GENEL MİKROBİYOLOJİ UYGULAMA KILAVUZU

Transkript

1 TC SAKARYA ÜNİVERSİTESİ MÜHENDİSLİK FAKÜLTESİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ GENEL MİKROBİYOLOJİ UYGULAMA KILAVUZU Doç. Dr. Serap COŞANSU AKDEMİR Arş. Gör. Ayşe SARIÇAM Arş. Gör. Selime MUTLU

2 MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI ÇALIŞMA KURALLARI 1. Laboratuvara gelirken beyaz ve temiz önlük giyilmeli ve çalışma sırasında önlüğün önü kapatılmalı olmalı, 2. Saçlar uzunsa mutlaka toplanmalı, 3. Laboratuvarda herhangi bir şey yenilip içilmemeli, çalışırken eller yüze sürülmemeli ve ağza herhangi bir şey atılmamalı, 4. Uygulama öncesinde ve sonrasında eller yıkanmalı, 5. Laboratuvar temiz ve düzenli tutulmalı, laboratuvarı terk ederken kullanılan alet ve malzemeler yıkanmalı ve ilgili yerlere konmalı, 6. Çanta, manto, defter gibi eşyalar laboratuvar tezgâhları üzerine konmamalı, 7. Laboratuvardaki bütün malzemeler itina ile kullanılmalıdır. 8. Öze uçları her kullanımdan önce ve sonra Bunzen beki alevinde sterilize edilmeli, 9. Çalışırken laboratuvar kapı ve pencereleri kapalı tutulmalı, 10. Sterilizasyonundan kuşku duyulan malzeme kullanılmamalı, 11. Etil alkol gibi yanıcı, tutuşucu maddeler Bunzen beki alevi çevresinden uzak tutulmalı, 12. Laboratuvarda gereksiz ve yersiz şakalardan kaçınılmalı, 13. Hazırlanan çözeltiler, besiyerleri üzerine ismi, tarihi yazılmalı, eğer etiket yapıştırılacak ise dil ile ıslatılmamalı. 1

3 Mikrobiyoloji Laboratuvarında Kullanılan Malzemeler ve Cihazlar CAM MALZEMELER MALZEME ADI FOTOĞRAFI AÇIKLAMA Deney Tüpü Durham Tüpü Petri Kutusu Tüplük denilen tüp koruyucularına dizilerek, dilüsyon çözeltileri ve besiyerlerinin hazırlanmasında kullanılır. Gaz oluşturarak test edilen mikroorganizmaların tespiti için sıvı besiyeri ekimlerinde kullanılır. Test tüpünün içine ters yerleştirilerek üzerine sıvı besiyeri konulur ve sterilize edilir. İç içe geçmiş iki cam/plastik kapaktan oluşur. Küçük olanın içine ince tabaka sterilize edilmiş besiyeri dökülür ve mikroorganizmaların izolasyonu ile sayımı yapılır. Preparat hazırlamada kullanılır. Lam ***Thoma lamı (maya sayımında), Howard lamı (küf sayımında), çukur lam gibi özel tipte lamlar da bulunur. Lamel Kare şeklinde çok ince camdan yapılmıştır. Temiz lameller lam üzerindeki örneği kapatmada kullanılır. Pipetler Belli hacimlerde sıvı alma ve aktarma işlemlerinde kullanılan içi boş, dereceli veya derecesiz özel cam veya plastik borulardır. Pipet Çeşitleri: Otomatik Pipet: Sıvıyı çekme ve bırakma düğmeleri vardır. Sıvı miktarını pipet hacmi kadar otomatik olarak çeker. Dereceli pipet: Üzerlerinde 2

4 taksimat bulunan pipetlerdir. Erlen Besiyeri hazırlanmasında, Dilüsyon çözeltisi hazırlanmasında, Aktarma işleminde, Numune kabı olarak kullanılır. Balon Mikrobiyolojik çalışmalarda besiyerlerinin hazırlanmasında ve sterilizasyonunda kullanılır. Balonjoje Beher Dar uzun boyunlu, boyun kısmında ölçü çizgisi bulunan, cam malzemelerdir. Ölçü çizgisine kadar tam doldurulduğunda üzerinde belirtilen hacim kadar sıvı alır. Genellikle istenen hacimde çözelti hazırlamada kullanılır. Isıtma, Karıştırma, Tartım, Aktarma, Besiyeri ve çözelti hazırlama, Örnek kabı olarak kullanılır. Mezür Sıvıların ölçümünde ve aktarımında kullanılır. Cam çubuk (baget) Çözeltilerin karıştırılmasında, ezilmesinde ve kaptan kaba aktarılmasında kullanılır. 3

5 Cam çubuğun, ucunun üçgen şeklinde kıvrılması ile oluşan özelerdir. Drigalski spatülü Yayma yöntemiyle ekimde, sıvı numunenin petri kutusu içindeki katı besiyeri üzerine aktarılmasından sonra yüzeye homojen şekilde yayılmasında kullanılır. METAL MALZEMELER Bunzen Beki Üç ayak Kafesli tel Tüplük Alev çatısı oluşturma, Isıtma veya kaynatma Metal malzemelerin özellikle özelerin alevden geçirilmesinde ve akkor haline getirerek sterilize edilmesinde kullanılır. Bekte ısıtma veya kaynatma yapılacağı zaman gerekli olan bir malzemedir. Üç ayak üzerinde ısı dağıtıcı olarak kullanılır. Çıplak alevle direkt temas nedeniyle cam malzemelerin çatlama ve kırılmalarını önler. Deney tüpleri konulur. Spatül Numune ve kimyasal maddelerin alınması, tartımı, karıştırılması ve ezilmesinde kullanılır. Pens Öze Daha çok tartım sırasında ve cam tartı kaplarının tutulmasında kullanılır. Numunelerin transferinde 4

6 kullanılan, ucunda nikel-krom veya platinden yapılmış, yuvarlatılmış tel bulunan sap kısmı ısıdan etkilenmeyen bir malzemedir. Pipet Kutusu Pipetlerin sterilize edilmesinde ve sterilize pipetlerin saklanmasında kullanılır. DİĞER MALZEMELER Puar Pipetlerin arkasına takılarak, ağızla çekilmesi tehlikeli olan sıvı veya çözeltilerin, özellikle de patojen mikroorganizma içeren besiyerlerinin pipetlenmesinde kullanılır. Havan Katı gıda örneklerinin mikrobiyolojik analize hazırlanmasında kullanılır. Piset Çoğunlukla plastikten üretilen kaplardır. LABORATUVARDA KULLANILAN CİHAZLAR Otoklav Gıda mikrobiyolojisi laboratuvarının en önemli cihazları arasındadır. Temel görevi basınç altında buharla sterilizasyondur. 5

7 İnkübatör Mikrobiyolojik analizlerde besiyerine ekim yapıldıktan sonra uygun sıcaklık ve sürede ortam inkübatörlerle sağlanır. Sterilizatör 0-300ºC sıcaklık aralığına sahip etüvdür. Cam ve metal malzemelerin kurutulması (50-60ºC) ve sterilizasyonu(180ºc) amacıyla kullanılır. Saf Su Cihazı Besiyerleri ve çeşitli çözeltilerin hazırlanmasında, yıkanmış malzemelerin durulanmasında kullanılan saf suyun (ph ı 6,5-7.5) üretimini sağlar. Hassas Terazi Genellikle 1/1000 g duyarlılıkta tartım yapan araçlardır. İstenilen miktarda tartım alma işlemlerinde kullanılır. ph Metre Besiyeri ve çözeltilerin ph ayarlamasında kullanılan araçlardır. Su Banyosu Agarlı besiyerlerinin sterilizasyon sonrası katılaşmasını önlemek, Özel çalışmalarda inkübasyon sağlamak amacıyla kullanılmaktadır. 6

8 Homojenizatör (Stomacher) Katı örneklerin ilk çözeltilerini yapmak için kullanılır. Steril Kabini Analiz edilecek ürüne dışarıdan mikroorganizma bulaşmasını önlemek amacıyla kullanılan kabinlerdir. Manyetik Karıştırıcı Çözeltilerin, besiyerlerinin karıştırılmasında, manyetik balık ile birlikte kullanılır. Vorteks Ekimi yapılacak sıvı numunenin homojenizasyonunda kullanılır. Koloni sayıcı Panosuna petri kutusu yerleştirilerek koloni sayımının yapılabildiği araçtır. Aydınlatma, büyütme sistemleri bulunur. Numaratör sistemi bulunanları da vardır Maşa Erlen, tüp vb sıcak malzemenin taşınmasında kullanılır. 7

9 Laboratuvarın işlevine göre yeterli niteliklerde mikroskop veya binoküler mikroskop, mikrodalga fırın, membran filtrasyon seti, soğutucu (buzdolabı-derin dondurucu) gibi araçlar da gıda mikrobiyoloji laboratuvarında bulunmalıdır. 8

10 UYGULAMA 1: MİKROSKOP KULLANIMI Mikroskop; çıplak gözle görülemeyecek kadar küçük olan mikroorganizmaları görülebilecek derecede büyüterek görülmesini sağlayan alettir. Mikroskobun kısımları Şekil 1 de verilmiştir. Şekil 1. Işık Mikroskobu ve Kısımları MİKROSKOBUN KISIMLARI a. Oküler: Mikroskopta göz ile bakılan kısımdır. b. Objektif: Bir veya birden fazla sayıda olan, dönen bir tabla üzerinde bulunan mercek sistemidir. 10:1, 40:1 ve 100:1 şeklinde büyütme güçleri üzerlerinde yazılıdır. Büyütme gücü 100:1 olan objektif immersiyon objektifi dir ve preparat, üzerine immersiyon yağı damlatılarak incelenir. c. Tabla: Preparatın yerleştirildiği kısımdır. Tabla üzerinde preparat(lam) tutucuları bulunur. 9

11 d. Kondenser: Tablanın altında bulunur. Işık kaynağından gelen ışınları bir noktada toplar. e. Diyafram: Işık kaynağından gelen ışık miktarını azaltıp çoğaltır. f. Işık kaynağı: Güneş veya elektrik lambasından gelen ışınları diyaframa gönderen kısımdır. Bunun için ayna çeşitli konumlara ayarlanır. g. Ayak: Mikroskobun oturduğu kısımdır. h. Kol: Mikroskobun bir yerden bir yere taşınması sırasında tutulan kısmıdır. i. Kaba ve ince ayar vidaları (Makrovida-mikrovida): Tabla üzerine yerleştirilen preparat üzerinde görüntüyü bulmak için kullanılan, kolun aşağı kısmında sağlı sollu bulunan vidalardır. Mikroskopta Numune İnceleme Esnasında (Görüntünün Odaklanması Esnasında) Yapılması Gereken İşlemler: - İmmersiyon objektifi ile çalışmıyorsanız, 1. Preparatı tabla üzerindeki sıkıştırma klipslerinin arasına dikkatli bir şekilde yerleştiriniz. 2. Makrovida ile tablayı en üst seviyeye çıkarınız. Aynı zamanda, preparatta inceleyeceğiniz kısmı, okülerden görebileceğiniz hizaya getiriniz. 3. Okülerden bakarak preparattaki görüntü belirinceye kadar makrovidayı ters yöne çeviriniz. 4. Bulanık bir görüntü görüldüğü an makrovidayı bırakıp mikrovida ile görüntüyü netleştirerek inceleme yapabilirsiniz. 5. Büyütmeyi arttırmak için hareketli revolveri saat yönünde çevirerek ve her objektif değiştirildiğinde sadece ince ayar düğmesini kullanarak görüntüyü bulmaya çalışınız. (Her objektif değiştirildiğinde revolverde hafif bir oturma sesi çıkacaktır. Bu ses duyulmadan görüntü elde edilmez). Her büyütmede ışığa ihtiyaç artacağı için iris diyafram daha fazla açılmalı, gerekirse aydınlatma ayar düğmesinden de ışık şiddeti artırılmalıdır. - İmmersiyon objektifi ile çalışıyorsanız, 1. Preparatta inceleyeceğiniz kısma immersiyon yağını damlatınız. 2. Preparatı tabla üzerindeki sıkıştırma klipslerinin arasına, yağ damlatılmış kısım üste gelecek şekilde, dikkatlice yerleştiriniz. 3. Tablayı sağa sola hareket ettirerek, preparatın, okülerden bakıldığında görülecek şekilde ayarlayınız. 10

12 4. Makrovida yardımıyla tablayı yukarı hareket ettirerek önce immersiyon objektifinin yağa yavaşça dalmasını, sonra preparat ile objektifin temasını sağlayınız. 5. Okülerden bakarak, preparattaki görüntü görülene kadar makrovidayı ters yönde hareket ettiriniz. 6. Bulanık bir görüntü elde edilince makrovidayı bırakıp mikrovida ile görüntüyü netleştirerek inceleme yapabilirsiniz. *** İmmersiyon objektifi ile inceleme yaparken dikkat edilmesi gereken en önemli nokta, immersiyon objektifi ile preparattaki immersiyon yağının temasının kesilmemesidir. Preparat incelendikten sonra mikroskop dikkatlice temizlenmeli hareketli revolver yardımı ile en düşük büyütme seviyesindeki objektif aşağıda bırakılmalıdır. 100 objektife immersiyon objektifi de denir ve objenin üzerine immersiyon yağı (sedir yağı) damlatılarak kullanılır. Çünkü immersiyon objektifinin alt kısmı çok küçüktür. Objeden elen ışınlar yeteri kadar bu objektife geçemez. Bunu sağlamak için immersiyon yağından yararlanılır. İmmersiyon yağının kırılma indisi camın kırılma indisine çok yakındır. Bu nedenle ışınlar kırılmadan merceğe girebilir. Bazı sıvıların kırılma indisi: İmmersiyon yağı 1,535 Balsam 1,524 Gliserol 1,460 Su 1,334 Hava 1,000 Mikroskop Kullanımında Dikkat Edilmesi Gereken Hususlar: 1. Mikroskop sadece gövde kolu üzerinden tutulmalı ve bu kol üzerinden taşınmalıdır. 2. Objektif oküler ile birlikte en düşük büyütme seviyesine getirilip bırakılmalıdır. 3. Aydınlatma sisteminin kapatılması unutulmamalıdır. 4. Toz, mikroskop ve optik aksamın en önemli düşmanıdır. Bu nedenle mikroskobun hassas iç bölmelerine tozun girmesini engellemek için herhangi bir objektif veya oküler kesinlikle mikroskop üzerinden çıkarılmamalıdır. 11

13 5. Şayet mikroskobun gövdesi veya tablası tozlu ise tozun silinmesi ve mikroskobun temizlenmesi için yumuşak pamuklu bez kullanılmalıdır. 6. Tüm bu işlemlerden sonra mikroskop koruma örtüsüyle örtülmelidir. Şekil 2. Peynirde gelişen küfler Şekil 3.Mikroskopta küf misellerinin görüntüsü Şekil 4. Mikroskop altında maya hücreleri 12

14 Şekil 5. Mikroskop altında bakteri hücreleri 13

15 UYGULAMA 2: BASİT BOYAMA Mikroorganizmalar renksiz ve şeffaf oldukları için mikroskopta direkt incelendiklerinde morfolojileri tam olarak belirlenemez. Bunun için mikroorganizmanın çeşitli boyalardan biri ile boyanması gerekir. Boyanmış olan mikroorganizma canlılığını kaybeder ve zeminle arasında oluşan renk ton farklılığı (kontrast) onun morfolojik olarak net görünmesini sağlar. Ayrıca mikroorganizmanın çeşitli organellerinin (Kapsül, spor, çekirdek, flagella vb.) belirlenmesi için de değişik tip boya ve metotları da kullanılmaktadır. Boyama mikroorganizma ve boya arasında kimyasal bir reaksiyon sonucu meydana gelir. Boyalar genellikle iyonlardan bir tanesinin renkli olduğu tuzlardır. Boyalar, boya molekülünün elektrik yüklerine göre, asit, bazik ve nötr olarak üç bölüme ayrılır; Bazik Boyalar: İyonize oldukları zaman, molekülün boya kısmı pozitif elektrikle yüklenir. Bunlar da renkli bazların tuzlarıdır (genellikle, klorid benzen sulfat, okzalat ve asetat). Bazik boyalardan, metilen mavisi, kristal viyole (Jansiyana violet) ve bazik fuksin yaygın olarak kullanılır. Asit Boyalar: İyonize oldukları zaman, molekülün porsiyonu negatif elektrikle yüklenir. Bunlar da renkli asitlerin tuzlarıdır (genellikle, sodyum tuzu). Bazen potasyum, kalsiyum veya amonyum tuzları olabilir. Asit boyalar arasında, asit fuchsin, safranin, asit pikrik, eosin, vs. bulunmaktadır. Nötr Boyalar: Asit ve baz boyaların uygun oranda karışımlarından elde edilir (Giemsa, Wright, Leishman vs.). Preparat hazırlama 1. Temiz bir lamın ortasına bir damla damıtık su konur (sıvı kültürlerde yoğunluk yeterli ise buna gerek görülmeyebilir). 2. Kültürden öze ile alınan örnek, önce su damlası yanında ezilerek, daha sonra da su damlası ile azar azar karıştırılarak lamın üzerine ince bir film halinde yayılır. 3. Havada kuruması sağlanır. 14

16 4. Bakterilerin lam üzerine tespiti (fiksasyon) yapılır. Bunun için genel olarak, lamın alt yüzünü üç defa Bunzen beki alevinden geçirmek gerekmektedir. Tespit sırasında preparat alev üzerinden seri olarak geçirilmelidir. Aksi takdirde mikroorganizmalar dağılmış, şişmiş, patlamış ve deforme olmuş bir şekilde görülürler. Tespit işlemi bakterilerin ölmesini ve lama yapışmalarını, böylece preparat yıkanırken onların lamın üzerinden akıp gitmemesini sağlamak için yapılır. Basit Boyama: 1. Yukarıda anlatıldığı şekilde hazırlanan preparat üzerine bir damla kristal viyole damlatılır ve 1 dakika beklenir. 2. Boya dökülerek ve preparat damıtık su ile yıkanır. 3. Kurutulan preparat mikroskopta immersiyon objektifi ile incelenir. Şekil 6. Basit Boyama Metodu 15

17 Şekil 7. Bakteri şekilleri 16

18 UYGULAMA 3: GRAM BOYAMA Bakterileri hücre duvarı yapılarına göre Gram-pozitif ve Gram-negatif olarak iki gruba ayırmak ve bu özelliklerinden tanımlamada yararlanmak için yapılan boyama yöntemidir. Bu ayrım bakterilerin tanımlanmasında önemli bir aşamadır. Gram boyamada dikkat edilmesi gereken önemli noktalardan biri saatlik aktif kültür kullanılmasıdır. Çünkü daha yaşlı kültürlerden yanlış sonuç alınabilir; örneğin Gram pozitif bakteriler Gram negatif reaksiyon verebilir. Gram boyama yönteminde işlem aşamaları şunlardır: 1. Preparat hazırlama (lam üzerine aktarma, yayma, kurutma ve fiksasyon) 2. Preparat kristal viyole ile kaplanır ve 1 dakika beklenir, 3. Preparat bol damıtık suyla yıkanır, 4. Preparat üzeri lugol (Gram iyot çözeltisi) ile kaplanır ve bir dakika beklenir, 5. Lugol akıtılarak damıtık su ile yıkanır, 6. Preparat üzerine % 96 lık etil alkol yayılarak saniye beklenir (bu işleme dekolorizasyon adı verilmektedir), 7. Preparat hemen damıtık su ile yıkanır, 8. Preparat karşıt boya safranin ile kaplanarak saniye beklenir, 9. Preparat bol damıtık su ile yıkanarak havada ya da kurutma kağıdı arasında kurutulur, 10. Mikroskopta immersiyon merceğinde incelenir. Mikroskopla incelemede; Gram pozitif bakteriler mor renkli (kristal violet i hücre çeperinde tutabilen bakteriler), Gram negatif bakteriler ise pembe-kırmızı renkli (kristal violet i tutamayıp hücre dışına bırakan bakteriler) gözlenir. Şekil 8. Gram Boyama Metodu 17

19 UYGULAMA 4: SPOR BOYAMA Bacillaceae familyasına giren bakteriler tarafından oluşturulan endosporun kolayca incelenmesi için uygulanan boyama metodudur. Endosporların normal çevre sıcaklıklarında boyaları içlerine almaya karşı dirençleri vardır. Ancak boya çözeltisinin sıcaklığı yaklaşık 100 C ye yükseltildiğinde, endosporların bu direnci kırılmakta ve endosporlar boyayı içlerine alarak boyanmaktadırlar. Malaşit Yeşili ile Spor Boyama Yöntemi: 1. İncelenecek bakteri kültürü ile preparat hazırlanır ( yayma, kurutma, tespit), 2. Preparat, uygun bir beher ya da teneke kutu kullanılarak hazırlanan su banyosu düzeneği üzerine yerleştirilir, 3. Preparatın üzeri % 5 lik malaşit yeşili boya çözeltisi ile kaplanır ve bunun üstüne daha önceden, lamdan daha küçük boyutta olacak şekilde kesilerek hazırlanmış olan bir kurutma kağıdı yerleştirilir. Kurutma kağıdı boya çözeltisini çekerek ıslanır. Şekil 9. Kaynar Su Banyosu üzerinde malaşit yeşili ile spor boyama 18

20 4. Kurutma kağıdının üstüne malaşit yeşili boya çözeltisi damlatılır ve bundan sonra kağıdın sürekli olarak ıslak kalmasını sağlayacak şekilde hareket edilir. Bu amaçla kurutma kağıdının ıslaklığı azaldıkça, üstüne malaşit yeşili boya çözeltisi damlatılır ve preparat bu şekilde 5-6 dakika boyanır, 5. Süre sonunda kurutma kağıdı bir pensle kaldırılarak atılır, preparat yıkanır, 6. Karşıt boya safranin (%5 lik sulu çözeltisi) ile saniye boyanır, 7. Yıkanır, havada kurutulur, 8. Mikroskopta immersiyon merceğinde incelenir. Endospor yeşil renkte görülür. Şekil 10. Bakteri endosporları 19

21 BAKTERİLERDE HAREKET MUAYENESİ Kamçıya sahip ve aktif hareket edebilen bakterilere hareketli, bu özelliğe sahip olmayan bakterilere ise hareketsiz bakteriler denilmektedir. Kamçının olup olmaması taksonomik bir özelliktir. Bakterilerde hareket muayenesi, bakterilerin hareketli olup olmadıklarını ve dolayısıyla kamçılı veya kamçısız oluşlarının tespiti amacıyla yapılır. Asılı Damla Yöntemi ile Hareket Muayenesi: Bu yöntemde çukur lam adı verilen özel lamlar kullanılmakta ve genel olarak aşağıdaki şekilde bir yol izlenmektedir: 1. Çukur lam temizlenir ve çukur kısmın dört bir yanına çok az miktarda (toplu iğne başı kadar) immersiyon yağı sürülür, 2. Temiz bir lamelin orta kısmına bir öze dolusu sıvı bakteri kültürü (veya bakteri süspansiyonu) aktarılır, 3. Çukur lam ters çevrilerek, lamelin üzerindeki kültür damlası çukur kısmın tam ortasına gelecek şekilde, lamel üzerine yavaşça bırakılır. Daha sonra preparat tekrar ters çevrilerek mikroskop tablasına yerleştirilir, 4. Lamel üzerine bir damla immersiyon yağı damlatılır ve mikroskopta, immersiyon objektifi ile hareket incelemesine geçilir, 5. İncelme sonucunda, lamel dikkatlice lam üzerinden alınarak, içinde dezenfektan çözeltisi olan kaba atılır. Şekil 11. Asılı Damla Preparatının Hazırlanması 20

22 UYGULAMA 5: SÜRME YÖNTEMİ İLE TEK KOLONİ DÜŞÜRME TEKNİĞİ Bir ortamda bulunan veya besiyerinde gelişen karışık kültürlerden saf kültür elde etmek için en çok seyreltme (dilusyon) ve sürme metodları kullanılır. Sürme metodu ile saf kültür elde etmede izlenecek yol: 1. Karışık kültürden alınan bakteri materyali bunzen alevinde sterilize edilen öze ile steril besiyeri üzerine kısa bir çizgi veya zik-zak çizerek sürülür. 2. Sonra öze alevden geçirilir. Birinci çizgiden bulaştırılan öze, besiyeri üzerinde ikinci çizgi veya zik-zak çizerek sürülür. 3. Öze tekrar alevden geçirilir, ikinci çizgiden bulaştırılan öze ile, (3) ve gerekirse (4) numaralı zik-zaklar çizilir. 4. İnkubasyon süresi sonunda, kural olarak (3) ve (4) numaralı çizgiler üzerinde tek tek kolonilerin (saf kültür) gelişmesi beklenir. 21

23 UYGULAMA 6: BESİYERİ HAZIRLAMA-DÖKME Besiyerleri (besi ortamı, ortam, vasat, kültür ortamı, kültür vasatı, kültür besiyeri) mikroorganizmaların geliştirilmesi için formülize edilmiş ortamlardır. Bunlar, mikroorganizmaların geliştirilmesi, izolasyon, identifikasyon, sayım, duyarlılık testleri, sterilite testleri, klinik örneklerin incelenmesi, gıda, su ve çevre kontrolleri, biyolojik ürünlerin elde edilmesi, antibiyotik ve vitamin analizleri, endüstriyel analizler vb. gibi çok farklı amaçlara yönelik olabilir. Her besiyeri üzerinde yazan formülasyona göre distile su ile hazırlanır. Örneğin 1 litre besiyeri hazırlamak için 25 gram tartılması gerektiği yazıyorsa, 200 ml besiyeri hazırlamak için 5 gram besiyeri tartılır. 200 ml suyun yaklaşık 1/3'ü uygun bir kaba aktarılır, bunun üzerine tartılmış dehidre besiyeri ilave edilir. Bu uygulama ile cam kabın tabanına dehidre besiyerinin yapışarak erimemesine bağlı sterilizasyon yetersizliğinin önüne geçilir. Daha sonra suyun geri kalan kısmı cam kap boğazında ve iç çeperlerde kalmış olabilen besiyeri parçacıklarını yıkayarak kaba ilave edilir. Besiyerinin çözünüp homojen hale gelmesi için ısıtıcılı manyetik karıştırıcıda eritilir. Eritme sırasında erlenin ağzı alüminyum folyo ile hafifçe kapatılarak buharlaşma ve buharın laboratuvara dağılması önlenmelidir. Erime sağlandıktan sonra besiyeri kutusunun üzerinde yazan talimata göre sterilizasyon normları ayarlanarak otoklavda sterilize edilir. Otoklav sonrasında agarlı besiyerleri C lik su banyolarına yerleştirilerek besiyeri sıcaklığının sabitlenmesi sağlanır ve aseptik koşullarda steril petri kaplarına besiyeri dökümü gerçekleştirilir. Besiyeri hazırlamada kullanılacak cam malzemenin çok iyi bir şekilde yıkanmış ve durulanmış, besiyeri hazırlamada kullanılan kalitede sudan geçirilmiş ve yeterince kurutulmuş olması gerekmektedir. Kırık ve çatlak cam malzeme kullanılmamalıdır. 22

24 Besiyerinin hazırlanacağı cam malzemenin yeterli büyüklükte olması çoğu kere ihmal edilen, ancak çok önemli bir ayrıntıdır. Cam kapların hacmi mutlaka yeterli bir karıştırma sağlanacak ölçüde olmalıdır. İdeal olarak, hazırlanacak besiyeri hacminin yaklaşık 2 katı hacimde cam kap kullanılmalıdır. Sıvı besiyerleri için, besiyeri hacmi cam kap hacminin en fazla 3/4'ü olabilir. Cam kabın büyük tutulmasının nedeni otoklavlama sırasında ısı geçişinin daha sağlıklı olması, otoklav sonrasında da rahat ve güvenilir çalışma sağlamasıdır. 1 litrelik bir erlende 1 litre besiyeri hazırlanırsa soğuk noktanın yeri nedeni ile ya soğuk nokta yeterince sterilize edilemeyecektir ya da çepere yakın yerler gereğinden fazla ısıya maruz kalmış olacaktır. Büyük miktarlardaki besiyerlerinin balonda hazırlanması aynı nedenle benimsenmez. Tartım için özel tartım kayıkçıkları ya da küçük beherler kullanılmalı, doğrudan erlen ya da balona tartımdan olabildiğince kaçınılmalıdır. Özellikle bileşimden hazırlamalarda tartım sırasında her madde için temiz spatül kullanılması, besiyeri ve/veya besiyeri bileşenlerinin kapakları açıldıktan sonra hata yapmamaya özen gösterilerek tartımın elden geldiğince çabuk bitirilmesi ve besiyeri kapağının sıkıca kapatılması gerekir. Tartım sırasında besiyeri ve/veya bileşenlerinin çok az da olsa toz bulutu oluşturmamasına özen gösterilmeli, eğer toz bulutu oluştu ise kesinlikle solunulmamalıdır. Tartım sırasında besiyeri ve/veya bileşenlerinin çıplak deriye ve özelikle göze temas etmemesi sağlanmalıdır. Tartım sonrasında terazi üzerinde toz oluşmuş ise yumuşak fırça ile temizlenmeli ve damıtık su ya da %70 etil alkol ile silinmelidir. SORULAR 1. Agarlı besiyerinin döküm sıcaklığının neden C olduğunu açıklayınız. 2. Aseptik koşul ne demektir? 3. Besiyeri dökümünün aseptik koşullarda yapılmaması ne gibi olumsuzluklara neden olur? 23

25 KAYNAKLAR Ayhan Temiz, Genel Mikrobiyoloji Uygulama Teknikleri, Hatipoğlu Yayınevi, 3. Basım, 2000, ANKARA, 291. Sami Özçelik, Genel Mikrobiyoloji Uygulama Kılavuzu, 3. Baskı, 2009, ISPARTA, 98. T.C Milli Eğitim Bakanlığı MEGEP (meslekî eğitim ve öğretim sisteminin güçlendirilmesi projesi) gıda teknolojisi kültür elde etme, 2007, ANKARA. T.C Milli Eğitim Bakanlığı MEGEP (mesleki eğitim ve öğretim sisteminin güçlendirilmesi projesi) gıda teknolojisi mikrobiyolojik analizlere hazırlık, 2008, ANKARA. 24

26 Düzen (10 puan) Deneyin konusu (10 puan) Deneyin amacı (10 puan) Deneyin yapılışı (30 puan) Deneyin sonuçları ve yorum (40 puan) TOPLAM GENEL MİKROBİYOLOJİ UYGULAMA DENEY RAPORU UYGULAMA KONUSU:.../ /20... DENEYİN AMACI: DENEYİN YAPILIŞI: DENEY SONUÇLARI VE YORUM: 25