Genomic Structure, Replication and Epidemiology of Norovirus ÖZET

Transkript

1 flora DERLEME/ REVIEW Norovirüsün Genomik Yapısı, Replikasyonu ve Epidemiyolojisi Aylin ALTAY 1, Gülendam BOZDAYI 1 1 Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye ÖZET Norovirüs çocuklarda ve yetişkinlerde yaygın olarak sporadik gastroenteritlere veya gıda ve su kaynaklı salgınlara neden olan bir RNA virüsüdür. Genomik organizasyonu yapısal ve yapısal olmayan proteinleri kodlayan ORF1, ORF2 ve ORF3 olmak üzere üç açık okuma bölgesi [open reading frame (ORF)] içermektedir. ORF1, yapısal olmayan poliproteini kodlarken; ORF2 yapısal majör kapsid proteini VP1 i, ORF3 ise yapısal VP2 proteinini kodlamaktadır. Norovirüsler nükleotid dizi benzerliğine göre beş genogruba ayrılmaktadır. İnsanları infekte eden genogruplar GI, GII ve GIV tür. GIII genogrubu sığır türlerini, GV genogrubu ise fare türlerini infekte etmektedir. Norovirüsün replikasyonu virüsün in vitro koşullarda kültürü yapılamadığı için henüz tam olarak aydınlatılamasa da hayvanları infekte eden diğer genogrupların kültürleri kullanılarak çeşitli çalışmalar yürütülmektedir. Dünyada ve Türkiye de, norovirüs her yaş grubundan insanı infekte edebildiği gibi; daha çok çocuklar ve yaşlıların yaşadığı topluluklarda salgınlara neden olmaktadır. Bu salgınların çoğundan GII, özellikle de GII.4 genotipinin suşları sorumludur. GII genogrubunu, GI suşları izlemekte, GIV ise daha az oranda görülmektedir. Türkiye de 2008 yılında meydana gelen salgında da GI ve GII genogrupları saptanmıştır. Ülkemizde norovirüs ile ilgili yapılan az sayıdaki çalışmada da GII genogrubuna daha sık rastlanmıştır. Özellikle akut gastroenteritli çocukların dahil edildiği araştırmalar öne çıkmakta ve yaklaşık %10-17 oranında norovirüs pozitifliği saptanmaktadır. Norovirüsün laboratuvar tanısında, genogrupların tayini ve virüsün tiplendirilebilmesi için altın standart, revers transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonudur, ancak hızlı tanı için daha çok ELISA ve immünkromatografik çabuk tanı testleri kullanılmaktadır. Anahtar Kelimeler: Norovirüs, Epidemiyoloji SUMMARY Aylin ALTAY 1, Gülendam BOZDAYI 1 1 Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, University of Gazi, Ankara, Turkey Norovirus is an RNA virus that causes commonly sporadic gastroenteritis or foodborne and waterborne outbreaks in children and adults. Its genomic organization includes three open reading frames (ORF) ORF1, ORF2 and ORF3 which encode the structural and the nonstructural proteins. ORF1 encodes the non-structural polyprotein, ORF2 encodes VP1 which is the structural major capsid protein and ORF3 encodes structural protein VP2. Noroviruses are subdivided into five genogroups according to the nucleotide sequence similarity. Geliş Tarihi/Received: 28/02/ Kabul Ediliş Tarihi/Accepted: 23/03/2012 1

2 Altay A, Bozdayı G. Genogroups infecting humans are GI, GII and GIV. Genogroup GIII infects bovine species, genogroup GV infects murine species. Due to the lack of an in vitro culture system, noroviruses replication is not elucidated, however several studies are carried out using the culture of other genogroups infecting animals. Around the world and in Turkey as well as norovirüs can infect every age groups of people, outbreaks commonly occur in communities containing rather children and elderly population. Genogroup II and especially genotype GII.4 strains are responsible from the bulk of these outbreaks. Genogroup II is followed by GI and GIV is seen less common. GI and GII genogroups were detected in an outbreak that occurred in Turkey in In a few studies had been carried out about norovirus in our country genogroup GII is detected more often. Especially, studies involved children with acute gastroenteritis are prominent and approximately 10-17% norovirüs positivity is detected. In the laboratory diagnosis of noroviruses reverse transcriptase-polymerase chain reaction is the gold standard to determine the genogroups, however ELISA and immunochromatographic rapid diagnostic tests are in common use for quick results. Key Words: Norovirus, Epidemiology Norwalk, Ohio da 1968 yılında bir gastroenterit salgınına neden olan norovirüs 1972 yılında immün elektron mikroskobun kullanılmaya başlanmasıyla insanlarda gastroenterit sebebi olarak tanımlanan ilk virüs olmuştur [1,2]. Dünya genelinde, yiyecek ve su kaynaklı hastalıkların ve akut bakteriyel olmayan gastroenteritlerin önde gelen nedenlerinden biridir. Her yaştan insan infekte olabilir. Ancak salgınlar; daha çok yaşlılar ve immün sistemi baskılanmış kişilerin bulunduğu bakımevi ve hastane gibi kurumlarda morbidite ve mortaliteye neden olarak ciddi etkilere sebep olabilmektedir. Norovirüsler gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde beş yaşın altındaki çocuklarda şiddetli gastroenterite neden olan rotavirüsten sonra en yaygın ikinci nedendir [3,4]. Norovirüsler tüm dünyada çocuklar, erişkinler ve yaşlılarda yaygın olarak görülmektedir. Rotavirüsten sonra akut gastroenteritlerin en önemli sebebi norovirüslerdir [2]. Yiyecek ve su kaynaklı sporadik olgulara veya salgınlara neden olmaktadır. Norovirüs salgınları sağlık sistemlerinde, turizm ve yemek endüstrisinde büyük bir ekonomik sıkıntı ortaya çıkarmaktadır [5]. Norovirüsün hücre kültüründe ve bir hayvan modelinde üretilememesi norovirüs araştırmalarını ve klinik laboratuvarlarda kullanılan tanı yöntemlerinin gelişmesini geciktirmiştir [3]. Norovirüs tanısında elektron mikroskopi, enzime bağlı immünosorbent yöntemler (ELISA) ve ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yöntemleri kullanılmaktadır [6,7]. Ancak, elektron mikroskopiyle tanıda, bir gram dışkıda en az yaklaşık 10 6 norovirüs partikülü bulunması gerektiği ve bu yöntem deneyimli personel gerektirdiği için rutin kullanımı oldukça zordur ve yöntemin duyarlılığı bu nedenlerden dolayı kısıtlıdır [8]. ELISA ise çalışılması kolay bir yöntem olmasına rağmen duyarlılığı RT-PCR ye göre daha düşük kalabilmektedir [9]. Bu nedenle günümüzde en yaygın kullanılan tanı yöntemi RT-PCR dir. Bu moleküler tanı yöntemi, real time RT-PCR, multipleks RT-PCR gibi yöntemlerle daha da geliştirilmektedir [10,11]. NOROVİRÜSÜN GENOMİK YAPISI Genomik Organizasyonu Norovirüs, Caliciviridae ailesinde, zarfsız, 32 tane kupa şeklinde çöküntüsü olan, ikozahedral yapılı, yaklaşık 38 nm çapında, 7.6 kb uzunluğunda ve tek zincirli bir RNA virüsüdür. Yapısal ve yapısal olmayan genleri kodlayan üç open reading frame (ORF) içermektedir. ORF1: Genomik yapısı 5 kb dan fazladır ve genomun ilk 2/3 lük kısmını oluşturmaktadır. Aynı zamanda viral replikasyon için temel olan viral proteaz enzimi tarafından altı proteine ayrılan ve yapısal olmayan yaklaşık 200 kda luk poliproteini kodlamaktadır [12,13]. Bunlar, N-terminal protein (p48), nükleozid trifosfataz (NTPaz), fonksiyonu bilinmeyen bir protein (p20), genomun 5 ucuna kovalent bağlı olan VPg, proteaz (Pro) ve RNA bağımlı RNA polimerazdır (Pol) [12]. ORF2: Uzunluğu 1.8 kb olan, 57 kda luk majör yapısal kapsid proteini VP1 i kodlamaktadır [12]. Majör kapsid protein içteki core (öz) ve protruding (çıkıntı) (P) domainini oluşturan shell (kök) (S) ve esnek bir hinge (menteşe yapısı) tarafından bağlanmış P domainlerine ayrılmaktadır. P domaini, P1 ve P2 olmak üzere iki farklı altdomaine ayrılmaktadır. P1, S ve P2 arasında stem (gövde, sap, kol) bölgesi olarak bulunmaktadır. S yüksek derecede kararlıyken, P domaini değişkendir. Kapsid proteininin en yüzeysel kararsız 2

3 Norovirüsün Genomik Yapısı, Replikasyonu ve Epidemiyolojisi Altay A, Bozdayı G. bölgesi olan P2 ise çok değişkendir ve karbonhidrat ligand-bağlanma bölgelerini içermektedir. P2 alt domaini kapsomerlerin dış kısmına yerleşmiştir ve virionun yüzeyine yayılarak kupa benzeri çöküntü şeklini vermektedir [13-16]. ORF3: Genomik yapısı 0.6 kb uzunluğunda, 22 kda luk genomu virionların içine paketleme fonksiyonu olduğu varsayılan, VP1 ile ilişkili temel yapısal proteini (VP2) kodlamaktadır. VP2 temel aminoasitlerce zengindir ve viral stabilitede rolü vardır [3,12]. Viral RNA, VPg olarak bilinen ve genomun 5 ucunda bulunan bir viral proteine bağlıdır. Genomun 3 ucunda VP2 den sonra bir poli A kuyruğu bulunmaktadır (Şekil 1) [12,16]. 1 Yapısal olmayan poliprotein VP1 Kapsid VP2 N-term NTPaz p20 VPg Pro Pol ORF2 ORF3 Bağlantı noktası Shell domain P1 P2 alt domain P Şekil 1. Norovirüsün genomik yapısı ve kapsid domainleri. Norovirüs genomu üç ORF den oluşmaktadır. ORF1 yapısal olmayan proteinleri (açık mavi) kodlamaktadır. ORF2 majör kapsid proteini VP1 i, ORF3 minör yapısal protein VP2 yi içeren yapısal proteinleri (sarı) kodlamaktadır. Yapısal olmayan poliprotein proteaz enzimi tarafından altı proteine işlenmektedir: N-term, NTPaz, p20, VPg, Pro ve Pol. Majör kapsid proteini shell (S) ve protruding (P) domainlerine ayrılmakta, P domaini de P1 ve P2 olmak üzere iki alt domaine ayrılmaktadır. S (yeşil), P1 (koyu mavi), P2 (kırmızı), bağlantı noktası (turuncu) [12]. Protein Yapısı ve Fonksiyonları Norovirüs genomunun ORF1 kısmında bulunan proteinlerden p48 in (N-terminal protein) rolü tam olarak bilinmemektedir. Ancak, in vitro ifade edilmiş, gen transferi sonucu infekte olmuş hücrelerdeki membranın yeniden düzenlenmesinde ve intraselüler protein trafiğinde rol oynadığı düşünülen golgi aparatına yerleştiği gösterilmiştir. Nükleozid trifosfataz (NTPaz), NTP leri bağlamakta ve hidrolize etmektedir. Viral protein g (VPg) transkripsiyonu hazırlamada önemlidir ve translasyonun başlamasında rol oynamaktadır [12]. Viral proteaz enzimi (pro), ORF1 in kodladığı yapısal olmayan poliproteini, altı proteine bölmektedir [3]. RNA bağımlı RNA polimeraz (pol) ise, VPg-hazırlama mekanizmasını ve genomik kalıptan RNA sentezi için poli-a kuyruğunu kullanarak viral genom replikasyonunu gerçekleştirmektedir [12]. Bunun yanında, viral genomu virüs partiküllerinin içerisine paketlemede rol oynadığı gösterilmiştir [17]. Genetik Çeşitliliği Norovirüs, viral kapsid geninin (VP1) filogenetik analizine dayanan GI den GV e kadar beş genogruba (G), genogruplar ise genotip olarak adlandırılan genetik kümelere ayrılmaktadır (Tablo 1). Norovirüs, beş genogrubu arasında yaklaşık %46 nükleotid çeşitliliğiyle oldukça yüksek çeşitliliğe sahip bir genustur. İnsanlarda en yaygın olarak görülen GI ve GII genogrupları sırasıyla sekiz ve 19 genotip içermektedir. Bu beş genogrup geniş miktarda türü infekte etmektedir. GI insanları, GII insanları ve domuz türlerini, GIII sığır ve koyun türlerini, GIV insanları, köpekleri ve aslanları, GV ise fare türlerini infekte etmektedir. Prototip suş olan Norwalk virüs, GI.1 olarak sınıflandırılmıştır [3,14]. Norovirüs suşları genellikle salgınların görüldüğü bölgelere göre isimlendirilmiştir. Her izolat rutin olarak suş/yıl/ülke olarak isimlendirilmektedir (NV/93/USA). Bazı norovirüslerin genomik sekanslarının analiz sonuçları, farklı genogruplardaki suşların sadece %51-56 sı benzerken, aynı genogruptaki suşların %69-97 sinin nükleotid benzerliğinin olduğunu göstermiştir [12]. REPLİKASYONU Norovirüsler ilk kez 1972 yılında tanımlanmış olmasına rağmen, uygun bir in vitro kültür sistemi ve hayvan modelinin eksikliğine bağlı olarak; replikasyonunun tam olarak açıklanması ve antiviral ilaçların geliştirilmesi sağlanamamaktadır [17,18]. Ancak yapılan bir çalışmada, ifade edilmiş genomik (expressed genomic) RNA dan biyolojik olarak fonksiyonel subgenomik RNA nın transkripsiyonunun gösterdiğine göre; genomik RNA dan negatif zincirin sentezi, yapısal olmayan proteinlerin kullanılmasıyla meydana gelmektedir. Genomik RNA nın virüs partiküllerinin içerisine paketlenmesi ise, subgenomik RNA ile birlikte ifade edildiği zaman gerçekleşmektedir. Bu gözlem, genomik RNA paketleme sinyalinin ORF1 bölgesinde bulunabileceğini veya yapısal olmayan proteinlerin, RNA nın paketlenmesinde gerekli olabileceğini göstermektedir [17]. 3

4 Altay A, Bozdayı G. Tablo 1. Norovirüsün genetik çeşitliliği Norovirüs genogrupları GI GII GIII GIV GV GI.1, GI.2, GI.3, GII.1, GII.2, GII.3, GIII.1, GIII.2 GIV.1 GV.1 GI.4, GI.5, GI.6, GII.4, GII.5, GII.6, GI.7, GI.8 GII.7, GII.8, GII.9, GII.10, GII.11, GII.12, GII.13, GII.14, GII.15, GII.16, GII.17 İnsanları infekte eden norovirüsleri çoğaltmak için in vitro bir sistemin olmayışına bağlı olarak yaşam döngülerinin özellikleri, memeli hücre kültürlerinde üretilebilen diğer hayvanları infekte eden kalisivirüs ilgili çalışmalardan anlaşılabilmektedir [19]. Bunun yanında, son zamanlarda bir insan norovirüsü izole edilmiş ve viral RNA süspansiyonda yetiştirilmiş küçük epitel hücrelerinin olduğu beş pasajın her birinde üretilebilmiştir [20]. Ancak, bu sistemin çeşitli norovirüs genotiplerinin izolasyonu için uygun olup olmadığı henüz kesinleşmemiştir. Kalisivirüslerin replikasyonunda, viral kapsid hücre reseptörüne tutunduktan sonra virion hücre içine alınmaktadır. Poliproteinin translasyonuyla yapısal olmayan proteinler açığa çıkmaktadır. Bu proteinlerin, genomu replike eden enzimatik kompleksin içeriğinde olduğu ve antigenomik RNA yı sentezlediği varsayılmaktadır. Antigenomik RNA, subgenomik RNA için kalıp olarak kullanılmaktadır. Subgenomik RNA nın transkripsiyonuyla yapısal proteinler VP1 ve VP2 oluşturulmaktadır. Antigenomik RNA, aynı zamanda genomik RNA nın da kalıbıdır ve yapısal olmayan olgun proteinlerin translasyonunda görevlidir. Son olarak, genomik RNA nın paketlenmesini olgun virionun hücreden ayrılması izlemektedir (Şekil 2) [16]. DÜNYADA NOROVİRÜS EPİDEMİYOLOJİSİ Dünya genelinde beş yaş altı çocukların yaklaşık %12 sinin hastaneye yatışından norovirüs sorumludur. Her yıl, endüstrileşmiş ülkelerde yaklaşık pediatrik gastroenterit olgusuna, gelişmekte olan ülkelerde en az 1.1 milyon olguya ve ölüme yol açmaktadır [21]. Rotavirüs aşılarının kullanılmaya başlanmasıyla Amerika Birleşik Devletleri (ABD) gibi ülkelerde rotavirüs infeksiyonu prevalansında önemli derecede azalma kaydedilmiştir. Rotavirüs aşısının başarısıyla norovirüsün yakında dünya genelindeki pediatrik popülasyonda en önemli enterik patojen olacağı tahmin edilmektedir. Norovirüsler düşük miktardaki infektif dozu ( virüs), cansız yüzeylerdeki stabilitesi ve geleneksel temizlik yöntemlerine dirençli olmalarıyla enterik salgın patojeni olarak ideal özelliklere sahiptir [3]. Norovirüs salgınları hastaneler, bakımevleri, yolcu gemileri, okullar, çocuk yuvaları ve ordu gibi toplulukların bulunduğu yarı kapalı çevrelerde sık görülmektedir [22]. Salgınlar genellikle tüm yıl boyunca görülebilmesine rağmen, bazı yıllar mevsimsel salgınlar da görülmüştür. Bu salgın şekilleri kuzey ve güney yarımkürede farklılıklar göstermektedir. Kuzey yarımkürede norovirüs sebepli gastroenteritler kış mevsiminde ve ilkbaharın başlarında yaygın olarak görülmektedir ve bu sebeple kış kusma hastalığı olarak bilinmektedir. Güney yarımkürede ise salgınlarla en sık ilkbahar veya yaz mevsiminde karşılaşılmaktadır [1]. Norovirüs olgularının çoğundan GI ve GII ve bu genogrupların genetik kümeleri sorumludur yılından beri görülen gastroenterit epidemilerine genellikle GII neden olmuştur. GII nin genetik kümeleri arasında ise en sık GII.4 suşu ile karşılaşılmıştır. GII den sonra GI görülmekte ve nadir olarak da GIV saptanmaktadır [12]. ABD deki Centers for Disease Control and Prevention (CDC) ın 2009 yılındaki sürveyans raporuna göre ABD deki gıda kaynaklı hastalıkların %55 ine virüsler sebep olmakta ve bunların da %98 ini norovirüsler oluşturmaktadır [23]. ABD de her yıl yaklaşık 23 milyon norovirüs kaynaklı gastroenterit olgusu meydana gelmektedir [3]. 4

5 Norovirüsün Genomik Yapısı, Replikasyonu ve Epidemiyolojisi Altay A, Bozdayı G. Viral genomun zarfından 2 ayrılması 1 7 Genomik RNA Antigenomik RNA (A) n Subgenomik Poliprotein RNA 11 4 Yapısal olmayan proteinler NS3 NTPaz VPg NS6 proteinaz NS7 RdRp 10 Viral genomun paketlenmesi ve hücreden salınması Replikasyon kompleksi 5 Yapısal proteinler 9 Şekil 2. Kalisivirüslerin çoğalma döngüsü; 1. Bu virüslerin yaşam döngüsünde virüsün hücre reseptörüne tutunduktan sonra hücre içine alınması; 2. Kapsidin soyulması; 3. Poliproteinin translasyonu; 4. Yapısal olmayan proteinlerin sentezi; 5. Bu proteinlerin replikasyon kompleksini oluşturması; 6. Replikasyon kompleksinin antigenomik RNA yı sentezlemesi; 7. Antigenomik RNA nın genomik RNA nın sentezi için kalıp olarak kullanılması; 8. Antigenomik RNA nın subgenomik RNA nın sentezi için kalıp olarak kullanılması; 9. Subgenomik RNA dan yapısal proteinlerin (VP1, VP2) translasyonu; 10. Yapısal proteinlerin oluşması ve genomik RNA nın paketlenmesi; 11. Olgun virionun hücreden serbest kalması [16]. ABD de, yıllarındaki gastroenterit salgınlarının %55 inde GII US 95/96 suşu saptanmıştır. Bu etken yılları arasında tüm dünyaya yayılmıştır. GII ye bağlı gastroenteritler 2004 yılı boyunca Avrupa, ABD ve Avustralya da görülmüştür. Hollanda Ulusal Halk Sağlığı ve Çevre Enstitüsü 2002 yılında ve 2004 ün sonlarına doğru Avrupa ve Amerika daki norovirüs salgınlarında artış olduğunu bildirmiştir. GII.4 varyantı 2004 yılında Avustralya, Avrupa ve Asya da tanımlanmıştır [12,24]. Amerika Kıtası CDC kayıtlarına göre, Ocak 1996 tarihinden Haziran 1997 tarihine kadar bildirilen viral gastroenterit salgınlarının %96 sından norovirüsler sorumludur [1]. CDC Ulusal kalisivirüs laboratuvarının bildirdiğine göre, 2006 yılı boyunca ABD deki 126 salgından 761 dışkı örneği RT-PCR ile test edilmiş ve bunların %90 ında norovirüs olduğu gözlenmiş, %76 sı da iki yeni GII.4 varyantıyla (Minerva ve Laurens varyantları) ilişkilendirilmiştir [12]. Vega ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, Ekim 2009-Haziran 2010 tarihleri arasında ABD deki 21 eyalette meydana gelen 194 salgından toplanan fekal örnekler CDC ye gönderilmiş ve örneklerin 39 (%20) unda norovirüs GII.12 suşu saptanmıştır. Aynı dönemde CaliciNet teki bir veriye göre GII.12 suşu ABD deki 12 eyalette raporlanan 469 salgının 67 (%14) sine sebep olmuştur [25]. Ferreira ve arkadaşlarının Brezilya da, yılları arasında Rio De Janeiro da yaptıkları norovirüs infeksiyonları sürveyansı çalışmasında 1087 örnek test edilmiştir. Örneklerin %35.1 (381/1087) inin pozitif olduğu saptanmıştır. En sık saptanan genogrup GII ve genotip GII.4 olmuştur. Bunu GII.6, 3, 14, 7 ve 8 takip etmiştir. GI.3 ve GI.2 olmak üzere iki GI suşu da saptanmıştır [26]. Sao Paulo, Brezilya da 2010 ocak-mart ayları arasında büyük bir gastroenterit salgını meydana gelmiş ve 327 örnek immünenzimatik yöntemiyle norovirüs için test edilmiştir. Yapılan çalışmaya göre 107 5

6 Altay A, Bozdayı G. (%32.7) örnek ELISA pozitif bulunmuştur. Revers transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu yöntemiyle 52 örnek test edilmiş ve 33 (%63.5) ü pozitif olarak saptanmış ve GII ile ilişkilendirilmiştir. Örneklerin ikisi ise GI genogrubuna ait bulunmuştur [27]. O Ryan ve arkadaşlarının Şilili çocuklarda yapmış oldukları çalışmada, Temmuz 2006-Ekim 2008 tarihleri arasında akut ishal epizodu olan hastalardan toplanan örneklerde %26 (331/1913) oranında rotavirüs saptanırken, %18 (224/1913) oranında NoV saptanmıştır [28]. O Ryan ve arkadaşlarının 2009 yılında yayınladığı bir çalışmada Şili deki bir hastaneye başvuran 198 çocuk takip edilmiş ve değerlendirilen 145 akut ishal epizotunun %18 i norovirüs pozitif (GII) bulunmuştur. Toplanan 2278 dışkı örneğinin %8 inde asemptomatik norovirüs infeksiyonu saptanmıştır [29]. Avrupa Kıtası Norovirüs Avrupa da; İngiltere, Almanya, Hollanda gibi birçok ülkede salgınlara neden olmuştur. Bu ülkelerdeki artış GII.4 genotipinde yeni bir varyant norovirüsü ile ilişkilendirilmiş ve bu virüs ilk olarak 2002 yılı başlarında tespit edilmiştir [24]. Siebenga ve arkadaşlarının belirttiğine göre, Hollanda da norovirüsünün neden olduğu gastroenterit salgınları 1994 yılından 2005 yılına kadar yeni GII.4 suşlarıyla ilişkili üç epidemik mevsimde artmıştır [30]. Danimarka da 2005 yılının haziran-eylül ayları arasında altı noktada, kaynağı Polonya dan ithal edilen dondurulmuş ahududu olan norovirüs salgınları kaydedilmiştir. Salgınların beşindeki norovirüs türleri GII.4, GII.b ve GII.7 olarak tespit edilmiştir. Kaynağın çiftliklerdeki, fekal olarak kontamine olmuş sulama suyu olabileceği ya da virüsün çiftliklerde veya ürünün işlenmesi aşamasında çalışan işçilerden fekal-oral yolla bulaşmış olabileceği üzerinde durulmaktadır [31]. Avusturya nın Salzburg şehrinde, 2005 yılında meydana gelen bir salgında ise bir turist grubu infekte olmuştur. Salgının önce gıda kaynaklı olduğu düşünülmüş, ancak yapılan epidemiyolojik araştırma sonucunda salgından etkilenen kişilerde yağış sonrası şehirde meydana gelen su baskınları sırasında kanalizasyon suyu ile temas etme öyküsü tespit edildikten sonra salgının su kaynaklı olduğuna karar verilmiştir [32]. Almanya da, gastrointestinal infeksiyonlarla ilgili yapılan bir çalışmada Ocak 2002 tarihinden Aralık 2008 tarihine kadar toplam hasta norovirüs, rotavirüs, bakteriyel patojenler, Cryptosporidium parvum ve Giardia lamblia için test edilmiş ve norovirüs daha çok eylül-nisan aylarında saptanmıştır. En yüksek aktivite görülen aylar boyunca norovirüs için pozitif sonuçlar %10-49 olarak bulunmuştur [33]. Almanya da, uluslararası seyahat edip ishalle geri dönenlerde norovirüs prevalansı araştırması kapsamında Ağustos 2006 tarihinden Mayıs 2008 tarihine kadar 55 erkek hastadan 104 dışkı örneği toplanmış ve %15.7 sinde norovirüs infeksiyonu tanımlanmıştır [34]. Bulgaristan da, Mladenova ve arkadaşlarının 2008 yılında yayınladıkları ve Aralık 2006-Nisan 2007 tarihleri arasında bir salgın ve sporadik olgulardan toplanan 474 örnekte norovirüs varlığını araştırdıkları çalışmada 72 (%15) örnek enzim immünassay yöntemiyle norovirüs pozitif olarak saptanmıştır. Bunların 59 u RT-PCR ile doğrulanmıştır. GII.3, GII.4/2006a, GII.4/2006b, GII.20 ve GII. Karachi genotipleri tespit edilmiştir [5]. İspanya Majorca da, 2009 yılında ortaya çıkan bir otelin çocuk kulübüyle ilişkili bir gastroenterit salgınında ise Sanchez ve arkadaşları yapılan dışkı analizlerinde %50 oranında norovirüs GII genotipi saptamışlardır [35]. Phillips ve arkadaşlarının 2010 yılında yayımladığı, İngiltere de norovirüs ile ilişkili bulaşıcı bağırsak hastalıkları insidansı çalışmasında yıllarında test edilen dışkı örneklerinin %4.5 i norovirüs ile ilişkili bulunmuştur. Yaşı beşten küçük olan çocuklar arasında insidans %21.4 olarak saptanmıştır [36]. Hollanda da, 2011 yılında van Asten ve arkadaşlarının yayınladığı yaşlılarda spesifik olmayan gastroenteritler ve ölümlerle ilişkili norovirüs epidemileri çalışmasında 1999 yılından 2006 yılına kadar 65 yaş üzeri yaşlılar haftalık olarak sayılarak Poisson regresyon analizleri yapılmıştır. Her norovirüs salgını tahminen 26 spesifik olmayan gastroenteritle (%95 güven aralığı= 17-34), 2.2 hastaneye kaldırılmayla ( ) ve 0.14 ölümle ( ) ilişkilendirilmiştir [37]. Kele ve arkadaşlarının, Macaristan da 2011 yılında yayınladıkları bir çalışmada çeşitli üniversite hastanelerinden 61 sporadik ishalli dışkı örneği toplanmış ve RT-PCR ve ELISA yöntemleriyle 52 örnek norovirüs pozitif bulunmuştur. Örneklerin biri GI ge- 6

7 Norovirüsün Genomik Yapısı, Replikasyonu ve Epidemiyolojisi Altay A, Bozdayı G. nogrubu iken, diğerleri GII genogrubu olarak saptanmıştır [38]. Asya Kıtası Çin de, yılları arasında çocuklardaki norovirüs gastroenteritlerinin moleküler epidemiyolojisiyle ilgili yapılan bir sürveyans çalışmasında %13.1 (115/881) oranında norovirüs saptanmış, %26.1 (30/881) oranında ise rotavirüsle karışık infeksiyon tespit edilmiştir. Sekans analizleri 115 örneğin hepsinin GII genogrubuna ait olduğunu göstermiş ve GII.4 genotipinin en baskın olduğu görülmüştür [39]. Jin ve arkadaşlarının, Çin de yıllarındaki noroviral gastroenterit salgınları ve moleküler karakteristikleriyle ilgili yaptıkları çalışmada 19 gastroenterit salgınından toplanan 201 örnek RT-PCR ile test edilmiş ve sekans analizleri yapılmıştır. Norovirüslerin, 19 salgının 12 sinde tespit edilerek Çin de viral gastroenterit salgınlarına neden olan en baskın patojenlerden biri olduğu gösterilmiştir. GII.4/2006b suşunun, 12 salgının 11 inden sorumlu olduğu bulunmuştur. Saptanan diğer genotipler GII.17, GII.6 ve GII.3 tür [40]. Çin Beijing de, yetişkinlerdeki norovirüs ile ilişkili sporadik gastroenteritlerin klinik ve moleküler epidemiyolojik analizlerinin yapıldığı bir çalışmada Ekim 2007-Eylül 2008 tarihleri arasında 403 örnek toplanmış ve 48 (%11.9) örnekte norovirüs saptanmıştır. GII.4, GII.b, GII.6, GI.2, GI.3 ve GI.4 genotipleri tanımlanmıştır. GII.4/2006b en baskın suş olarak tespit edilmiştir [41]. Zeng ve arkadaşları ise, Ağustos 2008-Temmuz 2009 tarihleri arasında Çin deki beş metropolitan şehirde, ishalli çocuklarda norovirüs ve rotavirüs sürveyansı çalışması yapmışlar ve 5091 örnek toplamışlardır. Toplam 3528 rotavirüs negatif örneğin 1049 (%29.7) u norovirüs pozitif bulunmuştur. Toplam 1036 (%98.7) örnek GII genogrubu, 16 (%1.5) sı GI genogrubu ve üçü GI ve GII karışık olarak saptanmıştır [42]. Japonya da, yıllarında akut gastroenteritli çocuklarla yapılan bir çalışmada beş farklı şehirden 954 fekal örnek toplanmış ve %26.6 (254/954) oranında norovirüs saptanmıştır. GII (%97.3) ye GI (%2.7) den daha sık rastlanmıştır. GI sekanslarının hepsi GI.4 olarak saptanırken, GII sekanslarında GII.4 başta olmak üzere GII.14, GII.3 ve GII.6 genotipleri saptanmıştır [43]. Kore de bir ilkokulda 2008 yılında yiyecek kaynaklı bir norovirüs salgını meydana gelmiş ve 131 semptomatik kişi ve 11 yiyecek hazırlayan kişiden dışkı örnekleri toplanmıştır ve %45 (64/142) inde norovirüs pozitif bulunmuştur. İki yiyecek hazırlayan kişide norovirüs saptanmıştır [44]. Tayland da, Thongprachum ve arkadaşları yıllarında akut gastroenteritli çocuklardan 463 fekal örnek toplamış ve RT-PCR ile 62 pozitif örnek saptamışlardır. Norovirüs GII.3, GII.4, GII.6, GII.13, GII.15 ve GII.16 genotipleri tespit edilmiştir [45]. Tayvan da, Yang ve arkadaşlarının yaptığı 2009 yılında akut ishal ile hastaneye başvuran beş yaş altı çocuklarda yapılan norovirüs ve rotavirüs infeksiyonu ile ilgili çalışmada 989 olgunun %14.6 sında norovirüs saptanmıştır. GII %80.6 oranıyla baskın suş olarak tespit edilmiştir [46]. Avustralya Kıtası Bruggink ve arkadaşlarının Avustralya da yaptıkları bir çalışmada yıllarında meydana gelen salgınlarda GI.2, GII.4 ve GII.b genotipleri saptanmıştır [47]. Melbourne, Avustralya da yılları arasında, rotavirüs negatif olan gastroenteritli 272 çocuktan toplanan dışkı örnekleriyle yapılan bir çalışmada RT-PCR yöntemiyle %36 oranında pozitiflik saptanmıştır. En çok GII.4 ve GII.3 genogruplarıyla karşılaşılmıştır [48]. Türkiye de Norovirüs Türkiye deki gastroenteritlerde norovirüs prevalansı konusunda yapılmış fazla çalışma ve 2008 yılına kadar bildirilmiş norovirüs salgını bulunmamaktadır [49]. Altındiş ve arkadaşları, Kasım 2006 tarihinden Haziran 2007 tarihine kadar Türkiye nin Orta-Batı Anadolu Bölgesinde çocuklarda norovirüs infeksiyonu sıklığını araştırmışlar ve %17 (15/88) oranında norovirüs saptamışlardır. Dizi analizi sonuçlarına göre ise, çoğu suş GIIb/Hilversum olarak tanımlanırken, bir suş GII.4/2006a, bir suş GII.6 olarak tanımlanmıştır [50]. Aksaray, Şereflikoçhisar, Kırşehir ve Adana da 2008 yılının mayıs ayı sonundan itibaren salgınlar görülmüş ve sırasıyla 7, 4, 25 ve 14 olmak üzere toplam 50 örnek Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Baş- 7

8 Altay A, Bozdayı G. kanlığı Viroloji Referans ve Araştırma Laboratuvarına gönderilerek real-time PCR ve ELISA testleri yapılmıştır. ELISA testi yapılan 50 örneğin 13 (%26) ünde norovirüs antijeni saptanmıştır. Kırşehir den gönderilen 25 örneğin 10 u PCR için uygun bulunmamış ve çalışmaya alınamamıştır. Çalışmaya alınan 40 örneğin 13 (%33) ü norovirüs pozitif bulunmuştur. Norovirüs RNA varlığı saptanan 13 örneğin dokuzu GI, dördü GII genotipi olarak bulunmuştur. Sağlık Bakanlığı 2008 yılında ilk önce Aksaray da görülen gastroenterit olgularının Türkiye deki ilk norovirüs salgını olduğunu resmi olarak açıklamıştır [49]. Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı Viroloji Referans ve Araştırma Laboratuvarında 2009 yılında akut viral gastroenteritlerin değerlendirilmesi amacıyla 11 ayrı ilden toplam 147 dışkı örneği toplanmıştır. Örnekler multipleks real time PCR kiti (Fast-track Diagnostics, FTD Gastrointestinal pathogens, Luxemburg) ile norovirüs GI ve GII, rotavirüs, adenovirüs ve astrovirüs açısından incelenmiştir. Bir yıllık süreç içerisinde, araştırılan viral gastroenterit etkenlerinden norovirüs (özellikle GII) en sık olarak tespit edilen etken olmuştur. Balıkesir, Tokat, Kocaeli, Tunceli, Kastamonu, Ordu ve Sivas illerimizden gelen örneklerde esas etken olarak norovirüs GI veya GII tek tek veya birlikte tespit edilmiştir. Bu etkenler şubat ile ekim aylarında görülmüştür. GI %18 oranında saptanırken, GII %57 oranında saptanmıştır. %40 oranında GI-GII koinfeksiyonu, %20 oranında ise norovirüs GII-adenovirüs koinfeksiyonu görülmüştür [51]. Özkul ve arkadaşlarının İstanbul da Mayıs 2011 tarihinde ishalli çocuklarda norovirüs sıklığı ve filogenetik yapısını araştırdıkları bir çalışmada Cerrahpaşa Tıp Fakültesi ve Haseki Hastanesindeki ishalli çocuklardan 238 dışkı örneği toplanmış ve %15 inde norovirüs GII saptanmıştır. Bu örneklerin %72.2 si GII.4, %5.5 i GII.16, %16.7 si GIIb, %5.5 i ise GIIe dir [52]. SONUÇ Yapılan çalışmalar norovirüsün dünyada ve ülkemizde sporadik veya salgınlara sebep olacak şekilde gastroenteritlere neden olduğunu göstermektedir. Norovirüs salgınları sağlık sistemlerinde, turizm ve yemek endüstrisinde büyük bir ekonomik sıkıntı ortaya çıkarmakta ve ciddi iş gücü kayıplarına neden olmaktadır. Yeterli sıvı replasmanı yapılamayan hastalarda mortalite sebebi olabilmektedir. Özellikle beş yaş altı çocuklarda ve yaşlılarda daha yaygın olarak görülmektedir. En sık karşılaşılan genogrup GII ve onun genotipi GII.4 tür. Gıda ve su kaynaklı viral gastroenteritlerin içerisinde önemli bir yeri vardır. Oldukça bulaşıcı ve birçok çevresel etkene karşı dirençli olması sayesinde kısa sürede büyük popülasyonları etkileyebilmesi nedeniyle hızlı laboratuvar tanısı önemlidir. Bu hızlı tanıda daha çok ELISA ve immünkromatografi gibi yöntemler kullanılmaktadır. Ancak, tanı yöntemlerinin karşılaştırıldığı bazı çalışmalarda RT-PCR gibi moleküler yöntemler kullanıldığı zaman, ELISA ya göre daha yüksek oranda pozitiflik saptanmaktadır. Ayrıca, laboratuvar tarafından norovirüs tanısı konulması hastaların gereksiz antibiyotik kullanmasını da engellemiş olacaktır. Bu yüzden norovirüs testlerinin rutin kullanımda olmasının faydalı olacağını düşünmekteyiz. KAYNAKLAR 1. Thornton AC, Jennings-Conklin KS, McCormick MI. Noroviruses: agents in outbreaks of acute gastroenteritis. Disaster Manage Response 2004;2: Ustaçelebi Ş, Abacıoğlu H, Badur S. Norwalk virus. Ustaçelebi Ş, Abacıoğlu H, Badur S (editörler). Moleküler, Klinik ve Tanısal Viroloji. 1. Baskı. Ankara: Güneş Kitabevi, 2004: Koo HL, Ajami N, Atmar RL, Dupont HL. Noroviruses: the principal cause of foodborne disease worldwide. Discov Med 2010;10: Siebenga JJ, Vennema H, Zheng DP, Vinjé J, Lee BE, Pang XL, et al. Norovirus illness is a global problem: emergence and spread of norovirus GII.4 variants, J Infect Dis 2009;200: Mladenova Z, Korsun N, Geonova T, Di Bartolo I, Fiore L, Ruggeri FM, et al. Prevalence and molecular epidemiology of noroviruses detected in outbreak and sporadic cases of gcute gastroenteritis in Bulgaria. J Med Virol 2008;80: Atmar RL, Estes MK. Diagnosis of noncultivatable gastroenteritis viruses, the human caliciviruses. Clin Microbiol Rev 2001;1: Rabenau HF, Stürmer M, Buxbaum S, Walczok A, Preiser W, Doerr HW. Laboratory diagnosis of norovirus: Which method is the best? Intervirology 2003;46: Bruin E, Duizer E, Vennema H, Koopmans MPG. Diagnosis of norovirus outbreaks by commercial ELISA or RT-PCR. J Virol Methods 2006;137: Vipond IB, Pelosi E, Williams J, Ashley CR, Lambden PR, Clarke IN, et al. A diagnostic EIA for detection of the prevalent SRSV strain in United Kingdom outbreaks of gastroenteritis. J Med Virol 2000;61:

9 Norovirüsün Genomik Yapısı, Replikasyonu ve Epidemiyolojisi Altay A, Bozdayı G. 10. Richards GP, Watson MA, Fankhauser RL, Monroe SS. Genogroup I and II noroviruses detected in stool samples by real-time reverse transcription-pcr using highly degenerate universal primers. Appl Environ Microbiol 2004;70: Mohamed N, Belak S, Hedlund KO, Blomberg J. Experience from the development of a diagnostic single tube real-time PCR for human caliciviruses, norovirus genogroups I and II. J Virol Methods 2006;132: Donaldson EF, Lindesmith LC, Lobue AD, Baric RS. Norovirus pathogenesis: mechanisms of persistence and immune evasion in human populations. Immunol Rev 2008;225: Tan M, Fang P, Chachiyo T, Xia M, Huang P, Fang Z, et al. Noroviral P particle: structure, function and applications in virus-host interaction. Virology 2008;382: Bull RA, White PA. Mechanisms of GII.4 norovirus evolution. Trends Microbiol 2011;5: Prasad BV, Hardy ME, Dokland T, Bella J, Rossmann MG, Estes MK. X-ray crystallographic structure of the norwalk virus capsid. Science 1999;286: Rohayem J, Bergmann M, Gebhardt J, Gould E, Tucker P, Mattevi A, et al. Antiviral strategies to control calicivirus infections. Antiviral Research 2010;87: Asanaka M, Atmar RL, Ruvolo V, Crawford SE, Neill FH, Estes MK. Replication and packaging of Norwalk virus RNA in cultured mammalian cells. PNAS 2005;29: Kapikian AZ. The discovery of the 27-nm NV: an historic perspective. J Infect Dis 2000;181(Suppl): Guix S, Asanaka M, Katayama K, Crawford SE, Neill FH, Atmar RL, et al. Norwalk virus RNA is infectious in mammalian cells. J Virol 2007;81: Straub TM, Höner zu Bentrup K, Orosz-Coghlan P, Dohnalkova A, Mayer BK, Bartholomew RA, et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis 2007;13: Patel MM, Widdowson MA, Glass RI, Akazawa K, Vinje J, Parashar UD. Systematic literature review of role of noroviruses in sporadic gastroenteritis. Emerg Infect Dis 2008;8: Lopman BA, Reacher M, Gallimore C, Adak GK, Gray JJ, Brown DWG. A summertime peak of winter vomiting disease: surveillance of noroviruses in England and Wales, 1995 to BMC Public Health 2003 ( 23. Centers for Disease Control and Prevention, Surveillance for foodborne disease outbreaks-united States. MMWR 2006;58: Akçalı A, Esen B. Norovirus Outbreaks in Some European Countries. AER 2005;4: Vega E, Vinje J. Novel GII.12 Norovirus Strain, United States, Emerg Infect Dis 2011;17: Ferreira MSR, Victoria M, Carvalho-Costa FA, Vieira CB, Xavier MPTP, Fioretti JM, et al. Surveillance of Norovirus Infections in the State of Rio De Janeiro, Brazil J Med Virol 2010;82: Morillo SG, Lunchs A, Cilli A, Ribeiro CD, Calux SJ, Carmona RCC, et al. Large gastroenteritis outbreak due to norovirus GII in Sao Paulo, Brazil, summer 2010 (Letter to Editor). Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2011;53: O'Ryan ML, Peña A, Vergara R, Diaz J, Mamani N, Cortes H, et al. Prospective characterization of norovirus compared with rotavirus acute diarrhea episodes in Chilean children. Pediatr Infect Dis J 2010;29: O Ryan ML, Lucero Y, Prado V, Santolaya ME, Rabello M, Solis Y, et al. Symptomatic and asymptomatic rotavirus and norovirus infections during infancy in a Chilean birth cohort. Pediatr Infect Dis J 2009;28: Siebenga JJ, Vennema H, Duizer E, Koopmans MPG. Gastroenteritis caused by norovirus GGII.4, the Netherlands, Emerg Infect Dis 2007;13: Falkanhorst G, Krusell L, Lisby M, Madsen SB, Böttiger B, Molbak K, et al. Imported frozen raspberries cause a series of norovirus outbreaks in Denmark, Eurosurveillance 2005;10: Schmid D, Lederer I, Much P, Pichler AM, Allerberger F. Outbreak of norovirus infection associated with contaminated flood water, Salzburg, Eurosurveillance 2005;10: Terletskaia-Ladwig E, Eggers M, Enders M, Regnath T. Epidemiological aspects of gastrointestinal infections. Dtsch Med Wochenschr 2011;136: Apelt N, Hartberger C, Campe H, Löscher T. The Prevalence of Norovirus in returning international travelers with diarrhea, BMC Infect Dis 2010;10: Domenech-Sanchez A. Gastroenteritis outbreak caused by norovirus associated with the children s club of a hotel located in Majorca, Spain. Clin Microbiol Infect 2011;17: Phillips G, Tam CC, Conti S, Rodrigues LC, Brown D, Iturriza-Gomara M, et al. Community Incidence of norovirus-associated infectious intestinal disease in england: improved estimates using viral load for norovirus diagnosis. Am J Epidemiol 2010;171: van Asten L, Siebenga J, van den Wijngaard C, Verheij R, van Vliet H, Kretzschmar M, et al. Unspecified gastroenteritis illness and deaths in the elderly associated with norovirus epidemics. Epidemiology 2011;22: Kele B, Lengyel G, Deak J. Comparison of an ELISA and two reverse transcription PCR methods for norovirus detection. Diagn Microbiol Infect Dis 2011;70: Dai Y, Hu G, Zhang X, Song C, Xiang W, Wu X, et al. Molecular epidemiology of norovirus gastroenteritis in children in Jiangmen, China, Arch Virol 2011;156:

10 Altay A, Bozdayı G. 40. Jin M, Sun JL, Chang ZR, Li HY, Liu N, Zhang Q, et al. Outbreaks of noroviral gastroenteritis and their molecular characteristics in China, Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi 2010;31: Gao Y, Jin M, Cong X, Duan Z, Li HY, Guo X, et al. Clinical and molecular epidemiologic analyses of norovirus-associated sporadic gastroenteritis in adults from Beijing, China. J Med Virol 2011;83: Zeng M, Chen J, Gong ST, Xu XH, Zhu CM, Zhu QR. Epidemiological surveillance of norovirus and rotavirus diarrhea among outpatient children in five metropolitan cities. Zhonghua Er Ke Za Zhi 2010;48: Chan-It W, Thongprachum A, Okitsu S, Nishimura S, Kikuta H, Baba T, et al. Detection and genetic characterization of norovirus infections in children with acute gastroenteritis in Japan, Clin Lab 2011;57: Yu JH, Kim NY, Koh YJ, Lee HJ. Epidemiology of foodborne norovirus outbreak in Incheon, Korea. J Korean Med Sci 2010;25: Thongprachum A, Khamrin P, Chaimongkol N, Malasao R, Okitsu S, Mizuguchi M, et al. Evaluation of an immunochromatography method for rapid detection of noroviruses in clinical specimens in Thailand. J Med Virol 2010;82: Yanga SY, Hwanga KP, Wu FT, Wu HS, Hsiung CA, Chang WC, et al. Epidemiology and clinical peculiarities of norovirus and rotavirus infection in hospitalized young children with acute diarrhea in Taiwan. J Microbiol Immunol Infect 2010;43: Bruggink L, Marshall J. The relationship between health care and nonhealth care norovirus outbreak settings and norovirus genotype in Victoria, Australia, J Microbiol Immunol Infect 2011;44: Mahar JE, Kirkwood CD. Characterization of norovirus strains in Australian children from 2006 to 2008: prevalence of recombinant strains. J Med Virol 2011;83: Uyar Y, Carhan A, Ozkaya E, Ertek M. Evaluation of laboratory diagnosis of the first Norovirus outbreak in Turkey in Mikrobiyol Bul 2008;42: Altindis M, Banyai K, Kalayci R. Frequency of norovirus in stool samples from hospitalized children due to the acute gastroenteritis in Anatolia, Turkey, Scand J Infect Dis 2009;41: Albayrak N, Yağcı Çağlayık D, Altaş AB, Korukluoğlu G, Ertek M yılı akut viral gastroenterit verilerinin değerlendirilmesi. Turk Hij Den Biyol Derg 2011;68: Ozkul AA, Kocazeybek BS, Turan N, Reuter G, Bostan K, Yilmaz A, et al. Frequency and phylogeny of norovirus in diarrheic children in Istanbul, Turkey. J Clin Virol 2011;51: Yazışma Adresi/Address for Correspondence Doç. Dr. Gülendam BOZDAYI Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Beşevler, Ankara-Türkiye E-posta: gbozdayi@hotmail.com 10