SENDROMİK TANIDA MİKROBİYOLOJİK YAKLAŞIM: SSS ENFEKSİYONU TANISI NAT PANELLERİ YORUMLAMA VE RAPORLAMA

Transkript

1

2 SENDROMİK TANIDA MİKROBİYOLOJİK YAKLAŞIM: SSS ENFEKSİYONU TANISI NAT PANELLERİ YORUMLAMA VE RAPORLAMA AYŞIN ZEYTİNOĞLU 4. ULUSAL KLİNİK MİKROBİYOLOJİ KONGRESİ 8-12 KASIM 2017 ANTALYA

3 Başağrısı- ateş +/- ense sertliği ENSEFALİT MENENJİT MENİNGOENSEFALİT ENSEFALOMİYELİT AKUT SUBAKUT KRONİK REKÜRREN

4

5 2 Enterovirüslerden en sık bildirilen SSSE etkeni koksaki (A9, B1, B5 vb) ve ekovirüslerdir (5,6,18,30,70,71 vb)

6 MANYETİK REZONANS GÖRÜNTÜLEME

7 SSSE Akut bakteriyel menenjit ABD 3-5/ kişi Mortalite % 6-12 Streptococcus pneumoniae Group B streptokok Neisseria meningitidis Haemophilus influenzae Listeria monocytogenes Viral enfeksiyonlar Daha selim seyirli olabiliyor. HSE tedavi edilmezse fatal/ciddi sekellerle seyrediyor Coğrafik bölge ve mevsimlere göre farklılıklar gösteriyor polio dışı EV- sonbahar ve geç ilkbahar döneminde pik yapıyor He T 2016

8 SSSE He T 2016 Tanı önemli. Tedavi edilmezse fatal seyrediyor- HSE Klinik etkene göre çok farklılık göstermiyor NAT testleri - rutin tanı NAT testleri klasik yöntemlere göre daha hızlı, duyarlılık ve özgüllük Klasik yöntemlerle zor saptanan etkenlerin tanısında, BOS ta etkenin gösterilmesi yeni altın standart SSSE da rutinde tanısal ve izlem amacı ile yaygın kullanılan NAT sonuçlarının özellikle klinik bulgular ile dikkatli bir şekilde yorumlanması gerekiyor.

9 İngiliz Viral Ensefalit Ulusal Rehberi (Nöroloji+Enfeksiyon) JI,2012 Yaş İmmunsupresyon durumu Coğrafya Etkenle karşılaşma Klinik bulgular/laboratuvar bulgular?! Ensefalopati nedenleri -ayırıcı tanı Parainfeksiyöz immun ilişkili ensefalit ADEM Otoimmun/enflamatuvar ensefalit Metabolik Vasküler neoplastik Paraneoplastik Toksik Septik ensefalopati (sepsiste %50-70)

10 NAT viral etkenler için altın standart

11 BOS NAT Mono(single)pleks testler HSV DNA, vb virüsler Zika virüs +/- Chikungunya, dengue virüs Japon ensefalit virüsü N. meningitis S. pneumoniae H. influenzae type b M. tuberculosis (The Xpert MTB/RIF D: % 80.5) Multipleks testler Bakteri etkenleri Luminex suspension array (bakteri+virüs-8) BF Film array (bakteri+mantar+virüs-15) Seegene Seeplex (3 panel) (bakteri+virüs-12) FTD Neuro 9 (3 panel) (bakteri+ virüs-17) BD Max (virüs-3) Meningofinder (bakteri+mantar+virüs-21)

12 He T 2016

13

14 Lazzarotto T 2017 ESCV FA ME Panel Klasik Yöntemler Bakteri 1 saat 45 dk (1 s 25 dk- 2 s) 84 saat ( s) p Virüs 1 saat 45 dk (1 s 25 dk- 2 s) 5 saat (2-9s) p

15 Steiner 2012 Eur J Neurol EFNS-ENS Rehberi SSSE tanısında PCR teknolojisinin kullanımı

16 Steiner 2012 Eur J Neurol EFNS-ENS Rehberi SSSE tanısında PCR teknolojisinin kullanımı

17 Steiner 2012 Eur J Neurol EFNS-ENS Rehberi SSSE tanısında PCR teknolojisinin kullanımı Bakteriler Standardize kantitatif RT- PCR bakteriyel menenjit tanısında önemli, rutin BOS örneklerinde öneriliyor A I Mikroskobi ve kültür altın standart A II

18 He T 2016 A. Tanı için NAT uygundur B. Tanı için NAT bazı durumlarda veya enfeksiyonun bazı formlarında uygundur C. Tanı için NAT nadiren uygundur, referans laboratuvarlarında epidemiyolojik çalışmalarda veya beklenmeyen durumların tanısında kullanılmaktadır.

22 BOS NAT testimiz : Negatif Monopleks/ multipleks test aradığımız etken yok diğer testler ensefalit - yaklaşık % 60 tanı konulamıyor yeni yöntemlere gereksinim var (NGS vb) erken örnek alınmış herpes simpleks ensefaliti; 3-5 gün sonra test tekrarı

23 SSSE paneli Solunum sistemi enfeksiyon paneli

24 SSSE paneli Solunum sistemi enfeksiyon paneli Örneğe uygun olmayan paneller kullanıldığında (eksik etkenler için), etkenlerin tiplerine dikkat etmeli- paneller genişletilinceye kadar

25 Coğrafya Etkenle karşılaşma BOS NAT testimiz : Pozitif

26 Zeytinoğlu 17 Feyzioğlu 14 Kalfaoğlu 14 Soylar 13 Çiçek 12,14 SSSE % Sağlık 13 Varıcı 17 Kahraman 17 *Akkaya 17 Erdem 17 TK Kleines 14 Hasbun 17 HSV , ,9 8.3 Dupuis 11 ABD HSV ,5 CMV 3.3 0,4 2 3,6 2, ,4 EBV , ,6 VZV 0.5 1, ,9 HHV , ,9 EV ,3/ 5,9 6, , ADV 0.4 0,6 22 0,08 BNV 1.4 0,2

27 BOS NAT testimiz : Pozitif Ön tanı, etkenle karşılaşma

28 Klinik Sendrom Aseptik menenjit Ensefalit Miyelit Nörit (radikülit) Sinir Sisteminde Etkilenen Bölge Meninksler Beyin parenkimi Omurilik Periferik sinirler

29 Ensefalit % Altuğlu 06 Mülayim 05 Zeytinoğlu 00 Sili (MR+) 14 HSV Aseptik Menenjit % Sayıner 03 Özkaya 05 Dirim 15 Güney 03 HSV 1 9,7 EV 38,7 17 (P) 8 63 (P) Akut Menenjit % Kalfaoğlu 14 EBV 1.8 HHV Atipik Menenjit/ Ensefalit (P) % Koçak 17 HSV 1 2 HHV 6 4 EV 1

30 Dupuis M ve ark. Molecular detection of viral causes of encephalitis and menengitis in NYS. JMV 2011; 83:

31 Retrospektif, çok merkezli, toplum kökenli SSSE n: 2583 Arnavutluk, Bosna, Hersek, Hırvatistan, Çek C, Danimarka, Mısır, Fransa, Macaristan, Hong Kong, İran, İtalya, Kazakistan, Kosova, Pakistan, Portekiz, Romanya, Sırbistan, Suriye, Teksas/ABD, Türkiye

32 Erdem 2017 Toplum kökenli SSSE Tüm mikroorgnizmalara bağlı ölüm oranı %9

33 İmmunsupresyon BOS NAT testimiz : Pozitif

34 İngiliz Viral Ensefalit Ulusal Rehberi (Nöroloji+Enfeksiyon) JI,2012 Ensefalitte mikrobiyoloji tanı- BOS PCR Tüm hastalar HSV1 VZV HSV2 Parekovirüs EV Endikasyon varsa - immunsuprese EBV HH6 ADV Kızamık virüsü Kabakulak virüsü Klamidya CMV HHV7 İnfluenza A ve B Rotavirüs (pediatrik) Parvovirüs B19 Özel durumlar Kuduz virüsü Kene kaynaklı ensefalit virüsleri BNV

35 Ensefalit Tüm hastalar HSV1 VZV HSV2 Parekovirüs EV Endikasyon varsa - immunsuprese EBV HH6 ADV Kızamık virüsü Kabakulak virüsü Klamidya CMV HHV7 İnfluenza A ve B Rotavirüs (pediatrik) Parvovirüs B19 Özel durumlar Kuduz virüsü Kene kaynaklı ensefalit virüsleri BNV

36 Ensefalit Tüm hastalar HSV1 VZV HSV2 Parekovirüs EV Endikasyon varsa - immunsuprese EBV HH6 ADV Kızamık virüsü Kabakulak virüsü Klamidya CMV HHV7 İnfluenza A ve B Rotavirüs (pediatrik) Parvovirüs B19 Özel durumlar Kuduz virüsü Kene kaynaklı ensefalit virüsleri BNV Bakteriyel menenjit S. pneumoniae E. coli N. menengitidis L. monocytogenes H. influenza S. agalactiae Aseptik menenjit EV Nörotrop mantarlar C. neoformans/c. gattii

37 Ensefalit Tüm hastalar HSV1 VZV HSV2 Parekovirüs EV Endikasyon varsa - immunsuprese EBV CMV HHV6 HHV7 ADV İnfluenza A ve B Kızamık virüsü Rotavirüs (ped) Kabakulak virüsü Parvovirüs B19 Bakteriyel menenjit S. pneumoniae E. Coli N. menengitidis L. Monocytogenes H. influenza S. agalactiae Nörotrop mantarlar C. neoformans/c.gattii BFA SP (3 panel) FTD (3 panel) BDM Meningofinder (HHV8, Borrellia) ek panelle! ADV, influenza ek paneller influenza,kızamık ve kabakulak virüs ek paneller

38 BOS NAT testimiz : Çoklu Etken Pozitifliği

39 BOS NAT testimiz : Çoklu Etken Pozitifliği Çok etkenli SSSE?

40 BOS NAT testimiz : Çoklu Etken Pozitifliği Çok etkenli SSSE? Etiyolojik etken?

41 BOS NAT testimiz : Çoklu Etken Pozitifliği Çok etkenli SSSE? Etiyolojik etken? Bir / daha çok seyirci ( by stander ) mikroorganizma mı var?

42 BOS NAT testimiz : Çoklu Etken Pozitifliği Çoklu SSSE? Etiyolojik etken? Bir / daha çok seyirci ( by stander ) mikroorganizma mı var? Yalancı pozitiflik!

43 ÇOKLU ENFEKSİYONLAR Saptanan virüsler (NAT) Sayı Zeytinoğlu 2017 HSV1 + EBV 3 HSV1 + HHV 6 1 EBV + VZV 1 EBV + HHV 6 1 Saptanan virüsler (NAT) Sayı Akkaya 2017 EV+ADV 3 S. pneumoniae + CMV HHV 6 + HSV 1 S. pneumoniae + VZV EV + HPeV S. agalactiae + HSV 1

44 ÇOKLU ENFEKSİYONLAR Saptanan virüsler (NAT) Sayı Zeytinoğlu 2017 HSV1 + EBV 3 HSV1 + HHV 6 1 EBV + VZV 1 EBV + HHV 6 1 Saptanan virüsler (NAT) Sayı Akkaya 2017 EV+ADV 3 % 85 pediatrik S. pneumoniae + CMV HHV 6 + HSV 1 S. pneumoniae + VZV EV + HPeV S. agalactiae + HSV 1

45 BOS ta çoklu SSSE etkenleri BOS ta lenfotropik herpes virüs DNA PCR (EBV, HHV 6, HHV 7, HHV 8) pozitifse muhtemel ilgili herpes virüsle ilişkili ensefaliti gösterir, tanı kesin değildir + VZV Boivin G, 2004

46 HHV-6 için PCR ın duyarlılığı %95 ama sağlıklı erişkinlerde ensefalit tanısı açısından pozitif prediktif değerinin %30 olduğu bildirilmiştir Rotbart HA 2003 HHV6 ve EBV (çoklu enfeksiyon) HHV 6 (cihhv 6)ve EBV insan hücre kromozomuna entegre olur Sağlıklı beyin dokusunda ve BOS ta bulunabilir De Tiege 2003, Clark DA 2016, Pellett PE 2012 Kan hücrelerinde, beyinde ve diğer dokularda latent genomun saptanması? Etiyolojik ajan? Akut enf (virüs aktif olarak replike olur) Latent genomun reaktivasyonu - kantitasyon! Hücre içi latent virüsün saptanması kantitasyon! Venkatesan 2013

47 EBV HIV+ olgular (primer SSS lenfoması)dışında, muhtemel etken Steiner Eur J Neurol EFNS-ENS Rehberi MS EBV çalışmaları: seyirci etken, enfekte B lenfositlerinde latent genomun saptanması Burnard S 2017 VZV etken ise VY, MS/ilişkili nörolojik hast pozitif olabilir Persson 2009 HHV6 özellikle ISH Diğer viral akut enf - reaktivasyon (çoklu pozitiflik) MS Temporal lop epilepsisi Normal beyin dokusunda/bos ta pozitif (kromozoma entegre) Clark 2016, Pellet 2012

48 Steiner Eur J Neurol EFNS-ENS Rehberi VZV BOS ta VZV DNA nın tanısal değeri, BOS ta VZV IgG saptanmasından daha düşük Nagel 2007, Gilden 1998 Kanda VZV DNA ve BOS ta kantitatif VZV IgG bakısı Kennedy Zoster sine herpete JCV PML- yüksek JCV viral yük, kısa süre Koralnik 1999,Garcıa de Viedma 2002 düşük uzun süre Yiannoutsos 1999 sağ kalım ile ilişkili bulunmuş CMV ensefaliti (immunsuprese olguda reaktivasyon) HIV enfekte olgularda organ transplant alıcılarında konjenital CMV li yenidoğanda

49 DİĞER SENDROMİK TESTLER Solunum etkenleri - multipleks NAT Basel, 5 yıllık- semptomatik çocuk ve erişkinlerde Compagno ve ark. ECCMID 2017 (poster) çoklu etken pediatrik % 10 virus+virus yetişkin % 6 % 1 bakteri + virüs % 1

50 RT PCR tanısal duyarlılık * tanının kalitesi Avantaj * daha erken doğru antimikrobiyal kullanım Dezavantaj * etiyolojik ajan olmayanların da saptanması atoksijenik suşların saptanması enfektif dozdan az olan patojenin saptanması (seyirciler!) Zautner AE 2017, mini derleme Frontiers in Microbiology enfeksiyonda beklenmeyen virulans faktörü genlerinin saptanması Özellikle steril olmayan örneklerde çoklu fakültatif patojenik mikroorganizmaların saptanması, etiyolojik etkenin tanımlanması açısından sorunludur.

51 Solunum yolu ve dışkı örnekleri Ct değerleri - semikantitatif bir değerlendirme Yüksek patojen yükünün klinik anlamlı (düşük ct değerleri, jelde koyu bant) SSSE

52 Solunum yolu ve dışkı örnekleri Ct değerleri - semikantitatif bir değerlendirme Yüksek patojen yükünün klinik anlamlı *Dışkı örneklerinde PCR inhibisyonu ct bazlı semi-kantitatif değerlendirmeyi zorlaştırır *Ct değerleri PCR protokollerine göre değişebilir internal kontrol olarak kantitatif standartlar olmalı

53 Solunum yolu ve dışkı örnekleri Ct değerleri - semikantitatif bir değerlendirme Yüksek patojen yükünün klinik anlamlı SSSE Houben SYE RSV Pediatrik, Lindsay 2013, Liu 2014 ASYE panelinde- farengeal lavaj örneği aynı zamanda -rinit, farenjit, bronşit etkenleri varsa kontaminasyon! Frickmann 2015 O an geçirilmekte olan sistemik bir enfeksiyon Kanda antikor testleri ve NAT

54 Mikroorganizmaların Kan Beyin Bariyerini Geçmesi SSSE Bakteriler ve Mantarlar Kanda yüksek miktarda olması (E.coli, pnömokok, GBS ve HiB ) Transselüler penetrasyon mekanizmaları (bağlayıcı pr, pili, reseptör etkileşimi - S.pneumoniae, N.meningitidis, kandidalar- BMEH, C.neoformans) Kan beyin bariyerini hasarlandırarak (S.pneumoniae, GBS, E.coli K1, N.meningitidis, C.neoformans) Enfekte fagositler içinde (Truva atı) Virüsler Kanda viral yük yüksekliği (Gastrik asidite, mukus (mukozal IgA) gibi fiziksel bariyerleri ve makrofajları geçerek) BMEH in doğrudan aşılması (JCV, polio, EBV, HTLV-1,BNV) Truva atı mekanizması (Enfekte lökositlerin KB-B yi geçmesi, HIV) Periferik sinirler yolu ile SSS ulaşım (Poliovirus, koksaki, adenovirus, kuduz virüsü, herpes virüsler) (M.tuberculosis ve L.monocytogenes?, C.neoformans )

55 SSSE Solunum yolu ve dışkı örnekleri Ct değerleri - semikantitatif bir değerlendirme Yüksek patojen yükünün klinik anlamlı Houben SYE RSV Pediatrik, Lindsay 2013, Liu 2014 ASYE panelinde- farengeal lavaj örneği aynı zamanda -rinit, farenjit, bronşit etkenleri varsa kontaminasyon! Mikrobiyata önemli (BOS?) Harvard Gazetesi 2017

56 Solunum yolu ve dışkı örnekleri Ct değerleri - semikantitatif bir değerlendirme Yüksek patojen yükünün klinik anlamlı Houben SYE RSV Pediatrik, Lindsay 2013, Liu 2014 ASYE panelinde- farengeal lavaj örneği aynı zamanda -rinit, farenjit, bronşit etkenleri varsa kontaminasyon! Mikrobiyata önemli SSSE Kolonizasyon? Latent enf? Kantitatif/semi-kantitatif testler; yüksek patojen yükü - hastalık ile korele düşük mikroorganizma yükü- kolonizasyon? latent virüs reaktivasyonu/ latent virüs saptanması. Özellikle immunsuprese olgularda Kantitatif değerlendirmelerde kesin eşik değer tanımları çok az etkende var Viral SSSE enfeksiyonlarında? Yüksek endemik bölgede Asemptomatik taşıyıcılık/önceki enfeksiyonlardan kalma DNA lar - D PCR etkeni tanımlamakta kısıtlılıklar

57 Olgu : OG Test HSV2 DNA PCR (BOS) NEGATİF NEGATİF CMV DNA PCR (BOS) NEGATİF NEGATİF VZV DNA PCR (BOS) NEGATİF NEGATİF HHV-6 DNA PCR (BOS) NEGATİF NEGATİF HSV1 DNA PCR (BOS) POZİTİF NEGATİF EBV DNA PCR (BOS) POZİTİF POZİTİF AMPİRİK ASİKLOVİR

58 Olgu : OG Test HSV2 DNA PCR (BOS) NEGATİF NEGATİF CMV DNA PCR (BOS) NEGATİF NEGATİF VZV DNA PCR (BOS) NEGATİF NEGATİF HHV-6 DNA PCR (BOS) NEGATİF NEGATİF HSV1 DNA PCR (BOS) POZİTİF NEGATİF EBV DNA PCR (BOS) POZİTİF POZİTİF AMPİRİK ASİKLOVİR Zayıf Pozitif

59 Olgu : OG

60 Olgu : OG FARKLI ZAMANLARDA 3 ÖRNEK 1 ÖRNEK- 4 LABORATUVARA (bakteriyoloji, viroloji, mikoloji, mikobakteriyoloji) Parazitoloji? *VİRAL NAT MULTİPLEKS NAT- 6 VİRÜS MONOPLEKS OLSA- 6 ÇALIŞMA (10 çalışma)

61 Değişik biyolojik matrikslerde * nükleik asit ekstraktları (DNA/RNA) 30 güne kadar stabil * eksraksiyonu yapılmamış örneklerde sıcaklıkla ilişkili hedef kaybı serum ve BOS ta anlamlı p< 0.05 ( EDTA lı kan anlamlı değil) Hasan 2012 Sonuç- gelecekte, standardizasyonda Zautner AE 2017 Asemptomatik kolonizasyon- etiyolojik etken ayrımı için genel kabul görecek kantitatif eşik değerlere gereksinim var Kantitatif yaklaşım önemli. Yeni teknolojiler umut çözüm için veriyor. Bir salgında olguların % 67 sinin dışkı örneklerinde Shiga-toksin üreten E. coli nin etken olarak tanımlanması, negatif kontrol örnekleri ile kıyaslanan kantitatif NGS ile yapılmış Loman 2013

62 He T 2016 Kültür + mikroskobide % 35 etken saptanan bir çalışmada 16S rrna saptayan PCR temelli test etkeni % 65 saptamıştır Meyer 2014 Menenjit olgularında antibiyotik kullanımı nedeni ile klasik yöntemlerle negatif sonuç alınanlarda NAT testlerinin yararlı olduğu raporlanmaktadır Bahr 2016 BOS ta NAT testleri, zor saptanan/ tanımlanan virüslerin neden olduğu SSSE da platin standart Jaramillo-Gutierrez 2013, Launes 2015, McAllister 2015

63 Notlar.. Herpes grubu ve enterovirüslere bakıldığında genel olarak SSS enf yaklaşık %20 sinde etiyoloji saptanıyor Ensefalit ön tanısında ampirik antiviral başlanması önemli. Etkenin tanımlanması tedavinin kesilmesi/devam edilmesi açısından önemli Özellikle HSE şüphesi kuvvetli olan olgularda erken dönemde bakılan ve negatif NAT testlerinin 3-5 gün sonra tekrarı önerilir EBV, HHV6 (VZV?) çoklu enfeksiyonlarda sıklıkla saptanan virüsler

64 MULTİPLEKS TESTLER Tek bir çalışma Kolaylık Hızlı tanı Bakteri + virüs + mantar 7-24 sonuç Ampirik antimikrobiyal tedavinin devamı/kesilmesi BAKTERİ - MANTAR VİRÜS Menenjit gibi acil durumların yönetimi - D ve Ö Antibiyotik/antimikotik kullanan olgular Panelde olan etkenlerde D ve Ö Etkene yönelik doğru antiviral Etkene yönelik doğru korunma yöntemleri Çoklu etkenler! Antibiyotik duyarlılığı ᴓ Panel dışı etkenler! Çoklu etkenler!

65 MULTİPLEKS TESTLER Tek bir çalışma Kolaylık Hızlı tanı Bakteri + virüs + mantar 7-24 sonuç Ampirik antimikrobiyal tedavinin devamı/kesilmesi BAKTERİ - MANTAR VİRÜS Menenjit gibi acil durumların yönetimi - D ve Ö Antibiyotik/antimikotik kullanan olgular Panelde olan etkenlerde D ve Ö Etkene yönelik doğru antiviral Etkene yönelik doğru korunma yöntemleri Çoklu etkenler! Antibiyotik duyarlılığı ᴓ Çoklu viral etkenler için : kantitatif PCR panelleri ile tekrar BOS hücre sayısı, latent virüs?, eşik değer? sistemik enfeksiyon? Panel dışı etkenler! Çoklu etkenler!

66 MULTİPLEKS TESTLER Tek bir çalışma Kolaylık Hızlı tanı Bakteri + virüs + mantar 7-24 sonuç Ampirik antimikrobiyal tedavinin devamı/kesilmesi BAKTERİ - MANTAR VİRÜS Menenjit gibi acil durumların yönetimi - D ve Ö Antibiyotik/antimikotik kullanan olgular Panelde olan etkenlerde D ve Ö Etkene yönelik doğru antiviral Etkene yönelik doğru korunma yöntemleri Çoklu etkenler! Antibiyotik duyarlılığı ᴓ Çoklu viral etkenler için : Raporlama önerisi? Zayıf pozitif!! Panel dışı etkenler! Çoklu etkenler!

67 Pan-omik moleküler platformlar- gelecek NGS Pangenomik Metagenomik (insan mikrobiyomu)

68 Teşekkürler.