ILIMAN İKLİM MEYVE TÜRLERİNDE ÇEŞİT VE TİPLERİN MOLEKÜLER TEKNİKLERLE KARAKTERİZASYONU

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "ILIMAN İKLİM MEYVE TÜRLERİNDE ÇEŞİT VE TİPLERİN MOLEKÜLER TEKNİKLERLE KARAKTERİZASYONU"

Özgür Doğu
7 yıl önce
İzleme sayısı:

1 ILIMAN İKLİM MEYVE TÜRLERİNDE ÇEŞİT VE TİPLERİN MOLEKÜLER TEKNİKLERLE KARAKTERİZASYONU Meryem YILDIZ ÖCAL Gıda Yüksek Mühendisi Manavgat Gıda Tarım ve Hayvancılık İlçe Müdürlüğü

2 EĞİTİM BİLGİLERİ Eğitim Yeri: Foundacion Alua Dei Parque Científico Tecnológico -Zaragoza -İspanya Eğitim Süresi: 21 Aralık Mart 2013 Eğitim Konusu: Ilıman İklim Meyve Türlerinde Çeşit ve Tiplerin Moleküler Tekniklerle Karakterizasyonu Danışman: Dr. Angel Fernández Martí

3 ZARAGOZA

4 KAMPÜS

5 FUNDACION PCTAD GIDA VE TARIMSAL ÜRÜNLERDE KALINTI ANALİZİ MOLEKÜLER BİYOLOJİ HUBUBAT VE YAĞLI TOHUMLARDA KALİTE KONTROLÜ

6 Dr. Angel Fernández Martí- Bitki Islahı ve Moleküler Biyoloji Laboratuvarı Başkanı. Bademde ve kirazda kendine uyuşmazlık hakkında pek çok uluslar arası yayını bulunmaktadır Yılının En Başarılı Genç Araştırmacı Ödülü Yoko Higaki-Bitki Islahı ve Moleküler Biyoloji Laboratuvarı Teknisyeni

7 MOLEKÜLER TEKNİKLER Genetik Kaynak Yönetiminde; Çeşitlerin tanımlanması, Farklılıkların değerlendirilmesi, Duplikasyonların giderilmesi Islah Programlarında; Haritalama, MAS - Marker-assisted selection (Markır Destekli Seleksiyon) A. DNA dizisi biliniyorsa SSRs ( Simple Sequence Repeat Markers)-Basit dizi tekrarları - Mikrosatellite markers B. DNA dizisi hakkında bilgi yoksa RAPD ( Random Amplified Polymorphic Markers) Rastgele oligonükleotid primerleri ile çoğaltılmış polimorfik DNA AFLP( Amplified Fragment Lenght Polymorphism) Çoğaltılmış parça uzunluğu polimorfizmi

8 SSRS Avantajları: Ko-dominant ve locus-specific markırlar Yüksek oranda polimorfik Genomda bol sayıda ve rastgele dağılmışlardır Laboratuarlar arasında paylaşımı kolaydır Yüksek genotiping özelliği Dezavantajları: İlk Markır geliştirme pahalı ve çok zaman alıcıdır Taxa-spesifik

9 RAPD ( RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC MARKERS) RASTGELE OLIGONÜKLEOTID PRIMERLERI ILE ÇOĞALTILMIŞ POLİMORFİK DNA Avantajları az miktarda DNA gerektirir radyoaktif madde kullanımını gerektirmez ve polimorfizm oranı oldukça fazladır dominant markör tekniği amplike olmuş bantlar var veya yok olarak değerlendirilir Dezavantajları örneklerde meydana gelebilecek bulaşıklar dominant özellik farklı laboratuarlarda sonuçların tekrarlanmasında karşılaşılan sorunlar

10 AFLP( AMPLIFIED FRAGMENT LENGHT POLYMORPHISM) ÇOĞALTILMIŞ PARÇA UZUNLUĞU POLİMORFİZMİ Avantajları Yüksek orandaki tekrarlanabilirlik ve polimorfik bant sayısı Dezavantajları pahalı olması amplike bantların ortaya çıkarılmasında radyoaktif madde veya floresans boyama gerektirmesi

11 KİRAZ DALLARI VE TOMURCUKLAR

12 DNA EKSTRAKSİYONU: Kiraz ağacı tomurcukları sıvı azot ile ezilerek öğütüldü. ~50 mg örnek tüplere dolduruldu. Üzerine 700 µl CTAB mix eklendi C de 1 saat inkübe edildi.(her 15 dk karıştır) 600 µl SEVAG ekle (SEVAG hazırlamak için 240 ml CHCl ml isoanylalcohol karıştırılır) 1400 rpm de 5 dk santrifüj edilir. 1.5 ml lik yeni tüpe 400 µl transfer edilir. 400 µl dondurulmuş isopropanol eklenir ve yavaşça karıştırılır rpm de 5 dk santrifüj edilir. Üst faz atılır. 800 µl yıkama buffer ilave edilir. 1-2 saat kuruması için bekletilir rpm de 5 dk santrifüj edilir. Üst faz atılır. Vakum altında kurutulur. 100 µl MTE eklenir.(mte hazırlanışı: 2.5 ml 1 M Tris-HCl + 50 µl 0.5 M EDTA konur ve 250 ml ye ultra saf su ile tamamlanır) 1 gece 4 C de bekletilir. Nanodrop da DNA miktarı ölçülür.

13 ÖRNEKLERİN HAZIRLANMASI

14 DNA EKSTRAKSİYON AŞAMASINDAN GÖRÜNTÜLER

15 NANODROP İLE DNA KONSANTRASYONU ÖLÇÜLMESİ

16 PCR KOŞULLARI Milli Q water 2.2 µl 10x Buffer 1 µl dntp 0.2 µl Primer Forward µl Primer Reverse µl Taq polimeraz 0.1 µl DNA 2 µl TOTAL 8 µl

17 FARKLI RENKTEKİ MARKÖRLERİN AYNI PCR PROGRAMINDA ÇALIŞABİLECEK OLANLAR İLE PLANLANMASI

18 PCR PROGRAMI PCR (SSR 57 0 C) 94 0 C de 1 dk 94 0 C de 0.15 dk (34 döngü) 57 0 C de 0.15 dk 72 0 C de 1.00 dk 72 0 C de 2.00 dk 8 0 C de

19 PCR PROGRAMI GÖRÜNTÜSÜ

20 AB 3130XL GENETIC ANALYZER CİHAZI Hi-Di Mix karışımı Bir plaka için (96 örnek) Hi-Di formamide (-20 0 C de sakla) 1320 µl AF445 (4 0 C de sakla) 48 µl C de 5 dk denaturasyon

21 ÖRNEKLERİN SEQUENCER CİHAZINDA FRAGMENT ANALİZİ

22 DENDOGRAM İÇİN EXCEL PROGRAMI

23 DENDOGRAM

24 Dendogram programı ile türler arasındaki yakınlık görsel hale dönüştürülür. Böylece türler arası akrabalık, yakınlık görülebilir. Ayrıca yapı analizi ile de türler arasındaki akrabalık,yakınlık görülebilmektedir.

25 YAPI ANALİZİ

26 KİRAZDA KENDİNE UYUŞMAZLIK ÇALIŞMALARI Kiraz yetiştiriciliğinde döllenme en önemli sorunu teşkil eder. Son yıllarda elde olunan kendine verimli çeşitler dışındaki bütün kiraz çeşitleri meyve tutumu için karşılıklı döllenmeyi gerektirir. Bir kiraz çeşidinin kendi çiçek tozu ile döllendiği zaman meyve bağlamaması, kendiyle uyuşmazlık göstermesinden ileri gelmektedir. Kiraz çeşitlerinde kendiyle uyuşmazlıktan başka, birbirleriyle uyuşmazlık da yaygın olarak görülür. Normal yapıda çiçek tozu ve yumurta hücresi teşkil eden bu çeşitlerin birbirlerini dölleyememesi, çeşitler arasında var olan birbiriyle uyuşmazlıktan ileri gelmektedir. 56 kiraz örneği 2 farklı primer

27 PCR KOŞULLARI Milli Q water 3.75 µl 10x Buffer 1 µl dntp 0.2 µl Primer Forward 0.4 µl Primer Reverse 0.4 µl Taq polimeraz 0.05 µl DNA 3 µl TOTAL 8.8 µl

28 ÖRNEKLERİN PCR CİHAZINA KONULMASI

29 SELF-INCOMPATIBILITY PROGRAMI

30 JEL YAPIMI: Küçük jel için % 1 Agarose 60 ml TBE (Tris-borate-EDTA) 4 µl SyBr (flourecans) Tüm malzemeler behere konur, mikrodalgada 1 dk ısıtılır her 20 sn de karıştırılır. Çözelti berrak olunca işlem sonlandırılır. Hava kabarcığı olmamasına dikkat edilir.

31 JEL GÖRÜNTÜSÜ Jele yükleme 2 µl mavi boya (blue dye) 4 µl PCR ürünü 3 µl ladder 100 Volt da jel yürütülür. Jel elektroforesis

32 JEL GÖRÜNTÜLEME CİHAZI KİRAZ ÖRNEKLERİNİN BANT GÖRÜNTÜSÜ

33 Jel elektroforez ile S alleli yaklaşık olarak tespit edilebilirken fragment analizi ile S allelleri kesin olarak tespit edilebilmektedir. Fragment analizi için floresans etkili tail(kuyruk) kullanılmış ve S allelleri pik olarak görüntülenmiştir.

34 PCR KOŞULLARI(FLOURESANS ETKILI TAIL KULLANILARAK) Milli Q water 3.5 µl 10x Buffer 1 µl dntp 0.2 µl Primer Forward µl Primer Reverse 0.5 µl Taq polimeraz 0.1 µl Tail 0.5 µl DNA 2 µl TOTAL 7.8 µl

35 PCR programı 94 0 C de 4 dk 94 0 C de 1.00 dk (45döngü) 50 0 C de 1.00 dk 72 0 C de 1.00 dk 72 0 C de 5.00 dk 8 0 C de

36 Primer olarak PaCons1-F,PaCons1-R ve Fbox5, FboxintronR kullanılmıştır. İki PCR ürünü fragment analizi için tek plakaya; 1-Önce PCR 1 ürünü ve PCR 2 ürünü ultra saf su ile seyreltilmiştir.(1 µl PCR ürünü+9 µl milli Q water) 2-Seyreltilmiş PCR ürünlerinin her birinden 2.4 µl plakaya konulmuştur µl Hi-Di mix konur C de 5.00 dk denature edilir. 5- Buzdolabında karanlıkta bekletilir.

37 Hi-Di Mix karışımı Bir plaka için (96 örnek) Hi-Di formamide (-20 0 C de sakla) 1320 µl AF445 (4 0 C de sakla) 48 µl

38 ÇALIŞMADAN ELDE EDİLEN VERİLERE GÖRE ÖRNEKLERİN S ALLEL TABLOSU

39 DİĞER LABORATUVAR ÇALIŞMALARI Ayrıca yabani bademlerde kendine uyuşmazlık analizi ve mısırda transgenik ve transgenik olmayan örneklerin tespitine yönelik analizler yapıldı C de muhafaza edilen mısır örnekleri makasla küçültülerek örnek kabına konuldu.

40 ANALİZ AŞAMASINDAN GÖRÜNTÜLER

41 SU BANYOSUNDA BEKLETME

42 PCR KOŞULLARI DNA ekstraksiyonu sonucu elde edilen DNA konsantrasyonu Nanodrop cihazı ile ölçülür. PCR koşulları:1 örnek için Milli Q water 3.75 µl 10x Buffer 1 µl dntp 0.2 µl Primer Forward 0.4 µl Primer Reverse 0.4 µl Taq polimeraz 0.05 µl DNA 3 µl TOTAL 8.8 µl

43 PCR PROGRAMI 95 0 C de 5 dk 95 0 C de 0.30 dk (40 döngü) 60 0 C de 0.30 dk 72 0 C de 0.30 dk 72 0 C de 5.00 dk 4 0 C de Jel yapımı: Orta boy jel için % 1 Agarose 900 ml TBE 5 µl SyBr (flourecans) Tüm malzemeler behere konur, mikrodalgada 1 dk ısıtılır her 20 sn de karıştırılır. Çözelti berrak olunca işlem sonlandırılır. Hava kabarcığı olmamasına dikkat edilir. Jele yükleme; 2 µl mavi boya (blue dye) 4 µl PCR ürünü 3 µl ladder 100 Volt da jel yürütülür.

44 MISIR ÖRNEKLERİNE AİT JEL GÖRÜNTÜSÜ

45 SONUÇ Programın Alua Dei Bilim ve Teknoloji Park Vakfı ve Bakanlığımızın diğer araştırma enstitüleri ile olan bilimsel işbirliğini güçlendirmek bakımlarından faydalı olacağına inanılmaktadır. Moleküler tekniklerle ılıman iklim meyve türlerinin karakterizasyonuna yönelik projeler üretilebilir. -Çeşitlerin tanımlanması -Farklılıkların değerlendirilmesi -Duplikasyonların giderilmesi -MAS - Marker-assisted selection (Markır Destekli Seleksiyon) -Haritalama

47 İSPANYA

48 TEŞEKKÜRLER GIDA TARIM VE HAYVANCILIK BAKANLIĞI FOUNDACİON ALUA DEİ PARQUE CİENTÍFİCO TECNOLÓGİCO Dr. ANGEL FERNÁNDEZ MARTÍ

Benzer belgeler

1. Ekstraksiyon Tamponu: %2 (w/v) CTAB (Cetyltrimethyl-ammonium bromide) 1.4 M NaCl, % 0.2 (v/v) β-merkaptoetanol, 20 mm EDTA. 100 mm Tris-HCl (ph 8)

KONU-7. MOLEKÜLER BĠYOLOJĠDE TEMEL TEKNĠKLER BĠTKĠDEN GENOMĠK DNA ĠZOLASYONU Kullanılan Tamponlar: 1. Ekstraksiyon Tamponu: %2 (w/v) CTAB (Cetyltrimethyl-ammonium bromide) 1.4 M NaCl, % 0.2 (v/v) β-merkaptoetanol,