PROTEİN ÇİPLERİ MUSTAFA UZUN BAHAR 2007

Transkript

1 PROTEİN ÇİPLERİ MUSTAFA UZUN BAHAR 2007

2 PROTEİN ÇİPLERİ İnsanlık tarihinin en büyük ve sonuçları açısından en önemli projelerinden olan İnsan Genom Projesi (human genom project) ile elde edilen veriler,insan oğluna yeni ufuklar sunarken birçok farklı projeninde başlamasına neden olmuştur. İnsanlık tarihinin en büyük ve sonuçları açısından en önemli projelerinden olan İnsan Genom Projesi (human genom project) ile elde edilen veriler,insan oğluna yeni ufuklar sunarken birçok farklı projeninde başlamasına neden olmuştur.diğer taraftan insan genom projesi ile elde edilen bilgilerin çoğu ham bilgilerdir.bu bilgilerin uygulanabilmesi için, yeni bazı bilgilere ihtiyaç vardır.örneğin halen hücrede birçok molekülün nereden,hangi koşullar altında sentezlendiği bilinmemekte ve protein moleküllerinin rolleri açıklanamamaktadır. Birçok hastalık; gen kontrolü ile ilgili problemler, transkripsiyon,post-transkripsiyonal modifikasyon ve translasyon sırasında oluşan değişiklikler ile oluşmaktadır Bu nedenle, nükleik asit bazlı labaratuvar tetkikleri yanında protein bazlı labaratuvar tetkiklerinin de önemi artarak sürmektedir. Sıklıkla kullanılan geleneksel laboratuar yöntemleri, genellikle tek bir gen veya proteinin araştırılmasına yöneliktir.oysa hastalıkların çoğunda birçok gen etkilenmekte(multigenik) ve birçok faktöre bağlı olarak hastalıklar oluşmaktadır (multifaktöriyel). Bu da, birçok farklı genin ve proteinin bir arada, kolay ve efektif olarak incelenebilmesini gündeme getirmiştir. Günümüzde gelişen

3 bilgisayar teknolojisinin biyolojiye uyarlanması ile karşımıza çıkan DNA çipleri, bize bu olanağı sağlamaktadır. Mikroarrayler ile etkilenen genlerin ekspresyonları, kanserli bir dokuda aynı anda çalışılmakta, hücre siklusunu (döngüsünü) etkileyen yüzlerce genin ekspresyonu takip edilebilmektedir. Mikroarray, ileri derecede genotip ve gen ekspresyon analizleri için geliştirilmiş bir tekniktir.küçük örnek hacimleri kullanılarak tek deneyde mikroarrayler, SNP lerin,hastalıklı ve normal fizyolojik koşullardaki modifiye gen ekspresyonunun (mrna daki artış ve azalışlar) hızlı bir şekilde çalışılmasını sağlar. Gen ekspresyon arrayleri, mrna seviyelerindeki değişiklikleri,kodlanan protein seviyelerindeki değişikliklerle karşılaştırmak için kullanılırlar. Ancak bu çok doğru sonuç vermez. Gen ekspresyon arrayleri, hücre fonksiyonunu etkileyen protein post translasyonal modifikasyonları (fosforilasyon, glikolizasyon v.b.) hakkında bilgi sağlamaz. Protein seviyesinde ekspresyonu değerlendirmek, ilgilenilen proteinlerle ilgili kalitatif ve kantitatif bilgi gerektirir. Bu nedenle, protein mikroarrayleri geliştirilmiştir. Bir protein mikroarrayi; antikorlar, proteinler, protein fragmentleri, peptidler, aptamerler veya küçük yüzeylerde immobilize olmuş veya kaplanmış karbonhidrat monomerlerini içerir. Çip yüzeyinde yüzlerce spotlar vardır.her spot üzerinde de binlerce aynı tür problar vardır.prob türü sadece spottan spota değişir. Protein Array Tipleri -Antikor-Protein Array -Tek Antikor/İşaretlenmiş Örnek Protein Array -Hücresel Lizat Protein Array

4 -Antikor-Protein Array Antikor mikroarraylerinde, sandviç tip assayler için eşleşen antikor çifti,işaretli tek antikor ve işaretsiz antikor ligant olarak kullanılarak yapılır ve basit işaretleme metodu vardır. Birçok yayınlanan çalışmada,sandviç immunoassay mikroarray lerin kullanılabilirliği ve etkinliği gösterilmiştir.bu yöntemde antikor çifti aynı proteine bağlandığı için yüksek hassasiyetli analiz gerçekleşir. Saptayıcı antikor, direkt tanımlayıcı işaretle (enzim, floresan molekül, izotop, vb) modifiye edilir veya işaretli streptavidin ile prob uygulamasından sonra saptama için biotinlenir

5 Tek Antikor/İşaretlenmiş Örnek Protein Array Eşleşmiş antikor çiftleri yoksa, işaretli örnekler içeren tek antikor protein mikroarray protokolleri kullanılır. Sandviç antikor çift arraylerde olduğu gibi, array platformu arrayi yapılan antikoru (veya antikorları) içerir.. Bu yöntemde, protein örneklerinin daha önceden işaretlenmesi (floresan molekülle, isotop veya biotinle) gerekir. İşaret, örnekteki bir proteinin mikarray yapılan bir antikorla ve ilişkili elamanlarla etkileşimi tanımlamayı kolaylaştırır. Bu teknik, zayıf karakterli hücre sinyal proteinleri gibi protein hedeflerin değerlendirilmesinde kullanılır. Ana dezavantajı, spesifik antijen tanımasından emin olunmasını sağlayan antikor fazlalığının olmamasıdır. Ek olarak, tüm örnek bileşenleri işaretlendiği için, spesifik olmayan arka plan sinyali artacaktır. Yöntem daha çok primer olarak karşılaştırma ve kalitatif çalışmalarda kulanılır.

6 Hücresel Lizat Protein Array Hücresel proteinlerin mikroarrayleri, kompleks protein karışımları veya saflaştırılmış fazla miktarda eksprese olmuş proteinlerin arraylerinde kullanılır. Kompleks protein karışım arrayleri, hücresel lizatları dot blotlar. Saflaştırılmış veya fazla miktarda eksprese olmuş proteinlerin kitaplıklarından oluşan mikroarraylerin oluşturulması, protein:protein etkileşimlerinin ve kinaz aktivitelerinin görüntülenmesine olanak verir. Özelliklerine Karar Verme Protein arrayler, cam, membran, kütle spektroskopi plateleri, boncuklar ve diğer partiküller gibi yüzeylere immobilize proteinler kullanılarak katı-faz ligand bağlama deneme sistemleridir. Denemeler, paraleldir ve minyatüre edilebilirler (mikroarray ve protin çipleri). Hızlı ve otomatik olmaları, yüksek hassasiyette olmaları, çözeltilerin ekonomik olması ve tek denemeyle çok veri elde edilebilmesi bu yöntemin avantajlarıdır. Elde edilen verilerin değerlendirilmesi biyoinformatik sayesinde yapılabilmektedir. Uygulama Alanları Diyagnostikte, hapsedilen arrayler, paralel olarak birçok denemenin gerçekleşmesine olanak verir. Proteomikte, bu array, farklı örneklerdeki proteinlerin miktarlarını hesaplamada ve karşılaştırmada kullanılır.. Arrayde, ligandlardan daha spesifik olan proteinler, protein-protein, protein-dna, protein-ilaç, reseptör-ligand, enzimsubstrat gibi in vitro fonksiyonel etkileşimlerin görüntülenmesinde

7 kullanlır. Ayrıca, SNP lerden doğan polimorfik değişikliklerle protein fonksiyonu korele edilebilir Protein arraylerin kullanıldığı 4 ana alan vardır. 1. Diagnostik: Kan örneklerindeki antijen ve antikorların saptanması. 2. Proteomik: Protein ekspresyon profili oluşturulması, organ ve hastalık spesifik arrayler. 3.İleri ekspresyon ve maniplasyonlar için display kitaplıklarından bireysel üyelerin izolasyonu protein ve antikorların seçilimi 4.Protein fonksiyonel analizi: protein-protein etkileşimleri, reseptörün ligand bağlama özellikleri, enzim aktiviteleri, antikor çapraz aktivitesi ve spesifitesi, epitop haritalaması. Bu yeni teknolojinin günümüzde ilk kullanımları, meme kanseri üzerine yapılmıştır. Geliştirilen protein-çip teknolojisi ile yapılan bir çalışmada, 169 olgu incelenmiştir. Olguların 103'ü meme kanserli (evre I-III arası), 25 olgu iyi huylu (benign) meme hastalığınana sahiptir. Seçilen 41 olgu ise, meme yönünden sağlıklıdır. Çalışmada üç yeni markır elde edilmiş ve bu markırlar BC1 (4.3 kda), BC2 (8.1 kda) ve BC3 (8.9 kda) olarak adlandırılmıştır. Bu üç markıra ait sensitivite %93, spesifite %91 olarak bulunmuştur.meme kanseri haricinde protein çip teknolojisinden günümüzde özellikle kişilere ait HIV direncinin araştırılmasında, prostat, over, mide, akciğer ve mesane kanserlerinin takibinde araştırma bazında kullanılmaktadır. Formatlar ve Yüzeyler Protein arrayler, ELISA ve dot blot gibi metodların minyatürize edilmiş şekli olarak tasarlanmıştır. Genelde kullanılan fiziksel destek, cam slaydlar, silikon, mikrokuyular, nitroselüloz membranlar,

8 manyetik veya diğer boncuklardır.süspansiyondaki partiküller, array lerin temeli olarak kullanılır. Protein İmmobilizasyonu Proteinlerin imobilizasyonlarındaki çeşitlilikler çözeltiler ve yüzeyin özellikleridir. İyi bir protein array yüzeyi, kimyasal olarak eşleşme prosesinden önce ve sonra stabil olmalıdır, iyi spot morfolojisine izin vermelidir, saptama sistemleri arka planla girişim yapmamalıdır. Kullanılan immobilizasyon metodu tekrarlanabilir, farklı özellikteki proteinlere uygulanabilir, otomasyona yatkın olmalı ve tüm fonksiyonel protein aktivitesini geri kazanabilme yeteneğinde olmalıdır. Protein immobilizasyonu için hem kovalent hem de nonkovalent metodlar kullanılmaktadır. Yüzeye pasif adsorbsiyon metodolojik olarak basittir ancak az kantitatif ve tekrarlanabilirlikleri azdır.kovalent bağlanma metodları, stabil bağlanma sağlarlar ve çok geniş özellikte proteinlere uygulanabilirler ve tekrarlanabilirlikleri iyidir. Kovalent bağlanma substratları amino- veya aldehit içeren silan çözeltisiyle kaplanmış cam slaytları içerir. Versalinx sistemde [Prolinx], fenildiboronik asit ve salisilhidroksamik asit ile türevlenmiş proteinler arasındaki etkileşimler yüzeye geri dönüşümlü olarak immobilize edilmeyi başarılmıştır.ayrıca, bu yöntemde daha az arka plan bağlanması görülmüştür ve immobilize proteinlerin fonksiyonlarını kazanmaları sağlanmıştır. En yaygın kullanımı olan biyolojik eşleme metodu, biotin/streptavidin veya heksahistidin/ni etkileşimleridir. Biotin, titanyum dioksit gibi bir yüzeyde poli lizin iskeletine konjuge olabilir.

9 Saptama Saptamada en yaygın olarak floresan işaretleme kullanılmaktadır. DNA mikroarraylerini okumak için kullanılan metodlar, protein arraylere de uygulanabilmektedir. Differential display için, capture arrayler, (örn: antikor) 2 farklı hücre durumundaki floresanla işaretli probla incelenebilir oluşan renk, hedef okuyucuda okunur. Planar waveguide technology [Zeptosens] ultrahassas floresans saptaması sağlar ve yıkama prosedürünün olmaması da ayrı bir avantajıdır. Ayrıca, yüksek hassasiyet süspansiyon boncukları ve partikülleri ile işaret olarak fitoeritrin kullanılmasıyla sağlanır. Diğer alternatif metodlar, yüzey plazmon rezonansı, dönen halkasal DNA amplifikasyonu [Molecular Staging], kütle spektroskopisi ve atomik kuvvet mikroskopisidir. Uygun dalga boyundaki floresan yayan fluoroklomların streptavidine veya antikorlara bğlanabilen çeşitleri vardır.en çok kullanılanlar fluoresein izotiyosiyanat(fitc) yeşil,teksas kırmızısı ve rodamin kırmızı,aminometil kumarin asetik asit(amca) ise mavi renkte ışık yayarlar. Ayrıca saptamada fotolitografi tekniğide kullanılmaktadır. Photolitografi prosesinde, probun yüzeyini normal şartlar altında ışığı geçirmeyen bir madde (maske) kaplar. Hibridizasyondan sonra UV ışı altında hibridize olan bölgeler bu maddeyi delerek kendilerini beli ederler hibridize olmayan bölgeler ise karanlıkta kalır.

10 Large-Scale Protein Arrayleri Large-scale fonksiyonel çipler, çok sayıda saflaştırılan proteinin immobilizasyonu ile geniş miktarda biyokimyasal fonksiyonun (protein-protein etkileşimi, ilaç-hedef etkileşimi, enzim-substrat etkileşimi vs.) denemesinde kullanılırlar. KAYNAKLAR

11 www1.qiagen.com/products/protein