Moleküler Biyofizik Yöntemler. Doç. Dr. Handan Akçakaya

Transkript

1 Moleküler Biyofizik Yöntemler Doç. Dr. Handan Akçakaya

2 İdeal biyofiziksel yöntemler; biyolojik moleküllerin yapı ve dinamiklerini fizyolojik ortamlarda (yani in vivo koşullarda) atomik düzeyde incelemeye ve konformasyonel değişiklik ve kimyasal reyaksiyon sürecini görselleştirmeye elverişli olmalıdır.

3 Organizmaların ve bileşenlerinin büyüklükleri

4 Biyolojik Zaman Ölçeği

5 Yapısal Yöntemler Nükleer Magnetik Görüntüleme (NMI) X-ışını kırınımı Elektron Mikroskobu Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) Scanning Elektron Microscope (SEM)

6 Spektroskopik yöntemler Ultraviyole-görünür bölge absorpsiyon spektroskopisi Floresans ve fosforesans spektroskopisi Atomik absorpsiyon spektroskopisi Atomik emisyon ve atomik floresans spektroskopisi İnfrared (IR)spektroskopisi Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi Kütle spektrometrisi

7 Ligant bağlama Termodinamik Yöntemler Kompleks denge ve protein katlanması Calorimetri Fizik temelli simülasyon ve moleküler dinamik

8 Hidrodinamik Metotlar Dinamik ışık saçılması Ultrasantrifüj Elektroforez ve kromatografi

9 Tümleşik (entegre) yöntemler Biyoinformatik: (Genomik bilginin analizi) Fonksiyonel proteomiks: (Hücrede bulunan bütün proteinlerin tanımlanması) Yapısal proteomiks: (Protein yapılarının belirlenmesi) Dinamik proteomiks: (Protein populasyonlarının oluşturduğu cevapların belirlenmesi)

10 Spektroskopi, bir örnekteki atom, molekül veya iyonların, bir enerji düzeyinden diğerine geçişleri sırasında absorplanan veya yayılan elektromanyetik ışımanın ölçülmesi ve yorumlanmasıdır.

11

12 Spektrum ve Moleküler Etkiler

13 Ultraviyole-görünür bölge absorpsiyon spektroskopisi Çözelti içindeki madde miktarını çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanarak ölçme işlemine fotometri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da fotometre denir.fotometrik ölçümde, renksiz çözeltilerin konsantrasyonu da ölçülebilir.

14 Infrared (IR) spektroskopisi Molekülleri oluşturan atomların sürekli bir hareket içinde olmaları, molekülün öteleme hareketleri, bir eksen etrafında dönme hareketleri ve bir kimyasal bağın uzunluğunun periyodik olarak azalıp çoğalmasına veya moleküldeki açıların periyodik olarak değişmesine bağlı olarak titreşim hareketleri yapmalarına neden olur.

15 Infrared (IR) spektroskopisi Moleküllerde ortaya çıkan titreşimler, gerilme ve eğilme hareketlerini oluşturur. Infrared (IR) spektroskopisi moleküllerdeki çesitli bağların titresim frekanslarını ölçer ve moleküldeki fonksiyonel gruplar hakkında bilgi verir.

16

17

18

19 IR-Aktif ve IR-Aktif Olmayan Bağlar Polar bağlar genelde IR-aktiftir. Simetrik bir moleküldeki apolar bağlar zayıf absorbasyon gösterirler veya hiç absorbasyon göstermezler (IR-aktif değildir).

20 Moleküllerin infrared absorpsiyon bandlarında iki bölge tanımlanır. İnfrared bölgesinin cm-1arasında kalan kısmı fonksiyonel grup bölgesidir; < 1000 cm-1 bölgesi parmak izi bölgesidir.

21

22 İnfrared bölgesinin parmak izi bölgesinde gözlenen bandların tümü incelenen moleküle özgüdür. Moleküllerin infrared spektrumları yardımıyla yapılarının aydınlatılması bu yöntemin en yaygın olarak kullanıldığı alandır. Bilinmeyen maddelerin infrared spektrumları, şüphenilen maddelerin aynı koşullarda çekilen spektrumları ile veya katologlarda bulunan spektrumlarla karşılaştırılır. Bunun için kullanılan cihazlar, infrared absorpsiyon spektrofotometreleridir.

23

24 Floresans ve fosforesans spektroskopisi yöntemleri Bir atom veya molekülde elektronların en düşük enerjili orbitallere yerleşimi ile atom veya molekülün temel enerji düzeyi veya temel hali oluşur. Elektronların daha üst enerji düzeylerine yerleşmesi ile atom veya molekülün uyarılmış hali oluşur.

25 Uyarılmış bir singlet sistemden temel haldeki singlet bir sisteme geçiş sırasında yayılan ışığa floresans, uyarılmış bir triplet sistemden temel haldeki singlet bir sisteme geçiş sırasında yayılan ışığa ise fosforesans denir. Uyarılma (eksitasyon) ortadan kalkınca floresans olayı, s; fosforesans ise s sürer.

26

27 Atomik absorpsiyon spektroskopisi (AAS) AAS, ışığın gaz halindeki atomlar tarafından absorpsiyonunun ölçülmesi ilkesine dayanır. Bu ilkeye göre madde konsantrasyonu tayini yapmada kullanılan cihazlar atomik absorpsiyon spektrofotometreleridir. Işığı absorplayan atomlar, temel enerji düzeyinden karasız uyarılmış enerji düzeylerine geçerler ve absorpsiyon miktarı, temel düzeydeki atom sayısına bağlıdır.

28 Atomik absorpsiyon spektrofotometrelerinin en önemli bileşenleri, analiz elementinin absorplayacağı ışımayı yapan ışık kaynağı, örnek çözeltisinin atomik buhar haline getirildiği atomlaştırıcı, çalışılan dalga boyunun diğer dalga boylarından ayrıldığı monokromatör ve ışık şiddetinin ölçüldüğü dedektördür.

29 Atomik absorpsiyon spektrofotometrelerinde ışık kaynakları Oyuk katot lambaları,düşük basınçta neon veya argon gibi bir asal gazla doldurulmuş silindir biçiminde lambalardır. Katot, oyuk bir silindir şeklindedir ve analiz elementinden yapılmıştır. Anot ise tungsten veya nikelden yapılmış bir teldir. Anot ile katot arasına voltluk bir gerilim uygulandığında lamba içindeki asal gaz atomları iyonlaşır. Oluşan iyonlar katoda çarparak yüzeydeki metal atomlarını koparır ve uyarırlar. Uyarılan atomlar temel enerji düzeyine dönerken katot elementine özgü dalga boyundaki ışımayı yayarlar.

30 Atomik absorpsiyon spektrofotometrelerinde atomlaştırıcı (absorpsiyon hücresi), örnekteki iyonlardan ve moleküllerden, analizi yapılacak elementin temel düzeydeki atom buharının oluşturulduğu bölümdür. Alevli atomlaştırıcılarda örnek çözeltisi aleve havalı bir sisleştirici yardımı ile püskürtülür. Alevli atomik absorpsiyon spektrofotometresinde alevin oluşturulması için kullanılan yakıcılar önkarıştırmasız ve ön-karıştırmalı olmak üzere iki türdür.

31 Atomik absorpsiyon spektrofotometrelerinde monokromatörün görevi, oyuk katot lambasının yaydığı, incelenen elementin rezonans hattını diğer hatlardan ayırmaktır. Atomik absorpsiyon spektroskopisinde ışık sinyalinin elektrik sinyaline dönüştürülmesi için, fotoçoğaltıcı tüpler kullanılır. Dedektör, alternatif akım sinyaline cevap verecek şekilde yapılmıştır.

32 Atomik absorpsiyon spektroskopisi, özellikle eser miktarlardaki elementlerin nicel analizleri için çok yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.

33 Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi Rezonans, fizikte bir sistemin bazı frekanslarda diğerlerine nazaran daha büyük genliklerde salınması eğilimidir. Bunlar, o sistemin rezonans (tınlaşım) frekansları olarak adlandırılır. Bu frekanslarda küçük periyodik kuvvetler bile çok büyük genlikler üretebilir.

34 Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi Atomu oluşturan yüklü taneciklerden elektronlar, kendi etraflarında dönerler yani bir spin hareketi yaparlar. Atom çekirdeklerinin çoğu da spin hareketi yaparlar. Atom çekirdeklerinde proton ve nötron sayıları çift sayılı ise ( 4 He, 12 C, 16 O gibi) bu çekirdeklerin net spini yoktur.

35 Kendi ekseni etrafında dönen yüklü bir parçacık, dairesel bir elektrik alanı oluşturur ve bu akım bir manyetik alan yaratır. Spin hareketi yapan yüklü bir tanecik, küçük bir mıknatıs gibi davranır ve dolayısıyla dıştan uygulanan bir manyetik alandan etkilenir. Manyetik alan içinde tutulan yüklü bir taneciğin oluşturduğu manyetik dipol, bu alan içinde Lamor dönmesi hareketini yapar.

36 Presesyon hareketi Larmour (Lamor)frekansı ile titreşim

37

38 Manyetik alan etkisinde olan ve spin hareketi yapan ve net spini olan çekirdek h enerjisine sahip bir ışıma ile etkileşirse, bu ışımanın frekansı Larmour hareketinin frekansına eşit olduğu zaman rezonans koşulu sağlanmış olur ve ışık absorplanır.

39 Manyetik alan içinde tutulan bir çekirdeğin elektromanyetik ışımayı önemli ölçüde absorplaması için, örnek içerisindeki bolluğu çok olmalı ve büyük bir manyetik moment değerine sahip olmalıdır. Bu iki özelliği bir arada taşıyan çekirdekler 1 H, 19 F, 31 P dur.

40 Uygun bir radyo dalgası fotonu ile etkileştiğinde proton manyetik rezonansa gireceğinden 1 H-NMR yöntemiyle bir örnekte hidrojen atomu olup olmadığını anlamak ve varsa ne kadar hidrojen atomu olduğunu ölçmek mümkündür. Farklı kimyasal çevreye sahip çekirdeklerin uygulanan radyo dalgası fotonu ile farklı manyetik alanlarda rezonansa girmesine kimyasal kayma denir. Kimyasal kayma değerlerini birbirleri ile karşılaştırabilmek ve tablo haline getirebilmek için incelenen örnekle beraber bir karşılaştırma maddesinin de kullanılması gerekir.

41 Sulu olmayan çözeltilerde kullanılan karşılaştırma maddesi tetrametil silandır [TMS, Si(CH 3 ) 4 ]. Bu madde, örnek çözeltisine %5 oranında eklenir. Sulu çözeltilerde karşılaştırma maddesi olarak 2,2-dimetil-2-silapentan-5-sulfonik asit sodyum tuzu kullanılır. TMS nin proton rezonansına ait pikin kimyasal kayma değeri sıfır kabul edilir ve öteki piklerin kimyasal kayma değerleri TMS ninkine göre verilir. Bu tür kimyasal ölçeğe ölçeği adı verilir. Bir başka ölçek olan ölçeğinde TMS nin kimyasal kayma değeri 10 olarak alınır.

42

43

44

45 Nükleer manyetik rezonans spektrometrelerinde, numune sabit frekansta bir elektromanyetik enerjiyle ışınlanırken, manyetik alan şiddeti sürekli olarak değiştirilecek şekilde tasarlanabilir. Taramalı spektrometre ve pulslu spektrometre gibi NMR spektrometreleri vardır.

46

47

48

49 NMR spektrumları, daha çok saf haldeki bileşiklerin nitel analizinde ve yapılarının belirlenmesinde kullanılır. 1 H-NMR için, mg ağırlığında örnek 0,5 ml çözücüde çözülerek 15 cm uzunluğunda ve 0,5 cm çapında bir tüp içinde manyetik alana yerleştirilir. Nitel analizde kimyasal kayma değerleri tablolardaki değerlerle karşılaştırılır. NMR spektroskopisi ile nicel analiz de gerçekleştirilebilir. Ancak bu amaçla kullanılırken yöntemin duyarlılığı çok azdır.

50 Mikrodalga enerji bölgesine düşen doğal frekanslı magnetik rezonansa da elektron spin rezonans (ESR) ya da elektron paramagnetik rezonans (EPR) denir

51 NMR görüntüleme yöntemi olarakta kullanılır. Bu amaç için durgun magnetik alana ek olarak bir alan gradyenti de gerekir. Böylece magnetik sistemin (örneğin)farklı kısımları farklı şiddette magnetik alan etkisinde kaldıkları için farklı rezonansa ulaşır. Sonuçta elde edilen NMR sinyalleri örnek içinde farklı doğrultularda uygulanmasıyla örneğin iki ve üç boyutlu görüntüleri elde edilir.

52

53 Dokudaki hidrojen atomlarının yoğunluklarına ve hareketlerine göre görüntü oluşturur. MR da radyasyon kullanılmaz, onun yerine manyetik alanla vücuttaki hidrojen atomlarının çekirdeklerindeki proton uyarılır. Alıcılara ulaşan sinyaller bilgisayar analizleriyle siyah beyaz görüntülere (Perfüzyon görüntülemelerde sonuçlar renklendirilebilir) dönüştürülür.

54 MR cihazı adından kolayca anlaşılacağı üzere manyetizmaya dayanır. Cihaz manyetik alan altında atomların manyetik alan yönüne yönelmesi ve belirli bir frekansta salınım yapmalarına dayanır. Üzerlerine radyo dalgaları uygulanan bu atomlar belirli bir frekansta bu radyo dalgalarını geri yansıtacaklardır. Bu yansıyan dalgaları alan MR cihazı görüntüleri oluşturur.

55 Cihazda bulunan güçlü mıknatıslar, insan hücresinde bulunan atom çekirdeklerinin titreşim yapmasını sağlayacak alanlar yaratır. Titreşen atomlar üzerine gönderilen radyo dalgaları onların salınım yapmalarını sağlayacak ve bu salınımların sonucunda bu atomlar bir radyo dalgası yayılımı yapmaya başlayacaklardır. Bu yayımlanan dalgalar bir bilgisayar yardımıyla hareketsiz veya hareketli üç boyutlu görüntüler oluşturur. MR cihazının vücuttaki etkili kullanım alanları yumuşak dokulardır. MR yumuşak dokularda maksimum kontraslama ve görüntüleme sağlar. Bu sayede yumuşak dokulardaki lezyon ve patolojik oluşumlar kolayca incelenebilir.

56 Merkezi sinir sistemi, beyin ve omurilik hastalıklarının teşhisinde, sporcu yaralanmalarında, kas iskelet sistemi, özellikle menisküs, bel fıtığı gibi rahatsızlıkların tespitinin yanı sıra her türlü nörolojik hastalıklar değerlendirmesinde sıkça kullanılmaktadır.

57 Bu amaçla kullanılan manyetik alan 1-1,5 Tesla aralığındadır. Bir kıyaslama yapmak gerekirse, dünyanın manyetik alanı (pusulaların iğnesini kuzeye çeviren manyetik alan) 0,5 Gauss düzeyindedir. 1 Tesla, Gauss a eşittir. Dolayısıyla MR cihazında dünyanın manyetik alan gücünün yaklaşık 20 bin katı bir manyetik alan kullanılır.

58 İncelenen bölgenin her düzlemde kesit görüntüsü veya üç boyutlu görüntüleri elde edilebilir. MR incelemelerinin büyük çoğunluğu herhangi bir ön hazırlık gerektirmeden yapılır. 58 /3 6

59 MR görüntülemenin, canlı organizma üzerinde şu ana kadar kanıtlanmış herhangi bir zararı yoktur. Buna gebeler de dahildir; ama yine de organ gelişiminin gerçekleştiği ilk üç ayda MR çekimi önerilmez. Metal etkileşimi olan, vücudunda mıknatıs ya da metal protez taşıyan, kalp pili kullanan, göz içinde yabancı cisim bulunan, ateşli silah yaralanması geçirmiş olan (çoğu uyumsuz metaldir) ya da kalıcı dövme sahibi kişilerin MR cihazına girmeleri sakıncalı kabul edilir (hayati tehlike doğurabilir).

60 Kütle spektrometrisi yönteminde, atom veya moleküllerden gaz fazında iyonlar oluşturulur ve bu iyonlar kütlelerine göre birbirinden ayrılarak kaydedilir. İyonların bağıl miktarlarının (kütle/yük) oranlarına göre çizilmiş grafiğine kütle spektrumu denir.

61

62 Bir maddenin kütle spektrumunun elde edilebilmesi için bunun önce gaz fazına geçirilmesi ve daha sonra iyonlaştırılması gerekir. Örnek önce kütle spektrometresinin vakum altında tutulan giriş kısmına gönderilir ve madde gaz fazında değilse, ısıtılarak gaz fazına geçmesi sağlanır. Gaz haline getirilmiş maddenin molekülleri ince bir delikten difüzyon ile iyonlaşma bölgesine sızarlar.

63

64 Kütle spektrometresinde iyonlaştırma bölgesinde elde edilen iyonlar, elektrikle yüklü plakalara doğru çekilerek hızlandırılır ve kütle ayırıcısına gönderilir. Kütle ayırıcıları, manyetik, uçuş zamanlı, dört kutuplu ve iyon siklotron rezonanslı olmak üzere dört türdür. En çok kullanılan kütle ayırıcısı, manyetik ayırıcıdır. Kütle spektrometresinde kütle ayırıcısından geçen iyonlar dedektör tarafından algılanır.

65

66 Kütle Spektrumu

67 Dinamik Işık Saçılması Dinamik ışık saçılımı methodu (DLS) seyreltik çözelti içerisindeki küçük parçacıklardan saçılan ışığın şiddetinin ve değişiminin ölçülmesi temeline dayanır. Saçılan ışığın şiddetindeki değişim, parçacığın hareketine buna bağlı olarak da parçacığın büyüklüğüne, ortamın vizkozitesine ve sıcaklığa bağlıdır. Kolloyidal süspansüyonlar iki temel ışık saçılımı yöntemiyle karakterize edilir.

68 Dinamik Işık Saçılması Işık kaynağı olarak kullanılan lazer ile örnek çözeltinin konulduğu cam küvet arasında kalan söndürücü, lazer ışığının belirli bir şiddet değeri arasında kalmasını sağlar. Örneğin, büyük partiküllerin yer aldığı bir örnek veya derişik bir örnek ışığı daha fazla saçacağı için sağlıklı bir ölçüm için ışık şiddetinin düşürülmesi gerekmektedir. Küçük partiküllerin yer aldığı başka bir örnek için veya seyreltik bir örnek için de bu durumun tam aksi geçerlidir, yani ışık şiddeti artırılmalıdır.

69 Dinamik Işık Saçılması Cihazı Çalışma Mekanizması

70

71 Biyoinformatik Matematik ve İstatistik Bilgisayar bilimleri Biyoloji ve Fizik

72 DNA dizileme çalışmaları Protein dizi çalışmaları Makromoleküllerin yapılarının üç boyutlu dizilimleri Küçük moleküllerin ligandlarla ilişkilerinin araştılırılması Biyolojik bilginin paylaşımının kolaylaştırılması Bilgisayar ile otomize edilmiş veri analizi Etkileşimde bulunan gen ürünleri için veritabanları oluşturulması Biyolojik faaliyet süreçlerinin simülasyonu Büyük çaplı projelerden çıkan sonuçların değerlendirilmesi (genom projeleri)

73 Protein yapı ve fonksiyonunun belirlenmesi Her hangi bir biyolojik fonksiyonu artıran veya azaltan moleküllerin tasarlanması Karmaşık genetik işlev veya düzenlenmenin tanımlanması Tıbbi ya da endüstriyel amaçlı yeni makromoleküller üretilmesi Genetik faktörlerin hastalık yatkınlığına etkilerinin ortaya çıkarılması

74 Protein Dizisinden Yapısına APRKFFVGGNWKMNGDKKS LGELIHTLNGAKLSADTEV VCGAPSIYLDFARQKLDAK IGVAAQNCYKVPKGAFTGE ISPAMIKDIGAAWVILGHS ERRHVFGESDELIGQKVAH ALAEGLGVIACIGEKLDER EAGITEKVVFEQTKAIADN VKDWSKVVLAYEPVWAIGT GKTATPQQAQEVHEKLRGW LKSHVSDAVAQSTRIIYGG SVTGGNCKELASQHDVDGF LVGGASLKPEFVDIINAKH =

75 5 3 DNA mrna Polipeptid Protein Protein kodlayan bölgeleri nasıl bulacağız? intronları ve eksonları nasıl ayıracağız? Transkripsiyon Splicing Translasyon Katlanma Protein dizilerini nasıl karşılaştıracağız? Hangi durumda hangi genler çalışıyor? Özel bir protein hakkında ne biliyoruz? İşlev işlev Transport / Lokalizasyon Oligomerizasyon PTM (Post-Translational Modification) Protein yapılarını tahmin edebilir miyiz?