EK-11 Sonuç Raporu Formatı

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE Proje Türü Proje No Proje Yöneticisi Proje Konusu : Hızlandırılmış Destek Projesi :13H :Doç. Dr. Ayşe Karakeçili : Üç Fazlı Biyoaktif Polimerik M embranların Hazırlanması ve Karakterizasyonu Yukarıda bilgileri yazılı olan projemin sonuç raporunun e-kütüphanede yayınlanmasını; İSTİYORUM V n İSTEMİYORUM GEREKÇESİ: Doç. Dr. Ayşe Karakeçili

2 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ SONUÇ RAPORU ÜÇ FAZLI BİYOAKTİF POLİMERİK MEMBRANLARIN HAZIRLANMASI VE KARAKTERİZASYONU Proje Yürütücüsü: Doç. Dr. Ayşe Karakeçili Yardımcı Araştırm acılar: Em re Yüksel, M eltem Gam ze Ozturk Proje Numarası: 13H Başlama Tarihi: Bitiş Tarihi: Rapor Tarihi: Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " 2014 "

3 I. Üç Fazlı Biyoaktif Polimerik Membranların Hazırlanması ve Karakterizasyonu Özet Periodontitis, diş destek dokusu olarak görev yapan periodonsiyum tabakasının zarar görmesi sonucu meydana gelen ve yaygın olarak görülen mikroorganizmal bir hastalıktır. Bakteri plakalarının diş yüzeyinde oluşması ile başlayan hastalık, bu bakterilerin salgıladıkları toksinler nedeniyle dokuların hasar görmesi şeklinde devam eder. Tedavi sürecinde mikroorganizmalar bölgeden temizlenmekte ancak hastalığın ilerlemesi durumunda geri dönüşümsüz doku kaybı ve buna bağlı olarak sağlıklı dişin kaybı söz konusu olmaktadır. Periodontal dokunun hasar görmesiyle meydana gelen ileri dereceli rahatsızlıklarda, günümüz tedavi yöntemlerinin yetersiz kalması nedeniyle alternatif olarak doku mühendisliği yaklaşımı öne çıkmıştır. Doku mühendisliği yaklaşımı, kaybedilen dokunun in-vitro ortamda üretilerek hasarlı bölgeye implante edilmesi esasına dayanmaktadır. Hasarlı dokuların onarılarak işlevlerini yeniden kazanmaları için tasarlanan, canlı hücreler \e bivosinyal moleküller ile doğal ya da sentetik biyomalzemelerin bir arada bulunduğu hibrid sistemler ile yapılan başarılı çalışmalar, doku mühendisliğine olan ilgiyi arttırmıştır. Bu sistemlerde, hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde etkin olan biyosinyal moleküllerin önemli bir rolü bulunmaktadır. Hücre büyüme faktörleri hücre üremesi, göçü, farklılaşması ve metabolik faaliyetler gibi hücresel fonksiyonları düzenleyen hücre-hücre ve hücre-biyomalzeme etkileşimlerinde görev alan biyosinyal moleküllerdir. Hasarlı periodontal dokunun iyileşmesinde TGF-(3 (Transforming growth factor beta) ailesi üyelerinden olan kemik morfojenik proteinlerinin (BMP) hücrelerin üremesi ve farklılaşmasında önemli bir rolü olduğu bilinmektedir. Büyüme faktörlerinin hasarlı dokuda uzun süre etkinliğinin sağlanabilmesi için biyobozunur ve periodontal doku ile uyumlu olabilecek nitelikteki sentetik ve doğal polimerlerden hazırlanan doku iskelelerine yüklenmesi önerilmektedir. Bu amaçla doku iskelesi üretiminde sert diş dokusunun mekanik dayanımının sağlanabilmesi \c kemik oluşumunu arttırmak amacıyla, hidroksiapatit içeren mekanik dayanımı >üksck polikaprolakton (PCL) membranlar kullanılmaktadır. Bunun yanı sıra doğal bir polimer olan kollajen, kompozit doku iskelelerinin üretiminde temel biyomalzeme olarak sıkça tercih edilmektedir. Kollajen üç boyutlu doku morfolojisinin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Gerçekleştirilmiş olan proje kapsamında, periodontal doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere PCL bazlı üç tabakalı membranların hazırlanması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda hazırlanan üç fazlı biyoaktif membranlarda; ilk tabaka elektroeğirme ile hazırlanan PCL/kollojen membrandan, ikinci tabaka partikül ayırma/çözücü buharlaştırma yöntemi ile hazırlanan PCL/nanohidroksiapatit membrandan, üçüncü tabaka ise BMP-7 içeren ve elektroeğirme yöntemi ile hazırlanan PCL/kollojen membrandan oluşmaktadır. Sunulan proje çalışmasında üç fazlı biyoaktif yapının hazırlanması ve karakterizasyonuna yönelik çalışmalar gerçekleştirilmiştir.

4 Preparation of Triphasic Bioactive Polymeric Membranes Abstract Periodontitis is a common disease caused by microorganisms and occurring as a result of damage to the tooth-supporting tissues as serving periodontium layer. The disease starts with the formation of bacterial plaque on the dental surfaces and continues with tissue damage due to toxins secreted by the bacteria. Microorganisms are eliminated from the periodontium during the treatment process, however progression of the disease results an irreversible tissue lost, and consequently causing loss of tooth. Tissue engineering approach is an alternative treatment manner due to the inadequacy of today's treatment methods for periodontal diseases caused by destructive periodontal tissue. Tissue engineering approach is based on implanting the lost tissue which is produced in vitro on to the damaged area. Nowadays tissue engineering is getting mom significant because there are a lot of successful studies about hybrid systems. These hybrid systems are constructed on three different parts these are living cells, biosignal molecules and natural or synthetic biomaterials. Biyosignal molecules have an important role in regulation of cellular functions in these systems. Cell growth factors are the biosignal molecules* These molecules have two important tasks; these are regulating cellular functions as cell proliferation, migration, differentiation, and metabolic activity and playing a role in interactions between cell-cell or cell-biomaterials. BMP(Bone morfogenetic protein), which is a member of TGF-p (Transforming growth factor beta) superfamily, is known to play a major role during healing of the tissue injury in periodontal disease. It is recommended that the tissue scaffold is loaded by growth factors which are biodegredable prepared by using the synthetic and natural polymers compatible with the periodontal tissue in order to provide growth factors in the damaged tissue for a long time. Hence, polycaprolactone (PCL) membranes containing hydroxyapatite, which has high mechanical strength, are used for tissue scaffolds in order to enhance bone formation and to get mechanical strength against masticatory forces during chewing. Besides collagen, which is a natural polymer, is often preferred in production of the composite tissue scaffolds as basic biomaterials. Collagen also plays an important role for preserving three dimensional tissue morphology. Ip the scope of the performed project, the preparation of PCL-based three-layer membrane is intended to use for the periodontal tissue engineering applications. According to this purpose, three-phasic bioactive membrane is formed as three different layers; first layer is made of PCL/collagen which is produced by electrospinning method, second layer composed of PCL/nanohydroxyapatite which is produced by particulate leaching/solvent evaporation technique and the third layer is composed of PCL/collagen membrane, including BMP-7, which is produced by electrospinning technique. Study for preparation and characterization of three-phasic bioactive construct are fulfilled in the project.

5 II. Amaç ve Kapsam Dişin destek dokusu olarak görev yapan periodonsiyum, dişeti ve periodontal ligamentten oluşan sert dokuyu içeren bir tabakadır. Periodontitis bu dokunun mikrobiyal etkiyle tahrip olması sonucu meydana gelen ileri dereceli mikroorganizmal rahatsızlıklardır (Akman vd., 2010). Periodontitis tedavisinde periodontal rejenerasyon için greftler ve bariyerlerin kullanımını içeren günümüz tedavi yöntemlerinde ancak sınırlı sayıda rejenerasyon sağlanmaktadır. Bunlara alternatif olarak kaybedilen dokunun in vitro ortamda üretilerek hasarlı bölgeye implante edilmesi (periodontal doku mühendisliği) öne sürülmüştür (Soran, 2010; Bottino vd., 2012). Tedavi amaçlı olarak üretilecek ideal sistem, doku kendini yenileyene kadar gerekli faktörleri hasarlı bölgede bulundurmalı ve doku rejenerasyonunun ardından parçalanarak toksik etki oluşturmadan vücuttan atılmalıdır (Lanğer ve Vacanti, 1993). Hasarlı bölgeye nakledilecek proteinlerin, tek seferde yüksek dozda verilmesi, hem bu ajanların etkinliğini azaltmakta hem de çeşitli yan etkilerin ortaya çıkmasına neden olabilmektedir (Uebersax vd., 2009; Anzai vd., 2010). Doku mühendisliğinde taşıyıcı sistemlerin kullanılma amacı, bu olumsuz etkileri ortadan kaldırarak, uzun süreli azar azar salım yapmak ve daha etkin bir sonuç almaktır. Bu amaçla fonksiyonel katmanlara sahip nanofibröz membranlar kullanılabilmektedir (Ebisavva vd,, 1999; Chen vd., 2009). Periodontal doku; sement, alveol kemiği, gingiva ve periodontailigamentten oluşmaktadır (Zamani vd., 2010). Bu nedenle periodontitisten kaynaklı olarak hasarlı dokunun onanmıııda hem mekanik dayanımı sağlayacak nitelikte hem de kemik oluşumunu arttıracak nitelikte yapıların yer alması gerekir (Vaquetta vd., 2012; Bottino vd.s 2011). Sunulan proje çalışmasında bu amaca yönelik olarak elektroeğirme yöntemi ile partikül uzaklaştırma / çözücü buharlaştırma yönteminin bir arada kullanılması ile üç tabakalı membranlar hazırlanmıştır. Periodontal ligament hücrelerinin üremesi ve çoğalmasım destekleyecek ilk tabaka komik morfojonik protein-7 (BMP-7) içeren Polikaprolakton (PCL) / kollajen den elektroeğirme yöntemi ile elde edilmiştir. Kemik oluşumuna destek verecek ikinci tabaka kemik doku uygulamalarında sıkça kullanılan nanohidroksiapatit (nha) içeren PCL den partikül ayırma/çözücü buharlaştırma yöntemi ile hazırlanmıştır. Bariyer görevi görecek üçüncü tabaka ise PCL/kollajenden elektroeğirme ile hazırlanmıştır. Elde edilen üç fazlı polimerik membranın yapısal karakterizasyonu için Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) analizleri gerçekleştirilmiştir. PCL/kollajen fiberler içerisinde dağılmış olan BMP-7 moleküllerinin salım davranışının incelenmesi amacıyla in vitro ortamda salım çalışmaları gerçekleştirilmiştir.

6 III. M ateryal ve Yöntem Sunulan proje çalışmasında öncelikle; partikül uzaklaştırma/çözücü buharlaştırma yöntemi kullanılarak Polikaprolakton/Nanohidroksiapatit (PCL/nHA) doku iskeleleri oluşturulmuştur. Ardından doku iskelesinin her iki tarafı elektroeğirme yöntemi kullanılarak sırasıyla PCL/Kollajen/ Kemik morfojenik protein-7 (BMP-7) ve PCL/Kollajen membranlar ile kaplanmıştır. Proje kapsamında gerçekleştirilmiş olan deneysel çalışmalar aşağıda ayrıntılı bir şekilde açıklanmıştır. Nanohidroksiapatit Üretimi Nanohidroksiapatit (nha) üretmek amacıyla CaPTris yöntemi kullanılmıştır (Cengiz vd., 2008). Bu amaçla belirlenen miktarlarda Tris, hidroklorik asit (HC1), potasyumbifosfat (K2HPO4) ve kalsiyum klorür (CaCL) kullanılarak deionize suda 500 mltik CaPTris çözeltisi hazırlanmış ve çözeltinin ph ı 7.4 olacak şekilde ayarlanmıştır. Hazırlanan bu çözeltiye Ca/P oranı l.ö7 olacak şekilde CaCİ2 ve K2HPO4 eklenmiştir. Elde edilen süspansiyon cam şişelere konularak 1 gün boyunca 37 C sıcaklıkta 200 rpm hızda çalkalamak inkübatörde bekletilmiştir. Süspansiyon santrifüj işleminden sonra 5 kez deionize su ile 2 kez mutlak etanol ile yıkanmış ve elde edilen çökelek içerisine 25 mg polietilenglikol 2000 (PEG 2000) eklenmiştir. Daha sonra petri kaplarına alınan karışım 70 C'da kurutulmuş ve 700 C da fırında sinlerlenm iştir. PCL /nha Doku İskelesinin Partikül Uzaklaştırma/Çözücü B uharlaştırm a Yöntemi ile Üretimi PCL/Diklorometan (DCM) çözeltisi % 10 (Wv) derişimde oda sıcaklığında 12 saat süreyle karıştırılarak hazırlanmıştır. Daha sonra çözeltinin içerisine % 1 (w/v) oranında nanohidroksiapatit (nha) partiküller eklenmiştir. Elde edilen süspansiyon 1 saat karıştırılarak nha'in çözeltide homojen olarak dağılması sağlanmıştır. Son olarak; porojen görevi görecek olan sodyum klorür (NaCl) partikülleri (%80, w/v) eklenmiş ve çözelti 3 saat karıştırılmıştır. Ardından çözelti doku iskelesi kalınlığı 1 mm olacak şekilde teflon kalıplara dökülmüş ve çözücünün buharlaşması için oda sıcaklığına bırakılmıştır. Çözücü buharlaştırıldıktan sonra :elde edilen membranlar deionize su içerisinde 3 gün boyunca yıkanarak sodyum klorür partikülleri uzaklaştırılmış ve gözenekli yapıdaki doku iskeleleri elde edilmiştir. PCL/Kollajen ve PCL/KoIlajen/BMP-7 Tabakalarının Elektroeğirme Tekniği ile Üretimi PCL/Kollajen (5.5:2.5) oranında, % 8 (w/v) derişimde Hekzafloroizopropanol (HFIP) çözücüsünde 2 gün boyunca +4 C de karıştırılarak çözelti hazırlanmıştır. Elektroeğirme parametreleri 3 ml/sa akış hızı, 20 kv voltaj değeri ve 10 cm toplayıcı uzaklığı olarak optimize edilmiştir.

7 PCL/Kollajen nanofıber yapılann membran olarak PCL-nHA doku iskelesinin bir yüzeyine kaplanması amacıyla, PCL-nHA doku iskeleleri toplayıcı plaka üzerine çift taraflı bant yardımıyla yapıştırılmış ve yukarıda belirlenen elektroeğirme koşullarında nanofıbröz yapı doku iskelesi üzerine toplanmıştır. Üçüncü tabakanın BMP-7 içeren PCL/Kollajen çözeltisinin PCL-nHA doku iskelesine toplanması ile elde edilmesi düşünülmüştür. Bu amaçla; PCL/Kollojen (5.5:2.5) çözeltisi HFIP çözücüsünde hazırlanmış ve her 1 mi çözelti içerisine 50 pl BMP-7 çözeltisi (PBS içerisinde) eklenerek çözelti 1 dakika boyunca vortekslenmiştir. 3 ml/sa akış hızı, 20 kv voltaj değeri ve 10 cm toplayıcı uzaklığı olarak belirlenen elektroeğirme koşullarında BMP-7 içeren PCL/Kollojen fiberler elde edilmiştir. PCL/Kollajen/BMP-7 içeren fiberler bir yüzeyinde PCL/Kollajen kaplı olan PCL-nHA doku iskelelerinin diğer yüzeyinde toplanmıştır (Şekil 1). ^ ^ Eu'ktroeğırme ile yüzeye kaplanmış PCL/kollajen nanoflber membran tabakası gözenekli yapıda PCL-nHA doku iskelesi Elektroeğirme ile yüzeye kaplanmış PCL/kollajen /BMP-7 nanofiber membran tabakası Şekil 1. Elektroeğirme ve Partikül Uzaklaştırma/Çözücü Buharhıştırma yöntemlerinin birlikte kullanılmasıyla hazırlanan üç fazlı membranın gösterimi. Üç Tabakalı Doku İskelesinin Karakterizasyonu Önerilen proje kapsamında hazırlanan ve büyüme faktörü içeren biyoaktif doku iskeleleri aşağıda belirtilen analiz yöntemleri kullanılarak karakterize edilmiştir. a.taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) - EDAX Analizi: Partikül uzaklaştırma/çözücü buharlaştırma yöntemi ile hazırlanan PCL doku iskelesi ve elektroeğirme yönterri ile hazırlanan nanofıbröz membranlarm morfolojik yapılan SEM kullanılarak analiz edilmiştir. Öncelikle ayrı ayrı hazırlanan her üç tabakanın SEM görüntüleri alınmıştır (SEM, FEI Quanta 200 FEG, USA). Ardından üç tabakalı membranın kesit görüntüleri alınarak tabakalar arasındaki etkileşim incelenmiştir. Analiz öncesinde örnekler altın paladyum ile kaplanmıştır. b. Fourier Transform Infrared-Attenuated Total Reflectance (FTIR-ATR1 Spektroskopisi: PCL ve PCL/Kollajen membranlann yüzey kimyasal yapılan FTIR-ATR spektroskopisi ile cm'1dalga sayısı aralığında ve 4 cm'1çözünürlükte incelenmiştir. c.bmp-7 Moleküllerinin Üc Tabakalı Membranlardan Kontrollü Saliminin İncelenmesi: Membranlardan BMP-7 saliminin incelenmesi amacıyla, elektroeğirme işlemi için hazırlanan PCL/Kollajen/BMP-7 çözeltisinde floresan izotiyosiyanat (FITC) ile işaretlenmiş BMP-7

8 molekülleri kullanılmıştır. Bunun için 1 mi 10 pg/ml BMP-7 çözeltisine (PBS içinde) 50 mikrolitre FITC (5 pg/ml) eklenerek 8 saat boyunca 4 C'de karanlık ortamda karıştırılmıştır. Ardından, elde edilen karışım diyaliz membran içerisine yerleştirilmiştir. Diyaliz membran içi su dolu behere alınarak 48 saat süreyle +4 C de karanlık ortamda bekletilmiştir. Sonrasında diyaliz membran içerisinden alınan çözelti karanlıkta 1 gün boyunca liyofilize edilmiştir. FTIC işaretlenmiş olan BMP-7 molekülleri PCL/Kollajen/BMP-7 nanofibröz membran tabakanın hazırlanmasında kullanılmıştır. Üç tabakalı olarak hazırlanan membranlann her biri 2 mi PBS (ph:7.4) ortamına aktarılarak 100 rpm karıştırma hızındaki inkübatöre alınmıştır. Belirlenen zaman aralıklarında 500 pl PBS ortamdan uzaklaştırılarak UV spektrofotometresinde 495 nm dalga boyunda ölçüm yapılmıştır. Ortamdan uzaklaştırılan JSBS miktarı taze PBS ile tamamlanmıştır. UV spektrolbrtomctrcden okunan absorbans değerleri kullanılarak bir kalibrasyon grafiği yardımıyla salman BMP-7 miktarları kümülatif olarak belirlenmiştir. IV. Analiz ve Bulgular "... Sunulan proje çalışması kapsamında, biyoaktif özellik taşıyan üç tabakalı polimerik membranlann hazırlanması ve karakterizasyonu amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda biyouyumlu ve biyobozunur özellikleri dolayısıyla doku mühendisliği uygulamalannda sıklıkla tercih edilen bir polimer olan polikaprolakton kullanılmıştır. Hazırlanan üç tabakalı membranın potansiyel uygulama alanı periodontitis tedavisi olarak belirlenmiş ve bu amaca uygun olarak biyoatif ajanlar ile modifikasyonlar gerçekleştirilmiştir. Periodontal doku; sement, alveol kemiği, gingiva ve periodontal ligamentten oluşmaktadır. Bu nedenle periodontitisten kaynaklı olarak hasarlı dokunun onarımmda hem mekanik

9 dayanımı sağlayacak nitelikte hem de kemik oluşumunu arttıracak nitelikte yapıların yer alması gerekir. Periodontal ligament hücrelerinin üremesi ve çoğalmasını destekleyecek ilk tabaka (Tan vd., 2009) kemik morfojenik protein-7 (BMP-7) içeren Polikaprolakton (PCL) / Kollajen den elektroeğirme yöntemi ile elde edilmiştir. Kemik oluşumuna destek verecek ikinci tabaka ise kemik doku uygulamalarında sıkça kullanılan nanohidroksiapatit (nha) içeren PCL den partikül ayırma/çözücü buharlaştırma yöntemi ile hazırlanmıştır. Bariyer görevi görecek üçüncü tabaka ise PCL/kollaj enden elektroeğirme ile elde edilmiştir. Elde edilen membranlann morfolojik özellikleri ve yüzey kimyasal yapılarının karakterizasyonu gerçekleştirilmiş ve BMP-7 salımı incelenmiştir. Bu bölümde gerçekleştirilen deneysel çalışmalara ait bulgular sunulmuştur. PCL/nHA gözenekli doku iskelelerinin karakterizasyonu Kemik oluşumuna destek verecek orta tabakayı oluşturan gözenekli PCL/nHA yapıların hazırlanması için partikül ayırma/çözelıi buharlaştırma yöntemi kullanılmışta Yöntemde gözenekli yapıların elde edilebilmesi amacıyla porojen görevi gören partiküller kullanılmakta ve sonrasında yıkama işlemi ile yapıdan uzaklaştırılmadadır. Bu çalışmada porojen olarak NaCl paitikülleri kullanılmıştır. nha partiküller üretim aşamasında PCL çözeltisine eklenmiştir. Elde edilen gözenekli yapılaın morfolojik analizi SEM ile gerçekleştirilmiştir. PCL/nHA doku iskelelerine ait SEM görüntüleri Şekil 2 de sunulmuştur. ' H j

10 Şekil 2. PCL/nHA doku iskelesine ait SEM görüntüsü nha parliküllerin yapıya katıldığım göstermek amacıyla EDAX analizi gerçekleştirilmiştir. EDAX analizinden elde edilen sonuçlar Şekil 3 de sunulmuştur. Şekil 3. PCL/nHA doku iskelesine ait EDAX spektrumu. Şekil 2 ve Şekil 3 de elde edilen görüntüler ve analiz sonuçlâiî incelendiğinde, hazırlanan PCL/nHA doku iskelelerinin içsel bağlantılı yapıya sahip mikrogözenekli doku iskelelri olduğu ve HA partiküllerin yapıya başarıyla katıldığı sonucuna varılmıştır. PCL/Kollajen ve PCL/KoIlajen/BMP-7 nanofıbröz m em branların karakterizasyonu PCL/nHA doku iskelelerinin bir yüzeyine kaplanarak bariyer görevi görecek olan PCL/Kollajen tabakanın elektroeğirme koşullan optimize edilmiş ve Bölüm H de açıklanan koşullarda üretilen membranlar SEM ile karakterize edilmiştir (Şekil 4).

11 Şekil 4. PCL/Kollajen membranlara ait SEM görüntüsü Şekil 4 incelendiğinde gelişigüzel homojen yapıdaki boncuksuz PCL/Köllajen fiberler görülmektedir. SEM görüntüleri kullanılarak yapılan anlizlerde PCL/Kollajen fiberlerin ortalama çapı 625±50 nm olarak hesaplanmıştır (Jmicrovision). Kollajenin yapıya katılıp katılmadığının belirlenmesi amacıyla PCL ve PCL/Kollajen membranlara ait FTIR-ATR analizleri gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar Şekil 5'de sunulmuştur D alga sayısı (cm _1) Şekil 5. PCL ve PCL/Kollajen membranlara ait FTIR-ATR spektrumu PCL ve PCL/Kollajen membranlara ait spektrumlar incelendiğinde, kollajen yapısında bulunan fonksiyonel gruplar dolayısıyla sırasıyla 1631 ve 1542 cm 1dalga sayısında Amid-I ve Amid-II pikleri

12 görülmektedir. Bu piklerin varlığı kollajenin PCL yapısına başarıyla katıldığım göstermektedir. BMP- çözeltisinin elektroeğirme çözeltisine eklenmesiyle PCL/Kollajen/BMP-7 nanofibröz yapıda membranlar elde edilmiştir. Bu membranlara ait SEM görüntüsü Şekil 6 de sunulmuştur. Şekil 6. PCL/Kollaj en/bmp-7 membranlara ait SEM görüntüsü Jmicrovision programı kullanılarak yapılan analizde PCL/Kollajen/BMP-7 fiberlere ait ortalama çap değeri 565±40 nm olarak hesaplanmıştır. Üç tabakalı m em branların karakterizasyonu PCL/nHA gözenekli doku iskelesinin \üzeyleri, Bölüm Il de açıklanan şekilde sırasıyla PCL/Kollajen ve PCL/Kollajen/BMP-7 ile kaplanmıştır. Üç tabakalı membranların elde edilmesinde temel olarak kullanılan polimerik yapı PCL dir. Bu sebeple elektroeğirme ile elde edilmiş olan fiberler orta tabakayı oluşturan PCL/nHA iskele üzerinde stabil bir tabaka oluşturmuş ve yüzeyden kopma veya ayrılma gözlenmemiştir. SEM analizi ile elde edilen üç tabakalı mejpbrana ait yüzey ve kesit görüntüleri Şekil W 7 de sunulmuştur.

13 Şekil 7. Üç tabakalı membrana ait SEM görüntüleri a) PCL/KoIlajen/BMP-7 fiberler ile kaplı yapının üstten görünüşü, b) Üç kabalaı membrana ait kesit yapı x200, c) Üç tabakalı membrana ait kesit yapı x500. Şekil 7 incelendiğinde fiberlerden oluşan tabakaların başarılı hir şekilde gözenekli doku iskelesinin yüzeylerine kaplandığı görülmektedir. Membranlar ile gerçekleştirilen salım çalışmalarında yüzeylerin ayrılmadığı ve stabil tabaklar elde edildiği görülmüştür. Üç tabakalı m em branlardan BMP-7 şahmının incelenmesi Transfer büyüme faktörü-p (TGF-p) ailesinin üyesi olan BMP-7, özelikle kemik ve kıkırdak oluşumunda büyük önem taşımakta ve periodontal doku rejenerasyonu çalışmalarında sıklıkla kullanıldığı görülmektedir. Bu proteinin diş kökünde bulunan sert doku hücrelerinin çoğalmasında ve doku rejenerasyonunda etkili olması önem taşımaktadır. Bununla birlikte büyüme faktörlerinin hasarlı dokunun iyileşmesinde daha uzun süre etkinliğini sürdürebilmesi için uygun sistemlerde hasarlı bölgeye yerleştirilmesi gereklidir. Sunulan proje çalışmasında BMP-7 moleküllerinin hasarlı bölgeye uygun şekilde yerleştirilebilmesi için PCL/Kollajen fiberlerin içerisine hapsedilmesine karar

14 verilmiştir. BMP-7 nin üç tabakalı membrandan saliminin incelenmesi amacıyla in vitro ortamda salım çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Kümülatif salım değerleri kullanılarak elde edilen salım grafiği Şekil 8 de sunulmuştur. BMP-7 salımı incelendiğinde ilk 4 saat sonunda oluşan ani salım ile yüklenen miktarın %42 sinin ortama salmdığı görülmüştür. Ardından devam eden kontrollü salım davranışı 3 gün boyunca devam etmiştir. Şekil 8. Üç tabakalı membranlardan BMP-7 saliminin incelenmesi.

15 V. Sonuç ve Öneriler Gerçekleştirilmiş olan proje çalışmasında farklı biyoaktif özelliklere sahip polimerik yapıların bir arada kullanılmasıyla üç fazlı membranlar hazırlanmıştır. Yapılan karakterizasyon çalışmaları sonucunda farklı özelliklere sahip tabakaların stabil bir yapı oluşturdukları sonucuna varılmıştır. VI. Geleceğe İlişkin Öngörülen Katkılar Proje çalışmasından elde edilen sonuçlar ışığında, hazırlanan malzemenin periodontal doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmasının araştırılması amacıyla in vitro ortamda hücre kültür deneyleri ve bu deneylerden elde edilecek sonuçlar doğrultusunda in vivo hayvan deneyleri yapılması planlanmaktadır. Bu amaç doğrultusunda Gazi Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Periodontoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Prof. Dr. Altan Doğan ile işbirliği yapılmasına karar verilmiştir. VII. Sağlanan Altyapı Olanakları ile Varsa Gerçekleştirilen Projeler Projeden altyapı sağlanmamıştır. VIII. Sağlanan Altyapı Olanaklarının Varsa Bilim/Hizmet ve Eğitim Alanlarındaki Katkıları Projeden altyapı sağlanmamıştır.

16 IX. K aynaklar 1. Soran, Z., BMP-6 yüklü aljinat mikroküreler ve kitosan doku iskeleleri ile periodontal doku mühendisliği. Yüksek Lisans Tezi Hacettepe Üniversitesi Biyomühendislik Anabilim Dalı Bottino, M., C., Thomas, V., Schmidt, G., Vohra, Y., K., Chu, T., G., Kowolik, M., J., Janowski, G., M., Recent advances in the development of GTR/GBR membranes for periodontal regeneration A materials perspective, Dental M aterials, 28, (2012) 3. Akman, C.A. Periodontal doku mühendisliği uygulamaları için kitosan temelli doku iskelelerinin üretilmesi, kemik morfojenetik protein-2 (BMP-2), bazik fibroblast büyüme faktörü (bfgf), deksametazon (DEX) salım kinetiklerinin ve in vitro etkinliklerinin tayini. Doktora Tezi. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Ankara, 76 s (2007). 4. Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering Science 260, (1993). 5. Uebersax, L., Merkle, H., P., Meinel, L., Biopolymer based growth factor delivery for tissue repair: from natural concepts to engineered systems, Tissue Eng P art B, 15, (2009) 6. Anzai. J., Kitamura, M., Nozaki, T., Nagayasu, T., Terashima, A., Asano, T., Murakami, S., Effects of concomitant use of fibroblast growth factor (FGF)-2 with beta-tricalcium phosphate (b-tcp) on the beagle dog 1-wall periodontal defect model, Biochemical and Biophysical Research Communications, 403, (2010) 7. Tan, Z., Zhao, Q., Gong, P., Wu, Y., Wei, N., Yuan, Q., Wang, C., Liao, D., Tang, H., Research on promoting periodontal regeneration with human basic fibroblast growth factor-modified bone marrow mesenchymal stromal cell gene therapy, Cytotherapy, 11, (2009) 8. Ebisawa T., Tada K., Kitajima I., Tojo K., Sampath T.K, Kawabata M., Miyazono k. Imamura T., Characteriztion of bone morphogenetic protein-6 signaling pathways in osteoblastic differentiation. Jo u rn al of Cell Science. 112, (1999) 9. Chen, F., Chen, R., Wang X., Sun, H., Wu, Z., In vitro cellular responses to scaffolds containing two microencapsulated growth factors, Biomaterials, 30, (2009) 10. Akman, A. C., Tığlı, S. R., Gümüşderelioğlu, M., Nohutcu, R. M., Bone Morphogenetic Protein-6-loaded Chitosan Scaffolds Enhance the Osteoblastic Characteristics of MC3T3-E1 Cells, A rtif Organs, 34,65-74 (2010) 11. Ji, X., Q., Deng, J., Xing, X., M., Yuan, Q., C., Yu, X., B., Xu, C., Q., Yue, J., Biocompatibility of a chitosan-based injectable thermosensitive hydrogel and its effects on dog periodontal tissue

17 regeneration, C arbohydrate Polymers, 82, (2010) 12. Zhang, Y., Cheng, N., Miron, R., Shi, B., Cheng, X., Delivery of PDGF-B and BMP-7 by mesoporous bioglass/silk fibrin scaffolds for the repair of osteoporotic defects, Biomaterials, 33, (2012) 13. Vaquetta, C., Fan, W., Xiao, Y., Hamlet, S., Hutmacher, D., W., Ivanovski, S., A biphasic scaffold design combined with cell sheet technology for simultaneous regeneration of alveolar bone/periodontal ligament complex, Biomaterials, 33, (2012) 14. Bottino, C., M., Thomas, V., Janowski, G., M., A novel spatially designed and functionally graded electrospun membrane for periodontal regeneration, Acta Biomaterilia, 7, (2011) 15. Zamani M., Morshed M., Varshosaz J., Jannesari M., Controlled release of metronidazole benzoate from poly e-caprolactone electrospun nanofibers for periodontal diseases, E ur J Pharm Biopharm, 75, ,(2010) 16. Cengiz, B.. Gokce, Y., Yildiz, N., Aktas, Z., Calimli, A., Synthesis and characterization of hydroxyapatite nanoparticles, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 322,29-33, (2008) I;.»

18 X. EKLER a. Mali Bilanço ve Açıklam alar 2013 S Açıklama TÜKETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME ALIMLARI i HİZMET ALIMLARI Toplam Önceki Yıldan Devir 0,00 0,00 0,00 Başlangıç Eklenen Düşülen Eklenen Net H Bloke Edilen Bloke Edilen. Ödeneği Aktarma Aktarma Ödenek Ödenek (Avans) (Diğer) 7.849,50 0,00 0,00 0, , ,92 0, ,50 0,00 0,00 0, ,50 0,00 0, ,00 0,00 0,00 0, , ,92 0,00 0,00 0,00 0,00 481, , Sdu Aç,klama TÜKETİME YÖNELİK MAL VE MALZEME ALIMLARI HİZMET ALIMLARI Toplam Önceki Yıldan Devir Başlangıç Eklenen Düşülen Eklenen Net Ödeneği Aktarma Aktarma Ödenek Ödenek Harcanan Bloke Editen (Avans) 481,58 0,00 0,00 29,50 0,00 452,08 0,00 0,00 0, ,50 0,00 29,50 0,00 0, , ,00 0,00 0, ,08 0,00 29,50 29,50 0, , ,00 0,00 0,00 Bloke Edilen (Diğer) Kalan ,