TEZ ONAYI Mehmet Borga ERGÖNÜL tarafından hazırlanan Çinko (Zn) ve Bakırın (Cu) Lethal ve Sub-lethal Konsantrasyonlarına Maruz Bırakılan Kadife Balıkl

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ ÇİNKO (Zn) VE BAKIRIN (Cu) LETHAL VE SUB-LETHAL KONSANTRASYONLARINA MARUZ BIRAKILAN KADİFE BALIKLARINDA (Tinca tinca L., 1758) BAZI KAN PARAMETRELERİNİN İNCELENMESİ MEHMET BORGA ERGÖNÜL BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2011 Her Hakkı Saklıdır

2 TEZ ONAYI Mehmet Borga ERGÖNÜL tarafından hazırlanan Çinko (Zn) ve Bakırın (Cu) Lethal ve Sub-lethal Konsantrasyonlarına Maruz Bırakılan Kadife Balıklarında (Tinca tinca L., 1758) Bazı Kan Parametrelerinin İncelenmesi adlı tez çalışması tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı nda DOKTORA TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman : Prof. Dr. Ahmet ALTINDAĞ Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı Jüri Üyeleri : Başkan : Prof. Dr. Olcay OBALI Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Ali GÜL Gazi Üniversitesi Biyoloji Eğitimi Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Ahmet ALTINDAĞ Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Hijran YAVUZCAN Ankara Üniversitesi Su Ürünleri Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. Sibel ATASAGUN Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Özer KOLSARICI Enstitü Müdürü

3 ÖZET Doktora Tezi ÇİNKO (Zn) VE BAKIRIN (Cu) LETHAL VE SUB-LETHAL KONSANTRASYONLARINA MARUZ BIRAKILAN KADİFE BALIKLARINDA (Tinca tinca L., 1758) BAZI KAN PARAMETRELERİNİN İNCELENMESİ Mehmet Borga ERGÖNÜL Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Ahmet ALTINDAĞ Bu çalışmada esasiyel metaller olarak bilinen çinko (Zn) ve bakırın (Cu) Kadife balıkları (Tinca tinca L., 1758) için 96 saatlik LC 50 değerlerinin belirlenmesi ve bu metallerin sub-lethal ve lethal konsantrasyonlarına maruz bırakılan balıklarda hematokrit, lökokrit, alyuvar, akyuvar ve trombosit sayımı, hemoglobin seviyesi, sedimentasyon oranı, pıhtılaşma zamanı, plazma total protein, plazma albumin, plazma glukoz seviyesi, plazma laktat ve seruloplazmin seviyesi gibi bazı kan parametrelerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Çalışma sonunda çinko için 96 saatlik LC 50 değeri 20,7 ppm, bakır için ise bu değer 1137 ppb olarak bulunmuştur. Her iki metalin sub-lethal konsantrasyonlarının kronik uygulamalarında genel olarak pıhtılaşma zamanı, trombosit sayısı, alyuvar sayısı, hematokrit, hemoglobin seviyesi ve sedimentasyon oranı, akyuvar sayısı ve lökokrit seviyesi, plazma seruloplazmin, glukoz ve laktat seviyesinin uygulama süresine bağlı olarak değiştiği gözlenmiştir. Bu etkilerin lethal konsantrasyona 1 gün süreyle maruz bırakılan balıklarda daha belirgin olduğu tespit edilmiştir. Albumin ve total protein seviyesi ise her iki metalin hem lethal akut hem de sub-lethal kronik uygulamalarında değişmeden kalmıştır. Mart 2011, 129 sayfa Anahtar Kelimeler: Probit, toksisite, ağır metal, çinko, bakır, Kadife balığı, kan parametreleri. i

4 ABSTRACT Ph.D. Thesis THE ASSESSMENT OF THE BLOOD PARAMETERS OF TENCH (Tinca tinca L., 1758) EXPOSED TO LETHAL AND SUB-LETHAL CONCENTRATIONS OF ZINC (Zn) AND COPPER (Cu) Mehmet Borga ERGÖNÜL Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Prof.Dr. Ahmet ALTINDAĞ In this study the lethal concentrations (LC 50 ) of two essential metals; zinc (Zn) and copper (Cu) for tench (Tinca tinca L., 1758) were investigated. The effects of sub-lethal concentrations of these metals on the blood parameters such as hematocrit, leucocrit, red blood cell, white blood cell and thrombocyte counts, hemoglobin level, sedimentation rate, clotting time, plasma total protein, albumin, glucose levels, plasma lactate and ceruloplasmin levels of tench were also investigated. The 96 h LC 50 for zinc and copper was found as 20.7 ppm and 1137 ppb, respectively. It was found that the exposure to sub-lethal concentrations of both metals caused significant changes in clotting time, red blood cell, white blood cell and thrombocyte counts, hemoglobin level, sedimentation rate, clotting time, plasma glucose levels, plasma lactate and ceruloplasmin levels depending on the concentration and exposure time. It was also found that these changes were marked in fish which was exposed to lethal concentration for 24 h. Of the investigated parameters plasma albumin and total protein levels remained unchanged in fish exposed to chronic sub-lethal and acute lethal concentrations of both metals. March 2011, 129 pages Key Words : Probit, toxicity, heavy metal, zinc, copper, tench, blood parameters. ii

5 TEŞEKKÜR Tez çalışmalarım süresince her türlü maddi ve manevi desteğini gördüğüm, imkan ve bilgilerini benimle paylaşan, çalışmalarımla ilgili her konuda yardımcı olan, çözüm üreten ve yol gösteren danışman hocam Prof. Dr. Ahmet ALTINDAĞ a (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü), tez konusunu seçmemde büyük yardımları olan, bu konudaki tüm bilgilerini benimle paylaşan ve çalışmalarımı yönlendiren, maddi ve manevi desteklerini benden esirgemeyen Prof. Dr. Hijran YAVUZCAN a (Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Su Ürünleri Bölümü), tez çalışmalarımın her aşamasında beni destekleyen, tüm bilgi ve birikimini benimle paylaşan ve çalışmalarım sırasında karşılaştığım her türlü sıkıntılarımı dinleyen ve çözüm üreten Doç.Dr. Sibel ATASAGUN a (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü), ağır metal analizleri konusunda büyük yardımlarını gördüğüm Prof. Dr. Ali GÜL e (Gazi Üniversitesi Biyoloji Eğitimi Anabilim Dalı), denemeler sırasında yardım eden arkadaşlarım Özge BUYURGAN, Evren TUNCA, Kübra KOCATÜRK e, balık temini konusunda yardımcı olan yöre balıkçılarından Beyler TILISBIK ve Metehan DEMİRELLİ ye, tez çalışmalarım sırasında her türlü sıkıntımı sabırla dinleyen, maddi manevi desteğini hep gördüğüm eşim Senem AKGÜN ERGÖNÜL e teşekkürü bir borç bilirim. Bu çalışmanın bir kısmı TUBİTAK 108T662 Nolu Proje ile desteklenmiştir. Mehmet Borga ERGÖNÜL Ankara, Mart 2011 iii

6 İÇİNDEKİLER DİZİNİ ÖZET...i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii SİMGELER DİZİNİ...vi ŞEKİLLER DİZİNİ...viii ÇİZELGELER DİZİNİ...x 1. GİRİŞ Balıkların İmmün Sistemi ile İlgili Bilgiler Toksisite Deneyleri ile İlgili Tanımlar Çinko ile ilgili Bilgiler Çinko ile İlgili Çalışmalar Bakır ile İlgili Bilgiler Bakır ile İlgili çalışmalar Kadife Balığı (Tinca tinca L., 1758) MATERYAL VE YÖNTEM Kan Parametreleri Alyuvar sayımı Akyuvar ve trombosit sayımı Hematokrit ölçümü Lökokrit ölçümü Hemoglobin ölçümü Sedimentasyon oranı Pıhtılaşma zamanı Plazma laktat seviyesi Plazma glukoz seviyesi Plasma protein seviyesi Plasma albumin seviyesi Plasma seruloplazmin seviyesi İstatistiksel Analizler BULGULAR...42 iv

7 3.1 Laboratuvar Suyu Fiziko-Kimyasal Özellikleri Çinko LC Değerleri Bakır LC Değerleri Çinko Denemeleri Üç günlük deneme On günlük deneme Yirmi günlük deneme Akut deneme Bakır ile İlgili Bulgular Üç günlük deneme On günlük deneme Yirmi günlük deneme Akut deneme Çinko ve Bakır Uygulamalarının Karşılaştırılması Kronik deneme gruplarının karşılaştırılması Akut deneme gruplarının karşılaştırılması TARTIŞMA SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ v

8 SİMGELER DİZİNİ C Santigrad derece Cu Bakır Zn Çinko cm Santimetre m Metre m 3 mm 3 EC Fe Hb Hg MetHb Hct Kg G dl mg LC 50 Lct Metreküp Milimetreküp Elektriki iletkenlik Demir Hemoglobin Civa Met-Hemoglobin Hematokrit Kilogram Gram Desilitre Miligram Ortalama lethal konsantrasyon Lökokrit µg Mikrogram mmol Milimol ml Mililitre ZnCl 2 Çinko klorür CuSO 4.5H 2 O Bakır sülfat ph Çözeltinin asit/baz derecesini ifade eden ölçü birimi ppm Milyonda bir kısım ppb Milyarda bir kısım Pb Kurşun sn Saniye rpm Dakikadaki devir sayısı vi

9 % Yüzde Ca Kalsiyum CaCO 3 Kalsiyum karbonat Mg Magnezyum TSE Türk Standartları Enstitüsü EPA ABD Çevre Koruma Ajansı ZnSO 4.7H 2 O Çinko sülfat vii

10 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Balıklarda kaudal venadan kan alınması...35 Şekil 2.2 Improved Neubauer Thoma Lamının mikroskop altındaki görüntüsü...36 Şekil 3.1 Çinko uygulaması için hesaplanan 96 saatlik probit değerleri ve regresyon grafiği...44 Şekil 3.2 Bakır uygulaması için hesaplanan 96 saatlik probit değerleri ve regresyon grafiği...46 Şekil 3.3 Çinko ve bakıra maruz bırakılan balıklarda pıhtılaşma süresi (sn)...63 Şekil 3.4 Çinko ve bakıra maruz bırakılan balıklarda sedimentasyon oranı (mm/saat)...64 Şekil 3.5 Çinko ve bakıra maruz bırakılan balıklarda trombosit sayısı (10 3 /mm 3 )...65 Şekil 3.6 Çinko ve bakıra maruz bırakılan balıklarda alyuvar sayısı (10 6 /mm 3 )...66 Şekil 3.7 Çinko ve bakıra maruz bırakılan balıklarda akyuvar sayısı (10 6 /mm 3 )...67 Şekil 3.8 Çinko ve bakıra maruz bırakılan balıklarda hematokrit seviyesi (%)...67 Şekil 3.9 Çinko ve bakıra maruz bırakılan balıklarda lökokrit seviyesi (%)...68 Şekil 3.10 Çinko ve bakıra maruz bırakılan balıklarda hemoglobin seviyesi (g/dl)...69 Şekil 3.11 Çinko ve bakıra maruz bırakılan balıklarda laktat seviyesi (mmol/l)...70 Şekil 3.13 Çinko ve bakıra maruz bırakılan balıklarda glukoz miktarı (mg/dl)...70 Şekil 3.12 Çinko ve bakıra maruz bırakılan balıklarda seruloplazmin miktarı (mg/l)...71 Şekil 3.14 Çinko ve bakıra maruz bırakılan balıklarda viii

11 total protein seviyesi (g/l)...71 Şekil 3.15 Çinko ve bakıra maruz bırakılan balıklarda albumin seviyesi (g/l)...72 Şekil 3.16 Çinko ve bakırın akut lethal konsantrasyonuna 24 saat süreyle maruz bırakılan balıklarda pıhtılaşma süresi (sn)...72 Şekil 3.17 Çinko ve bakırın akut lethal konsantrasyonuna 24 saat süreyle maruz bırakılan balıklarda sedimentasyon oranı (mm/saat)...73 Şekil 3.18 Çinko ve bakırın akut lethal konsantrasyonuna 24 saat süreyle maruz bırakılan balıklarda trombosit sayısı (10 3 /mm 3 )...73 Şekil 3.19 Çinko ve bakırın akut lethal konsantrasyonuna 24 saat süreyle maruz bırakılan balıklarda alyuvar sayısı (10 6 /mm 3 )...74 Şekil 3.20 Çinko ve bakırın akut lethal konsantrasyonuna 24 saat süreyle maruz bırakılan balıklarda akyuvar sayısı (10 3 /mm 3 )...75 Şekil 3.21 Çinko ve bakırın akut lethal konsantrasyonuna 24 saat süreyle maruz bırakılan balıklarda hematokrit seviyesi (%)...75 Şekil 3.22 Çinko ve bakırın akut lethal konsantrasyonuna 24 saat süreyle maruz bırakılan balıklarda lökokrit seviyesi (%)...76 Şekil 3.23 Çinko ve bakırın akut lethal konsantrasyonuna 24 saat süreyle maruz bırakılan balıklarda hemoglobin seviyesi (g/dl)...76 Şekil 3.24 Çinko ve bakırın akut lethal konsantrasyonuna 24 saat süreyle maruz bırakılan balıklarda laktat seviyesi (mmol/l)...77 Şekil 3.25 Çinko ve bakırın akut lethal konsantrasyonuna 24 saat süreyle maruz bırakılan balıklarda seruloplazmin seviyesi (mg/l)...78 Şekil 3.26 Çinko ve bakırın akut lethal konsantrasyonuna 24 saat süreyle maruz bırakılan balıklarda glukoz seviyesi (mg/dl)...78 Şekil 3.27 Çinko ve bakırın akut lethal konsantrasyonuna 24 saat süreyle maruz bırakılan balıklarda total protein seviyesi (g/l)...79 Şekil 3.28 Çinko ve bakırın akut lethal konsantrasyonuna 24 saat süreyle maruz bırakılan balıklarda albumin seviyesi (g/l)...79 ix

12 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 Laboratuvar suyu fiziko-kimyasal özellikleri...42 Çizelge 3.2. Çinkonun LC 50 değerinin belirlenmesi için uygulanan konsantrasyonlar ve mortalite oranları...43 Çizelge 3.3 Çinko için 96 saatlik LC değerleri...43 Çizelge 3.4 Bakırın LC 50 değerinin belirlenmesi için uygulanan konsantrasyonlar ve mortalite oranları...45 Çizelge 3.5 Bakır için 96 saatlik LC değerleri...45 Çizelge 3.6 Çinkonun sub-lethal konsantrasyonuna 3 gün maruz bırakılan balıklarda kan parametreleri...48 Çizelge 3.7 Çinkonun sub-lethal konsantrasyonuna 10 gün maruz bırakılan balıklarda kan parametreleri...50 Çizelge 3.8 Çinkonun sub-lethal konsantrasyonuna 20 gün maruz bırakılan balıklarda kan parametreleri...52 Çizelge 3.9 Çinkonun lethal konsantrasyonuna 1 gün süreyle maruz bırakılan balıklarda kan parametreleri...54 Çizelge 3.10 Bakırın sub-lethal konsantrasyonuna 3 gün maruz bırakılan balıklarda kan parametreleri...56 Çizelge 3.11 Bakırın sub-lethal konsantrasyonuna 10 gün maruz bırakılan balıklarda kan parametreleri...58 Çizelge 3.12 Bakırın sub-lethal konsantrasyonuna 20 gün maruz bırakılan balıklarda kan parametreleri...60 Çizelge 3.13 Bakırın lethal konsantrasyonuna 1 gün maruz bırakılan balıklarda kan parametreleri...62 Çizelge 4.1 Bazı balık türleri için çinkonun LC 50 değerlerinin karşılaştırılması...84 Çizelge 4.2 Bazı balık türleri için bakırın LC 50 değerlerinin karşılaştırılması...86 x

13 1. GİRİŞ Canlı organizmalar içinde yaşadıkları ortamla çok yakından ilişkilidirler. Günümüzde her gün yüzlerce kirletici çevreye atılmakta ve burada yaşayan canlıları etkilemektedir. Çevre kirlenmesi, insan faaliyetleri sonucunda ortamdaki doğal dengenin fiziksel, kimyasal ve biyolojik etkenlerle bozularak canlıların yaşama ortamlarının kısmen veya tamamen ortadan kalkmasıdır (Ardalı 1990). Günümüzde sanayileşmenin artması sonucu, doğal suların kadmiyum (Cd), bakır (Cu), çinko (Zn), civa (Hg) ve kurşun (Pb) gibi ağır metallerle kirlenmesi küresel bir sorun haline gelmiştir. Ekolojik dengenin korunması ve insan sağlığı açısından, biyolojik çevrimin bir halkasını oluşturan ve ayrıca önemli bir protein kaynağı olarak tüketilen sucul canlılarda özellikle de balıklarda bu ağır metallerin etkilerinin belirlenmesi ayrı bir önem oluşturmaktadır (Sağlamtimur 1998). Doğada ağır metaller çok düşük derişimlerde bulunmakla beraber, insan nüfusunun hızlı artışı ve buna bağlı olarak artan sanayileşme, ortamdaki ağır metal derişiminin de artmasına neden olmuştur. Ağır metallerin ana kaynakları maden ocakları, metal ve kağıt endüstrisinin atık suları, gübreler, kömür ve motorin gibi fosil yakıtları, pestisitler ve kimyasallardır (Sağlamtimur 1998, Kalay ve Canlı 2000). Çeşitli insan aktiviteleri sonucu sucul ortama karışan ve genellikle çok düşük dozlarda bile toksik etki gösteren ağır metaller sucul canlılar tarafından çeşitli organ ve dokularda birikip belirli dozlara ulaştıktan sonra toksik etki göstermektedir. Canlı bünyelerinden kolaylıkla atılamadıkları için canlılarda birikir ve besin zinciri yoluyla insana ve diğer karasal canlılara ulaşmaktadır (Göksel 1993). Dolayısıyla ağır metallerin tüm ekosistem açısından bir tehdit oluşturdukları bilinmektedir. Çevreye sızan ağır metallerin büyük bir kısmı atmosferden, erozyonla taşınarak veya çeşitli insan aktiviteleri sonucu direkt olarak sucul ortama ulaşmaktadır (Kalay ve Canlı 2000). Ağır metallerin sucul canlılar üzerinde metabolik, fizyolojik ve davranışsal etkileri olduğu bir çok çalışmada gösterilmiştir (Sorengas vd. 1996, Roche ve Boge 1996, Shah ve Altındağ 2004a, Shah ve Altındağ 2004b, Shah ve Altındağ 2005). 1

14 Yoğunlukları genel olarak 5 gr/cm 3 den ve atom numarası 20 den büyük olan metaller ağır metal olarak adlandırılmaktadır (Eaton vd. 1995, Mason vd. 1996). Biyolojik olarak ağır metallerin bazıları canlılar için esasiyel olup çeşitli enzim sistemlerinde önemli rollere sahipken, bazıları ise biyodegredasyonla uzaklaştırılamayan ve hücre içindeki fonksiyonları kesin olarak bilinmeyen metallerdir ve genellikle canlılar için çok düşük dozlarda bile toksik etki gösterirler (Gill ve Pant 1985, Abel ve Papoutsoglou 1986, Sovenyi ve Szakolczai 1993). Balıkların besin amaçlı tüketilmeleri göz önüne alındığında sucul ortamların ağır metallerle kirlenmesi daha ciddi bir sorun oluşturmaktadır. İnsan sağlığı açısından olası tehditlerin yanısıra ağır metallerin balıkların immün sistemi üzerinde de etkileri olduğu ve balıkları hastalılara karşı daha duyarlı hale getirdiği çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir (Mahoney vd. 1973, Murchelano 1982). Bu durum kültürü yapılan ekonomik öneme sahip balık türleri söz konusu olduğunda ekonomik kayıplar da meydana getirebilmektedir. Ayrıca ağır metallerin kan parametreleri ve immün sistem üzerindeki etkilerinin incelenmesi için balıkların, insan ve diğer yüksek omurgalılar yerine iyi bir alternatif model olduğu öne sürülmektedir (Zelikoff 1998). Balıklar yaşadıkları ortamdaki değişimlere çok hızlı bir şekilde cevap verebilirler. Pek çok araştırmacı balıkların genel sağlık durumunun ve çevresel kirlilik yaratan ağır metallere karşı toleransının izlenmesi için kan parametrelerinin incelenmesinin iyi bir yöntem olduğunu savunmaktadır (Fajer-Avilla vd. 2003). Diğer taraftan bu parametrelerin pragnoz ve diyagnozdaki klinik değerleri pek çok balık türü özellikle de yetiştiriciliği yapılan ekonomik öneme sahip türler için bilinmektedir. Bu çalışma için seçilen balık türü olan Kadife balığı (Tinca tinca L., 1758) Türkiye iç sularında yaygın bir tür olup sucul ortamdaki olumsuz koşullara karşı nispeten dayanıklı bir türdür (Svobodova ve Kolarova 2004). Bununla birlikte Türkiye de üretilmemesine karşın bazı Avrupa ülkerinde üretimi üzerine çalışmalar yapılmaktadır (Svobodova ve Kolarova 2004, Buchtova vd. 2005). Ayrıca Çin in 2006 yılında Kadife balığı üretimine yönelik başlatmış olduğu büyük bir projesi bulunmaktadır (Wang vd. 2006). Kadife 2

15 balığına olan ilginin artması bu balık üzerine yapılan çalışmaları daha önemli kılmaktadır. Çalışma için seçilen her iki ağır metal de (çinko ve bakır; Zn ve Cu) esasiyel metaller olarak değerlendirilmelerine, canlılarda pek çok önemli role sahip olmalarına ve balık diyetlerinde belirli oranlarda bulunmaları şart olmalarına karşın yüksek konsantrasyonlarda toksik etki gösterirler. Bu metallerin bazı sucul canlılar için lethal konsantrasyonları belirlenmiş olmasına karşın, literatürde bu metallerin balıkların kan parametreleri üzerine etkilerini inceleyen kapsamlı çalışma sayısı oldukça sınırlıdır. Bu çalışmada çinko (Zn) ve bakırın (Cu) Kadife balığı (Tinca tinca L., 1758) için 96 saatlik LC 50 değerlerinin belirlenmesi ve bu metallerin lethal ve sub-lethal konsantrasyonlarına maruz bırakılan balıklarda hematokrit, lökokrit, alyuvar, akyuvar ve trombosit sayımı, hemoglobin seviyesi, sedimentasyon oranı, pıhtılaşma zamanı, plazma total protein, plazma albumin, plazma glukoz seviyesi, plazma laktat ve seruloplazmin seviyesi gibi bazı kan parametrelerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Literatürde kadife balığının kan parametrelerini inceleyen birkaç çalışma bulunmakla birlikte kadife balığının kan parametrelerinde belirtilen ağır metallerin yol açtığı etkileri inceleyen çalışmaya rastlanmamıştır. 1.1 Balıkların İmmün Sistemi ile İlgili Bilgiler Balıklarda immün sistem ve dolayısıyla hematolojik parametreler memelilerdekine benzemekle birlikte temelde bazı farklılıklar gözlenmektedir. Balıklarda immün sistem tıpkı memelilerde olduğu gibi spesifik ve non-spesifik immün sistem olmak üzere 2 kısımda incelenmektedir ki bu özelliklerinden dolayı balıkların immünolojik çalışmalarda yüksek omurgalılar yerine uygun bir alternatif model olduğu savunulmaktadır (Zelikoff 1998). Spesifik immün sistemde antijenin tanınması ve buna özel antikorların üretilmesi, patojenin eliminasyonu sonucu bazı lenfositlerin memory hücreler olarak saklanması rol oynar. Spesifik immün sistem aynı patojenle tekrar karşılaşılması durumunda daha etkin ve hızlı bir yanıt verilmesini sağlar. Dolayısıyla balıklar için aşılama uygulamaları elzemdir. Ancak balıklar soğukkanlı canlılar 3

16 olduklarından metabolizma hızları ve dolayısıyla spesifik immün sistemin işleyişi nispeten yavaştır ve ortam sıcaklığına bağlıdır. Ancak non-spesifik sistemde fagositik hücrelerin uyarılmasına gerek yoktur, patojene karşı anında, etkin ve spesifik olmayan bir cevap verirler. Dolayısıyla balıklarda savunma sistemi temel olarak granülositler (eozinofil, bazofil ve nötrofil), monosit ve makrofajlar, transferin, toksinler, lektinler, C- reaktif protein, çeşitli litik enzimler (lizozim gibi) interferon, enzimatik olmayan lizinler, enzim inhibitorleri ve komplementlerden oluşan non-spesifik immün sisteme dayanır (Magnadottir 2006). Balıklarda dolaşımdaki kan hücreleri türlere göre bazı farklılıklar göstermekle birlikte eritrosit, trombosit, lenfosit, monosit, nötrofil, euzonofil, bazofil ve bu hücrelerin immature hallerinden oluşur (Ellis 1977, Fange 1992). Bu hücrelerin büyük bir çoğunluğu memelilerdeki fonksiyonlara benzer fonksiyonlara sahiptir. Memelilerden farklı olarak balık eritrositlerinde hücre çekirdeği bulunmaktadır ve balıklarda eritrositler miktar olarak en fazla olan kan hücresidirler. Olgunlaşan eritrositlerin zamanla büyüklüğü ve içerdiği hemoglobin miktarı artar. Balıklarda kan hücrelerinin sayısı sadece türe göre değil aynı zamanda tür içinde bile mevsim, cinsiyet ve su kalitesi parametreleri gibi değişkenlere göre de farklılık gösterebilmektedir (Feldman vd. 2006). Trombositler ise tıpkı memelilerde olduğu gibi balıklarda da kanın pıhtılaşmasından sorumludur. Şekilleri aktive olup olmamalarına göre farklılık göstermektedir. Normalde bir ucu sivri şekilde olan trombositler pıhtılaşma sırasında aktive olduklarında oval bir şekil alırlar (Feldman vd. 2006). Balık lenfositleri büyük ya da küçük olabilir ancak lenfositlerin boyutu ile fonksiyonu arasında bir ilişki olup olmadığı henüz bilinmemektedir. Memelilerde olduğu gibi T, B ve non-spesifik sitotoksik lenfosit tipleri bulunmaktadır. Nötrofiller balıklarda dolaşımdaki en büyük hücrelerdir. Sitoplazmasının taneli bir yapı göstermesi ve çekirdeğinin bir çok türde böbrek şeklinde olmasıyla kolayca ayırtedilirler. Ancak bazı türlerde çekirdek loblu ya da segmentli bir görünümde olabilir (Terry ve Smith 2006). Eozinofil ve bazofiller bazı balık türlerinden bildirilmiştir. Eozinofillerin temel görevi parazitlerin öldürülmesi ve fagositozdur. Bazofil morfolojisi ve fonksiyonu hakkındaki 4

17 bilgiler oldukça sınırlıdır. Ancak memelilerdekine benzer bir fonksiyona sahip oldukları düşünülmektedir ve ayrıca her balık türünde nötrofil, basofil ve eozinofil tipine rastlanmadığı bildirilmektedir (Terry ve Smith 2006). Monositler genelde yuvarlak şekilli olup çekirdekleri de genelde at nalı şeklindedir. Sitoplazmasında bol miktarda vakuol gözlenebilir. Tıpkı memelilerde olduğu gibi balıklarda da monositler dokulara geçip makrofajlara dönüşürler. Monositler ve makrofajlar balıklarda temel fagositik hücrelerdir (Ellis 1977). Birçok araştırıcı balıklarda çeşitli toksik maddelerin ve çevresel koşulların balıkların kan parametrelerinde meydana getirdiği değişimleri incelemiştir. Aynı zamanda balıklarda stres sonucu kan parametrelerinin değiştiği de bilinmektedir (Sorengas vd. 1996, Yavuzcan vd. 2009, Yavuzcan ve Ergönül 2010). Balıklarda stres sonucunda adrenal bezlerden çeşitli hormonlar salınmaktadır ve bu hormonların balıkların immün sistemini baskılayabileceği gösterilmiştir. Stresin akut olması durumunda adrenal bezlerden epinefrin salınır. Bu hormon balığı canlı kalmak ve koşullara dayanmak için savaşmaya zorlayan fizyolojik değişimlere yol açar. Karaciğerdeki glikojen, hızlı ulaşılabilir bir enerji kaynağı görevi görür ve bu hormonun uyarısı ile glikojenolizis sonucu glikojen monomerlerine parçalanır. Beyin ve kasa giden kan akımı, daha atik hareket için artar. Bir kombinasyon olarak tüm bu reaksiyonlar, hayvanın strese karşı koymasına yardım eder. Ancak bu değişiklikler fazla sürerse vücudu fazla yorup kendileri bir stres kaynağı olacaktır. Akut stresin en belirgin belirtisi kan glukoz seviyesinin yükselmesidir (Watson ve McKeown 1976, Torres vd. 1986, Roche ve Boge 1996, Yavuzcan ve Pulatsü 1999, Chen vd. 2004, Ramesh vd. 2007, Yavuzcan ve Ergönül 2010). Stresi oluşturan durumun ya da koşulların uzaması durumunda stres kronik bir hal alır ve bu durumda yine böbrek üstü bezlerden kortizol salınır. Kortizol, epinefrin gibi, birçok fizyolojik değişikliğe neden olabilir. Salgılanma ve etki etme süresi fazla uzadığında metabolik dengesizliğe yol açar. Örneğin; protein yıkımında artış veya tiroid hormonlarında yükselmeye neden olabilir (Redding vd. 1984, Laidley ve Leattherland 2006) ki bu durum metabolizmayı hızlandırdığı için fiziksel tükenmeye neden olabilir. Kortizolün aynı zamanda immün sistem üzerinde direkt baskılayıcı etkileri de olabilmektedir. Kortizolün makrofajlarda oluşturulan lizozom membran 5

18 yapısını bozduğu ve fagositozu baskıladığı gösterilmiştir (Verstieg ve Giesy 1985, Köhler 1991, Witeska 2005). Genel olarak balıklarda türe göre değişmekle birlikte hematokrit seviyesi %20-45 arasında değişmektedir. Hemoglobin seviyesi memelilere oranla düşük olmakla birlikte genelde 5-10 g/dl arasındadır. Alyuvar sayısı ise diğer tüm kan parametreleri gibi tür, mevsim, cinsiyet, çevresel koşullara göre değişiklik göstermekle birlikte temelde balığın oksijen ihtiyacına göre farklılık gösterir. Örneğin buzullarda yaşayan balıklarda alyuvar sayısı hayli düşüktür. Sedenter balıklarda düşük seviyede olmasına karşın hızlı yüzen pelajik balıklarda ise hayli yüksektir. Ayrıca genel olarak daha aktif balıklarda hematokrit ve hemoglobin seviyesi daha yüksektir. Genel olarak balıklarda alyuvar sayısı 0.77 ile 4.96x10 6 /µl, akyuvar sayısı 10.1 ile 282x10 3 /µl, trombosit sayısı ise 7.6 ile 310 x10 3 /µl arasındadır (Terry ve Smith 2006). Balıklarda tüm bu kan parametreleri hastalık diyagnozunda ve balıkların çevresel değişimlere verdikleri yanıtın yorumlanmasında oldukça önemlidir. Bir çok araştırıcı çevresel değişimlerin izlenmesi için balıkların kan parametrelerinin incelenmesinin oldukça pratik ve güvenilir bir yöntem olduğunu savunmaktadır (Fajer-Avilla vd. 2003). Bu parameterlerden alyuvar sayısı, hematokrit ve hemoglobin miktarı oksijen gereksinimi belirlemek, lökokrit ve akyuvar sayısı ise balığın immün cevabı hakkında genel bir fikir edinmek için kullanılmaktadır (Blaxhall ve Daisley 1973, McLeay ve Gordon 1977). Balıklarda alyuvar sayısı, hematokrit ve hemoglobin seviyesi gibi parametrelerin hastalık (Barton ve Iwama 1991), çeşitli toksik maddelere maruz kalma (Shah ve Altındağ 2004a, Shah ve Altındağ 2005) ve stres (Yavuzcan ve Pulatsü 1999; Yavuzcan vd. 2009, Yavuzcan ve Ergönül 2010) gibi faktörlere göre değiştiği bildirilmektedir. Sedimentasyon oranı yine alyuvar hücreleri ile ilgili bir parametre olup hastalık (Wintrobe 1967), kirleticilere maruz kalma (Kori-Siakpere ve Ubogu 2008) gibi durumlarda değişebilmektedir. Ayrıca bir çok araştırıcı balıklarda stres, kimyasal maddelere maruz kalma ve hastalık gibi durumlarda pıhtılaşma ile ilgili parametrelerin (trombosit sayısı ve pıhtılaşma zamanı gibi) değişebileceğini bildirmektedir (Kawatsu 1986, Singh vd. 2008, Tavares-Dias ve Oliveira 2009). Kan glukoz seviyesi ise stres yanıtın en pratik ve hassas parametrelerinden biridir. Benzer şekilde balıkta oksijen 6

19 ihtiyacının karşılanamaması durumunda anaerobik metabolizma hızı artmakta ve glukoz yıkımı sonucu laktat seviyesi yükselmektedir (Burggren ve Cameron 1980, Sancho vd. 1997, Wells ve Pankhurst 1999). Total protein ve albumin seviyesi ise balığın metabolizması hakkında genel bir fikir edinmek için kullanılmaktadır (örneğin, stres koşulları altında katabolizmanın arttığı ve albumin ve total protein seviyesinin azaldığı bilinmektedir) (Çelik 2006). Seruloplazmin ise bir akut faz proteini olup enfeksiyon gibi durumlarda miktarı artmaktadır (Cousins 1985). 1.2 Toksisite Deneyleri ile İlgili Tanımlar Toksikoloji: Kimyasal maddelerin biyolojik dokulara kantitatif tesirlerinin mekanizmalarıyla birlikte araştırılmasını inceleyen ve elde edilen bilgilerden insan populasyonuna ve çevreye zararları ve etkileri hakkında tahmin yapılmasını temin eden bilim dalıdır (Anonim 1988). Toksik madde: Organizmada şekillenen veya dışarıdan organizmaya giren, kimyasal yapıları dolayısıyla canlının organ veya dokularını etkileyebilen ve canlının sağlığında geçici veya sürekli olarak olumsuz etki gösteren maddelerdir. Toksisite: Organizmalar üzerinde tehlikeli etkilere neden olan bir maddenin mevcut durumu veya kapasitesidir. Bu maddeler genellikle zehirli maddeler ve kirleticilerdir. Akut toksisite deneyleri: Deney organizmalarında saat gibi kısa sürelerde olumsuz değişikliğe sebep olan deney konsantrasyonlarını belirleme işidir. Kronik toksisite deneyleri: Deney organizmalarında 1-3 hafta veya daha uzun sürelerde olumsuz değişikliğe sebep olan deney konsantrasyonlarını belirleme işidir. Ortalama öldürü konsantrasyon (LC 50 ): Tatbik edildiği organizmaların yarısını belirli bir zaman diliminde öldüren konsantrasyondur. 7

20 Toksik doz: Mortalite gözlenmemekle birlikte, zehirlenme belirtilerine sebep olan dozdur. Akut toksisite: Tek dozda, 24 saatlik süre içinde gözlenen zehirliliktir. Kronik toksisite: Genellikle 3 hafta veya daha uzun süreli denemelerde gözlenebilen zehirliliktir. Biyodeneyler: Çeşitli maddelerin toksisitesini tespit etmek, müsade edilebilir limitlerini tayin etmek ve çeşitli sucul canlıların izafi hassasiyetlerini ortaya koymak ve sıcaklık, ph, sertlik gibi fiziksel ve kimyasal değişkenlerin toksisite üzerine etkilerini tanımlamak üzere yürütülür (Anonymous 1971, 1977). Biyodeneyler zehirli maddelerin ortama bir defaya mahsus olmak üzere deney başlangıcında veya devamlı olarak verilmesine göre iki tiptir: Statik ve sürekli. Statik akut deneylerde, deney çözeltisi ve deney organizmaları uygun bir akvaryuma yerleştirilir ve deney süresince bekletilir. Uzun süreli deneylerde oksijen azalması ve özellikle de metabolik atıklar önemli bir sorun oluşturduğundan, statik akut deneyler genellikle 96 saat veya daha kısa sürelidir (Anonim 1988). Daha uzun süreli deneylerde ortamdaki suyun kısmen yenilenmesi ve uygun miktarda maddenin ortama tekrar eklenmesi gerekir. Sürekli deneylerde ise ortamdaki su akvaryumun bir tarafından akarken diğer tarafından boşalır ve özel düzenekler vasıtasıyla kontrollü bir şekilde, suyun akış ve çıkış hızı göz önüne alınarak, ortama maddenin uygun konsantrasyondaki çözeltisi sürekli olarak eklenir. LC 50 tayin metodu: Bu metodun prensibi 24, 48, 72 veya 96 saat gibi bir süre boyunca toksik madde bulunan bir ortamda canlıların %50 sini öldürebilen maddenin konsantrasyonunun tayin edilmesidir (Vural 1996). Buna göre katı maddeler için doz ağırlık, sıvı maddeler için ise hacim olarak verilir. Gazlar için doz birimi içinde bulunduğu gaz karışımındaki konsantrasyonu olarak (hacim/hacim) şeklinde verilir. 8

21 Toksik maddelerin konsantrasyonu suda düşük miktarlarda olduğu zaman mortalite gözlenmeyebilir veya mortalite oranı çok düşük olabilir. Toksik madde konsantrasyonu arttıkça mortalite oranı da artar ve belirli bir konsantrasyondan sonra canlıların tümü ölür. Bu tip denemelerde toksik madde konsantrasyonu ile mortalite oranı arasında sigmoid bir ilişki vardır. Bu sigmoid eğri üzerinde interpolasyon yolu ile LC 50 nin hesaplanması mümkündür. Ancak bu değer tahmini bir değerdir. Toksik konsantrasyonların doğal logaritmaları ile ölüm oranlarının probitleri arasında doğrusal bir ilişki bulunduğundan probit regresyon doğrusunun hesaplanması ile LC 50 nin bulunması daha doğru sonuç verir (Düzgüneş ve Düzgüneş 1958). 1.3 Çinko ile İlgili Bilgiler Çinko ilk olarak M.Ö yıllarında Çinliler ve Romalılar tarafından alaşım materyali olarak, prinç yapımında kullanılmıştır. Çinko metali hakkında ilk bilimsel çalışmalar Paracelsus ( ) tarafından yapılmıştır. Günümüzde çinko; çelik, alüminyum ve bakırdan sonra dünyada miktar olarak yıllık tüketimi en fazla olan metaldir. Kimyasal yönden aktif olması ve diğer metallerle kolayca alaşım yapabilmesi nedeniyle çinko, endüstride birçok alaşımın ve bileşiğin üretiminde kullanılmaktadır. Kuvvetli elektropozitif özelliğinden dolayı diğer metallerin özellikle demir-çelik ürünlerinin aşınmaya karşı korunmasında kullanılmaktadır. Çinko, sembolü Zn, atom ağırlığı g/mol ve atom numarası 30 olan gümüş renkli bir metaldir. Elementlerin periyodik tablosunda geçiş elementleri grubunda yer alır. Yerkabuğunda en çok bulunan elementler arasında 23. sıradadır. Çinko, bileşiklerinde + 2 değerlikli olarak bulunur. Oluşturduğu bileşiklerde genelde iyonik bağ yapar ve toz halde çok etkili bir ingirdeyicidir. Yoğunluğu 7.14 g/cm 3, erime sıcaklığı C, kaynama sıcaklığı ise 906 C dir. Dökülmüş halde sert ve kırılgandır. Elektrokimyasal potansiyel dizisinde demirden daha negatif değerdedir. Böylece çinko anot olarak katodik korozyon korumada önemli bir kullanım alanı bulur. Galvanizleme bu tür uygulamalardan biridir. 9

22 Genel olarak çinko mineralleri altı grup altında sınıflandırılmaktadır. Sülfürler, sülfatlar, karbonatlar, silikatlar, oksitler ve diğer mineraller Çinkonun başlıca kullanım alanları ise şunlardır: - Korozyondan korunma amacıyla, çelik gibi diğer metallerin galvanize edilmesinde, - Pirinç, nikelli gümüş, değişik lehimler, alman gümüşü gibi alaşımların yapımında, - Genellikle otomotiv endüstrisinde döküm kalıplarında, - Pillerin gövdelerinin yapımında kullanılır. - Çinko oksit, sulu boyalarda beyaz pigment olarak ve lastik sanayinde aktivatör olarak kullanılır. Reçetesiz satılabilen bazı merhemlerin bileşiminde bulunur ve ince bir tabaka halinde uygulandığında cildin su kaybetmesini önler. Yazın güneş, kışın da soğuk yanıklarına karşı koruyucudur. Bebeklerin bez bağlanan bölgelerinde çok az miktarda kullanılarak ciltte meydana gelebilecek kızarıklıklar önlenebilir. Yaşa bağlı göz hastalıklarının tedavisinde de kullanılır. - Çinko klorür (ZnCl 2 ), deodorantlarda, yara merhemlerinde ve ahşap koruyucu olarak kullanılır (Addemir vd. 1994). Canlılarda hücrelerin proliferasyon, replikasyon ve farklılaşması için aminoasitler, glukoz, yağ asitleri ve vitaminler yanında minerallere de ihtiyaç vardır. Çinko, organizma için esasiyel bir mineraldir ve bir çok metaloenzimin hem yapısına girer hem de bu enzimlerin fonksiyonlarını düzenler (Valee ve Auld 1990). İntraselüler bir düzenleyici olup, moleküler etkileşimlerde proteinler için yapısal destek sağlar. Biyolojik membranların ve iyon kanallarının stabilitesini ve bütünlüğünü korur. Nükleik asit veya diğer gen düzenleyici proteinlerde yapısal element olarak rol oynar. Redoks aktivitesinin olmaması nedeniyle bağlandığı proteini dayanıklı hale getirir. Karbonhidrat, protein, lipid, nükleik asit, Hem sentezi, gen ekspresyonu, üreme ve embriyogeneziste de görevleri vardır. Çinkonun serbest radikal oluşumu ve oksidatif stresten koruyucu rolü vardır. Oksidatif hasarın neden olduğu kütanöz ve romatolojik inflamatuar hastalıklar, alkolizm, karaciğer sirozu ve kardiyovasküler hastalıkların patogenezinde rol oynar. Çinko diğer taraftan yara iyileşmesinde de oldukça önemli role sahiptir. Bağ dokusunun biyosentezi ve integrasyonu için çinko gereklidir. Bu nedenle 10

23 cerrahi operasyonlar sonrası yeterli oranda çinkonun alınması önem taşımaktadır (Vallee ve Falchuk 1993). Çinko organizmada demirden sonra en çok bulunan eser elementtir. 70 kg ağırlığındaki bir insanda yaklaşık gr çinko bulunur. Çinko kanda, çoğunlukla albümin (%60-70), α2-makroglobülin (%30-40) ve daha düşük oranda da transferin ve serbest amino asitlerle taşınmaktadır. Bağırsaklardan emilen çinko, transferrine bağlı olarak karaciğere taşınır. Çinko'nun en hızlı birikimi ve dönüşümü karaciğer, böbrek ve dalakta gerçekleşir. Eritrositlerde çinko başlıca karbonik anhidraz ve diğer bazı enzimlerin yapısında bulunur. Serumda çinko konsantrasyonu, plazmadakinden yaklaşık %16 daha yüksektir. Bu fark; pıhtılaşma sırasında trombositlerin parçalanmasına, plazma dilüsyonunun hafifçe yüksek olmasına, ve hemolize bağlıdır (Berg ve Shi 1996). Çinko biyolojik membranlardan pasif difüzyonla geçemez. Bu nedenle çinkonun hücreye alınması veya hücreden dolaşıma geçmesi için özel taşıyıcı sistemler gerekmektedir (McMahon ve Cousins 1998). 1.4 Çinko ile İlgili Çalışmalar Balıklar için besinlerde belirli oranlarda çinko bulunmasının şart olduğu bildirilmektedir ve bu oran balıkların büyük bir çoğunluğu için 20 mg Zn / kg kuru yem civarındadır (Clearwater vd. 2002). Çinko nispeten non-toksik bir element olduğu kabul edilmesine rağmen, diğer tüm ağır metaller gibi yüksek dozlara maruz kalmak toksik etki gösterir (Borovansky vd. 1997, Chukhlovin vd. 2001, Wood 2001). Çinkonun toksik etkilerini esasen demir metabolizması üzerinden gösterdiği düşünülmektedir. Aşırı çinko yüklemesinde karaciğer ve böbrekteki çinko seviyesi belirgin bir şekilde artarken, demir seviyesinin düştüğü ve buna paralel olarak demir içeren enzimlerin aktivitesinin de düşebileceği bildirilmektedir. Ayrıca kronik uygulamalarda anemiye yol açabildiği ve meydana gelen aneminin aslında demir eksikliğinden kaynaklandığı öne sürülmektedir. Çinkonun ayrıca bakır metabolizması üzerinde de etkisi olduğu ama gözlenen olumsuz etkilerin asıl sebebinin demir 11

24 eksikliğine, özellikle de çinkonun ferritin üzerindeki etkisine (Smith ve Larson 1946) bağlı olduğu vurgulanmaktadır (Gallagher 1957, Dempsey vd. 1958). Shaw vd. (2006) Daphnia magna ile yaptıkları çalışmada çinko (ZnCl 2 ) için 48 saatlik LC 50 değerini 12.5 µmol/l olarak bulmuşlardır. Çalışmada kullanılan suyun fizikokimyasal özellikleri bildirilmemiştir. Thorp ve Lake (1974) bir tatlısu karidesi olan Paratya tasamaniensis için 96 saatlik LC 50 değerini 1.1 mg/l olarak bulmuştur. Palaemonetes pugio adlı karides türünde yapılan bir çalışmada çinko için 48 saatlik LC 50 değeri 11.3 mg/l olarak bildirilmiştir (Burton ve Fisher 1990). Devi (1987), Uca annulipes adlı denizel yengeçlerde yaptığı çalışmada ağır metal kirliliği olan bir bölgeden toplanan yengeçler için 96 saatlik LC 50 değerini 76.9 mg/l olarak kaydederken, temiz bir bölgeden toplanan yengeçler için bu değeri 31.9 mg/l olarak saptamıştır. Matthiesen (1973), yaptığı çalışmada Gastrosteus aculeatus un distile suda mg Zn 2+ ya maruz bırakılmasının balıkların 1-3 gün içerisinde ölümüne yol açtığını ancak sert suda mg Zn 2+ nın 700 saatlik bir süre boyunca balıklarda herhangi bir toksik etki göstermediğini kaydetmiştir. Bengtsson (1974), Phoxinus phoxinus ta yaptığı bir çalışmada ppm Zn 2+ ya maruz bırakılan balıkların 150 günlük süre sonunda kontrol grubuna oranla çok daha yavaş büyüme gösterdiğini tespit etmiştir. Araştırmacı aynı zamanda juvenillerin, erginlere oranla çinkoya daha duyarlı olduğunu vurgulamıştır. Çinkonun sub-lethal konsantrasyonlarının uzun süreli uygulanmasının Poecilia reticulatus, Pimaphales promelas ve Lebistes reticulatus gibi balıklarda da büyümeyi olumsuz etkilediği bildirilmiştir (Brungs 1969, Crandall ve Goodnight 1962). Bu durumun çinko verilen balıklarda iştahın azalmasına ve/veya tat reseptörlerinin bozulmuş olmasına bağlı olabileceğini öne sürmüştür. Ancak diğer taraftan çinkonun, karaciğer mitokondrisinde 12

25 inorganik fosfatın organik fosfata dönüştürülmesini bozduğu ve dokulara oksijen alınımını inhibe ettiği bulunmuştur (Hiltibran 1971). Spehar (1976), juvenil Jordanella floridae için 96 saatlik LC 50 değerini 1.5 mg/l olarak bulmuştur. Watson ve McKeown (1976) ppm çinkoya maruz bıraktıkları Salmo gairdneri de Zn uygulamasının balıklarda 7. güne kadar glukoz seviyesini arttırdığını, ancak sonraki dönemde glukoz seviyesinin normale döndüğünü tespit etmiştir. Chapman (1978a), Oncorhynchus nerka da çinko için 96 saatlik LC 50 değerini 749 µg/l olarak bulmuştur. Chapman ve Stevens (1978), O. kisutch ve Salmo gairdneri de çinko için 96 saatlik LC 50 değerlerini sırasıyla 905 ve 1755µg/l olarak bulmuşlardır. Lindan vd. (1979) Alburnus alburnus için ZnSO 4 ün 96 saatlik LC 50 değerini 42 mg/l, ZnCl 2 için ise 96 saatlik LC 50 değerini 32 mg/l olarak bildirmiştir. Thompson vd. (1980) Lepomis macrochirus adlı balık türünde yaptıkları çalışmada su sertliğinin , alkalinitenin ise mg CaCO 3 /l olduğu koşullarda çinko (ZnSO 4.7H 2 O) için 96 saatlik LC 50 değerini 3.6 mg/l olarak bulmuşlardır. Spear (1981) yaptığı çalışmada sudaki CaCO 3 konsantrasyonunun 20 den 360 mg/l ye çıkarılmasının Pimaphales promelas için 96 saatlik LC 50 değerini 0.87 den 33.4 mg/l ye çıkardığını bulmuştur. Aynı koşullar Lepomis macrochirus için 96 saatlik LC 50 değerini 5.4 ten 40.1 mg/l ye çıkmasına yol açmıştır. Lovegroove ve Eddy (1982), Salmo gairdneri de yaptıkları bir çalışmada Ca 2+ sertliği 7.5 mg/l olan suda çinko için 72 saatlik LC 50 değerini 2.0 mg/l olarak bulmuşlardır. 13

26 Khangarot vd. (1984), C. carpio da yaptıkları bir çalışmada ph ı 6.3 ve Ca 2+ sertliği 7.1 mg/l olan suda çinko için 24 ve 48 saatlik LC 50 değerlerini sırasıyla 9.04 ve 7.28 mg/l olarak bulmuşlardır. Abbasi ve Soni (1986) Nuria denricus ta yaptıkları çalışmada 24 saatlik LC 50 değerini 3.67 mg/l olarak kaydetmişlerdir. Çalışmada ayrıca Ca 2+ sertliğinin 3.0 mg/l olduğu belirtilmiştir. Torres vd. (1986), Scyliorhinus canicula da yaptıkları çalışmada balıkları stres, stres+çinkoya 1 gün maruz bırakmış ve bazı kan parametrelerini incelemiştir. Çalışmada stres faktörü olarak balıklara elle müdahele, transport gibi işlemler uygulanmıştır. Verilen çinko miktarı ise 80 mg/l dir. Çalışma sonunda stresin balıklarda hematokrit, hemoglobin, alyuvar sayısı, lökokrit seviyesinde düşüşe yol açtığı, stres+çinkoya maruz bırakılan balıklarda ise bu düşüşün daha da fazla olduğu bulunmuştur. Stres sonucu kan parametrelerinde görülen bu düşüşün hemodilusyondan kaynaklanabileceği öne sürülmüştür. Smit vd. (1979) hemodilusyonun, dolaşım sistemine giren irrite edici maddelerin konsantrasyonlarının düşürülmesi için geliştirilmiş bir mekanizma olduğunu bildirmiştir. Çinkonun toksisitesi embriyo safhasından eksojen besin alma aşamasına kadarki sürede artmakta ve juvenil evreden ergin evreye doğru giderek azalmaktadır. Meisner ve Hum (1987), Salmo gairdneri de yaptıkları çalışmada çinko için 96 saatlik LC 50 değerlerini juveniller için 2.6 mg/l, ergin bireyler için ise 2.4 mg/l olarak bulmuşlardır. Çalışmada çinko kaynağı olarak ZnSO 4.7H 2 O kullanılmıştır ve suyun CaCO 3 sertliği 140 mg/l olarak bildirilmiştir. Mishra ve Srivastava (1979) ise 100 ppm çinkoya 90 saat süreyle maruz bırakılan Colisa fasciatus da alyuvar ve akyuvar sayısı, hematokrit ve lökokritin düştüğünü, trombosit sayısı, pıhtılaşma süresi ve hemoglobin seviyesinin değişmediğini, sedimenatasyon oranının ise arttığını bulmuştur. 14

27 Flos vd. (1987) çinkoya maruz bıraktığı balıklarda (S. canicula) lökosit sayısının arttığını bulmuştur. Hilmy vd. (1987) Tilapia zilli ve Clarias lazera balıklarında yaptıkları bir çalışmada su sıcaklığının çinko (ZnSO 4.5H 2 O) toksisitesi üzerinde etkili olduğunu bulmuşlardır. Yaptıkları çalışmada 18 C de T. zilli için 96 saatlik LC 50 değerini 21 mg/l olarak bulurken, 25 C de 13 mg/l olarak bulmuşlardır. Yine benzer olarak C. lazera için 18 C de 38 mg/l, 25 C de ise 26 mg/l olarak bulmuşlardır. Araştırmacılar ayrıca T. zilli yi 32 mg/l lik, C. lazera yı ise 22 mg/l lik çinkoya 96 saat süreyle maruz bırakmış ve hematoktrit ve hemoglobin seviyesinin her iki balıkta da 24. saate kadar düşüş gösterdiği ve 96. saatin sonlarına doğru tekrar yükseldiği, alyuvar sayısının ise başta değişim göstermediği ancak 96. saat sonlarına doğru artış gösterdiğini bulmuşlardır. Çalışmada aynı zamanda kas ve karaciğer dokusundaki laktik asit miktarı da ölçülmüş ve her iki balıkta da her iki dokuda da laktik asit miktarının aşırı bir artış gösterdiği bulunmuştur. Bu durumu çinko toksisitesinin anaerobik metabolizmayı hızlandırması şeklinde yorumlamışlardır. Spry vd. (1988), 3-4 g ağırlığa sahip Salmo gairdeneri de yaptıkları 16 haftalık bir çalışma sonucunda yüksek çinko (700 µg/g besin) içeren besinlerin ve/veya suya yüksek oranda çinko (590 µg/l) uygulanmasının hematokrit değerlerinde belirgin bir farklılığa yol açmadığını tespit etmişlerdir. Grobler vd. (1989) Tilapia sparrmanii de yaptıkları çalışmada çinkoya (98 mg/l) maruz bırakılan balıkların oksijen tüketim oranının düştüğünü tespit etmişler ve bu durumun solungaçlarda mukus birikimi ve/veya solungaçlarda meydana gelen yapısal hasar sonucu gelişmiş olabileceğini vurgulamışlardır. Aynı zamanda yüksek konsantrasyonlarda çinkoya maruz bırakılan balıklarda laktik asit seviyenin de yükseldiği bildirilmiştir (Grobler 1988). Gehrke (1988) çinkonun solungaç yüzeyinde oksijen alış-verişini bozduğunu ve 10 ve 20 mg/l lık çinkoya maruz bırakılan balıklarda (Leiopotherapon unicolor) bunu takiben hiperventilasyon ve bradikardi gözlendiğini kaydetmiştir. 15

28 Gatlin vd. (1989), Ictalurus punctatus ta yaptığı bir çalışmada yeme çinko karıştırılmasının balık üzerindeki etkilerini 12 hafta süreyle incelemiştir. Çalışma sonunda verilen çinko miktarı arttıkça hematokrit değerinin düştüğü ancak hemoglobin miktarında belirgin bir değişim olmadığı saptanmıştır. Knox vd. (1982) ise gökkuşağı alabalıklarında yaptığı çalışmada yeme yüksek oranda çinko karıştırılmasının hem hematokrit hem de hemoglobin değerlerini düşürdüğünü bulmuşlardır. Bununla birlikte bu değişimlerin balık sağlığı üzerinde çok önemli etkileri olmadığını belirtmişlerdir. Gatlin vd. (1989) yaptığı çalışmada aynı zamanda karaciğerde çinko, bakır ve demir birikimini de incelemiş ve balıkların yemine karıştırılan çinko miktarı arttıkça karaciğerdeki demir seviyesinin düştüğünü, bakır seviyesinin ise önemli bir değişim göstermediğini kaydetmiştir. Burton ve Fisher (1990), Fundulus heteroclitus ta yaptıkları çalışmada çinko için 48 saatlik LC 50 değerini 96.5 mg/l olarak saptamışlardır. Çalışmada kullanılan suyun ph aralığı olarak bildirilmiştir. Aynı balık türü için 8 günlük LC 50 değeri ise mg/l olarak bulunmuştur (Eisler ve Hennekey 1977). Hogstrand ve Wood (1995) balıkların çinkoya maruz bırakılmasının kalsiyum (Ca 2+ ) alınımını inhibe etmesi olduğunu göstermişlerdir. Diğer taraftan kalsiyumun da benzer şekilde çinko alınımını inhibe ettiği gösterilmiştir. Gomez vd. (1998) Cnesterodon decemmaculatus adlı tatlısu balıklarında yaptıkları çalışmada çinko (çalışmada çinko kaynağı olarak ZnCl 2 kullanılmıştır) toksisitesi üzerine su sertliği (HCO 3 ), elektriksel iletkenlik ve ph ın etkilerini araştırmışlar ve çalışma sonunda suyun sertliği ve elektiriksel iletkenliği arttıkça 96 saatlik LC 50 değerlernin de yükseldiğini bulmuşlardır. HCO 3 içeriği 58 mg/l ve elektriksel iletkenliği 713 µs/cm olan suda lethal konsantrasyonu 12.4 mg/l bulurken, HCO 3 içeriği 106 mg/l, elektriksel iletkenliği 695 µs/cm olan suda lethal konsantrasyonu 40.6 mg/l olarak bulmuşlardır. Buthelezi ve Wepener (2000) 40 µg/l lik çinkoya 96 saat süreyle maruz bıraktıkları O. mossambicus adlı balık türünde çinko toksisitesi ve sıcaklık arasındaki ilişkiyi 16

29 araştırmış aynı zamanda çinkonun bazı kan parametreleri üzerindeki etkilerini incelemişlerdir. Witeska ve Kosciuk (2003) 75 g ağırlığında sazan balıkları (C. carpio) kullanarak yaptıkları bir çalışmada balıkları 3 saat süreyle 20 g/dm 3 lük çinkoya (ZnSO 4 ) maruz bırakmışlar ve balıkların 0, 24, 48 ve 96 saat süreyle kan parametrelerini incelemişlerdir. Çalışmada çinkoya maruz bırakılan balıklarda hematokrit değerinin arttığını, alyuvar sayısının değişmediğini dolayısıyla hematokritte gözlenen bu artışın alyuvarların şişmesinden kaynaklandığını ve bunun da çinkonun eritrosit zarı geçirgenliğini bozmasından kaynaklanabileceğini bulmuşlardır. Çalışmada ayrıca akyuvar sayısının 0 anında arttığı ancak daha sonra ani bir düşüş gösterdiği kaydedilmiştir. Trombosit sayısı da akyuvar sayısına oldukça benzer bir şekilde değişim göstermiştir. Ancak çalışmada sayımlar smearlerden yapılmıştır. Hattink vd. (2006), çinko (ZnCl 2 ) toksisitesi üzerine yaptıkları çalışmada sazan balıkları (C. carpio) için normoksik koşullarda 96 saatlik LC 50 değerini 149 µmol/l, hipoksik koşullarda ise 55 µmol/l olarak kaydetmişlerdir. Gioda vd. (2007) Leporinus obtusidens adlı balık türünde yaptıkları çalışmada, su sertliğinin 22, alkalinitenin ise 42.3 mg CaCO 3 mg/l olduğu koşullarda çinko (ZnSO 4.5H 2 O) için 96 saatlik LC 50 değerini 23.6 mg/l olarak bulmuşlardır. Çalışmada ayrıca balıklar 45 gün süreyle lethal konsantrasyonun %10 ve 20 sine maruz bırakılmış ve bazı kan parametreleri incelenmiştir. Deneme sonunda her iki konsantrasyonda da alyuvar sayısı, hematokrit ve hemoglobin seviyesinin düştüğü, akyuvar sayısının ise değişmediği tespit edilmiştir. Gündoğdu (2008), gökkuşağı alabalıklarında yaptığı çalışmada suyun sertliğini mg/l CaCO 3, ortlama balık ağırlığını 3.02 g olarak vermiş ve çinko klorür (ZnCl 2 ) için 96 saatlik LC 50 değerini mg/l olarak bulmuştur. 17

30 Öner vd. (2008) 5, 10, 20 ve 30 gün süreyle çinkoya (ZnCl 2 ) maruz bıraktıkları nil tilapyalarında (O. niloticus) serum total protein seviyesinin değişmediğini tespit etmişlerdir. Kori-Siakpere ve Ubogu (2008) Heteroclarias sp. adlı balık türünde yaptıkları çalışmada su sertliğinin 124.5, alkalinitenin ise 32.8 mg CaCO 3 /l olduğu koşullarda balıkları 15 gün boyunca 5 ve 10 mg/l lik çinkoya (ZnSO 4.7H 2 O) maruz bırakmışlardır. Çalışma sonunda her iki deneme süresinde de alyuvar sayısı, hematokrit, hemoglobin ve plazma total protein seviyesinin düştüğünü, akyuvar sayısının ise 5 mg/l lik dozda değişmediğini ancak 10 mg/l lik dozda hafif bir düşüş gösterdiğini, eritrosit sedimentasyon oranının ise çok hafif bir artış gösterdiğini ancak bunun istatistiksel açıdan önemli olmadığını kaydetmişlerdir. Ololade ve Ogini (2009) Clarias gariepinus adlı balık türünde yaptıkları çalışmada, alkalinitenin 193.3, sertliğin ise mg CaCO 3 /l olduğu suda çinko (ZnSO 4.7H 2 O) için 96 saatlik LC 50 değerini 36.7 mg/l olarak bulmuşlardır. Çalışmada aynı zamanda balıklarda rengin aşırı koyulaşması, hızlı ve ani çırpınma hareketleri, denge kaybı ve genel halsizlik gibi belirtiler de kaydedilmiştir. Ayrıca balıklar 30, 35, 40, 45 ve 50 mg/l lik çinkoya 96 saat süreyle maruz bırakılmış ve bazı kan parametreleri incelenmiştir. İncelenen parametrelerden alyuvar sayısı, hematokrit, hemoglobin seviyesi ve lökosit sayısının doz arttıkça düştüğü, trombosit sayısının ise 30 ve 35 mg/l lik konsantrasyonlarda düştüğü 40 mg/l lik konsantrasyonda yükseldiği, 45 ve 50 mg/l lik konsantrasyonlarda ise kontrol grubu değerlerinden farklı olmadığı saptanmıştır. Dobreva vd. (2008) havuz balıklarında (Carassius gibelio) yaptıkları bir çalışmada balıkları 0.5, 1.0, 15. v 2.0 mg/l çinkoya (ZnSO 4.7H 2 O) maruz bırakmışlar ve 96 saat süreyle balıkların solunum oranlarını incelemişlerdir. Çalışma sonunda tüm doz gruplarında balıkların solunum oranının kontrol grubuna oranla önemli ölçüde düştüğünü tespit etmişlerdir. 18

31 Garg vd. (2009) Labeo rohita, Cirrhinus mrigala ve Catla catla adlı balık türlerinde yaptıkları çalışmada balıkları 45 gün süreyle 0.02, 0.04 ve 0.06 mg/l lik çinkoya maruz bırakmışlar ve çalışma sonunda balıkların kas dokusunda lipid ve karbohidrat içeriğinin belirgin ölçüde azaldığını kaydetmişlerdir. Fırat ve Kargın (2010) 0.5 mg/l lik çinkoya 7 ve 14 gün süreyle maruz bıraktıkları nil tilapyalarında (O. niloticus) albumin, seruloplazmin, plazma glukoz ve total protein seviyesinin her iki deneme süresinde de kontrol grubuna oranla yüksek olduğunu bulmuşlardır. Memelilerde çinko toksisitesi üzerine yapılmış çalışmalara bakıldığında, çinkonun temel olarak plasma albumin proteinine ve daha az miktarda α2-makroglobuline bağlandığı belirtilmektedir (Cousins 1985, Bettger vd. 1987) ve eritrosit sitosolünde yer alan çinkonun predominant olarak çinko metaloenzimlere, karbonik anhidraza ve Cu- Zn-dismutaz enzimine bağlandığı ancak bir miktar çinkonun hemoglobine bağlandığı bilinmektedir (Gardiner vd. 1984, Ohno vd. 1985). Ayrıca çinko seviyesinin eritrosit membranlarında alyuvarlardan 3-4 kat daha yüksek oranlarda olduğu saptanmıştır (Bettger vd. 1987). Cox ve Harris (1970) yaptıkları çalışmada 3 hafta süreyle yemlerine % 0.6 oranında çinko karıştırılan sıçanlarda hemoglobin miktarı ve hematokrit değerlerinin düştüğünü gözlemişlerdir. Gözlenen bu aneminin 14. günden itibaren belirginleştiği ve deneme bittikten 6 hafta sonra bile hemoglobin değerinin normale dönmediği saptanmıştır. Bununla birlikte hayvanlarda büyümenin de oldukça yavaşladığı kaydedilmiştir. Settlemire (1967), sıçanlarda yaptıkları çalışmada yeme % 0.75 oranında çinko katılmasının hemoglobin miktarını kontrol grubunun yarı seviyesine kadar düşürdüğünü, eritrosit ozmotik frajilitesini azalttığı ve eritrosit ömrünü kısalttığı gözlemiştir. Chandra (1984), insan deneklerde yaptığı bir çalışmada oral yoldan aşırı çinko alınımının lenfosit fonksiyonlarını bozduğunu ve bakterisidal kapasitenin azaldığını kaydetmiştir. 19

32 1.5 Bakır ile İlgili Bilgiler Bakır insanların eski çağlardan beri çeşitli amaçlarla kullandığı ve günümüzde de sanayinin temel girdileri arasında yer alan önemli metallerden biridir. Endüstride bakırın önemli rol oynamasının ve çeşitli alanlarda kullanılabilmesinin nedeni, çok çeşitli özelliklere sahip olmasıdır. Bakırın en önemli özellikleri arasında yüksek elektrik ve ısı iletkenliği, aşınmaya karşı direnci, dövülebilme özelliği ve antikorozif özellikleri sayılabilir. Ayrıca alaşımları çok çeşitli olup endüstride değişik amaçlı kullanılmaktadır. Günümüzde tüketimi 13 milyon tonun üzerine çıkan bakır en çok kullanılan ikinci metal durumuna gelmiştir. Yüksek elektrik ve ısı iletkenliği özellikleri bakırı, elektrik santralları ve iletken malzemenin vazgeçilmez girdisi haline getirmektedir. Soğuk hava makina ve teçhizatında, paslanmaz özelliğinden ötürü nakliye vasıtalarında ve dış kaplamalarda bakırın büyük kullanım alanları bulunmaktadır. Bunlara ilaveten bakırın kaynak işlerinde, metalurjide ve bronz üretiminde önemli yeri vardır. Bakır sembolü Cu, atom ağırlığı g/mol, atom numarası 29, kırmızımsı bir renge sahip bir geçiş grubu elementidir. Bileşiklerinde + 1 veya + 2 değerlikli olarak bulunabilir. Yoğunluğu : 8.93 gr/cm 3, erime noktası 1083 C, kaynama noktası ise 2300 C dir. Bakır doğada genellikle sülfürlü, oksitli ve kompleks halde bulunur. Yeryüzündeki suların neredeyse tamamı bir miktar bakır içermektedir ve bakır yerkabuğunun % sını oluşturmaktadır. Genel olarak toprakta µg, suda ise µg/l aralığında bulunur (Brooks 2000). Bakırın Kullanım Alanları ise; - Elektrik ve elektronik sanayi - İnşaat sanayi - Ulaşım sanayi - Endüstriyel ekipmanlarda - Askeri ve diğer sanayi kolları vb. 20

33 Bakır yaşayan bütün sistemlerin yaşamsal faaliyetlerinde gerekli bir elementtir. Bu yüzden vücutta demir ve çinkodan sonra en fazla bulunan iz elementtir. Bakır omurgalılarda demir transportu, oksidatif enzim aktivitesi ve hemoglobin sentezi gibi bir çok biyolojik olayda görevlidir (Sorensen 1991). Ayrıca immün sistem, sinir sistemi, iskelet sisteminin yapısı ve fonksiyonları için, normal hücresel homeostazisin ve sağlığın devamı için gerekli olan metal içeren enzimlerin ve proteinlerin kofaktörü olarak, biyokimyasal fonksiyonlar ve temel fizyolojik fonksiyonlar için gereklidir. Bakır içeren en önemli enzimler sitokrom c-oksidaz, süperoksit dismutaz ve seruloplazmindir. Normal olarak bakır kanda seruloplazmine ve çok az miktarda da albumine bağlanır. Vücutta en çok bakır içeren dokular karaciğer, kalp, beyin ve böbrektir. Kas ve kemik vücuttaki toplam bakırın %50 sini içerirler. Bakır biyolojik sistemlerde 1 ve 2 değerlikli olmak üzere iki farklı biçimde bulunabilir. Dokulardaki bakırın çok düşük konsantrasyonları anemiye yol açarken, çok yüksek konsantrasyonları karaciğer hasarına yol açmaktadır. Memelilerde bakırın yüksek konsantrasyonuna maruz bırakılan bireylerde magnezyum yetersizliği sendromları görüldüğü bildirilmiştir ve magnezyum hemoglobin sentezini stimule etmektedir (Lontie 1984). Bakır bileşikleri uzun yıllardır balık hastalıklarını önlemede profilaktik amaçlı olarak ve balık parazitleri ile mücadelede kullanılmasının yanı sıra havuzlarda alg gelişimini önlemek amacıyla da kullanılmaktadır (Moore vd. 1984, Straus ve Tucker 1993). Ayrıca bakır sülfat bileşiği bir pestisit olarak değerlendirmektedir (Anonymous 2003). 1.6 Bakır ile İlgili Çalışmalar Bakır esasiyel bir ağır metal olması sebebiyle optimum balık gelişimi için balık diyetlerinde belirli oranlarda bulunmak zorundadır. Örneğin gökkuşağı alabalıkları (O. mykiss) için bu oran 3 µg Cu / g kuru yem olarak bildirilmiştir, ancak 730 µg Cu / g kuru yem ve üzerindeki dozların sub-lethal toksik etkileri olduğu saptanmıştır. (Clearwater vd. 2002). Ayrıca balıklarda bakırın suya karıştırılmasının diyete karıştırılmasından daha hızlı etki ettiği ve dolayısıyla suda solungaçların bakır 21

34 alınımından esas sorumlu organ olabileceği belirtilmektedir. Besin yoluyla alınan bakır ise en fazla karaciğer ve böbreklerde birikim yapmaktadır (Shaw ve Handy 2006). Sucul canlılarda özellikle de balıklarda sucul ortama sızmış bakırın ilk giriş yeri solungaçlardır (Pelgrom vd. 1995). Bakırın (Cu 2+ ) genel olarak toksik etkilerini hidromineral dengesini bozarak gösterdiği ve büyümeyi olumsuz etkilediği bildirilmektedir (Priya vd. 1999, McGeer vd. 2000). Ayrıca bakırın eritrosit membranlarına direk zarar verebildiği ve alyuvarlar içinde oksidatif harabiyete sebep olabildiği saptanmıştır. Diğer taraftan bakır özellikle hemoglobin fonksiyonu üzerinde oldukça önemli bir etkiye sahiptir. Cu 2+ iyonları güçlü bir okside edici ajandır ve oksihemoglobini okside ederek hemoglobin molekülü içinde yer alan demir iyonunu ferrous halden ferric hale dönüştürür. Hemoglobin bu formda iken oksijen bağlama kapasitesini kaybeder ve methemoglobine (MetHb) dönüşür (Yang vd. 2004). Bakırın toksisitesi temel olarak kuprik iyon (Cu 2+ ) ve bakır hidroksit (CuOH ve Cu 2 OH 2 ) ile ilgildir (Brooks 2000). Bakırın toksisite kriterleri belirlenirken sertliğin dikkate alınmasının gerektiği vurgulanmaktadır (Anonymous 2003). Ayrıca çözünmüş organik karbon miktarı (Oronsaye ve Ogunbor 1998), ph ve sıcaklığın da bakır toksisitesi üzerinde önemli etkisi olduğu belirtilmektedir. Genel olarak salinite, alkalinite, ph ve sertlik arttıkça bakır toksisitesinin düştüğü kaydedilmektedir (Lauren ve McDonald 1987, Sorensen 1991). Dave (1984), Daphnia magna için bakır toksisitesini araştırdığı bir çalışmada deneme süresince aç bırakılan bireylerde 48 saatlik LC 50 değerini 6.5, yemlenmiş bireylerde ise bu değeri 18.5 µg/l olarak bulmuştur. Çalışmada bakır kaynağı olarak bakır sülfat (CuSO 4.5H 2 O) kullanılmıştır. Mastin ve Rodgers (2000) ph ın aralığında olduğu, toplam kalsiyum karbonat sertliğinin ise mg/l olduğu suda bakırın Daphnia magna için 48 saatlik LC 50 değerini 18.9 µg/l olarak, aynı değeri Pimaphales promelas için ise 19.2 µg/l olarak bulmuşlardır. Suedel vd. (1993) aynı balık türü için 48 saatlik LC 50 değerini 20.2 µg/l olarak bulmuşlardır. 22

35 Verriopoulos ve Dimas (1988) bir kopepod türü olan Tisbe holothuriae için bakırın 48 saatlik LC 50 değerini 0.37 mg/l olarak bulmuşlardır. Çalışmada bakır kaynağı olarak bakır sülfat (CuSO 4.5H 2 O) kullanılmıştır. Penaeus monodon adlı karides türünde yapılan bir çalışmada bakırın 96 saatlik LC 50 değeri salinitesi %15 olan suda 3.13 mg/l olarak bulunurken, salinitenin %25 olduğu suda bu değer 7.73 mg/l olarak tespit edilmiştir (Chen ve Lin 2001). Arnott ve Ahsanullah (1979) Paragrapus quadridentatus adlı yengeç larvalarında yaptıkları çalışmada bakır için 96 saatlik LC 50 değerini 0.17 mg/l olarak bulmuşlardır. McKim ve Benoit (1970), Salvelinus fontialis adlı balık için kalsiyum karbonat sertliğinin 35 ppm olduğu suda 96 saatlik LC 50 değerini 100 ppb olarak bulmuşlardır. Lepomis macrochirus adlı balık türü için kalsiyum karbonat sertliğinin 45 ppm olduğu suda 96 saatlik LC 50 değeri 2400 ppb olarak bulunmuştur (O Hara 1971). Smith ve Heath (1979) havuz balıklarında yaptıkları bir çalışmada su sertliğinin 36 mg CaCO 3 mg/l olduğu koşullarda 5, 15 ve 30 C de bakır (CuSO 4.5H 2 O) toksisitesini araştırmışlardır. Çalışma sonunda 5, 15 ve 30 C için 24 saatlik LC 50 değerlerini sırasıyla 2.8, 2.9 ve 1.5 mg/l olarak bulmuşlardır. Thompson vd. (1980) Lepomis macrochirus adlı balık türünde yaptıkları çalışmada su sertliğinin , alkalinitenin ise mg CaCO 3 /l olduğu koşullarda bakır (CuCl 2.2H 2 O) için 96 saatlik LC 50 değerini 1.1 mg/l olarak bulmuşlardır. Dick ve Dixon (1985), bakırın iki farklı konsantrasyonuna (16 hafta, 118 µg/l ve 24 saat, 300 µg/l) maruz bırakılan alabalıklarda (2.6 ve 30 g) alyuvar ve akyuvar sayısının her iki sürede ve her iki konsantrasyonda da düştüğünü, trombosit sayısının ise 24 saatlik denemede azaldığını ama bunun istatistiksel açıdan önemli olmadığını, 16 haftalık uygulamada ise arttığını ancak bunun da istatistiksel açıdan önemli olmadığını bulmuşlardır. 23

36 Cusimano vd. (1986) O. mykiss için bakırın 48 saatlik LC 50 değerini 7 µg/l olarak kaydetmişlerdir. Heath (1987), Lepomis macrochirus adlı balık türünde yaptıkları çalışmada balıkları 7 gün süreyle bakır ( mg/l) ve çinkoya ( mg/l) maruz bırakmış ve hem bakır hem de çinko uygulanan grupta hematokrit değerlerinin arttığını bulmuştur. Tort vd. (1987), Scyliorhinus canicula da yaptıkları çalışmada balıkları 2, 4, 6, 8 ve 16 (24 saatlik LC 50 değeri) mg/l lik bakıra yaklaşık 48 saat süreyle maruz bırakmışlar ve hematokrit, alyuvar sayısı, hemaglobin ve lökokrit seviyesinin düştüğünü gözlemlemişlerdir. Hamilton ve Buhl (1990) yaptıkları çalışmada alabalık yavruları için bakırın 96 saatlik LC 50 değerini 60 µg/l olarak bulmuşlardır. Çalışmada bakır kaynağı olarak bakır sülfat kullanılmıştır ve laboratuvar suyu fiziko-kimyasal özellikleri şu şekilde verilmiştir; CaCO 3 sertliği mg/l, ph: 7.5. Singh ve Raddy (1990) Heteropneustes fossilis adlı balıkta yaptıkları çalışmada balıkları 1,5, 10, 20 ve 30 gün süreyle 0.25 ppm bakıra maruz bırakmış ve bazı kan parametrelerini incelemişlerdir. Çalışma sonunda alyuvar sayısının ilk 24 saatte değişmediği ancak sonrasında deneme boyunca düşük olduğunu, hemoglobin seviyesinin ise çalışmanın tümünde kontrol grubuna oranla yüksek olduğunu ve akyuvar sayısının ise 20. günden itibaren artmaya başladığını tespit etmişlerdir. Sorensen (1991), yetişkin alabalıklar (O. mykiss) için 96 saatlik LC 50 değerini µg/l, Chapman (1978b) ise O. tshawytscha için CaCO 3 sertliğinin 24 mg/l olduğu suda 96 saatlik LC 50 değerini µg/l olarak bulmuştur. Baldigo ve Baudanza (2001) ise CaCO 3 sertliğinin 157 mg/l olduğu koşullarda 96 saatlik LC 50 değerini Salmo trutta için 61.5 µg/l olarak bulmuşlardır. Straus ve Tucker (1993), Ictalurus punctatus adlı balık türünde ph ve su sertliğinin bakır toksistesi üzerindeki etkisini araştırmışladır. ph ın 7.3, kalsiyum karbonat 24

37 sertliğinin ise 16 ppm olduğu suda 96 saatlik LC 50 değerini mg/l, ph ın 8.4, kalsiyum karbonat sertliğinin ise 161 ppm olduğu suda ise bu değeri 1.13 mg/l olarak bulmuşlardır. Nussey vd. (1995a), 96 saat süreyle 0.16 mg/l lik bakıra maruz bıraktığı O. mossambicus balıklarında alyuvar ve akyuvar sayımı, hematokrit, plazma sodyum, potasyum ve kalsiyum gibi bazı kan parametrelerini incelemiş ve akyuvar sayısı hariç bu parametrelerden hiçbirinin önemli bir değişim göstermediğini bulmuştur; akyuvar sayısında ise belirgin bir düşüş kaydedilmiştir. Ancak uzun bakıra uzun süre maruz bıraktığı balıklarda plazma klor seviyesinin düştüğünü saptamıştır. Karan vd. (1998) yaklaşık 30 günlük olan sazan balıklarında 96 saatlik LC değerini 0.64 mg/l, 6 aylık olan balıklarda ise bu değeri 5.45 mg/l olarak bulmuşlardır. Çalışmada kullanılan suyun ph ı 7.3, EC değeri ise 470 µs/cm olarak bildirilmiştir. Dethloff vd. (1999), 3, 7, 14 ve 21 gün süreyle, yaklaşık 6, 16 ve 26 µg/l lık bakıra maruz bıraktıkları alabalıklarda bazı kan parametrelerini incelemiş ve hemoglobin seviyesinin 21 gün sonunda üç konsantrasyonda da belirgin bir farklılık göstermediğini saptamıştır. Hematokrit seviyesi ise 7. güne kadar 3 konsantrasyonda da artış göstermiş ancak 21.gün kontrol grubu değerlerine düşmüştür. DeBoeck vd. (2000) gökkuşağı alabalıkları (O. mykiss), sazan (C. carpio) ve havuz balıklarında (Carassius auratus) yaptıkları çalışmada bakırın 96 saatlik LC 50 değerini sırasıyla 3, 10 ve 27 µm olarak bulmuşlardır. Dethloff vd. (2001), bakır kirliliği gözlenen bölgelerde yaptıkları çalışmada alabalıkların kan parametrelerini incelemiş ve kirlilik arttıkça hematokrit değerinin arttığını gözlemişler ve kronik bakıra maruz kalan balıklarda oksijen taşıma kapasitesinin düşmesine yol açabileceğini bildirmişlerdir. Mazon vd. (2002), Prochilodus scrofa adlı bir tatlısu balığında yaptıkları çalışmada balıkları lethal konsantrasyona (29 ppb) 96 saat süreyle maruz bırakmışlar ve alyuvar 25

38 sayısı, hematokrit ve hemoglobin seviyesinin arttığını, benzer şekilde akyuvar sayısının da arttığını, trombosit sayısının ise değişmediğini tespit etmişlerdir. Wu vd. (2003) O. mossambicus larvalarında yaptıkları çalışmada balıkları 30, 50, 100, 200 ve 400 ppb bakıra 24, 72 ve 96 saat süreyle maruz bırakmış ve larvaları Na, K ve Cl gibi elektrolitler yönünden incelemişlerdir. Çalışmada 100 ppb ve daha yüksek konsantrasyonlarda bakıra maruz bırakılan larvalarda Na ve K içeriğinin istatistiksel açıdan önemli ölçüde azaldığı, Cl içeriğinin ise nispeten değişmeden kaldığını kaydetmişlerdir. Sciera vd. (2004) Pimaphales promelas adlı balık türünde yaptıkları çalışmada sertliğin (CaCO 3 ) mg/l, ph ın , çözünmüş organik karbonun ise 0-10 mg/l aralığında değişmesinin bakırın 96 saatlik LC 50 değerinin 2.9 ile 427 µg/l arasında değişmesine yol açtığını bulmuşlardır. Oliveria-Filho vd. (2004) çeşitli bakır bileşiklerinin Danio rerio adlı balık türü için lethal konsantrasyonlarını belirlemeye yönelik yaptıkları çalışmada bakır oksiklorid, bakır sülfat ve bakır oksit kullanmışlardır. Bakır oksiklorid için 96 saatlik LC 50 değerini mg/l, bakır sülfat için mg/l ve bakır oksit için ise mg/l olarak bulmuşlardır. Çalışmada kullanılan suyun kalsiyum karbonat sertliği mg/l olarak bildirilmiştir. Clarias gariepinus adlı balıkta yapılan bir çalışmada 96 saatlik LC 50 değeri 0.60 mg/l olarak bulunmuştur. Denemede kullanılan suyun sıcaklığı 26 C, ph ı 7.01, sertliği ise mg/l (CaCO 3 ) olarak bildirilmiştir. Çalışmada balıklar 96 saat süreyle bakırın 3 farklı konsantrasyonuna (1.8, 3.2 ve 5.6 mg/l) maruz bırakılmış ve bazı kan parametreleri de incelenmiştir. Deneme sonunda bakır konsantrasyonu arttıkça hematokrit ve hemoglobin seviyesinin düştüğü ve alyuvar sayısında da benzer bir düşüş olduğu saptanmıştır (Olaifa vd. 2004). Chen vd. (2004), yaptıkları bir çalışmada tilapya balıklarını ortalama 50 µg/l lik bakıra (bakır sülfat) 7 gün süreyle maruz bırakmışlardır. Çalışma sonunda balıkların 26

39 hematokrit, alyuvar sayısı, plazma elektrolitleri (sodyum, klor ve potasyum), plazma total protein ve plazma albumin seviyesi gibi bazı kan parametrelerini incelemişlerdir. İncelenen parametrelerden sadece plazma sodyum seviyesinin kontrol grubuna oranla istatistiksel açıdan önemli bir düşüş gösterdiğini tespit etmişlerdir. Benzer olarak düşük konsantrasyonlarda bakıra maruz bırakılan balıklarda kan elektrolitlerinin önce düştüğü daha sonra ise kontrol değerlerine döndüğü (McKim vd. 1970) yüksek konsantrasyonlarda bakıra maruz bırakılan balıklarda ise Na-Cl homeostazisinin bozulduğu gösterilmiştir (Bury vd. 2003, Sloman 2003). Dautremepuits vd. (2004), sazan balıklarını bakırın sub-lethal dozlarına (0.1 ve 0.25 mg/l) 96 saat süreyle maruz bırakmış ve ön böbrek ve plazma lizozim aktivitesinin arttığını ve plazma seruloplazmin aktivitesinin ise düştüğünü gözlemişlerdir. Vutukuru vd. (2005) Esomus danricus adlı tatlı balık türünde yaptıkları bir çalışmada bakırın (CuSO 4.5H 2 0) 96 saatlik LC 50 değerini mg/l olarak bulmuşlardır. Aynı çalışmada bakıra maruz bırakılan balıklarda hem lethal hem de sub-lethal konsantrasyonlarda solungaçlarda belirgin histolojik değişimler olduğunu ve bu durumun balıklarda hipoksiyaya neden olduğunu belirtmişlerdir. Witeska (2005), sazan balıklarında yaptığı bir çalışmada balıkları bakırın 5 mg/l lik, çinkonun ise 20 mg/l lik yüksek konsantrasyonlarına 3 saat süreyle maruz bırakmış ve balıkların kan parametrelerinde meydana gelen değişimi 96 saat süreyle izlemiştir. Deneme sonunda her iki metalin de balıkların hematokrit değererinde geçici ve hafif bir artışa neden olduğunu, alyuvar sayısında ise belirgin bir değişiklik gözlenmediğini ve bu durumun eritrositlerin strese bağlı şişmesinden kaynaklanabileceğini bildirmiştir. Akyuvar sayısında ise her iki metalin de bir artışa neden olduğu gözlenmiş ancak 96 saat sonunda akyuvar sayısının kontrol grubuna oranla belirgin bir düşüş gösterdiği tespit edilmiştir. Arslan vd. (2006) bakırın üç farklı konsantrasyonuna (0.1, 0.5 ve 1.0 ppm) 7, 15 ve 30 gün süreyle maruz bıraktıkları Clarias lazera adlı balık türünde deneme süresince 27

40 herhangi bir mortalite gözlemediklerini kaydetmişlerdir. Çalışmada 30 günlük deneme gruplarında serum glukoz seviyesinin kontrol değerlerine döndüğü saptanmıştır. Bagdonas ve Vosyliene (2006), bakırın alabalık için 96 saatlik LC 50 değerini 0.65 mg/l, olarak buldukları çalışmada balıkları 96 saat süreyle lethal dozun 1/4 üne, 1/8 ine ve 1/16 sına maruz bırakmışlar ve bazı kan parametrelerini incelemişlerdir. Çalışma sonunda alyuvar sayısı, hemoglobin seviyesi ve hematokrit değerlerinde önemli bir değişim olmadığını, akyuvar sayısının ise bir düşüş gösterdiğini tespit etmişlerdir. Rabago-Castro vd. (2006) haftada bir 1 saatlik 1.5 ppm lik bakır banyosuna maruz bıraktıkları Ictalurus punctatus balıklarında 11 hafta süreyle balıkların büyüme performansını izlemişlerdir. Çalışmanın sonlarına doğru deneme grubunda büyümenin belirgin bir şekilde gerilediği saptanmıştır. Bu durumun balıklarda kronik stresin bir etkisi sonucu gözlenmiş olabileceği vurgulanmıştır. Kjartansson vd. (1998) kronik stres altında balığın homeostazisi korumak için daha fazla enerji harcaması gerektiğini ve bu durumun balıkta büyümenin yavaşlamasına yol açabileceğini bildirmiştir. Sazan balığı (C. carpio) için 24 saatlik LC 50 değeri 0.7 ppm olarak bulunmuştur (Ramesh vd., 2007). Çalışmada bakır kaynağı olarak bakır sülfat kullanılmıştır. Yine bu çalışmada balıklar 0.07 ppm bakıra 7 gün süreyle maruz bırakılmış ve kortizol seviyesinin 3 kat arttığı gözlenmiştir. Gioda vd. (2007) Leporinus obtusidens adlı balık türünde yaptıkları çalışmada, su sertliğinin 22, alkalinitenin ise 42.3 mg CaCO 3 mg/l olduğu koşullarda bakır (CuSO 4.5H 2 O) için 96 saatlik LC 50 değerini 0.2 mg/l olarak bulmuşlardır. Çalışmada ayrıca balıklar 45 gün süreyle lethal konsantrasyonun %10 ve 20 sine maruz bırakılmış ve bazı kan parametreleri incelenmiştir. Deneme sonunda her iki konsantrasyonda da alyuvar sayısı, hematokrit ve hemoglobin seviyesinin düştüğü, akyuvar sayısının ise değişmediği tespit edilmiştir. 28

41 Gündoğdu (2008), gökkuşağı alabalıklarında (O. mykiss) yaptığı bir çalışmada su sertliğinin mg CaCO 3 /l olduğu koşullarda bakır (CuSO 4.5H 2 O) için 96 saatlik LC 50 değerini mg/l olarak bildirmiştir. Singh vd. (2008) bakırın 0.36 mg/l lik bir konsantrasyonuna 15, 30 ve 45 gün süreyle maruz bıraktıkları Channa punctatus adlı balık türünde hemoglobin seviyesinin ve hematokrit değerlerinin 15 gün boyunca normal seyrettikten sonra giderek düştüğünü, alyuvar sayısının ise giderek azaldığını, akyuvar sayısı, pıhtılaşma süresi ve sedimentasyon oranının ise giderek arttığını tespit etmişlerdir. Öner vd. (2008) 5, 10, 20 ve 30 gün süreyle bakıra (CuCl 2.2H 2 O) maruz bıraktıkları nil tilapyalarında (O. niloticus) serum total protein seviyesinin düştüğünü ve 30 günlük deneme grubunda bu düşüşün daha belirgin olduğunu tespit etmişlerdir. Lynch ve Klevay (1992) bakır eksikliğinin etkilerini araştırdıkları bir çalışmada diyetlerinde bakır bulunmayan farelerin hematokrit ve seruloplazmin seviyelerinin kontrol grubuna oranla oldukça düşük olduğunu saptamışlardır. Aydemir ve Özcan (2003) sıçanlarda yaptıkları çalışmada yeme 10 ve 20 mg Cu/kg yem/gün karıştırılmasının alyuvar ve akyuvar sayısı üzerine etkisi olmadığını ancak superoksit dismutaz enziminin aktivitesini düşürdüğünü tespit etmişlerdir. Akut oral bakır zehirlenmelerinde insanlarda en yaygın görülen semptomlardan birisi hemoglobin seviyesindeki düşüş olduğu kaydedilmektedir. Ayrıca eritrosit frajilitesinde ve protrombin zamanında artış gözlenmektedir (Thiru vd. 1984, Nagaraj vd. 1985). Jelis vd. (2004) yaptıkları in vitro çalışmada bakırın insan kanı pıhtılaşma süresini ve sedimentasyon hızını düşürdüğünü tespit etmişlerdir (Jelis vd. 2003). 29

42 1.7 Kadife Balığı (Tinca tinca L., 1758) Yeşil sazan olarak da adlandırılan Kadife balığı (Tinca tinca L., 1758) sadece Türkiye iç sularında değil ayrıca Avrupa da ve batı Sibirya da da oldukça geniş yayılım gösteren bir Cyprinidae üyesidir (Lukowicz ve Proske 1979). Kadife balığının doğal rengi yeşilzeytin rengidir ancak bulunduğu ortamdaki su kalitesine göre rengi daha açık veya daha koyu olanlarına da rastlanmaktadır. Dış özelliklerinden en çok dikkati çeken kalın ve bol mukuslu derisidir. Görünüşünden ve ele çok yumuşak geldiğinden dolayı "Kadife" diye adlandırılmıştır. Ayrıca bazı yörelerde mukusunun yara iyileşmesinde rolü olduğu düşüncesiyle doktor balığı olarak da adlandırılmaktadır. Fazla hareket etmeyen kadife balıkları yavaş akan suların ve durgun göllerin dip kısımlarında bulunur. Eurytherm bir balık türü olup 1600 m ye kadar rakıma sahip göllerde ve 35 C nin üzerindeki sıcaklıklarda yaşayabilir. Genel olarak su kalitesi parametrelerindeki değişimlere direnci yüksek olduğu kabul edilmektedir. Oksijen seviyesindeki düşüşlere karşı toleransı yüksektir. Hastalıklara ve parazitlere karşı direnci yüksek olmakla birlikte mantar enfeksiyonlarına ve beyaz benek hastalığına karşı oldukça duyarlıdır. Bir dip balığı olmasına karşın besin tercihi sazan ile benzerlik göstermektedir. Genel olarak yavaş büyüyen bir balık türüdür, 5-15 g ağırlığa sahip I yaşındaki bireyler, III yaşında g ağırlığa erişirler. Üreme dönemi Türkiye iç suları için Nisan-Mayıs arası başlar ve Ağustos ayına kadar devam eder. Türkiye iç sularında yakalanan kadife balıklarına pek rağbet olmamasına karşın, yurtdışında özellikle Avrupa ülkelerinde besin ve rekreasyonel amaçlı tüketilmektedir. Üretimine yönelik çalışmalarda resirkülasyon sistemlerinde büyümesinin oldukça yavaş olduğu ve bunun da strese karşı aşırı duyarlılıklarından kaynaklandığı öne sürülmektedir (Arlinghaus vd. 2003). Eddy (1974) yaptığı çalışmada sağlıklı kadife balıkları için laktat seviyesinin mg/dl aralığında olduğunu, ortalama değerin ise ± 2.13 mg/dl olduğunu bildirmiştir. 30

43 Collazos vd. (1995) yaptıkları diğer bir çalışmada kadife balıklarında fagositik hücrelerin aktivitelerinde meydana gelen mevsimsel değişimleri incelemişler ve mobilite oranı, fagositik indeks ve mikrobisit kapasitesi yönünden en yüksek fagositik aktivitenin kış aylarında olduğunu saptamışlardır. Collazos vd. (1998) yaptıkları çalışmada kadife balıklarının kan parametrelerinde meydana gelen mevsimsel değişimleri araştırmışladır. Çalışma sonucunda alyuvar ve akyuvar sayısının sonbaharda en yüksek, ilkbahar ve kış aylarında ise en düşük olduğunu bulmuşlardır. Kadife balığı için akyuvar sayısı referans değerleri 13.7 ile /mm 3 arasında değişim göstermiştir. Hematokrit değerleri de alyuvar sayısına paralel bir değişim göstermiştir. Alyuvar sayısı için referans değerler /mm 3 arasında değişim göstermiştir. Total protein seviyesi ise yaz aylarında en yüksek, kış aylarında ise en düşük olarak kaydedilmiştir. Çalışmada total protein için aralık g/dl olarak verilmiştir. Çalışmada ayrıca incelenen kan parametreleri yönünden erkek ve dişi bireyler arasında istatistiksel açıdan önemli bir fark olmadığı belirtilmiştir. Kan parametrelerinde meydana gelen bu dalgalanmanın balıkların yaşadığı ortam sıcaklığına bağlı olduğu kaydedilmiştir. Guijarro vd. (2003) yaptıkları çalışmada kadife balıklarının kan parametrelerinde meydana gelen mevsimsel değişimi incelemişlerdir. Çalışma sonucunda alyuvar sayısının sonbaharda en düşük, yazın ise en yüksek, akyuvar sayısının ise yazın en yüksek sonbahar ve kışın ise en düşük olduğunu bulmuşlardır. Çalışmada alyuvar ve akyuvar sayıları için referans değerler sırasıyla /mm 3 ve /mm 3 olarak verilmiştir. Hematokrit ve hemoglobin seviyeleri de alyuvar sayısına paralel bir değişim göstermiştir. Alyuvar sayısı, hematokrit ve hemoglobin seviyesinde gözlenen bu değişimin yaz aylarında sıcak artışı sebebiyle gözlenen oksijen seviyesinin düşmesinden kaynaklı olabileceği öne sürülmüştür. Hematokrit ve hemoglobin seviyeleri için referans değerler sırasıyla % ve g/dl olarak verilmiştir. Çalışmada ayrıca diferansiyel sayım da yapılmış olup trombosit yüzdesi için aralık % olarak verilmiştir. Total protein için aralık mg/dl olarak verilirken protein seviyesinin mevsimsel olarak belirgin bir değişim göstermediği saptanmıştır. Plazma glukoz seviyesi ise yaz ve sonbahar aylarında en yüksek, kış ve 31

44 ilkbahar aylarında ise en düşük değerlere ulaşmıştır. Plazma glukoz seviyesi için referans değerler mg/dl olarak verilmiştir. Plazma glukoz seviyesinde gözlenen bu dalgalanmanın besin alınımı ile ilgisi olduğu belirtilmiştir. Shah ve Altındağ (2004a, b, 2005) yaptıkları çalışmada kadife balıkları için civa, kurşun ve kadmiyumun 96 saatlik LC 50 değerlerini sırasıyla 1.0, 6.5 ve 300 ppm olarak bulmuşlardır. Çalışmada aynı zamanda bu metallerin lethal konsantrasyonlarına 24 saat süreyle ve sub-lethal konsantrasyonlarına 3 hafta süreyle maruz bırakılan balıkların alyuvar ve akyuvar sayısı, hematokrit, lökokrit ve hemoglobin seviyesi gibi parametreleri incelenmiştir. Pedro vd. (2005) laboratuvar koşullarında yetiştirilen sağlıklı kadife balıkları için yıl boyu bazı hematolojik parametrelerdeki dalgalanmaları incelemiş ve alyuvar sayısınının /mm 3, hematokrit seviyesinin % , hemoglobin seviyesinin g/dl, akyuvar sayısının /mm 3, plazma glukoz seviyesinin mg/dl ve plazma total protein seviyesinin ise g/dl aralığında olduğunu saptamıştır. Witeska vd. (2006) sağlıklı kadife balığı için alyuvar sayısını 1.34 ± /mm 3, akyuvar sayısını 44.6 ± /mm 3 ve trombosit sayısını ise 4.1 ± /mm 3 olarak bildirmiştir. Shah (2010) yaptığı bir çalışmada sağlıklı kadife balıkları için hematokrit değeri için aralığı % , hemoglobin seviyesi için (g/dl), alyuvar sayısı için /mm 3, lökokrit seviyesi için % ve akyuvar sayısı için aralığı /mm 3 olarak bildirmiştir. 32

45 2. MATERYAL VE YÖNTEM Çalışmada kullanılan balıklar Ankara ya 20 km güneyinde yer alan Mogan Gölü nden mm gözenek çapına sahip galsama ağları ve pinterler kullanılarak yakalanmış ve 50 litrelik bidonlarda laboratuvara transfer edilmiştir. Çalışmada kullanılan balıklar için ortalama ağırlık ± 12.3 g, boy ise 25.2 ± 3.1 cm dir. Çalışmada erkek ve dişi bireyler toplu halde değerlendirilmiş ve balıklar deneme gruplarına rastgele taksim edilmiştir. Çalışma Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Hidrobiyoloji Laboratuvarında yürütülmüştür. Laboratuvara getirilen balıklar 800 litrelik tanka yerleştirilerek laboratuvar koşullarına adapte olmaları için 10 gün süreyle bekletilmiştir. Balıkların ilk 2-3 gün süreyle yem almadıkları gözlenmiş, bu süreden sonra yemlenmeye başlamışladır. Balık yemi olarak no:5 pellet yem (Pınar Yem) kullanılmıştır. Tüm denemeler boyunca fotoperyod 12 A:12 K şeklinde ayarlanmıştır. Laboratuvarda akvaryumlarda dinlendirilmiş ve kloru uçurulmuş musluk suyu kullanılmıştır. Akvaryumdaki suların belirli aralıklarla bazı fiziko-kimyasal parametreleri ölçülmüş ve kaydedilmiştir. Sudaki oksijen seviyesi WTW marka oksijen metre ile, ph WTW marka phmetre ile, elektriksel iletkenlik (EC) ve sıcaklık WTW marka konduktivimetre ile ölçülmüştür. Denemelerde kullanılan sudaki çinko ve bakır seviyesi analizleri Gazi Üniversitesi Analitik Kimya Laboratuvarında Varian Marka (AA240FS) atomik absorbsiyon spektrometresi ile yapılmıştır. Laboratuvarda kullanılan musluk suyuna ait CaCO 3 alkalinitesi ve sertliği ile ilgili analizler ASKİ Genel Müdürlüğü Su Kalite Kontrol Laboratuvarları nda yaptırılmıştır. Çalışmada çinko kaynağı olarak çinko klorür (ZnCl 2 ) (Merck) kullanılmıştır. Bakır kaynağı olarak ise bakır sülfat (CuSO 4.5H 2 O) (Sigma-Aldrich) kullanılmıştır. Çalışmada analiz sırasında kullanılan tüm malzemeler önceden seyreltik asit solüsyonu ile yıkanmış ve saf su ile durulanarak kullanılmıştır. Balıklar laboratuvar koşullarına adapte olduktan sonra lethal konsantrasyonların belirlenmesi amacıyla 100 er litrelik akvaryumlara akvaryum başına 10 ar adet olmak üzere rastgele yerleştirilmişlerdir. Akvaryumlar pompalar yardımı ile sürekli 33

46 havalandırılmış ancak herhangi bir iç ya da dış filtre kullanılmamıştır. Balıklar akvaryuma alınmadan 24 saat öncesinden yemleme durdurulmuş ve 96 saatlik lethal konsantrasyonun belirlenmesi süresince de yem verilmemiştir. 96 saatlik süreçte akvaryumların suyunun yarısı 2 günde bir değiştirilmiş ve ölen balıklar akvaryumdan alınmıştır. LC 50 değerlerinin belirlenmesi için çinko ve bakırın farklı konsantrasyonları denenmiş ve sonuçlar Anonymous (1997) tarafından geliştirilen EPA Probit Analysis Programı (V 1.5) ile değerlendirilmiştir. Akvaryumlarda kısmi su değişimi sırasında uygun stok solusyonlar hazırlanarak akvaryumlara gereken miktarda ilave edilmiş ve istenen konsantrasyonun sabit kalması sağlanmıştır. Deneme grupları için 400 litrelik tank kullanılmıştır. Deneme grubu için toplamda her bir metal için 36 şar adet balık kullanılmıştır. Pıhtılaşma zamanının tayini için heparinsiz enjektörle kan alınması gerektiğinden ve bu işlem sırasında çok seri çalışılması gerektiğinden pıhtılaşma zamanı tayini içini kullanılan balıklardan alınan kanın fazlası diğer analizler için kullanılmamıştır. Pıhtılaşma zamanının tayini için 5 er balık, diğer parametrelerin tayini için ise 7 şer balık kullanılmış olup, kronik uygulamalarda toplam 36 adet balık kullanılmıştır. Çalışmanın 3. gününde tanktan rastgele 12, 10. gününde 12 adet ve 20. gününde kalan 12 balık alınmış ve kan örnekleri kaudal venadan steril enjektörlerle çekilmiştir. Lethal konsantrasyona 1 gün süreyle maruz bırakılan balıklarda da aynı yöntem izlenmiştir. Pıhtılaşma zamanı tayini için heparinsiz, diğer parametrelerin analizi için ise içi önceden heparinle (Nevparin) çalkalanmış enjektörler kullanılmıştır. Heparinli enjektörlerdeki alınan kan örnekleri eppendorflara alınmış ve daha sonra rpm de 5-6 dakika santrifüjlenerek plasma elde edilmiş ve -20 derecede analizler yapılana kadar saklanmıştır. 3, 10 ve 20. gün sonunda tanktan rastgele seçilen 5 er balık pıhtılaşma zamanı tayini için, 7 şer balık ise alyuvar sayısı, akyuvar sayısı, trombosit sayısı, hematokrit, lökokrit, hemoglobin ve sedimentasyon oranı gibi parametrelerin tayini ve plazma eldesi için kullanılmıştır. Deneme gruplarına paralel olarak bir kontrol grubu kullanılmıştır. 34

47 Kronik uygulamalar süresince hem deneme gruplarında hem de kontrol grubunda akvaryum suyunun yarısı 2 günde bir değiştirilerek stok çözeltiden uygun miktarda eklenmiştir. Balıklara deneme süresince pellet yem verilmiş ancak kan alımından 24 saat önce yemleme sonlandırılmıştır. Kan alımı sırasında deneme grubuna uygulanan kepçeyle yakalama, elle müdahele gibi işlemlerin aynısı kontrol grubu balıklara da uygulanmıştır. Her iki deneme grubunda da balıklar çalışmanın sonlandırılmasına kadar yem almaya devam etmişlerdir. 2.1 Kan Parametreleri Lethal konstrasyonun belirlenmesinin ardından balıklar bu metallerin sub-lethal konsantrasyonlarına (lethal konsantrasyonun %10 u) 3,10 ve 20 gün süreyle ve lethal konsantrasyona 1 gün süreyle maruz bırakılmışlardır. Belirtilen süreler sonunda balıklar akvaryumdan birer kepçe yardımıyla alınmış ve için önceden heparinle çalkalanmış olan steril enjektörlerle kaudal venadan kan örnekleri alınmıştır (Şekil 1). Pıhtılaşma zamanının tayini için heparinsiz enjektörler kullanılmıştır. Şekil 2.1 Balıklarda kaudal venadan kan alınması Alyuvar sayımı Kan örneklerindeki eritrosit sayılarının belirlenmesinde Improved Neubauer Thoma Lamı (Şekil 2.2) kullanılmıştır. Bu amaçla eritrosit pipetinin 0.5 rakamlı çizgisine kadar kan örneği, 101 rakamlı çizgisine kadar da Hayem solusyonu (0.25 gr HgCl 2 ; 0.5 gr 35

48 NaCl, 2.5 gr Na 2 SO 4, saf su ile 100 ml ye tamamlanır) çekilmiştir. Bu şekilde 1/200 oranında sulandırılan kan örnekleri, pipet ucundaki ilk bir iki damla uzaklaştırıldıktan sonra Thoma lamına alınmış ve ışık mikroskobunda x40 lık objektifle incelenmiştir. Thoma lamında, her bir köşe ve ortadaki 16 lık 5 büyük (Şekil 2.2 üzerinde E ile işaretli kareler) karede (toplamda 80 küçük kare) eritrositler sayılarak taranmış, elde edilen verilerin aşağıdaki formülde yerine konmasıyla 1 mm 3 kandaki eritrosit sayısı belirlenmiştir (Wintrobe 1967). Alyuvarlar sayılırken karelerde alt ve sağdaki çizgilere içten ve dıştan temas edenler sayılmamıştır. Şekil 2.2 Improved Neubauer Thoma Lamının mikroskop altındaki görüntüsü Alyuvar sayımı için şekil 2.2 de E ile gösterilen her bir karenin hacmi 0.2 x 0.2 x 0.1 = mm 3 E ile gösterilen 5 büyük karenin hacmi x 5 = 0.02 mm 3 36