Antiviral Direnç Terminoloji

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ Dirençli HBV: Moleküler Mekanizmalar, Genotipik/Fenotipik Yöntemlerle Saptanması A.Mithat BOZDAYI Ankara Üniversitesi Hepatoloji Enstitüsü II. HEPATOLOJİ OKULU Mayıs 2008 Antalya

2 HBV İLE İGİLİ SON YAYINLAR -Lok ASF et al. Chronic Hepatitis B : AASLD Practice Guidelines. Hepatology Hoofnagle JH et al. Management of Hepatitis B: Summary of a Clinical Research Workshop. Hepatology Lok ASF et al. Antiviral Drug Resistant HBV : Standardization of Nomenclature and Assays and Recomendations for management. Hepatology Keeffe EB et al. Report of an Internatıonal Workshop: Roadmap for management of Patients Receiving oral therapy for chronic hepatitis B. Clin Gastrenterol Hepatol Pawlotsky JM et al. Virologic Monitoring of Hepatitis B virus therapy in Clinical trials and Practice: Recommendations for a standardized Approach. Gastroenetrology 2008

3 Antiviral Direnç Terminoloji Tedavide primer yanıtsızlık ( Primary treatment failure ) Tedavide sekonder yanıtsızlık ( Secondary treatment failure ) Biyokimyasal kırılma ( Biochemical breakthrough ) Genotipik direnç ( Genotypic resistance ) Fenotipik direnç ( Phenotypic resistance ) Çapraz direnç ( Cross resistance )

4 Tedaviye Primer Yanıtsızlık 1-Tedaviye uyumsuzluk (Compliance( Compliance) 2-Konağın genetik özellikleri 3-Çapraz direnç

5 Primer Yanıts tsızlık k kriteri HBV DNA Viral Yükünde azalma Tedavi haftası AASLD 1 NIH Makalesi 2 HBV İlaç direnç grubu 3 HBV yol haritası 4 Uluslar arası panel 5 2 log 24 1 log 24 1 log 24 1 log 12 1 log 12 1 Lok ASF et al. Hepatology 2007; 2 Hoofnagle JH et al. Hepatology 2007; 3 Lok ASF, Zoulime F et al. Hepatology 2007; 4 Keeffe EB et al. Clin Gastrenterol Hepatol Pawlotsky JM et al. Gastroenetrology 2008

6 NÜKLEOZİD ANALOGLARI HÜCRESEL KİNAZ AKTİVİTESİ FOSFORİLASYON ANALOG dntp HÜCRESEL dntp 1.HBV 2.Karaciğer 3.Mitokondri NÜKLEOTİD ANALOGLARI

7 Konağa bağlı direnç; Multi drug resistance gen ailesi; MPR4, MPR5 Uzayan DNA dan nükleozid analogların kesen enzimler I-p53, II-APE1, III-3-5 ekzonükleaz P-P-P Nükleozid kinaz, Nükleotid kinaz, diğerleri, Nükleozid analoglarının, hücre içine alınmasında, fosforilasyonunda ya da katabolizmasında rol oynayan tüm genler konağa bağlı fenotipik dirençte yer alırlar. Delaney et.al. Antivir Chem Chemo 2001

8 Viral genetik hetrojenitenin de novo kombinasyon tedavisi süresince değişimi Doğal tip v LAM-R LAMIVUDİN ADEFOVİR Zoulim et al, Antiviral Research 2004 ADV-R Sıklık?? LAM+ ADV -R

9 Tedaviye Sekonder Yanıtsızlık (Virolojik kırılma) -Tedaviye uyumlu hastada, tedavi süresince, HBV DNA viral yükünde, birer ay arayla yapılmış 2 ölçümde 1 log veya daha fazla artış (=Virolojik kırılma) 1, 2 1 Lok ASF, Zoulime F et al. Hepatology 2007; 2 Pawlotsky JM et al. Gastroenetrology 2008

10 Biyokimyasal kırılma -Tedaviye uyumlu hastada, tedavi süresince normal değerlere inmiş alanin aminotransferaz (ALT) düzeylerinin yükselmesi 1, 2 1 Lok ASF, Zoulime F et al. Hepatology 2007; 2 Pawlotsky JM et al. Gastroenetrology 2008

11 Genotipik direnç -In-vitro çalışmalarda tedavide kullanılan antiviral ilaca karşı direnç gösterdiği belirlenmiş amino asit değişikliklerine neden olan mutasyonların saptanması. 1 -Bu mutasyonlar genellikle virolojik kırılma döneminde saptanırlar. Fakat persistant viremilerde de virolojik bir kırılma olmaksızın saptanabilirler. 1 1 Lok ASF, Zoulime F et al. Hepatology 2007;

12 1- Genotipik Direnç Genotipik direnç 2-Biyokimyasal kırılma ile birlikte olan genotipik direnç 3-Virolojik ve biyokimyasal kırılmalar ile birlikte olan genotipik direnç Her yıl cumulative probability olarak verilmeli. Pawlotsky JM et al. Gastroenetrology 2008;

13 Fenotipik direnç -HBV polimerazında amino asit değişikliklerine bağlı olarak in-vitroi çalışmalarda tedavide kullanılan antiviral ilaca karşı azalmış duyarlılık göstermesi. 1 -Bu mutasyonlar genellikle virolojik kırılma döneminde saptanırlar. Fakat persistant viremilerde de virolojik bir kırılma olmaksızın saptanabilirler. 1 1 Lok ASF, Zoulime F et al. Hepatology 2007;

14 Çapraz direnç -HBV polimerazında 1 ya da 1 den fazla amino asit değişikliği sonucunda, 1 den fazla antiviral ilaca karşı duyarlılığın azalması. 1 1 Lok ASF, Zoulime F et al. Hepatology 2007;

15 Lamivudine dirençli HBV mutasyonunun Adefovire çapraz direnç göstermesi In-vivo yeni pattern: A181S + M204I/V L S P F L L A Q F T S A I C 28-tk 04/ S tk 07/ S tk 03/ S pg/ml S V V R R A F P H C L A F S tk 04/ tk 07/ tk 03/ Y M D D V V L G A K S V Q H tk 04/01....I/V tk 07/01....I/V tk 03/03....I/V IU/mL 9 MU/TIW LAMIVUDINE 100mg/D 9 MU/TIW ADEFOVIR 10 mg/d MONTHS Karatayli E et al. A novel mutation pattern emerging during lamivudine treatment shows cross-resistance to adefovir dipivoxil treatment. Antivir Ther. 2007;12(5):761-8.

16 Antiviral ilaçlara direnci belirleyen olası belirleyiciler; Viral mutasyon frekansı, Replikasyon oranı, Hedef DNA nın mutasyona uğrama olasılığı, Antiviral ilacın seçici baskısı, Replikasyonun uyumluluğu (fitness), Replikasyon alanı (space), S. Locarnini, J Hepatol 2003

17 HBV polimeraz Terminal protein Spacer Reverse transcriptase Rnase H G F A B C D E FLLA YMDD

18 Core HBV polimeraz geninin diğer HBV genleri ile çakışması; Pre-S1 a determinant HBsAg-L HBsAg-M X HBsAg-S S GRE ENHANCER Terminal protein Spacer Reverse transcriptase Rnase H G F A B C D E Delaney et.al. Antivir Chem Chemo 2001

19 Kronik Hepatit B tedavisinde kullanılan 3 grup Nükleoz(t)id analogu 1. Ḻ- Nük ükleo leozidler lamivudin emtrisitabin telbivudin klevudin 2. Asiklik Fosfonatlar adefovir tenofovir 3. Siklopentan/pent /pentanlar entecavir (3TC) (FTC) (L-dT) (L-FMAU) (PMEA) (PMPA) (ETV)

20 HBV DE DİRENCD RENCİN N SAPTANMASINDA KULLANILAN YÖNTEMLERY

21 HBV ilaç direncinin, onaylanmış Anti-HBV ilaçlar ile klinik pratikte gösterilmesi; 1 Tedavideki primer ya da sekonder başarısızlığın tanısı, - HBV DNA viral yük deneyleri 2 Başarısızlıkta HBV ye ait olmayan nedenlerin elenmesi, -İlaç dozu ( compliance compliance ) 3 Tedavi süresince HBV mutasyonlarının ortaya çıktığının gösterilmesi, esi, - DNA dizi analizi İki olasılık var: Seçilen mutasyon, ilaca karşı direnç gösterdiği bilinen bir mutasyondur: HBV direnci tanısı kolaydır. Seçilen mutasyon, ilaca karşı direnç gösterdiği bilinmeyen bir mutasyondur: İleri karakterizasyon çalışmalarına gereksinim vardır.

22 İlaca dirençli HBV dizinlerinin belirlenmesi; 1-Genotipik deneyler, 2-Fenotipik yöntemler, 3-Sanal fenotipleme ( Virtual Phenotyping )

23 Genotipik deneyler DNA dizi analizi, PCR ürünlerinin DNA dizi analizi, Klonlanmış HBV segmentlerinin DNA dizi analizi, Line probe assay, PCR- RFLP TRFLP Real- Time PCR Mikroçip ile DNA dizi analizi MALDI- TOF Kütle spektrometresi Single Genome Sequencing Ultra deep sequencing ( Next generation sequencing )

24 ANKARA ÜNİVERSİTESİ ANKARA TIP FAKÜLTESİ GASTROENTEROLOJİ BİLİM DALI ARAŞTIRMA LABORATUVARI SONUÇ FORMU (Bilim Dalı Kodu: DH2) HASTA ADI,SOYADI: H. Ö. TARİH: TEST: HBV DNA Polimeraz YMDD mutasyonunun araştırılması DENEY: PCR ile DNA Polimeraz geninin ilgili bölgesinin çoğaltılması ve DNA Dizi analizi yöntemi ( ABI 310 Genetic Analyser ) ile DNA dizi analizinin yapılması SONUÇ: NÜKLEOTİD DİZİSİ X cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg Hasta...a X gctttccccc actgtttggc tttcagttat atggatgatg Hasta gt... AMİNOASİD DİZİSİ X02496 F L L A Q F T S A I C S V V R R A F P H C L A F S Y M D D Hasta.. M S.. Hastada, 552.kodonda metyoninden serin değişimine neden olan timinden gunaine ve guaninden timine bir çift nükleotid mutasyonu ( ATG AGT ) saptanmıştır. 528.kodonda lösinden metyonine değişime neden olan sitozinden adenine bir nükleotid mutasyonu ( CTG ATG ) saptanmıştır. Bu bulgular hastada; 1-YMDD YSDD variant gelişimini göstermektedir kodonda L M variant gelişimini göstermektedir. Dr.A.Mithat BOZDAYI

25 LAM tedavisi altındaki bir hastada mutasyon seçilimi ALT (U/L) Lamivudin 100mg/gün HBV DNA log kopya :mlu/ml Gün Kodon 180 Kodon 204 Kodon 207 L M V L M V L/M M V M M V M M V M M/V V M V V INNO-LiPA deney sonuçları 450.günde YMDD (V204) mutasyonun belirlenmesi

26 Anti-viral direnç testi Fenotipik yöntemler Fenotipik Anti- viral ilacın değişik konsantrasyonlarında virüsün büyüme yeteneğini ölçer, Bu ilaçların klinik yanıtını belirleyebilir, Deneyler Hücre kültürü temelinde olanlar, Enzimatik olanlar, Hayvan mdelleri, Hastadan elde edilmiş klonların hücre kültürü sisiteminde denenmesi, Monoklonal yaklaşım, Poliklonal yaklaşım,

27 Transfeksiyon temelinde modeller; Phenotyping phy106 vektörünün geliştirilmesi;

28 Transfeksiyon temelinde modeller; Phenotyping phy106 vektörünün geliştirilmesi;

29 Hasta serumundan HBV DNA tüm Genomunun PCR ile çoğaltıması; HBV DNA + Strand HBVP2 HBVP1 DR1 DR2 5' 5'

30 Transfeksiyon temelinde modeller; Phenotyping

31 Transfeksiyon temelinde modeller; Phenotyping

32 HBV fenotipik deney akış şeması Hastadan kan alınması Viral DNA ekstraksiyonu PCR ile tüm HBV DNA genomunun çoğaltılması 2-3 hafta Klonlamalı strateji : Transfeksiyon için bir vektöre klonlama Klonlamasız strateji: PCR ürünlerinin direkt transfeksiyonu Huh 7 hücrelerine polilklonal transfeksiyon Antiviral ilaç değerlendirmesi Real Time PCR ile IC 50 ve IC 90 değerlendirmesi 1 hafta

33 Sanal fenotipleme ( Virtual Phenotyping ) Hastadan izole edilen HBV sekasnlarının veritabanlardaki dizilerle ve verilerle karşılaştırılarak artificial intelligence temeilinde elde edilecek sonuçların hasta tedavisinde kullanımı. SeqHepB

34 viral genome sequence data clinical and routine pathology test data Genome Analysis Engine Database in-vitro phenotypic data Patient Management System Data Mining Tool

35

36

37 SONUÇ HBV araştırmalarında tün tanımlarda ortak bir noktada buluşmak tüm araştırmaların anlaşılmasını ve karşılaştırılabilmesin daha verimli bir hale getirecektir. Lamivudin, Adefovir ve diğer nükleozid/nükleotid analoglarına karşı direnci belirleyen muatsyonlar tanımlanmaya devam edilmektedir. Dirençle ilgili mutayonlar, onları belirleme yöntemleri gittikçe daha karmaşık bir hal almaktadır. İlaca dirençli viral dizinlerin daha duyarlı bir şekilde saptanmasını sağlayacak yöntemler HBV tedavisinin akılcı tedavisine katkıda bulunacaktır. Nükleozid analogu olmayan diğer antiviral ilaçların da HBV tedavilerine eklenmesi ile, HBV nin tedavi edilme başarı oranları artacaktır. Çok sayıda nükleozid/nükleotid analogu antiviral ilaçların kullanıma girmesi ile fenotipleme çalışmaları HBV infeksiyonlarının tedavisinde yeni bir ufuk olamaya adaydır. Sanal fenotipleme yöntemleri de (SeqHepB gibi) klinik uygulamada yerini bulabilecek görünmektedir.