ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ DİYARBAKIR İLİ ASMA GEN POTANSİYELİNİN RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) TEKNİĞİ İLE MOLEKÜLER ANALİZİ Hüseyin KARATAŞ Bahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı ANKARA 2005 Her hakkı saklıdır

2 Prof. Dr. Y. Sabit AĞAOĞLU danışmanlığında, Zir. Yük. Mühendisi Hüseyin KARATAŞ tarafından hazırlanan bu çalışma.../.../.... tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı nda Doktora tezi olarak kabul edilmiştir. Başkan :... İmza : Üye :... İmza : Üye :... İmza : Üye :... İmza : Üye :... İmza : Yukardaki sonucu onaylarım (imza) Prof. Dr.... Enstitü Müdürü

3 ÖZET Doktora Tezi DİYARBAKIR İLİ ASMA GEN POTANSİYELİNİN RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) TEKNİĞİ İLE MOLEKÜLER ANALİZİ Hüseyin KARATAŞ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı Danışman : Prof. Dr. Y. Sabit AĞAOĞLU Bu araştırmada, Diyarbakır ilinde yetiştirilen 38 çeşit ve bu ilden Milli Koleksiyon Bağı na aktarılan 8 çeşit olmak üzere toplam 46 üzüm çeşidinin (Vitis vinifera L. cvs.) 25 dekamer primer kullanılarak RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) tekniği ile genetik benzerlikleri araştırılmıştır. Kullanılan primerlerden en fazla polimorfik bant (7 bant) OPA-18 de elde edilirken, en düşük polimorfik bant değerlerini (3 bant) OPA- 01, OPA-02, OPA-04, OPF-06, OPO-02, OPO-11, UBC-238 ve P-437 primerleri vermiştir. Çalışmada daha önce asma da (Vitis vinifera L. cvs.) bir çok araştırıcı tarafından kullanılan Lodhi et al. (1994) metoduna göre 46 üzüm çeşidinin DNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu çeşitler arasındaki genetik ilişkiler benzerlik indeksi ve dendogram düzeyinde gerçekleştirilmiştir. Üzüm çeşitlerinden en düşük benzerlik Hasani-Amorku çeşitleri arasında (0.630), en yüksek benzerlik oranı ise (0.918) Şaraplık-Avkenek kombinasyonunda görülmüştür. Çeşitlerdeki nispeten yüksek genetik benzerlik oranı dendograma da yansımıştır. Dendogram, farklı dallanmalardan ziyade iç içe girmiş değişik sayıda çeşit içeren alt gruplardan oluşmuştur. Bunlarda ise bağlantı oluşturan çeşitler dışında temel olarak beş alt grup oluşmuş olup 1. Grupta 3, 2. Grupta 3, 3. Grupta 6, 4. Grupta 8 ve 5. Grupta 17 çeşit yer almıştır. Araştırmada kullanılan çeşitlerin genetik benzerlik oranları ile ampelografik benzerlikleri arasında genellikle bir ilişkiye rastlanmamıştır. 2005, 70 sayfa ANHTAR KELİMELER : Vitis vinifera L., moleküler tanımlama, üzüm çeşitleri, DNA izolayonu, RAPD, benzerlik indeksi, dendogram. i

4 ABSTRACT Ph. D. Thesis MOLECULAR ANALYSIS OF DIYARBAKIR REGION'S GRAPEVINE GERMPLASM BY RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) TECHNIQUE Hüseyin KARATAŞ Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Horticulture Supervisor : Prof. Dr. Y. Sabit AĞAOĞLU In this research, genetic similarities a total of 46 grape cultivars (Vitis vinifera L. cvs.) were investigated using mer RAPD primers. The highest number of polymorphic bands (7) was obtained from OPA-18 primer. The lowest band number (3) was observed in OPA-01, OPA-02, OPA-04, OPF-06, OPO-02, OPO-11, UBC-238 and P-437 primers. Cultivars were obtained from the city of Diyarbakır, Türkiye (38 cvs.) and from the National Germplasm Collection Vineyard located in Tekirdağ, Türkiye (8 cvs.). DNA isolation was performed according to Lodhi et al (1994). Genetical relationships were analyzed by using genetic similarity index and dendogram. The lowest similarity was observed between Hasani and Amorku (0.630) and the highest was between Şaraplık and Avkenek. Relatively high genetic similarity rates observed were consistent with the result of dendogram analysis. Dendogram was consisted of sub-groups containing different cluster. Aside from single cultivar containing groups, 5 subgroups were formed with 3, 3, 6, 8 and 17 cultivars in each, respectively. Cultivars did not show any relationships between their ampelographical features and genetic similarity rates. 2005, 70 pages Key Words : Vitis vinifera L., molecular identification, grape cultivars, DNA isolation, RAPD, similarity index, cluster analysis. ii

5 TEŞEKKÜR Doktora tez konumun belirlenmesinde ve yönlendirici katkılarından dolayı başta danışman hocam sayın Prof. Dr. Y. Sabit AĞAOĞLU na en içten teşekkürlerimi sunmayı görev sayarım. İlgisinden dolayı hocam Prof. Dr. Hasan ÇELİK'e teşekkür ederim. Yardımlarından dolayı ve bize modern laboratuvar ve rahat çalışma ortamı sağlayan hocam sayın Prof. Dr. Gökhan SÖYLEMEZOĞLU na özel teşekürlerimi sunarım. Yine her zaman desteğini sırtımda hissetiğim hocam Prof. Dr. Birhan MARASALI KUNTER'e de teşekkür ederim. Tezimin her aşamasında yardımlarını ve desteklerini esirgemeyen değerli meslektaşlarım; Araş. Gör. ZelihaYAŞA, Araş. Gör. Dilek DEĞİRMENCİ, Araş. Gör. Nurhan KESKİN, Araş. Gör. Eda KARAAĞAÇ, Araş. Gör. Elif Çiğdem DOĞAN, Araş. Gör. Atilla ÇAKIR, Araş. Gör. Kazım MAVİ ve Araş. Gör. Şeyda ÇAVUŞOĞLU ve diğer Araş. Gör. arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunmayı bir borç bilirim. Lisans öğrenciliğimden bu yana benden manevi desteklerini esirgemeyen çok sevdiğim tüm Bahçe Bitkileri hocaları ve çalışanlarına da teşekkür borçluyum. Akademik yaşantıma geçiş için beni teşvik eden rahmetli hocam Prof. Dr. Y. Yılmaz FİDAN' ı şükranlarımla anıyorum. Materyallerimin toplanması esnasında katkılarınıı gördüğüm Dr. İlyas ÇIĞŞIR'a teşekürlerimi borç bilirim. Özellikle, Moleküler Biyoloji konusunda beni yönlendiren, bilgilerini paylaşan ve çalışmalarından da yararlandığım sayın Dr. Ali ERGÜL e de şükranlarımı sunarım. Ayrıca, eğitim hayatı boyunca benden maddi-manevi desteğini esirgemeyen başta babam Refik KARATAŞ, rahmetli annem Hanife KARATAŞ'a ve isimlerini burada belirtemeyeceğim kadar kalabalık olan ailemin tüm bireylerine teşekkürlerimi sunarım. Hüseyin KARATAŞ Ankara, Mart 2005 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR...iii ŞEKİLLER DİZİNİ... v ÇİZELGELER DİZİNİ... vii 1.GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Yöntem DNA izolasyonu PCR uygulamaları Sonuçların değerlendirilmesi ARAŞTIRMA BULGULARI DNA İzolasyonu PCR Uygulamaları Benzerlik İndeksi ve Genetik İlişki Dendogramı TARTIŞMA ve SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ iv

7 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 4.1. Araştırmada kullanılan Diyarbakır ili üzüm çeşitlerine ait DNA'ların agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil 4.2. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPA-01 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri [Markör: 100bp DNA Ladder (Promega). Kontrol: Genomik DNA hariç diğer PCR öğeleri] Şekil 4.3. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPA-02 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil 4.4. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPA-04 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil 4.5. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPA-07 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil 4.6. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPA-09 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil 4.7. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPA-15 primerleri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil 4.8. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPA-18 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil 4.9. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPB-07 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPF-05 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPF-06 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPF-08 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüler Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPO-02 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPO-05 primeri ile oluşturulan PCR mplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri v

8 Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPO-07 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPO-10 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPO-11 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon üzümlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPO-19 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin UBC-238 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin B-389 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OD-08 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin P-123 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin P-166 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin P-437 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüsleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin P-443 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin S-34 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri Şekil Çeşitlere ait genetik ilişki dendogramı vi

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1. Araştırmada kullanılan Diyarbakır iline ait üzüm çeşitleri ve kısa ampelografik özelikleri Çizelge 3.2. Denenen PCR reaksiyon karışımları Çizelge 3.3. Denenen amplifikasyon koşulları Çizelge 3.4. RAPD analizlerinde kullanılan primerler ve baz dizileri Çizlege 4.1. Araştırmada kullanılan üzüm çeşitlerine ait DNA'ların miktar (ng DNA/μl) ve saflık (A260/A280) değerleri Çizelge 4.2. Araştırmada kullanılan RAPD primerlere ait toplam bant sayısı (n), polimorfik bant sayısı (n) ve polimorfik bant oranları (%) değerleri Çizelge 4.3. Diyarbakır ili üzüm çeşitlerine ait benzerlik indeksi vii

10 1. GİRİŞ Araştırmada kullanılan üzüm çeşitlerinin yetiştirildiği Diyarbakır ilinin coğrafi konumu, bağcılık için son derece uygun bir yapı göstermektedir. Bölgedeki bağcılık çok eskilere dayanmaktadır. Ekonomisi büyük ölçüde tarıma dayalı olan ve kuru tarımın yaygın olduğu bu ilimizde, tahıllardan sonra bağcılık önem taşımaktadır. Diyarbakır ve yöresinde yaklaşık ha lık alanda bağcılık yapılmaktadır. İldeki üzüm üretimi yaklaşık ton, ortalama verim ise 547 kg/da dır. Diyarbakır merkez ve ilçelerde en fazla üretim 2001 yılı değerlerine göre Lice ve Ergani ilçelerinde olup bunları Çermik ve Dicle ilçeleri izlemektedir (Atalay vd 2003). Diyarbakır ilinde halen eski bağcılık tekniği uygulanmaktadır. Filoksera zararlısı yanında, bağların yaşlı olması, kurak şartlarda bağcılık yapılması ve gelişen bağcılık tekniğinin yeterince bilinmemesi gibi nedenlerle yörede bağcılık gittikçe gerilemektedir. Bu gerilemeyi durdurmak ve bağcılığı geliştirmek için yeni bağcılık tekniğine süratle geçilmesi için bir dizi önlem alınması gerekmektedir. Bu önlemlerden en başta geleni mevcut gen potansiyelinin belirlenmesi ve özellikle çok farklı dağılım gösteren ve hızla kaybolmayla karşı karşıya kalmış bölgeye ait çeşitlerin tespitinin ve genetik tanımlanmalarının yapılmasıdır. Diyarbakır ili, bitki tür çeşitliliği ve bu türler bazında ulaşılan verim bakımından, ülkemizde önemli bir yere sahiptir. Asma, yöreye adapte olmuş çok yıllık bahçe bitkileri türlerinin başında gelmektedir. İlde, çok sayıda sofralık, şaraplık ve kurutmalık çeşitlere rastlanmaktadır. Kaplan (1994), yörede yetiştirilen üzüm çeşitleri üzerinde klasik yöntem olarak adlandırdığımız ampelografik bir çalışma yürütmüştür. Bu çalışmasında araştırıcı ildeki genotip zenginliğine dikkati çekmekte, adlandırmada ortaya çıkan sinonimlerin olayı daha da karıştırdığını bildirmektedir. Çeşitlerin yöresel anlamda farklı isimlendirilmeleri, gerek yapılan araştırmalarda gerekse üretimin tüm aşamalarında kullanılan çeşitlerin ismine doğruluğu konusunda önemli sorunlara ve kuşkulara neden olmaktadır. Bu sorunların çözümlenmesi, ancak polimorfizm gösteren moleküler markörlerin kullanılmasıyla mümkün olacaktır. 1

11 Son yıllarda bağcılıkta kullanılan moleküler markörler (RFLP, RAPD, AFLP, SSR, ISSR vb.) değişik amaçlara yönelik yoğun kullanımları ile birlikte gerek bağcılıkta gerek diğer alanlardaki ıslah çalışmalarında bir çığır açmıştır. DNA ya dayalı bu moleküler markörlerle daha kesin sonuçlara ulaşılması nedeniyle izoenzim markörlere oranla daha etkin kullanılmaya başlanmıştır. Bağcılıkta farklı amaçlara (çeşit tanımlama, klonların sınıflandırılması, türler arası melezleme, gen aktarma, cinsiyet belirlenmesi, erken seleksiyon, genom haritalama, hastalıklara dayanım, hastalık ve zararlıların teşhisi vb.) yönelik kullanılan RAPD tekniği tek başına veya diğer moleküler markörlerle kombine bir şekilde kullanılmaktadır. Rastgele dekamer oligonükleotidler (primer) kullanılarak PCR (Polimerase Chain Reaction: Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ile çoğaltılan DNA uzunluklarının ortaya çıkardığı farklılıkları esas alan RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) tekniği bir çok avantajı ile PCR markörler içerisinde hızla benimsenmiş ve bu konuda çalışılan laboratuvarlarda tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. Ancak, teknikte başarılı sonuçlara ulaşmak ve bu sonuçların tekrarlanabilirliği, özellikle bitkisel materyale uygun miktar ve saflıkta DNA kullanımı, PCR ve elektroforez koşullarının optimizasyonun uygun primerlerin seçimi ile doğrudan ilişkilidir (Ergül 2000). Bu çalışmada, günümüzde Diyarbakır ilinde yetişmekte olan üzüm çeşitleri ile daha önceki yıllarda ilden Milli Koleksiyon Bağına ( Tekirdağ ) aktarılan çeşitlerin DNA düzeyinde belirlenmesi, gen kaynaklarının korunması ve doğru tanımlanması amaçlanmıştır. Bu araştırma, aynı zamanda bölgesel anlamda genetik tanımlamanın yapılması açısından da ülkemizde bir ilki teşkil etmektedir. Bu hedeften yola çıkarak, ülkemizde zengin gen potansiyeline sahip Güneydoğu Anadolu Bölgesi'ndeki Diyarbakır ilinde yetiştirilen 46 adet üzüm çeşidinin genetik tanımlamaları gerçekleştirmiştir. Bu amaçla Vitis vinifera L. çeşitlerin tanımlanmasında bir çok araştırcı tarafından önerilen (Büscher et al. 1994, Ye et al. 1998, Loureiro et al. 1998, Vidal et al. 1999, Regner and Wiedeck 2000, Ergül 2000, Ağaoğlu vd. 2000, Luo et al. 2001) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) tekniği kullanılmış, bu suretle 46 üzüm çeşidinin RAPD tekniği ile genetik benzerlikleri, çeşitlere özgün PCR bant profilleri ve uygun primerler belirlenmiştir. 2

12 2. KURAMSAL TEMELLER Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) yöntemi, 9-10 baz uzunluğundaki rastgele oligonükleotidlerin (primerlerin), kalıp (templete) DNA'nın iki iplikçiği üzerinde, birbirine karşı iki farklı noktada tamamlayıcılarını (komplementerlerini) bularak, bu ara bölgenin çoğaltılmasını (amplifikasyonunu) esas alan nükleotid dizi polimorfiziminden oluşmaktadır.yaygın olarak diğer PCR uygulamalarının aksine iki değil bir başlatıcı DNA kullanılmaktadır (Ergül 2000). Ancak bu başlatıcı her iki yöndeki DNA üretimi için de kullanılmaktadır. Dolayısıyla kullanılan başlatıcının DNA üzerinde birbirine yakın iki bölgeye yapışabildiği genom bölgelerinin amplifikasyonu yapılmaktadır. Üretim yapılan DNA parçaları bir agaroz jel üzerinde elektroforeze tabi tutulduğunda bazı parçaların bazı genotiplerde üretilip bazılarında üretilmediği gözlenmektedir. Bu işlem açılan bir populasyonda yapıldığında ebeveynlere ait üretim bantlarına bakarak gerçekleştirilmektedir (Welsh ve McClelland 1990). RAPD markörlerin pratik sonucu olan çoğaltım ürünlerinin (bantlarının) ve bunların farklı kaynaklı DNA'lardaki polimorfizm oranlarının ortaya çıkışı bir çok faktöre bağlıdır. Bu faktörlerin detayları ile incelenmesi yöntemin mekanizmasını ortaya çıkaracağı gibi, uygulamada da başarı artırılacaktır. Sözü edilen bu faktörler ise; primer bağlanma bölgelerinin oluşturulması, amplifikasyon koşullarının düzenlenmesi, primer dizilerinin belirlenmesi ile genom büyüklüğü ve amplifikasyon ürünlerinin oranları şeklinde sıralanabilir (Ergül 2000). RAPD tekniğin uygulamadaki esas prensibi uygun bir optimizasyon koşulu tespit edip bu koşula uygun primerleri seçmek ve sonuç değerlendirmelerinde, çoğaltımı iyi gerçekleşmiş bantları değerlendirmektir. Sonuçların tekrarlanabilirliğine yönelik çalışmalarda bu temel prensip gözününe alınmakta ve araştırıcılar hepsi kendi optimizasyonlarında, RAPD sonuçlarının tekrarlanabilirliğini çok iyi veya mükemmel olarak değerlendirmektedirler (Meunier ve Griment 1993, Colins ve Symons 1993, Yu et al. 1993, Ergül 2000) 3

13 RAPD markörler bağcılıkta değişik amaçlara yönelik kullanılmaktadır. Ergül (2000) bunları aşağıdaki şekilde sınıflandırmıştır. a) Vitis cinsinde evrimsel gelişimin tespit edilmesi b) Vitis vinifera L. çeşitlerinin genetik tanımlanması c) Amerikan asma anaçlarının genetik tanımlanması d) Somaklonal varyasyonların saptanması e) Melezleme ıslahında hibrit bitki tanısı f) Değişik amaçlara yönelik genetik haritalama ve markörler yardımı ile seleksiyon Bu sınıflandırmalar içerisinde, araştırmamızın ana konusunu oluşturan konular, Vitis vinifera L. çeşitlerinin genetik tanımlanması diğer bir ifade ile çeşitlerin moleküler analizi grubu içersinde yer almaktadır. Bu nedenle Kuramsal Temeller bölümünde sadece bu konuya ilişkin erişilebilen kaynaklar incelenmiş; buna ilave olarak merikan asma anaçlarının moleküler analizi konularına da, filoksera ile yeni tanışmaya başlayan Diyarbakır yöresi için yararlı olacağı nedeniyle kısaca değinilmiştir. Vitis vinifera L. çeşitlerinin genetik tanımlanması RAPD tekniğinin en fazla kullanıldığı alanlarından birisi çeşitlerin moleküler düzeyde tanımlanmasıdır. Vitis vinifera L. türüne ait çeşitler, ekotipler ve klonlar düzeyinde yoğunlaştırılan bu çalışmalar, V. vinifera ile değişik türlerin melezlenmesi sonucu elde edilen çeşitlerin moleküler tanımlanmasını da içermektedir. Gogorcena et al. (1993), RAPD fragmentlerini RFLP de prob kullanarak çeşit ve bu çeşitlere ait klonlar düzeyinde polimorfizmi araştırmışlardır. Bu amaçla Pinot noir çeşidinden elde edilen RAPD probu ile yapılan RFLP uygulamalarında, Pinot noir klonları birbirinden ayrılmaz iken, Pinot blanc, Grey Riesling ve Cabernet Sauvignon çeşitleri birbirinden ayırım göstermişlerdir. RAPD uygulamalarında ise, Pinot noir klonları ve bu klonlarla Pinot gris çeşidi arasında ayrım görülmez iken, diğer çeşitler 4

14 DNA düzeyinde farklı bulunmuşlardır. Bu çalışma sonucunda araştırıcılar, RAPD de polimorfizm oranının primere ve türe bağlı olduğunu belirlerken, daha fazla bant vermesi nedeni ile bu tekniğin RFLP ye oranla daha avantajlı olduğunu bildirmektedirler. Birbirlerine oldukça yakın morfolojik benzerlik gösteren 10 çeşit ile Shiraz ve Pinot noir klonlarına ait farklılığı araştırmak amacıyla Collins ve Symons (1993) tarafından yürütülen bir çalışmada; klonal ayırımda bir farklılık yakalamayan araştırıcılar, RAPD tekniğini PCR ve elektroforez koşulları açısından detaylı bir şekilde analiz etmişlerdir. Yapılan bir diğer çalışmada, inceledikleri oligonükleotidler içerisinden OPA-1 ve OPA- 18 primerlerini kullanarak RAPD analizi yapan araştırıcılar, Cabernet Sauvignon ve Cabernet franc ile Gamay ve Chenin çeşitlerinin birbirine benzer olduğunu saptamışlardır (Jaques et al. 1993). Tschammer ve Zyprian (1994), 20 dekamer primer kullanarak 10 Riesling tipi ve 12 Burgundy tipi üzüm çeşidinin moleküler farklılıklarını araştırmışlardır. Morfolojik farklılıklar gösteren Riesling tipi çeşitlerden; Aubin blanc, Aubin vert ve Elbing çeşitleri birbirlerine yakın benzerlik gösterirken, diğer çeşitler dendogram düzeyinde uzak dağılım göstermişlerdir. Burgundy grubunda ise; Pinot noir, Pinot Meunier, Pinot blanc ve Pinot gris birbirinden ayırt edilemez iken, Chardonnay gruplarında da tam bir ayırım sağlanamamıştır. Araştırıcılar, ayırt edilemeyen Burgundy çeşitleri arasındaki yakın ilişkiyi bir baz düzeyinde küçük genomik farklılıklara dayandırmakta ve uygun bir primerin bulunması ile ayırımın mümkün olabileceğini savunmaktadırlar. Bir diğer çalışmada Moreno et al. (1995), RAPD le klon ayırımı üzerinde durmuşlar ve bu amaçla 14 dekamer primer kullanarak 31 çeşit ve klonda genetik polimorfizm yakalamışlarken; polimorfizmin yakalanabilmesi için daha çok sayıda primer kullanılması gerektiğini bildirmişlerdir. Kuzeybatı İtalya da (Piemonte) Brachetto ismi ile (siyah aromatik) yetiştirilen dört farklı üzüm çeşidinin (Brachetto de Montebore, Brachetto de Nizza Monferratao, Brachetto de Roero, ve Brachetto de Acqui) ve bunların klonlarının ayrımını tespit 5

15 etmek amacıyla PGM ve GPI izoenzimleri, RAPD ve STMS mikrosatellit markörlerle kombine edilerek kullanılmış; uygulamalar bu 4 çeşidin ayrımını sağlamış, ancak klonları ayıramamışlardır ( Botta et al. 1995). Stavrakakis et al. (1997), Girit adasında yetiştirilen 8 üzüm çeşidinde 15 primer kullanarak RAPD tekniğini kullanmışlardır. 140 a yakın polimorfik bant elde eden araştırıcılar, her bir çeşidi kendine özgü gösterdiği bant polimorfizmi ile rahat bir şekilde tanımlanabildiğini belirtmişlerdir. Lodhi et al. (1997) tarafından yapılan bir çalışmada, Vitis ile ilgili populasyonlarda RAPD markörlerinin kullanılma olasılığı araştırılmıştır. Primerler başlangıç alanları çoğaltılacak şekilde tasarlanmış olup bu da, genomdaki tek çift DNA diziliminin tek bir kopyasının RAPD markörlerinin maksimum seviyede üretilmesi anlamına gelmektedir ki; burada RAPD bantları etiketlenmiş ve Aurore, Cayuga White, Horizon ve Illinois çeşitlerinin genomik DNA ve RAPD ürünleri blotta prob olarak kullanılmış, kesilip çıkarılan RAPD ürününün yeniden çoğaltılması sonucunda değişik bant desenleri çıkartılmıştır. RAPD analizi genomik blotların RAPD markörlerinin hibridizasyonu kadar iyi olması dikkatle seçilen markörlerle populasyonun ayrımı yapılmış, Kozak dizi kökenli primerlerle tek kopya bölgelerinin seçimi mümkün olabilmiştir. Fakat, test edilen düşük sayıdaki problar ve DNA dizi bilgisinin eksik olması kesin bir sonuca varılmasını engellemiştir. Dekamer ve uzun baz dizili (17-24) 53 primer kullanarak V. vinifera ve Vinifera x Labrusca melezlerinden elde edilen 16 çeşit ve klonlarının RAPD analizlerini yapan Ye et al. (1998), Chardonay ve Pinot klonları arasında bir farklılık bulamaz iken, Pinot Meunier, Pinot gris ve Gamay Beaujolais çeşitlerinin Pinot noir den farklı polimorfizm sergilediklerini saptamışlardır. Malvasi ve Torrontes üzüm çeşitlerinin RAPD ve STMS markörlerle genetik analizini yapan Borrego et al. (1998) çeşitlere ait farklı sinonimlerin bulunduğunu, fakat kombine kullanılan bu DNA markörlerle ekotip düzeyinde ayrımların gerçekleştiğini bildirmektedirler. 6

16 Polat vd (1998), ülkemizde kombinasyon melezlenmesi ile elde edilen 12 sofralık üzüm çeşidiyle, Cardinal ve Perlette üzüm çeşitlerinin 30 primerle DNA parmak izlerini araştırmışlardır. Araştırma sonucunda; melez çeşitlere özgü bant desenlerini veren primerler saptanmış, çeşitler düzeyinde kimlik tanısı olarak DNA profilleri tespit edilmiştir. Galicia (Kuzeybatı İspanya) bölgesinde yetiştirilen Albarino çeşidinin morfolojik olarak farklı tipleri RAPD analizi ile araştırılmıştır. Çeşide ait genç ve 100 yaşlı bitkilerden seçilen 24 omcada 42 primerle yürütülen araştırmalar sonucunda, bireyler arasında genetik bir farklılık bulunamamıştır. Morfolojik farklılıkların ise dışsal faktörlerden kaynaklanabileceği belirtilmiştir (Vidal et al. 1998). Başka bir çalışmada ise bu bölgeden 16 ve diğer bölgelerden 8 olmak üzere Albarino isimli 24 sinonim çeşidin 20 RAPD primeri ve 6 SSR lokusu ile genetik benzerlikleri araştırılmış; ilk bölgeye ait 16 çeşitte poliformizme rastlanmaz iken, diğer bölgelerden sağlanan çeşitlerde ise genetik farklılıklara ulaşılmıştır (Loureiro et al. 1998). İspanya'da yapılan bir diğer çalışmada, İspanya nın kuzey batısındaki sınırlı bir alanda yetiştirilen çok eskiden kalma bir grup asmanın (Vitis vinifera L. ) genetik ilişkileri ile İspanya, Fransa ve Almanya nın farklı bölgelerinde yetişen eski çeşitler arasındaki ilişkiler RAPD markörleri kullanılarak incelenmiştir. İncelemeler sonucunda bu bölgede çok eski zamanlardan beri var olan Galicia sinonimleri ile diğerlerinin birbirine çok yakın benzerlik içersinde olmadıkları ve bunun nedenin ise muhtemelen asmaların farklı orjinli yerlerden gelmesinden kaynaklandığı sonucuna varılmıştır. Ayrıca, İspanya da geniş bir alanda yetiştirilen ve iyi tanınan 5 çeşidin diğerlerinden farklı olduğu da ortaya çıkarılmıştır. Araştırma sonunda, çeşitlerin ortak genel köken ve bazı morfolojik özelliklerini paylaşma durumlarına göre; Airen ve Malvar, Pinot noir ve Chardonnay, Albarino ve Caino blanco olarak gruplanabileceği Vidal et al. (1999) tarafından saptanmıştır. İspanya ve Fransa'da yetiştirilen 32 beyaz üzüm çeşidinin genetik ilişkisi, RAPD markörleri kullanılarak araştırılmıştır. 208 primerden seçilen 33 primer kullanılarak amplifikasyon yapılmıştır. Genetik ilişki; düşük frekanslı bantlarda da çalışılarak ve 7

17 "UPGMA Cluster Analizi" kullanılarak saptanmıştır. Çeşitler; Akdeniz ve Atlantik etkileri ile doğru bir coğrafi gruplar olarak dağılım göstermişlerdir. Bunlardan bazıları ampelografik karakterler ve ortak yetiştirildiği bölgelere göre sınıflandırılmıştır. Bu karakterleri yönünden çeşitlerin bir ortak orijinden geldikleri öne sürülmüş; buna ilaveten Galicia (İspanya) Caino blanco, Laueiro blanco ve Burgundy (Fransa'dan) Melon, Chardonnay, ve Aligote çeşitleri arasında yakın ilişki bulunmuştur. Diğer iki yakın grup ilişkisi Godello ve Vardejo, Movar ve Malvasia çeşitlerinde belirlenmiştir (Vidal et al. 1999) Ağaoğlu ve Ergül (1999a), Amasya üzüm çeşitleri ekotipleri olarak bilinen 8 üzüm çeşidinin RAPD tekniği ile genetik tanımlamalarını yapmışlardır. Kullanılan 8 adet dekamer oligonükleotid'den UBC-237 ve PRA-I primerlerinin ekotipler bazında kesin bir ayrım sağladığı görülmüş ve yapılan analizlerde bu ekotiplerin ayrı birer çeşit olarak tanımlanabileceği saptanmıştır. Ağaoğlu ve Ergül (1999b) yaptıkları bir diğer araştırmada, ülkemizde yetiştirilen 17 sofralık üzüm çeşidinin RAPD analizi ile genetik farklılıkları araştırılmıştır. Kullanılan 15 dekamer primerden toplam 156 bant elde edilmiş olup ve çeşitler arasındaki genetik ilişki benzerlik indeksi ve dendogram düzeyinde belirlenmiştir. Araştırma sonucunda RAPD'in etkili bir teknik olduğu vurgulanmıştır. Merdinlioğlu et al. (2000) tarafından yapılan bir araştırmada, üç farklı moleküler markör tekniği (RAPD, AFLP, SSR) Vitis vinifera nın 12 çeşidine ait 21 klonun testinde kullanılmıştır. Her çeşit kendine özgü bantlar ile çeşitlerin ayırımı sağlanmış, dendogramlara göre çeşide ait bantlar diğerlerinden ayrılmış ve dendogramlarına göre 7 çeşit grup belirlenmiştir. Ağaoğlu vd (2000), 15 dekamer primer ile 18 üzüm çeşidinde gerçekleştirdikleri RAPD analizlerinde, çeşitler arası benzerlik oranının (Bozcaada Çavuşu-Emir; Öküzgözü-Emir), (Hasandede-Narince) arasında değiştiğini belirlerken; DNA düzeyindeki genetik benzerliklerin ise morfolojik benzerlikleriden daha çok çeşitlerin ekolojik orijinlerine bağlı olduğunu vurgulamışlarıdır. 8

18 Üç farklı markör tekniği, Beyaz Riesling çeşidinin 10 farklı klon genotipinde kullanılmıştır. Bütün klonlarda, RAPD, SSR ve ISSR markörleri aracılığıyla genetik farklılık elde edilmiştir. RAPD bantlarında ayrımsal yaklaşım için stabilize az görülürken; SSR ve ISSR markörleri yüksek stabilize göstermiştir. Bu metotların klonal asmalarda ve Riesling üzüm çeşidi klonlarının karakterizasyonu için temel verilerin kurulmasına uygun olduğu belirlenmiştir (Regner ve Wiedeck 2000). Ergül (2000), 15 dekamer primer kullanarak ülkemizde yetiştirilen 34 üzüm çeşidinin RAPD tekniği ile genetik benzerliklerini araştırmıştır. Üzüm çeşitlerinde, en düşük benzerlik oranı Anadolu Yapıncağı ve Hacıbalbal arsında ulaşılmış, en yüksek benzerlik oranı ise Sultani Çekirdeksiz ve Yuvarlak Çekirdeksiz kombinasyonunda bulunmuştur. Ayrıca dendogram oluşumunda çeşitler iki grupta eşit dağılım göstermişlerdir. Bunlardan birinci grup 15 şaraplık ve 2 çekirdeksiz çeşitten oluşurken, ikinci grup 17 sofralık çeşidi içermiştir. Araştırmada, elde edilen benzerlik oranları, çeşitlerin morfolojik benzerliklerinden daha çok coğrafik yetiştirilme bölgelerinin benzerlikleri ile paralellik gösterdiği sonucuna varılmıştır. Tunus'ta yapılan bir araştırmada, daha önce biyokimyasal metotlarla analizleri yapılan 33 yerel üzüm çeşidi (Vitis vinifera L.) RAPD markörleri ile yeniden tanımlanmıştır. Yapılan UPGMA analizi sonucunda çeşitler 5 gruba ayrılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre; bu grupların biyokimyasal analizlerle ayrımlarının yapılamayacağı; ayrıca elde edilen dendograma göre, fenotipik karakterler ile orijinin birbirinden bağımsız olduğu ortaya konmuştur (Zoghlami et al. 2001). Fransa ve İtalya'nın kuzey batısından alınan ve sinonim olduğu tahmin edilen 31 çeşitte yapılan RAPD ve SSR analizleri sonucunda 16 tanesinin sinonim olduğu sonucu ortaya çıkmıştır. Buna göre; Fransa'nın "Verddese" çeşididinin İtalya'nın "Bianver" ile, Fransa'nın "Chatus" çeşididinin İtalya'nın "Neiret" çeşidi ile Fransa'nın "Gouais blanc" çeşidinin İtalya'nın "Preveiral" ve "Liseiret" çeşitleri ile sinonim oldukları saptanmıştır (Schneider et al. 2001). 9

19 Hindistan'da yapılan bir araştırmada, bir grup asma genotiplerinin (kültür çeşitleri, anaçlar ve yabani türler) aralarındaki genetik ilişki RAPD tekniği kullanılarak analiz edilmiştir. Kullanılan belirleyici 19 primerden 250 bant elde edilmiş, bunların çoğu yüksek polimorfizm göstererek yerli ve kültür çeşitlerini ayırmıştır. Yapılan grup analizi sonucunda 3 ana grup belirlenmiş; yabani türler kültür genotiplerinden ayrılmış, kültüre alınmış genotipler de Labrusca ve Vinifera tipleri olarak ikiye ayrılmışlardır. Vinifera genotipleri grubu da çekirdekli ve çekirdeksiz olarak iki grupta toplanmıştır. Bu gruplama çalışması daha önce morfolojik özelliklere göre yapılan çalışmalarla aynı sonuçları vermiş ve bu gibi çalışmalar için, RAPD analizinin uygunluğu vurgulanmıştır (Tamhanker et al. 2001). Luo et al. (2001) tafından, Çin'de yapılan bir araştırmada, 18 yerli, 73 yabani tipden oluşan bir grup, 7 V. vinifera çeşidi, SO4 anacı ve bir V. riparia genotipi RAPD tekniği ile araştırılmıştır. İncelenen 280 primerden analiz için 20 primer seçilmiş, elde edilen bantlardan yoğun ve ölçülmesi kolay 191 bant seçilmiştir. Yapılan değerlendirme sonucunda Çin'de yetiştirilen yerli ile yabani genotipler arasında yüksek seviyede polimorfizm ortaya çıkmıştır. Çalışmada, RAPD tekniğinin tanımlama çalışmalarında hızlı ve kullanımı kolay bir teknik olduğu belirtilmiştir. Ülkemizde, yapılan bir diğer çalışmada, RAPD tekniği ile 22 dekamer primer kullanılarak 17 yerli üzüm çeşidinde genetik ilişkinin tespit edilmesi amaçlanmıştır. Bu çeşitler arasındaki genetik ilişkinin yine çeşitlerin bulunduğu orjinle ilgili olduğu sonucuna varılmıştır (Ergül et al. 2002). Herrera et al. (2002) tarafından Şili de yapılan bir araştırmada, Şili de yaygın olarak yetiştirilen 4 üzüm çeşidinin (Vitis vinifera L. cvs.) RAPD ve ISSR teknikleri kullanılarak genetik tanımlanması yapılmıştır. Her iki teknik ile çalışılan çeşitler birbirinden ayrılabilmiş; ancak, ISSR profilinin çözüm gücü RAPD den daha yüksek bulunmuştur. Çalışma sonucunda, Fransız Merlot klonları ile Şili'nin Merlot klonları arasında oranında benzerlik görülmüş ve yakın akraba olmadıkları vurgulanmıştır. Japonya'da yapılan bir çalışmada, Japon üzüm çeşidi Koshu ve 9 kendine döllenmiş dölü üzerinde RAPD analizi yapılmıştır. Kulanılan 18 primerden 17'si polimorfizim 10

20 göstermiş ve 108 bant elde edilmiştir. Benzerlik oranları % arasında değişmiştir. Çalışma sonucunda, döller arası benzerlikler düşük çıkarken, döller ve ebeveyn arasındaki benzerlikler yüksek çıkmıştır (Yamakawa 2002). Traminer klonlarında yapılan bir çalışma RAPD ve SSR moleküler markörler kullanılmış, bu çalışmalar sonucunda morfolojik olarak ayrı olduğu belirtilen Traminer klonlarından birkaç tanesinde genetik farklılık ortaya çıkartılmıştır. Araştırmada ayrıca, RAPD polimorfizminin heterozigoti tahmininde, SSR lokusunun ise birey tanımlanmasında kullanılabileceği belirtilmiştir (Regner ve Kaserer 2002). Çin'de yapılan bir araştırmada 7 Amurensis germplasma ait genotiplerde türler arası polimorfizmi belirlemek amacıyla RAPD analizi yapılmış ve bu türlerin ayırımları belirlenmiştir (Jun et al. 2003). Tunus'un kuzeyindeki 18 değişik yerden alınan yabani asma (Vitis silvestris)'ya ait 74 genotip üzerinde yapılan bir çalışmada, çiçek yapısı ve yaprak özellikleri birbirlerinden farklı olan bu genotiplerde RAPD tekniği kullanılarak genetik farklılıklar belirlenmeye çalışılmıştır. 11 dekamer primer kullanılarak 54 bant elde edilen bu çalışmada, 4 grup saptanmış ve 14 orijin elde edilmiştir (Zoghlami et al. 2003). Schneider et al. (2003) yaptıkları bir araştırmada, İtalya ve Fransa'da yetişen 30 üzüm çeşidinde RAPD ve mikrosatellit moleküler markörler kullanmışlardır. Daha önce yapılan çalışmalarda morfolojik karakterler, ampelografik tanımlamalar, agronomik gözlemler ve şarap yapılarına dayanarak bunların 22 tanesinin sinonim olduğu belirtilmişti. Bu çalışma sonucunda İtalyan ve Alp'lerin batısındaki Fransız çeşitlerinin birbirlerinin sinonimleri oldukları ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada, birbirlerine benzer olan bu sinonimlerin, bölgedeki tarihsel ve sosyoekonomik olduğu kadar ekolojik ve biyolojik faktörlerle bağlantılı olduğu belirtilmektedir. Pinto et al. (2003) yaptıkları bir araştırmada, kuzey Portekiz'e ait 12 çeşitte 9 RAPD primeri ve 6 SSR lokusu kullanarak karakterizasyon ilişkisini belirlemeye çalışmışlardır. Bu araştırma sonucunda bu çeşitlerden 8 tanesinin monotip örnek olduğu 11

21 ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada tanımlanmasında kullanılabileceği bildirilmektedir. her iki moleküler markörün de çeşitlerin Ülkemizde yapılan bir çalışmada (Atak 2003), melezleme ile elde edilen bazı üzüm çeşit ve çeşit adayları ile bunların ebeveynlerinin tanımlanmaları yapılmıştır. Denemelerde 20 primer kullanılmış, uygulamalar sonucunda en iyi polimorfizm veren dört dekamer primer seçilmiştir. Denemedeki çeşit ve çeşit adayları ebeveynlerinin arasında değişen oranlarda genetik benzerlik gösterdikleri saptanmıştır. Ülkemizde yapılan yapılan diğer bir araştırmada, değişik illerden toplanmış 14 adet Büzgülü üzüm genotiplerinin RAPD analizi ile genetik tanımlamaları yapılmıştır. Araştırmada, seçilmiş 20 primer kullanılmış, bunlardan 17'si polimorfizm göstermiştir. Denemede Kara Büzgülü 643 (Muğla) ve Büzgülü 572 (Eskişehir) çeşitleri oranı ile en düşük benzerlik verirken, Sık Büzgülü 516 (Konya) ve Büzgülü 738 (Kütahya) çeşitlerin ile en yüksek benzerlik oranı elde edilmiştir. Çalışmada ayrıca aynı ekolojide yetiştirilen bitkilerde genetik benzerliklerin daha yüksek olduğu vurgulanmıştır (Polat 2003). Japonya'da RAPD tekniği kullanılarak yapılan bir araştırmada, 11 genotip (6 Japon çeşidi, 4 hibrit ve 1 Amurensis türü) üzerinde çalışılmıştır. Bu araştırmada incelenen 26 primerden 13 tane polimorfizm gösteren primer kullanılarak 11 genotipin genetik uzaklıkları belirlenmiştir (Cao et al. 2004) Ülkemizde yapılan bir araştırmada, Türkiye'de yetişen 30 üzüm çeşidinde 20 dekamer primer kullanarak genetik varyasyonları belirlemek amacıyla RAPD tekniği kullanılmıştır. Araştırma sonucunda, 263 RAPD bantından 181'i polimorfik bulunmuştur. Çeşitler arasındaki genetik ilişki dendogram ve benzerlik ilişkisi ile tahmin edilmiştir. En düşük benzerlik (0.493) Anadolu Yapıncağı-Balbal arasında, en yüksek benzerlik (0.834) Kalecik karası-karadimrit çeşitleri arasında bulunmuştur. Araştırma sonuçları ile çeşitlere ait morfolojik özellikler ve yetiştirilme bölgeleri karşılaştırıldığında ise; genetik benzerliklerin çeşitlerin morfolojik özellikleri ile 12

22 yetiştirilme bölgeleri arasında bağlantılı olabileceği gibi bağımsız olabileceği sonucuna da ulaşılmıştır (Ergül ve Ağaoğlu 2005). Amerikan asma anaçlarının genetik tanımlanması Anaçların moleküler düzeyde genetik tanımlaması da RAPD tekniği ile gerçekleştirilebilmektedir. Anaçların karakterizasyonu üzerindeki moleküler araştırmalar çok kısıtlı olup, bunlardan en çok kullanılanı RAPD yöntemidir. This et al. (1997) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada araştırıcılar, aşılı asma bitkilerinin odunundan izole ettikleri DNA ları kullanarak, bağcılıkta yaygın kullanılan 30 asma anacının RAPD tekniği ile tanımlamaları yapmışlardır. primerlerden ikisi 23 anacı ayırt ederken, OPA-20 primeri tek başına bütün anaçlarda polimorfiklik sağlamıştır. Wolf et al. (1998) tarafından, Almanya da yaygın olarak kullanılan 7 anaç (8B, 125A, Kober 5BB, 5C, SO4, 3309C ve Boerner) üzerinde 48 primer denemişler ve yeterli orandaki polimorfizmi iki primer ile sağlamışlardır. Wolf et al. (1999) çoğunluğu Almanya da da yetiştirilen 16 Amerikan asma anacının farklılığını RAPD tekniği ile belirlemişlerdir. Bu çalışmada RAPD in etkinliğinde karşılaşılan genel sorunun dinükleotid dizi primerlerin seçimi ve yüksek birleşme sıcaklığına (45 o C) sahip olmasına neden olan G/C içeriğinden sakınılması ile çözülebileceği vurgulanmıştır. Ülkemizde yapılan bir çalışmada, asma fidanı üretiminde kullanılan üç Amerikan asma anacının (5BB, 110R, 140Ru), 4 farklı üretim istasyonundan alınan örneklerde olası genetik farklılıklar RAPD tekniği ile araştırılmıştır. Dört damızlık parseline ait 5BB ve 110R örneklerinde herhangi bir polimorfizme rastlanmamış ve anaçlara özgü bantlar elde edilirken, 140Ru anacında OPP-17 primeri ile üç farklı genotipe ulaşılmıştır (Ergül ve Ağaoğlu 2001). 13

23 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Bu araştırma yılları arasında Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Tarımsal Biyoteknoloji Bahçe Bitkileri Birimi Laboratuvarında yürütülmüştür. Araştırmada kullanılan materyaller (genotiplere ait çelikler) 2001 yılının Mart-Nisan aylarında, daha önceki çalışmalarda yerleri belirlenmiş Diyarbakır merkez ve ilçelerindeki çeşitlerin tespit edilen omcalarından alınmıştır. Ayrıca ilden Milli Koleksiyon Bağına (Tekirdağ iline) aktarılan çeşitlerin tümü alınmıştır. Toplanan bu çeşitlerin kısa ampelografik özellikleri Çizelge 3. 1'de verilmiştir. Alınan tüm çeşitlere ait çelikler; yine 3-5 gözlü olarak perlit torf-kum (2: 2 :1) karışımından hazırlanmış ortamda, polietilen tüplere dikilmiş ve sera ortamında köklendirilerek gözlerin sürmesi sağlanmıştır. Her genotipten en az 10 çelik dikim ortamına dikilmiştir. Denemede, bu iki kaynaktan toplanan toplam 46 üzüm çeşidine ait sürgün uçları ve genç yapraklar kullanılmıştır. 14

24 Çizelge 3.1. Araştırmada kullanılan Diyarbakır iline ait üzüm çeşitleri ve kısa ampelografik özelikleri No Çeşitler Sinonimleri Çiçek yapısı Salkım Şekli Şekli Tane Kabuk rengi Çekirdek Sayısı Değerlendirme şekli Alındığı ilçe Kaynak 1 Mikeri Siyah cısna 2, Himkeri 2 Erdişi Silindirik Küre Koyu kırmızı-mor 2 Sofralık Eğil Kaplan, Balcani Balcan 1, Patlıcan 1, Balcanlı 2, Siyahbalcani 2 Erdişi Konik Uzun-Elips Koyu kırmızı-mor 2 Sofralık Lice Kaplan, Hatunparmağı (beyaz) Zeynebi 2, İstanbullu 2, Herzem 2 Erdişi Silindirik Orak biçim Yeşil-Sarı 2 Sofralık Çermik Kaplan, Vilki Kışüzümü 1, Sorik 2 Erdişi Kanatlı Küre Kırmızı 2 Sofralık Çermik Kaplan, Şitu Kışüzümü 1 Erdişi Konik Geniş-Oval Yeşil-Sarı 2 Sofralık Merkez Kaplan, Kızılbanki Kızılvanki 2 Erdişi Konik Geniş -Oval Kırmızı 2 Sofralık Çermik Kaplan, Kohar Kohur 2 Erdişi Silindirik Kısa-Elips Yeşil-Sarı 2 Sofralık Lice Kaplan, Hasani... Erdişi Kanatlı Küre Yeşil-Sarı 2 Sofralık Lice Kaplan, Asuri... Erdişi Silindirik Hafif-Oval Kırmızı-Siyah 2-3 Sofralık Eğil Gürsöz, Zerik... Erdişi Omuzlu Uzun-Oval Yeşil-Sarı 2-3 Sofralık Eğil Gürsöz, Ağek Ağanınüzümü 1, Sorik 2, Kırmızıüzüm 2 Erdişi Konik Küre Mavi-Siyah 2 Sofralık-Kurutmalık Çermik Gürsöz, Gençmehmet Mazrone Erdişi Dallı Küre Yeşil-Sarı 2 Pekmez-Pestil Çermik Kaplan, Şaraplık Boğazkere 1 Erdişi Kanatlı Küre Siyah 2-3 Şıralık Merkez Gürsöz, Iskıcuna... Erdişi Dallı Küre Koyu kırmızı-mor 2 Pekmez-Pestil Lice Kaplan, Merir Meri 2 Erdişi Konik Küre Yeşil-Sarı 2 Pekmez-Pestil Hani Kaplan, Suluüzüm 1, Zeynebi 2 Fonksiyonel dişi Konik Uzun -Elips Yeşil-Sarı 2 Sofralık-Kurutmalık Çermik Kaplan, Beyazüzüm 1, Tahnvi 2 Fonksiyonel dişi Konik Küre Yeşil-Sarı 2 Sofralık Kocabaş Kaplan, Morek Morık 1, Morüzüm 1, Zeynebi 2 Erdişi Konik Genç-Oval Koyu kırmızı-mor 2 Sofralık Ergani Kaplan, Fonsiyonel dişi Kanatlı Küre Yeşil-Sarı 2 Sofralık-Kurutmalık Çermik Kaplan, Şamuzli Şamüzümü 1 Erdişi Konik Hafif -Oval Yeşil-Sarı 2-3 Sofralık-Şıralık Eğil Gürsöz, Şirelik Şireüzümü 1 Erdişi Kanatlı Küre Yeşil-Sarı 2 Şıralık-Şaraplık Eğil Kaplan, Karik Karaerik 1 Erdişi Konik Geniş- Oval Mavi-Siyah 2 Kurutmalık Çermik Kaplan, Mazrumi Mazruma 1, Mazrume 1, Şire 2 Erdişi Konik Küre Yeşil-Sarı 2 Şıralık-Şaraplık Eğil Kaplan,

25 Çizelge 3.1. (devam) 24 Belelük... Erdişi Konik Küre Koyu kırmızı-mor 2 Pekmez-Pestil Çüngüş Kaplan, İm (küçük)... Erdişi Kanatlı Oval Koyu kırmızı-mor 2 Şıralık-Şaraplık Hani Kaplan, Siyahgıldun... Erdişi Silindirik Küre Mavi-Siyah 2 Sofralık Hani Kaplan, İm (büyük) İme Ermeniyan 1, 1 Erdişi Kanatlı Oval Koyu kırmızı-mor 2 Şıralık Hani Kaplan, Çirbet Cibeyt 2, Çirbeyt 2 Erdiş Konik Uzun-Elips Yeşil-Sarı 2 Pekmez-Pestil Çüngüş Kaplan, Beyazgıldun... Fonsiyonel dişi Kanatlı Uzun-Elips Yeşil-Sarı 2 Sofralık Hani Kaplan, Amorku Amarsev 1 Erdişi Konik Küre Mavi-Siyah 2 Sofralık Lice Kaplan, Avkenek Suüzümü 1, Avkinek 2 Erdişi Dallı Hafif -Oval Yeşil-Sarı 2-3 Sofralık-Şıralık Merkez Gürsöz, İstanbullu... Erdişi Konik Uzun-Elips Yeşil-Sarı 2 Sofralık Eğil Kaplan, Şekeri Auklek 1 Erdişi Konik Geniş-Oval Yeşil-Sarı 2 Sofralık-Kurutmalık Ergani Kaplan, Şaraplık 1 Erdişi Kanatlı Yuvarlak Kırmızı-Siyah 2-3 Şaraplık-Şıralık Eğil Gürsöz, Luvanek Tilkikuyruğu 1 Erdişi Kanatlı Kısa-Elips Yeşil-Sarı 2 Sofralık Çermik Kaplan, Hatunparmağı... Foksiyonel dişi Silindirik Uzun-Elip Koyu kırmızı-mor 2 Sofralık Çermik Kaplan, 1994 (Siyah) 37 Kışgıldun... Erdişi Dallı Küre Pembe 2 Sofralık Hani Kaplan, Kabarcık... Erdişi Silindirik Küre Yeşil-Sarı 2 Şıralık-Şaraplık Eğil Kaplan, Siyahüzüm* Raşme 1 Erdişi Kanatlı Küre Siyah-Mor 2-3 Şaraplık-Şıralık Ergani *T.B.A.E de gözlemler 40 *... Erdişi Kanatlı Uzun-Elips Siyah 2-3 Şıralık Eğil *T.B.A.E de gözlemler 41 İsimsiz * *... Erdişi Kanatlı Uzun-Elips Beyaz 2-3 Sofralık-Kurutmalık Ergani *T.B.A.E''de gözlemler 43 Morüzüm* Morık 1, Morüzüm 1, Zeynebi 2, Muhameddiye Erdişi Silindirik Küre Koyu kırmızı-mor 2-3 Sofralık Eğil *T.B.A.E''de gözlemler 44 * Mehmetyakupüzümü 1 Fonksiyonel Konik Elips Yeşil-Sarı 1-2 Sofralık Çermik *T.B.A.E''de gözlemler Dişi 45 * Suluüzüm 1, Zeynebi 2 Fonksiyonel Konik Elips Yeşil-Sarı 2-3 Sofralık-Kurutmalık Çüngöş *T.B.A.E de gözlemler Dişi 46 Abdullah* Apo 2 Erdişi Kanatlı Küre Yeşil-Sarı 2-3 Sofralık Eğil *T.B.A.E de gözlemler 1 Kaplan, (1994), 2 Gürsöz, (1993), *T.B.A.E: Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü'den (Milli Koleksiyon Bağı) alınan çeşitler. 16

26 3. 2. Yöntem Arştırmada kullanılan RAPD tekniği üç aşamada gerçekleştirilmektedir. Bu aşamalar; DNA izolasyonu, PCR uygulamaları ve Sonuçların değerlendirilmesidir DNA izolasyonu Araştırmada kullanılan DNA izolasyon (ekstraksiyon) yöntemi daha önce değişik araştırıcılar tarafından (Ergül 2000 ve Ergül et al. 2002, Ağaoğlu vd 2000 ve 2001) asmalarda kullanılan ve çok iyi sonuç verdiği saptanmış olan Lodhi et al. (1994) tarafından geliştirilmiş metot seçilmiştir. Bu araştırmada kullanılan 46 üzüm çeşidinin sürgün ucundaki yarı açılmış genç yapraklar kullanılarak DNA ekstraksiyonları gerçekleştirilmiştir. Denemede kullanılan bu DNA izolasyonu metodunun uygulanan aşamaları aşağıda verilmiştir. 0.5 g yaprak sıvı azot kullanılarak havanda iyice ezildi. Üzerine 5 ml ekstraksiyon buffer eklenerek örnek bu çözelti içersinde homojenize edildi. Karışım 15ml' lik polypropylene santrifüj tüpüne aktarıldı. Tüpteki karışıma 50 mg polyvinyl polyprolidone (PVPP) eklenerek karıştırıldı. (100 mg PVPP/g yaprak hesabı ile). Karışım 60 o C'deki su banyosunda 25 dk. bekletildikten sonra, oda sıcaklığına kadar soğutuldu. Soğuyan karışım üzerine 6 ml cloroform : octanol (24 : 1) ilave edilerek tüp hafif bir şekilde kez sallandı rpm'de 15 dk. oda sıcaklığında santrifüj yapıldı. Santrifüj sonucunda üst sıvı yeni bir 15 ml lık tüpe aktarıldı. 17

27 Faz renginin berrak olmadığı uygulamalarda ikinci chloroform-octanol ekstraksiyonu gerçekleştirildi ve santrifüj uygulaması yapıldı. Santrifüj sonucunda elde edilen berrak üst faz sıvı kısma hacminin yarısı kadar 5M NaCl eklendi ve hafifçe çalkalandı. Çalkalama işleminden sonra son hacmin iki katı % 95'lik soğuk ethanol (-20 o C) tüpe eklenerek, DNA iplikçiklerinin oluşumu ve gözlenebilmesi amacı ile dk., gerektiği hallerde hatta daha uzun süre buzdolabı koşullarında bekletildi. Oluşan DNA sarmalları, bir lup (plastik çubuk) yardımı ile alınarak, %76'lık soğuk ethanol (0-4 o C) içeren 1.5 ml'lik ependorf tüpüne aktarıldılar. DNA'nın çöktürülmesi amacı ile sırası ile 3000 ve 5000 rpm'de 3'er dakikadan toplam 6 dk. santrifüj edildiler. Santrifüj sonunda, sıvı kısmı (ethanol) DNA dan uzaklaştırılmak amacı ile ve DNA lar kurutulmadan tüpler ters çevrilerek 37 o C'de dk. beklendi. DNA lar µl TE buffer'da çözündürüldüler. Her 100 µl solusyon için 1µl RNAase A eklendi ve 37 o C'de 15 dk. süre ile bekletilerek RNA uzaklaştırıldı. Denemelerde kullanılan çözeltilerin özellikleri ve hazırlanışları aşağıda verilmiştir. Ekstraksiyon buffer: 20 mm sodium EDTA ve 100 mm tris-hcl (karışım ph 8.0'e HCI ile ayarlandı), 1,4 M NaCl ve % 2,0'lik (ağırlık/hacim) CTAB şeklinde hazırlanan çözeltiye % 0,2 β-mercapto ethanol kullanım öncesi ilave edildi. Chloroform: Octanol : 24:1 (hacim-hacim) NaCI : 5M TE buffer : 10 mm Tris-HCI ve 1 mm EDTA karışımı (ph 8.0) Rnase A (Sigma R9009) : 10 mg/ml Yöntemde elde edilen DNA miktarı genellikle 0,5-1 mg DNA/g taze yaprak dokusu oranında gerçekleştirilmiştir. 18

28 PCR uygulamaları PCR optimizasyonu Araştırmada ön denemeler yapılarak ve 5 çeşit (Kabarcık,,, Kızılbanki, ) ile PCR optimizasyonu çalışmaları gerçekleştirilmiştir. PCR optimizasyonu için 2 farklı protokol denenmiş (Çizelge 3.2) ve MJ PTC 100 Research, INC. Thermocycler cihazında, Çizelge 3.3'de belirtilen koşullarda amplifiye edilmiştir. Çizelge 3.2. Denenen PCR reaksiyon karışımları Reaksiyon Bileşimi(μl) Protokol No. 1 Protokol No. 2 Su 16.1 (15.9) 10.9 (10.7) 10Χ Buffer MgCl DNTP Taq 0.1 (0.3) 0.1 (0.3) DNA 2 3 Primer Toplam Hacim(μl) Çizelge 3.3. Denenen amplifikasyon koşulları Amplifikasyon No. 1 Amplifikasyon No.2 94 o C de 30 sn. 94 o C de 1 dk o C' de 1 dk o C de 2 dk. 72 o C' de 1.45 dk. 72 o C de 2 dk. 35 döngü 40 döngü 72 o C de 8 dk. 72 o C de 8 dk. 4 o C de tut 4 o C de tut 19

29 Bu karışım ve koşullarda yapılan denemelerin sonuçlarına göre belirli oranlarda (1/5, 1/10, 1/20) sulandırılan DNA örnekleri; P-166 (5 -GTGACGGACT-3 ), UBC-238 (5 - CTCTCCAGCA-3 ), OPO-02 (5'-ACGTAGCGTC-3') primerleri denenerek en iyi sonuçların alınabileceği durum araştırılmıştır. Bu sonuçlara göre, Protokol No.2 (0.3 μl Taq ile) ve Amplifikasyon No.1 ile en iyi optimizasyon koşulunu vermiştir. Agaroz jel elektroforez 5 μl yükleme buffer ı (%40 sucrose, %0.25 bromofenol blue) eklenen PCR ürünlerinin elektroforezi agaroz jel ortamında gerçekleştirilmiştir. 26 kuyucuklu jel tepsileri kullanılarak % 1.5'lik agaroz da 1X TBE (Trisma Base, Boric Acid., EDTA) buffer'da 4 saat ile 100 Volt'da yürütülen örnekler, 0.25 μg/ml ethidium bromide ile boyanmış ve UV altında Polaroid type 665 negatifli siyah-beyaz flimle görüntülenmiştir. Pimerler Araştırmada kullanılan sentetik oligonükleotid olarak denenen 60 primerden (OPA, OPB, OPF, OPO, UBC, P, B, S vb. serilerden) daha iyi sonuç veren 25 primer seçilmiş ve RAPD analizleri için kullanılmıştır. Kullanılan primerler ve bunlara ait baz dizilişleri Çizelge 3.4.' de verilmiştir. RAPD sonuçlarının tekrarlanabilirliği, yapılan PCR uygulamalarında tüm çeşitlerde 3 primer ile (OPA-15, OPO-02 ve P-123) tekrarlanmış ve elde edilen bant profilleri tamamen benzerlik göstermiştir. Ayrıca PCR reaksiyonlarda negatif kontrol kullanılmıştır. PCR reaksiyonlarda negatif kontrol kullanılması ve bunlarda herhangi bir bandın ortaya çıkmaması, elde edilen bantların kendi DNA larına ait bantlar olduğunu da göstermektedir. 20

30 Sonuçların değerlendirilmesi Agaroz jel üzerinde PCR amplifikasyon ürünlerinin oluşturdukları bantlar Polaroid film üzerine görüntülendikten sonra bu bantların okunmasında sadece kuvvetli bantlar değerlendirmeye alınmışlardır. Oluşan bantlar çeşitlerde ortak (monomorfik) veya farklı (polimorfik) olma durumlarına göre değerlendirilmiş; çeşitlerde var olma yada olmama durumuna göre bantlar "1" veya "0" şeklinde değerlendirilmiş ve benzerlik indeksleri oluşturulmuştur. Elde edilen RAPD verileri Jaccard katsayısına (Jaccard 1908) göre çeşitler arasındaki genetik uzaklığı saptamak için kullanılmıştır. MVSP yazılım paket programı (Kowach 1999) bezerlik katsayılarını bulmak için kullanılmış ve elde eidilen bu katsayılar UPGMA cluster kullanılarak dendogram haline dönüştürülmüştür. 21

31 Çizelge 3.4. RAPD analizlerinde kullanılan primerler ve baz dizileri Kullanılan primerler Baz dizisi 5'-3' OPA CAGGCCCTTC-3 OPA TGCCGAGCTG-3 OPA AATCGGGCTG-3 OPA GAAACGGGTG-3 OPA GGGTAACGCC-3 OPA TTCCGAACCC-3 OPA AGGTGACCGT-3 OPB GGTGACGCAG-3 OPF CCGAATTCCC-3 OPF GGGAATTCGG-3 OPF GGGATATCGG-3 OPO ACGTAGCGTC-3 OPO CCCAGTCACT-3 OPO CAGCACTGAC-3 OPO TCAGAGCGCC-3 OPO GACAGGAGGT-3 OPO GGTGCACGTT-3 UBC CTCTCCAGCA-3 B CGCCCGCAGT-3 OD GTGTGCCCCA-3 P GGGATTCGAC-3 P GTGACGGACT-3 P CGGATCGACA-3 P GCCGTGATAG-3 S GATAGCCGAC-3 22

32 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1. DNA İzolasyonu Araştırmada kullanılan 46 üzüm çeşidine ait DNA'lar, Lodhi et al. (1994) izolasyon yöntemine göre elde edilmiştir. İzole edilen tüm çeşitlere ait DNA'ların miktar ve saflık oranları (Nanodrop nd 1000 Model spektofotometre ile ölçülmüştür) Çizelge 4.1'de ve agaroz jeldeki görüntüleri ise Şekil 4.1'de verilmiştir. Denemede kullanılan üzüm çeşitlerinin DNA verileri incelendiğinde, çeşitlerden elde edilen DNA miktarları arasındaki farklılıkların oldukça fazla olduğu gözlenmiştir. DNA miktarlarında en yüksek değeri 2695 ng DNA/μl ile Siyahüzüm* çeşidi verirken, en düşük miktar 221ng DNA/μl) ile Abdullah çeşidinde elde edilmiştir (Çizelge 4.1). DNA ların saflığına bakıldığında ise, yine çeşitler arasında farklılıklar olduğu görülmektedir (Çizelge 4.1). Çeşitlerin saflık değerleri 1.51 (Asuri ve Avkenek)-2.03 (Mikeri) (A260/A280) arasında bulunmuştur. Çizelge incelendiğinde çeşitlere ait saflık değerlerinin genellikle (A260/A280) arasında yoğunlaştığı gözlenmektedir. Çok miktarda ve parçalanmamış DNA izolasyonun belirtisi olarak yükleme hücrelerinde de DNA'lara rastlanılan ve Şekil 4.1'de jel görüntüleri verilen DNA'ların, PCR'da kullanılmasına uygun tek bant oluşturdukları görülmüştür. DNA ların tek bant oluşturmuş olmaları, onların RNA ve hücre sekonder ürünlerden ari, sarmal yapılarını koruyarak parçalanmamış olduklarını göstermektedir. 23

33 4.2. PCR Uygulamaları RAPD analizlerinde değerlendirmeye alınan toplam bant sayısı (n), polimorfik bant sayısını (n) ve polimorfik bant oranları (%) Çizelge 4.2 de verilmiştir. Çizelge incelendiğinde, seçilen 25 primerden toplam 171 bant elde edilmiş, bu bantlardan 110 tanesi polimorfik çıkmıştır. Tüm bantların polimorfik oranları % olarak saptanmıştır. Primerler itibariyle değerlendirme yapıldığında en yüksek bant sayısı (10 bant) OPO-07 verirken, en düşük bant sayısı (5 bant) ile OPF-06, UBC-238, P-437, ve P-443 primerlerinde gözlenmiştir. Polimorfik bant sayılarında ise en yüksek değer (7 bant) B- 389 ile OPA-18'de elde edilirken, OPA-01, OPA-02, OPA-04, OPF-06, OPO-02, OPO- 11, UBC-238 ve P-437 primerleri 3 bant sayısı ile en düşük değerleri vermişlerdir. Primerler bazında polimorfik bant oranlarına bakıldığında, en yüksek oran % ile OPA-18 ve B-389 'da görülürken, en düşük değer OPA-01 ve OPO-02'de % oranında çıkmıştır. Diğer primerlerdeki polimorfik bant oranları bu değerler arasında kalmıştır. Amplifikasyon ürünlerinin jel görüntüleri ise Şekil 'da verilmiştir. 24

34 Çizlege 4.1. Araştırmada kullanılan üzüm çeşitlerine ait DNA'ların miktar (ng DNA/μl) ve saflık (A260/A280) değerleri Çeşitler DNA miktarı DNA saflığı (ng DNA/μl) (A260/A280) Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli l Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amorku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm* * İsimsiz* * Morüzüm* * * Abdullah* *Tekirdağ'dan getirilen çeşitler 25

35 Çizelge 4.2. Araştırmada kullanılan primerlere ait toplam bant sayısı (n), polimorfik bant sayısı (n) ve polimorfik bant oranları (%) değerleri Primerler Toplam bant sayısı (n) Polimorfik bant sayısı (n) Polimorfik bant Oranları (%) OPA OPA OPA OPA OPA OPA OPA OPB OPF OPF OPF OPO OPO OPO OPO OPO OPO UBC B OD P P P P S Toplam

36 Tekirdağ daki Çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Şekil 4.1. Araştırmada kullanılan Diyarbakır ili üzüm çeşitlerine ait DNA ların agaroz jel üzerindeki görüntüleri 27

37 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör bp Şekil 4.2. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPA-01 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri. [Markör: 100bp DNA Ladder (Promega). Kontrol: Genomik DNA hariç diğer PCR öğeleri] 28

38 Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Tekirdağ daki çeşitler Kontrol bp Şekil 4.3. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPA-02 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri 29

39 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil 4.4. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPA-04 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünmlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

40 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil 4.5. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPA-07 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

41 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil 4.6. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPA-09 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

42 Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Tekirdağ daki çeşitler Şekil 4.7. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPA-15 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp Kontrol

43 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil 4.8. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPA-18 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

44 Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Tekirdağ daki çeşitler Şekil 4.9. Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPB-07 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

45 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPF-05 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

46 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPF-06 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

47 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPF-08 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürürlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

48 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPO-02 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

49 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPO-05 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

50 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPO-07 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

51 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPO-10 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon üzünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

52 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPO-11 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

53 Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Tekirdağ daki çeşitler Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OPO-19 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

54 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin UBC-238 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

55 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin B-389 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

56 Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Tekirdağ daki çeşitler Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin OD-08 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

57 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin P-123 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

58 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin P-166 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

59 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin P-437 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

60 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin P-443 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp

61 Tekirdağ daki çeşitler Mikeri Balcani Hatunparmağı (beyaz) Vilki Şitu Kızılbanki Kohar Hasani Asuri Zerik Ağek Gençmehmet Şaraplık Iskıcuna Merir Morek Şamuzli Şirelik Karik Mazrumi Belelük İm (küçük) Kontrol Siyahgıldun İm (büyük) Çirbet Beyazgıldun Amarku Avkenek İstanbullu Şekeri Luvanek Hatunparmağı (siyah) Kışgıldun Kabarcık Siyahüzüm İsimsiz Morüzüm Abdullah Markör Şekil Diyarbakır üzüm çeşitlerinin S-34 primeri ile oluşturulan PCR amplifikasyon ürünlerinin agaroz jel üzerindeki görüntüleri bp