s Scarlet çeşidi gülün (Rosa sp.) genç dokularının, yaşlı dokulardan daha kolay kültüre alınabildiğini bildirmektedirler. Araştırıcılar ayrıca, kültüre alınmış bitkilerde kültürün uzun süre devam etmesi sonucunda bu eksplantlarda fenol konsantrasyonunun ve sentezlenmesinin; yeni kurulmuş kültürlere oranla daha az ve düşük olduğunu kaydetmektedirler. Ellialtıoğlu (1999), kültür ortamında oluşan kararmaları önlemek için farklı uygulamalar yapılmıştır. Eksplantın kültür ortamına dikilmesinden önce, belli çözeltilerde bekletme işleminin, salgılamanın azaltılmasında etkili bir yöntem olduğunu bildirmektedir. Rodriguez (1982), ceviz kotiledonlarını akan çeşme suyu altında belli bir süre tutmuş ve bu uygulamanın ortam kararmasında etkili olduğunu bildirmiştir. Chevre ve ark.(1983), kestane eksplantlarını steril suda 3 saat bekletmiş, aynı zamanda düşük tuz konsantrasyonuna sahip ortam kullanmıştır ve bu kombinasyonun, ortam kararmasındaki azalmada en etkili yöntem olduğunu belirtmişlerdir. Vieitz ve ark. (1983), ise kestane eksplantlarını hazırladıktan sonra 2-3 saat distile suda bekletmenin kararmaya neden olan maddelerin salgılanmasını azalttığını bildirmişlerdir. Rout ve ark. (1999), eksplantın kesim yüzeyinden sızan fenolik maddelerin oksidasyonu sonucunda kültür ortamında oluşan kararmanın, kültür ortamına ilave edilecek polivinil pirrolidon (PVP), sitrik asit, askorbik asit, aktif kömür, thiourea, L-sistin, glutamin, asparjin ve argenin gibi bazı antioksidan maddelerle çözülebileceği kaydedilmiştir. Tekinsoy (1991), cevizin (Juglans regia L.) doku kültürü ile çoğaltılması sırasında karşılaşılan, fenolik oksidasyon nedeniyle oluşan, kahverengileşme sorununun çözüm olanaklarını araştırmıştır. Bu amaçla, antioksidant maddelerle ( Askorbik asit + Sitrik asit, Na-DIECA, PVPP ) ön işlem uygulamaları, antioksidant maddelerin (askorbik asit + sitrik asit, PVP, DDT, Aktif kömür ) besin ortamına katılması ve hızlı transfer (saat ve gün aralıklı) uygulamalarının etkilerini incelemiştir. Araştırma sonucunda, 10

22 eksplantta kahverengileşme, eksplanatın gelişmesi ve yaşaması açısından olumlu sonuçlar aldığını, eksplant ve ortam kahverengileşmesini azaltma ve canlı eksplant oranını arttırma yönünden en iyi sonuçların sırasıyla besin ortamına 100 mg/l askorbik asit + sitrik asit katılması ve besin ortamına 5 g/l PVP eklenmesinden aldığını bildirmiştir. Tekinsoy ve Gülşen (1993), ise ceviz sürgün uçlarında in vitro koşullarda ortaya çıkan kahverengileşme olayına çözüm bulmak amacıyla yapmış oldukları çalışmalarında, 150 mg/l sitrik asit mg/l askorbik asit katılan besin ortamlarında, kahverengileşmenin önemli ölçüde azaldığını, ancak yine de başarılı bir gelişme sağlanamadığını kaydetmişlerdir. Araştırıcılar doku kahverengileşmesi sorununa karşı, besin ortamına sitrik asit ve askorbik asit karışımı ilave edilmesinin, sürgün ucu dokularının daha uzun süreyle canlı kalmalarını ve başlangıç aşamasında salgılama olayını kontrol altında tutup geciktirdiğini, buna karşılık tam bir çözüm sağlayamadığını ve eksplant gelişiminin de istenen düzeyde olamadığını ifade etmişleridir. Ellialtıoğlu (1999), kararmanın giderilebilmesi için eksplantlara doğrudan uygulanan veya besin ortamında kullanılan antioksidant maddeler, her zaman tutarlı sonuçlar vermemektedir. Kararmanın önüne geçebilmek için genellikle kullanılan teknik; doku gelişmesini engelleyici nitelikteki okside olan polifenolik bileşikleri içeren eksplantların ön çözeltilere batırılması ve kültüre aldıktan sonra hızlı transferdir. Bunlar pahalı ve zaman alıcı olmakla birlikte, bazı bitki cinslerinde eksplantların ilk dikim aşaması için zorunlu görünmektedir. Anderson (1975), Rhododendron sürgün ucunun yeşil kısımlarını her 3 haftada bir taze ortama alındığında canlılıklarını sürdürdüğünü bildirmiştir. McGranahan ve ark (1988) katı ortamda kültüre alınan ceviz eksplanlanlarının bir hafta aralıklarla taze ortamlara alınmasını tavsiye etmektedir. Curir ve ark. (1986), ceviz eksplantlarının 3 gün boyunca aktif kömür içeren ortamda bekletildikten sonra, taze ortama transfer edilmesinin, ilk eksplant gelişimini artırmada oldukça etkili olduğunu ifade etmiştir. 11

23 Pittet ve Moncousin (1981), fenolik maddelerin oksitlenmesinde etkili olan polifenol oksidaz enzim aktivitesinin ışık tarafında uyarıldığını, bu yüzden kültüre almadan önce eksplantları bir veya 2 gün boyunca karanlıkta bekletmenin kararma problemini azaltmada etkili olduğunu vurgulamışlardır. Payghamzadeh and Kazemitabar (2008), kararmayı önlemek için iki farklı ortam kullanmışlar. Tek fazlı ve değişik konsantrasyonlarda 6-benzil aminopurin (BAP) içeren birinci ortam ile alt fazına aktif kömür, sıvı DKW ortamından oluşan üst fazına ise BAP ilave edilmiş ikinci ortamı karşılaştıran araştırıcılar, iki fazlı ikinci ortamdan daha iyi sonuç aldıklarını kaydetmişlerdir. Bu araştırıcılar denedikleri BAP konsantrasyonları arasında en iyi sonucu 8.9 μm dan aldıklarını ifade etmişlerdir. Somers ve ark. (1982), BA konsantrasyonu ile siyah ceviz kültürlerinde ortam kararmasını azaltmak üzere kullanılan diğer yöntemler arasında önemli derecede ilişki bulunduğunu belirlemişlerdir. 1.0 mg/l BA düzeyinde, hızlı transfer tekniği kullanılması halinde sürgün sayısının arttığını ve kahverengileşmede büyük oranda azalma meydana geldiğini belirlemişlerdir. Fidancı (2005), cevizin doku kültürü ile çoğaltılmasında, en önemli problemin bulaşma ve kararma olduğunu, explantların salgıladığı fenollerin oksidasyonu sonucu oluşan kararmaların eksplantların ölümüne yol açtığını, kararma oranının kullanılan ortam ve explant tipine bağlı olarak değişim gösterdiğini bildirmiştir. Araştırıcı Şebin ve KR-2 ceviz çeşitleri ile yaptığı denemelerde farklı ortamları kullanmış ve MS ile WPM ortamında DKW ortamına göre daha fazla oranda kararma olduğunu kaydetmiştir. Meristem kültürü ve sürgün ucundan aldığı explantların tamamının kültür ortamında, kararma nedeni ile canlılığını kaybettiğini ifade etmiştir. Cevizin doku kültürü ile çoğaltılması konusunda yapılan ilk çalışmalarda daha çok uygun ortamın belirlenmesi üzerinde durmuşlardır. Cheng (1975), Murashige and Skoog (MS) (Murashige and Skoog, 1962), B5 (Gamborg ve ark. 1968) ve Woody Plant Media (WPM) (LIoyd ve McCown 1981) ortamları kullanılmıştır. Daha sonra bu ortamlarla yapılan çalışmalarda karşılaşılan bazı problemleri çözmek için ceviz türlerine özel DKW ortamı geliştirmiştir (McGranahan ve ark 1987). Bazı araştırıcılar bu ortamın ceviz türlerinde kullanılabileceğini bildirmektedir (Cornu ve Jay-Allemand 1989, 12

24 McGranahan ve ark. 1988). Diğer bazı araştırıcılar ise MS ortamında başarılı sonuçlar aldıklarını ifade etmektedirler (Revilla ve ark 1989; Gruselle ve Boxus 1990; Kornova ve ark. 1993). Leslie ve McGranahan (1992), Cevizin doku kültürü ile çoğaltılmasında ortam katılaştırıcısı olarak kullanılan maddenin de başarıyı etkilediği bildirilmektedir. DKW ortamında katılaştırıcı olarak kullanılan agarın ceviz doku kültüründe gelişmeyi yavaşlattığını ve yapraklarda sararmaya neden olduğunu, bunun yerine Gelrite kullanmanın daha uygun olduğunu kaydetmişlerdir. Diğer bazı araştırıcılar ise DKW ortamında Gelrite kullanıldığı zaman camlaşmanın artığını kaydetmektedir (Revilla ve ark 1989; Gruselle ve Boxus 1990; Kornova ve ark. 1993). Leslie ve McGranahan (1992) ise kendi çalışmalarında, kültür kaplarının ağzı sıkıca kapatılmadığı sürece camlaşma problemi ile karşılaşmadıklarını ifade etmişlerdir. Cornu ve Jay-Allemand (1989), bu iki farklı katılaştırıcı ortamı karşılaştırdıkları çalışmalarında, Gelrite kullandıkları ortamda, ikinci transferden sonra sürgün uzaması ve kallüs oluşumunun belirgin şekilde daha hızlı olduğunu kaydetmişlerdir. Barbas ve ark. (1993), da Gelrite in sürgün uzaması ve tomurcuk oluşumunu teşvik ettiğini buna karşılık agarın engelleyici etkisinin olduğunu bildirmiştir. Saadat ve Hennerty (2002), cevizin doku kültürü ile çoğaltılması üzerine farklı besi ortamları ve farklı katılaştırıcı maddelerin etkisini araştırdıkları çalışmalarında, en uygun ortamın Phytagel ile katılaştırılmış DKW ortamı olduğunu vurgulamışlardır. Araştırıcılar DKW ile MS ortamı arasında önemli bir farkın olmadığını, buna karşılık her iki ortamında WPM ortamından daha iyi sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Katılaştırıcı olarak Phytagel ile Difco Bacto agarı tek başına ve karışım halinde kullanan araştırıcılar tek başına kullanılan Phytagel den daha iyi sonuç aldıklarını ifade etmişlerdir. Cornu ve Jay-Allemand (1989) cevizde mikro çoğaltımın birçok faktöre bağlı olduğunu, en önemli faktörün ortamın özellikleri olduğunu ve katı olarak hazırlanan ortama sonradan sıvı ortam ilave etmenin başarıyı artırdığını vurgulamışlardır. 13

25 Cevizin doku kültürü ile çoğaltılması konusunda en uygun gelişme düzenleyici kombinasyonunu belirlemek için birçok çalışma yapılmıştır. Revilla ve ark (1989) genç ana bitkilerin boğum kısmından alınan ceviz explantlarının doku kültüründe çoğaltılması için en uygun gelişme düzenleyici kombinasyonun 1 mg/l 6- benzilaminopürin (BA) ve 0.1 mg/l indol-3-butirik asit (IBA) olduğunu iddia etmektedirler. Bu araştırıcılar daha yüksek BA konsantrasyonlarının morfolojik bozukluklara ve sonunda da camlaşmaya yol açtığını kaydetmişlerdir. Penuela ve ark. (1988), da MS ortamında sürgün çoğaltma aşaması için en uygun sitokinin konsantrasyonunun 1 mg/l BA olduğunu vurgulamıştır. Rodriquez ve ark (1993) ise en iyi sürgün çoğalma oranının 1 mg/l BA, 2 mg/l kinetin ve 0.01 mg/l IBA ilave edilmiş MS ortamından alındığını rapor etmiştir. Grusella ve ark (1987), cevizin doku kültürü ile çoğaltılması üzerine yaptıkları çalışmalarında, sürgün oluşumu üzerine farklı sitokinin türleri ve konsantrasyonlarının etkilerini denemişler; 2ip ve kinetinin etkisinin düşük olduğunu en iyi sonucu 1 mg/l BAP uygulamasından aldıklarını ifade etmişlerdir. Araştırıcılar BAP ile kombine ederek denedikleri GA 3, NAA ve IBA uygulamaları arasında ise 0.1 mg/l IBA uygulamasının biraz daha iyi sonuç verdiğini kaydetmişlerdir. Araşırcılar çok sayıda küçük sürgün oluştuğunu, yapraklarda nekrozlar oluştuğunu bildirmişleridir. Proliferasyon aşamasında elde edilen kısa sürgünleri uzatmak için, bu sürgünler farklı konsantrasyonda GA3 veya aktif kömür içeren ortamlara şaşırtılmış ve en iyi sürgün uzunluğu 0.1 mg/l GA3 içeren ortamdan elde edilmiş. Saadat ve Hennerty (2002), cevizde uygun gelişme düzenleyici konsantrasyonunu belirlemek amacıyla yürütülen bir başka çalışmada, sürgün çoğaltım aşaması için en uygun kombinasyonun 1 mg/l BA ve 0.01 mg/l IBA; sürgün uzama aşamasında ise 0.4 mg/l BA ve 0.01 mg/l IBA olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmada oksin kaynağı olarak IBA, IAA ve NAA da karşılaştırılmış ve ortamda 1 mg/l BA olduğunda, taze sürgün ağırlığı açısından IBA dan daha iyi sonuç alındığı belirlenmiş. IBA konsantrasyonları arasında ise sürgün sayısı açısından 0.1 mg/l IBA ile 0.01 mg/l IBA arasında önemli bir farkın oluşmadığı, buna karşılık sürgün morfolojisinin 0.01 mg/l IBA içeren ortamda daha iyi olduğu görülmüştür. 14

26 Al-Mizory ve Mayi (2012), cevizde nodal eksplantlarla yaptıkları çalışmalarında, proliferasyon aşamasında kinetine göre BA dan daha iyi sonuç aldıklarını kaydetmişlerdir. Aynı çalışmada BA ile kinetin ve BA ile NAA nın farklı kombinasyonları kullanılmış ve 2 mg/l BA+ 1 mg/l kinetin kombinasyonundan iyi sonuçların alındığı bildirilmiştir. Vahdati ve ark (2004), cevizde doku kültürü ile çoğaltmada başarının çeşitlere bağlı olarak önemli oranda değişim gösterdiğini bazı çeşitlerde tam olarak anlaşılamayan nedenlerden dolayı başarının çok düşük olduğunu bildirmektedirler. Benzer şekilde Navatel ve Bourrain (2001) de doku kültürü ortamında elde edilen sürgün sayısı ve sürgün uzunluğu açısından çeşitler arasında önemli farklılıkların oluştuğunu kaydetmişlerdir. Rios Leal ve ark (2007), cevizin mikro çoğaltımında, proliferasyon oranının ilk alt kültürlerde düşük olduğunu, taze ortamlara transfer edilen daha sonraki alt kültürlerde ise bu oranın arttığını bildirmişlerdir. Cheniany ve ark (2010), cevizin doku kültürü ile çoğaltılmasında, önemli bir aşamada elde edilen mikro çeliklerin köklendirilmesidir. Bu aşamada da ciddi oranda zorluklarla karşılaşılmaktadır. Köklenme oranı açısından çeşitler arasında önemli farklılıkların oluştuğunu, Sunland çeşidine ait mikro çeliklerde % 66 oranında, Howard çeşidinde ise % 29 oranında köklenme başarısı elde ettiklerini bildirmişlerdir. Aynı araştırıcılar çelik başına kök sayısı açısından da çeşitler arasında önemli farklılığın oluştuğunu; Sunland çeşidinde çelik başına ortalama 2.6, Howard çeşidinde ise 1.6 adet kök elde ettiklerini kaydetmişleridir. Grusella ve ark. (1987), doku kültürü ile çoğaltmada, sürgün gelişim aşamasında sitokinin, köklenme ortamında ise oksin grubu hormonların etkisi belirleyicidir. Doku kültürü ortamında elde ettikleri ceviz mikro sürgünlerde en iyi köklenmenin MS ortamına ilave edilen 2 mg/l IBA uygulamasından elde ettiklerini, bu ortamda kültüre alınan çeliklerin sadece % 30 unda köklenme olduğunu, köklenen çeliklerin ise % 20 sinin dış ortama şaşırmadan sonra canlı kalabildiğini bildirmişlerdir. 15

27 Fidan (2005), Şebin ve KR-2 çeşitlerinde yaptığı çalışmalar sonucunda, en yüksek köklenme oranını, kültür ortamına ilave edilen 4 mg/l IBA dan aldığını, buna karşılık köklenen bitkilerin dış ortama şaşırtılmasında başarı elde edilemediğini kaydetmiştir. Al-Mizory ve Mayi (2012), MS ortamında, köklenme oranı açısından IBA nın IAA dan daha etkili olduğunu, kökleneme oranı açısından 0.5 mg/l IBA, çelik başına kök sayısı açısından ise 1 mg/l IBA nın daha etkili olduğunu bildirmişlerdir. Fidancı (2005), Şebin ve KR2 ceviz çeşitleri ile yaptığı çalışmada, 16 saat aydınlık 8 saat karanlık kültür ortamında 4-6 haftalık bir gelişimden sonra elde ettiği 3-5 cm uzunluğundaaki mikro çelikleri, 1, 2, 3, 4 ve 5 mg/l IBA içeren köklendirme ortamlarına aldığını ve 30 günün sonunda en yüksek köklenme oranının her iki çeşitte de IBA'nın 4mg/l dozundan aldığını ifade etmiştir. Jay-Allemand ve ark (1992), köklenme ortamına vermikülit ilave edildiğinde, köklenme oranı ve kök sayısının artığını bildirmişleridir. Araştırıcılar, bu etkinin vermikülit içeren köklenme ortamında havlanmanın daha iyi olmasından kaynaklanmış olabileceğini işaret etmişlerdir. Jay-Allemand ve ark (1993), doku kültürü ortamında, ceviz mikro çeliklerinin köklenmesi üzerine etki eden faktörleri araştırdıkları çalışmalarında, sürgün üzerindeki gözleri uzaklaştırma işleminin ve bir flavon olan mirisitin içeren ortamda bir süre bekletmenin köklenme oranını önemli derecede artırdığını bildirmişlerdir. Nemnth (1986), doku kültürü ortamında köklenmenin genetik yapı, eksplant alınan bitkinin yaşı, gelişme düzenleyici, fenolik madde içeriği, kültür ortamında elde edilen sürgünün kalitesi, peroksidaz aktivitesi, fotoperiyod, ışık yoğunluğu gibi birçok faktörden etkilendiği bilinmektedir. Birçok odunlu bitkinin köklendirilmesinde, ilk bir hafta buyunca karanlık bir ortamda bekletmenin gerekli olduğu bildirilmektedir (Rugini and Verma 1983). Rugini ve ark (1993) ise cevizde sadece sürgünün alt kısmının karanlıkta bırakılmasının daha etkili olduğunu rapor etmiştir. Rugini ve ark (1993), putrescin uygulamasının elma ve zeytin mikro çeliklerinde köklenmeyi artırdığını buna karşılık cevizde azalttığını, bu durumun türler arasında bünyesel poliamin içeriğindeki farklılıktan kaynaklanmış olabileceğini bildirmişlerdir. 16

28 Ruguni ve ark. (1999), cevizde doku kültürü ile çoğaltmada başarının çeşitlere bağlı olmakla birlikte genel anlamda zor olduğu, kararma nedeni ile sürgün oluşum oranının düşük ve gelişmenin yavaş, mikro çeliklerin köklendirilmesinin zor, kültür ortamında elde edilen köklü bitkiciklerin dış ortama aktarılmasında büyük oranda kayıpların yaşandığı bildirmişlerdir. Diğer taraftan dış ülkelerde uzun yıllar boyunca yapılan çok sayıda çalışma sonucunda belli başarı düzeyleri yakalanmış olmasına karşılık, ülkemizde bu konuda çok az sayıda çalışma yapılmıştır. Bu durum göz önüne alınarak bu çalışmada, Kaman 1 ceviz çeşidi ve Kaman 5 ceviz genotiplerinin doku kültürü ile çoğaltılabilme başarısının belirlenmesi amaçlanmıştır. 17

29 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal Çalışma Kırşehir ili Ahi Evran Üniversitesi Ziraat Fakültesin Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Bitki Doku kültürü Laboratuarında yürütülmüştür. Çalışmada, Kaman 1 ve Kaman 5 ceviz çeşitlerinin aşılı fidanlarından alınan eksplantlar kullanılmıştır. Bu amaçla her iki ceviz çeşidinden 125 adet aşılı fidan Kırşehir ili Kaman ilçesi ceviz üretim merkezinden temin edilmiştir. Eksplantlar, 3 aylık aşılı fidanların koltuk altı (aksiller) tomurcuklarından alınmıştır. Eksplantlar fidanlarda sürgün gelişiminin en aktif olduğu Mayıs ayından itibaren izole edilerek kullanılmıştır. Şekil Kaman 1 ve Kaman 5 ceviz çeşidine ait bitkiler 3.2. Yöntem Büyüme ortamları ve kültür koşulları Denemelerde, % 3 lük sukroz (Sucrose Craystallized Duchefa, S ) ilave edilmiş MS besin ortamı (Murashige and Skoog 1962) (MSO) kullanılmıştır (Çizelge 3.1). Besin ortamının ph sı 1N NaOH ya da 1N HCl kullanılarak bitki gelişimi için en uygun değer olan e ayarlanmıştır. Otoklavlanmadan önce ortama % 0.65 lik agar (Duchefa Biochemie, P ) katılaştırmak amacıyla eklenmiştir. Ortam 18

30 hazırlığında çift distile su kullanılmış olup; gerektiğinde besin ortamına farklı konsantrasyonlarda bitki büyüme düzenleyicileri (sitokinin ve oksinler) de ilave edilmiştir. Ortamın sterilizasyonu otaklavda 1.2 atmosfer basınç altında ve C de 20 dk. tutularak sağlanmıştır. Tüm kültürler Philips beyaz floresan ışığı (Preheat Daylight/42 µmol photons m -2 s -1 ) altında 16 saat ışık 8 saat karanlık fotoperiyodunda 24±2 0 C sıcaklıkta tutulmuştur. Çizelge 3.1. MS Kültür ortamının kimyasal bileşimleri ve miktarları Makro Elementler Mikro Elementler Vitaminler Ortamda Ortamda Ortamda bulunan Konsantrasyon bulunan Konsantrasyon bulunan Konsantrasyon maddeler (mg/l) maddeler (mg/l) maddeler (mg/l) NH 4 NO Kl 0.83 Myo- Inositol KNO H 3 BO Nicotinic Acid CaCl 2. 2H 2 O 440 MnSO 4.4H 2 O Pyrotinic Acid MnSO 4.7H 2 O 370 ZnSO 4.7H Thiamine- HCl KH 2 PO Na 2 MoO 4.2H Glycine CuSO 4. 5H CoCl 2. 6H 2 O Fe 2 (SO 4 ).7H 2 0 Na 2EDTA.2H

31 1 litre MS ortamı hazırlamak için; 1000 ml lik behere 600 ml distile su konulmuş ve içine uygun büyüklükte bir balık atılarak manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirilmiştir. Behere, 4.4 gr MS (Sigma, M5519) ve 30 g sukroz (Duchefa, S ) eklenmiştir. Hacim distile su ile 1000 ml ye tamamlanmıştır. Besin ortamının ph sı 1N NaOH ya da 1N HCl kullanılarak e ayarlanmıştır. Otoklavlanmadan önce ortama % 0.65 lik agar (Duchefa Biochemie, P ) katılaştırmak amacıyla eklenmiştir. Şişe kapağı sıkılanmadan otoklava yerleştirilmiş ve ortam steril edilmiştir. Daha sonra biraz soğutularak steril kabindeki önceden steril edilmiş olan magenta kaplarına, her birinde 50 ml olacak şekilde dökülmüştür. Ortamların yaklaşık yarım saat süre ile soğutularak katılaşması sağlanmış ve magentaların kapakları kapatılarak kenarları streç film ile kaplanmıştır. Besin ortamlarının taze olarak kullanılması gerektiğinden her alt kültür öncesinde, yeni besin ortamları gerekli miktarda hazırlanarak kullanılmıştır Çalışmada kullanılan bitki büyüme düzenleyicileri, vitaminler, antibiyotik ve biyositler Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler Sigma Aldrich Chemical Co.(St Louis,M.O) dan temin edilmiştir. Bitki büyüme düzenleyici vd. nin dozları uygun çözücülerde çözüldükten sonra standart şekilde istenilen miktarlarda ve oranlarda stok solüsyonları hazırlanmıştır (çizelge 3.2). Bitki büyüme düzenleyici dozları, ortamlar otoklavda steril edilmeden önce ilave edilmiştir. Hazırlanan bitki büyüme düzenleyicilerinin stok solüsyonları +4 0 C de 3 ay saklanmıştır. 20

32 Çizelge 3.2. Kullanılan bitki büyüme düzenleyicileri, vitaminler, antibiyotik ve biyositlerin dozları ve çözücüleri Bitki büyüme Çözücü Seyreltme sıvısı Saklama koşulları düzenleyicileri Oksinler IBA(Indole-3-butyric acid) 1 N Su +4 0 C NaOH Sitokininler BAP(6-Benzylominopurine) 1 N Su +4 0 C NaOH Vitaminler Askorbik asit Su Su +4 0 C Sitrik asit Su Su +4 0 C Antibiyotik Augmentin (stok solüsyon 100 mg/l dir; cevizde kullanılan konsantrasyonu 500 mg/l su su C Biyosit Fungisit (Captan WP ıslanabilir toz) su su Oda koşullarında Fungusit (safa) captan 50 WP 50 gr tartılıp 5 lt suya eklenerek 1 'er hafta aralıklarla 3 hafta süresince ilaçlama yapılmıştır. 21

33 Antibiyotik Augmentin 600/42.9 mg sulandırılmış dozu 25 0 C 'nin altında depolanmış süspansiyon ise C'de en fazla 10 gün depolanmıştır Ceviz bitkilerinden eksplant izolasyonu Çalışmada Kaman 1 ve Kaman 5 ceviz çeşidinin tepeden itibaren 1 3' üncü koltuk altı tomurcukları keskin uçlu budama makasıyla kesilerek izole edilmiştir. Çalışmanın başlangıç aşamasında tek tomurcuk içeren (Şekil 3.a) yaklaşık cm boyunda eksplant kullanılmış fakat bu durum fenolik bileşiklerin daha fazla salgılanmasına sebep olmuş ve sürgün rejenerasyonunu olumsuz etkilemiştir daha sonra yapmış olduğumuz çalışmalarda ise en az 2 tomurcuk içeren ve yaklaşık 6 7 cm uzunluğundaki eksplantlar kullanılmıştır (Şekil3.b). Şekil 3.2. Ceviz fidanlarından eksplant izolasyonu 22

34 Şekil 3.3. a) Tek göz içeren eksplant izolasyonu b) 2-3 göz içeren eksplant izolasyonu Sterilizasyon Ön sterilizasyon İzole edilen eksplantlar 5 dakika Süre ile musluk suyu altında ön sterilizasyon işlemine tabi tutulmuştur (Şekil 4). Şekil 3.4. Ceviz eksplantlarının musluk suyu altında ön sterilizasyonu işlemi Yüzey sterilizasyonu İzole edilen eksplantların yüzey sterilizasyonunun optimizasyonu amacıyla her magenta da 5 eksplant olacak şekilde 3 tekrarlı kurulan denemelerde 2 farklı uygulama yapılmıştır. 23