ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ İlknur SOLMAZ BAZI KARPUZ GENOTİPLERİNİN SSR ve SRAP MARKÖRLERİ İLE KARAKTERİZASYONU ve FUSARIUM SOLGUNLUĞU (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) NA DAYANIMLARININ KLASİK ve MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAZI KARPUZ GENOTİPLERİNİN SSR ve SRAP MARKÖRLERİ İLE KARAKTERİZASYONU ve FUSARIUM SOLGUNLUĞU (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) NA DAYANIMLARININ KLASİK ve MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI İlknur SOLMAZ DOKTORA TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Bu Tez.../.../...Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza İmza..... İmza... Prof. Dr. Nebahat SARI Doç Dr. Yıldız AKA KAÇAR Doç. Dr. Şener KURT I. DANIŞMAN II. DANIŞMAN ÜYE İmza... Doç. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ ÜYE İmza Doç. Dr. Halit YETİŞİR ÜYE Bu tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF2006D28 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA TEZİ BAZI KARPUZ GENOTİPLERİNİN SSR VE SRAP MARKÖRLERİ İLE KARAKTERİZASYONU VE FUSARIUM SOLGUNLUĞU (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) NA DAYANIMLARININ KLASİK VE MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI İlknur SOLMAZ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Nebahat SARI II. Danışman : Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR Yıl : 2010, Sayfa: 140 Jüri : Prof. Dr. Nebahat SARI Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR Doç. Dr. Şener KURT Doç. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ Doç. Dr. Halit YETİŞİR Bu çalışmada, Çukurova Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü karpuz genetik kaynak koleksiyonunda yer alan toplam 93 genotip arasındaki genetik çeşitlilik SSR ve SRAP markörleri ile değerlendirilmiştir. Araştırmada, 14 SSRprimeri ve 31 SRAP primer kombinasyonu kullanılmıştır. En yüksek polimorfizm oranı, % 100 ile SSR markörlerinden elde edilmiş ve bunu % 97.3 ile SRAP markörleri izlemiştir. Moleküler karakterizasyon sonucu elde edilen verilerle yapılan kümeleme (cluster) analizlerine göre Türkiye nin değişik bölgelerinden toplanan Citrullus lanatus var. lanatus alt türüne ait karpuz genotiplerinin genetik olarak birbirine yakın olduğu ve birlikte kümelendiği tespit edilmiştir. Bu sonuç temel koordinat analizleri ile de desteklenmiştir. Fusarium solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na karşı dayanımın klasik yöntemle değerlendirilmesiyle elde edilen ortalama hastalık oluşum düzeyi, ırk 0 için % 25.9, ırk 1 için % 39.4 ve ırk 2 için ise % 67.0 olarak bulunmuştur. 1 no lu ırk için RAPD primeri OPP01 ile yapılan moleküler taramada 700 bp bandı, yalnızca Kar 26 ve PI genotiplerinde elde edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Citrullus lanatus, Polimorfizm, Moleküler markörler, Genetik kaynaklar, Fusarium oxysporum f.sp. niveum I

4 ABSTRACT PhD. THESIS CHARACTERIZATION OF SOME WATERMELON GENOTYPES BY SSR AND SRAP MARKERS AND EVALUATION FOR FUSARIUM WILT (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) WITH MOLECULAR AND CLASSICAL TECHNIQUES İlknur SOLMAZ DEPARTMENT OF HORTICULTURE INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Nebahat SARI Supervisor II : Assoc. Prof. Dr. Yıldız AKA KAÇAR Year : 2010, Pages:140 Jury : Prof. Dr. Nebahat SARI Assoc. Prof. Dr. Yıldız AKA KAÇAR Assoc. Prof. Dr. Şener KURT Assoc. Prof. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ Assoc. Prof. Dr. Halit YETİŞİR In this study, the genetic diversity of 93 genotypes selected from the watermelon genetic resource collection of Horticulture Department in Çukurova University was evaluated by SSR and SRAP markers. Fourteen SSR primers and 31 SRAP primer combinations were used in the experiment. The highest polymorphism with 100 % was obtained from SSR markers, followed by SRAP markers with 97.3 %. According to cluster analysis performed using molecular characterization data set, it was determined that watermelon genotypes collected from the different regions of Turkey of which belong to Citrullus lanatus var. lanatus subspecies were genetically close and grouped together in the same cluster. This result was supported by principle coordinate analyses as well. The mean disease incidence obtained by classical method to evaluate the resistance to fusarium wilt (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) was 25.9 % for race 0, 39.4 % for race 1 and 67.0 % for race 2. In the molecular analyses for determining resistance to race 1 with the RAPD primer OPP01, 700 bp band was recorded only in Kar 26 and PI Key Words: Citrullus lanatus, Polymorphism, Molecular markers, Genetic resources, Fusarium oxysporum f.sp. niveum II

5 TEŞEKKÜR Doktora tez konumun belirlenmesinde ve bu araştırmanın her aşamasında yardım ve desteğini esirgemeyen, akademik çalışmalarım boyunca beni yönlendiren ve her zaman daha iyiye ulaşmam için beni motive eden, zorluklar karşısında çözümcü, bilgide daima paylaşımcı olan değerli bilim insanı Danışman Hocam Sayın Prof. Dr. Nebahat SARI ya sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmalarım kapsamında bana moleküler genetik laboratuvarının kapılarını sonuna kadar açan, her türlü imkanı seferber eden, değerli bilgi ve tecrübeleriyle daima destek olan ikinci danışman Hocam Sayın Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR a saygı ve teşekkürü borç bilirim. Tez çalışmamın her aşamasında değerli katkılarıyla beni yönlendiren değerli Tez İzleme Komitesi üyeleri hocalarım Sayın Doç Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ ye ve Sayın Doç. Dr. Şener KURT a en içten saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Doktora tezimin her aşamasında bana yardımcı olan, değerli desteğini ve katkılarını esirgemeyen Hocam Sayın Doç. Dr. Sedat SERÇE ye teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışması boyunca yardımını gördüğüm ve her zaman sorularıma sabırla yanıt veren Hocam Sayın Doç. Dr. Halit YETİŞİR e teşekkür ederim. Laboratuvar çalışmalarım boyunca yardımlarını esirgemeyen arkadaşlarım Dr. Muharrem YILMAZ a ve biyolog Özhan ŞİMŞEK e teşekkür ederim. Son olarak tüm yaşantım boyunca bana daima manevi ve maddi olarak destek olan Sevgili Aileme sonsuz teşekkürler. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ I ABSTRACT II TEŞEKKÜR..... III İÇİNDEKİLER..... IV ÇİZELGELER DİZİNİ.... VII ŞEKİLLER DİZİNİ VIII SİMGELER ve KISALTMALAR X 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Karpuzlarda Yapılan Moleküler Karakterizasyon Çalışmaları Farklı Kabakgil Türlerinde SSR Markörleri ile Yapılan Karakterizasyon Çalışmaları Kabakgil Türlerinde ve Farklı Türlerde SRAP Markörleri ile Yapılan Karakterizasyon Çalışmaları Karpuzlarda Fusarium Solgunluğu Üzerine Yapılan Çalışmalar MATERYAL ve METOD Materyal Metod Moleküler Karakterizasyon Çalışmaları DNA İzolasyonu DNA Kalitesi ve Kantitesinin Belirlenmesi SSR Analizleri (1). SSR Analizleri PCR Çalışmaları (2). PCR Çalışmalarında Kullanılan SSR Primerleri (3). Li-Cor için Poliakrilamid Jel Hazırlığı (4). Li-Cor Elektroforez Koşulları SRAP Analizleri (1). SRAP Analizleri PCR Çalışmaları (2). PCR Çalışmalarında Kullanılan SRAP Primerleri IV

7 (3). Agaroz Jel Elektroforez ve Jel Görüntüleme Primerlerin Polimorfizm Oranlarının Belirlenmesi Benzerlik İndeksleri ve Dendrogramların Oluşturulması Karpuz Genotiplerinin Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımlarının Klasik ve Moleküler Yöntemlerle Araştırılması Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımın Klasik Yöntemle Araştırılması (1). İstatistiksel Analiz Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp niveum) na Dayanımın Moleküler Yöntemle Araştırılması (1). DNA Amplifikasyonu (2). RAPD Agaroz Jel Elektroforezi (3). Sonuçların Değerlendirilmesi BULGULAR ve TARTIŞMA Moleküler Çalışmalar SSR Analizleri Karpuz Genotiplerinin SSR Tekniği ile Karakterizasyonunda Polimorfizmin Değerlendirilmesi SSR Analizleri Sonucu Elde Edilen Benzerlik İndeksinin Değerlendirilmesi SSR Analizleri Sonucu Elde Edilen Dendrogramın Değerlendirilmesi SSR Verileriyle Yapılan Temel Koordinat Analizinin Değerlendirilmesi SRAP Analizleri Karpuz Genotiplerinin SRAP Tekniği ile Karakterizasyonunda Polimorfizmin Değerlendirilmesi SRAP Analizleri Sonucu Elde Edilen Benzerlik İndeksinin Değerlendirilmesi V

8 SRAP Analizleri Sonucu Elde Edilen Dendrogramın Değerlendirilmesi SRAP Verileriyle Yapılan Temel Koordinat Analizinin Değerlendirilmesi Karpuz Genotiplerinin Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımlarının Klasik ve Moleküler Yöntemlerle Araştırılması Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımın Klasik Yöntemle Araştırılması Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımın Moleküler Yöntemle Araştırılması SONUÇLAR ve ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ EK 1. SSR benzerlik indeksi EK 2. SRAP benzerlik indeksi 140 VI

9 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Çizelge 3.2. Çizelge 3.3. Çizelge 3.4. Çizelge 3.5. Çizelge 3.6. Çizelge 3.7. Çizelge 3.8. Çizelge 4.1. Çizelge 4.2. Çizelge Çalışmada kullanılan bitkisel materyal.. DNA izolasyonunda kullanılan tampon çözeltisinin içeriği.. SSR analizleri PCR reaksiyon koşulları Çalışmada kullanılan SSR primerlerinin ismi, sekansı, beklenen bant büyüklüğü (bp) ve referans çalışmaları... SRAP analizleri PCR reaksiyon koşulları SRAP analizlerinde kullanılan forward (İleri) primerleri... SRAP analizlerinde kullanılan reverse (Geri) primerleri... RAPD analizi PCR reaksiyon koşulları... SSR primerlerinin amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam allel sayısı (adet), polimorfik allel sayısı (adet), allel büyüklükleri (bp) ve polimorfizm oranı (%)... SRAP primerlerinin amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayısı (adet), polimorfik bant sayısı (adet), bant uzunluk aralıkları (bp), polimorfizm oranı (%)... Karpuz genotiplerinin Fusarium oxysporum f.sp. niveum un 0, 1 ve 2 no lu ırklarına karşı reaksiyonları VII

10 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Şekil 3.2. Şekil 3.3. Şekil 3.4. Şekil 3.5. Şekil 3.6. Şekil 3.7. Şekil 3.8. Şekil 3.9. Çalışmada kullanılan genotiplerin olgun meyve resimleri A: DNA izolasyonu amacıyla yaprak örneği alınan genç fideler; B: Yaprak örneklerinin alüminyum folyoya sarılması; C: Örneklerin o C de sıvı azota daldırılması; D: -85 o C de muhafazası DNA izolasyon aşamaları A: Porselen havanda sıvı azotla öğütülmüş yaprak örnekleri; B: Örneklerin tüplere aktarılması; C: Ekstraksiyon çözeltisinin eklenmesi; D: Örneklerin 65 o C de bekletilmesi; E: Örneklerin homojenizasyonu; F: Santrifüj işlemi; G: Tüplerin ters çevrilerek pelletin kurutulması; H: Pelletin TE içerisinde çözülmesi.. A: DNA kalite ve kantitesinin ölçümlerinde kullanılan spektrofotometre aleti; B: Spektrofotometrede DNA kalite ve kantitesinin okunması. A: Poliakrilamid jelin döküleceği camlar; B: Jel donduktan sonra tarağın jel içerisine yerleştirilmesi; C: Jel aparatının cihaza yerleştirilmesi; D: Poliakrilamid jelin yüklenmesi... PCR Hazırlık aşamaları A: PCR bileşenlerinin 1.5 ml lik tüp içerisinde hazırlanması; B: PCR bileşenlerinin vortex ile karıştırılması; C: PCR bileşenlerinin santrifüj yardımıyla homojenizasyonu; D: Tüplerin PCR a yerleştirilmesi... Agaroz jel elektroforez ve jel görüntüleme aşamaları; A: Agaroz jelin hazırlanması; B: Jelin dökülmesi; C: PCR ürünlerinin agaroz jele yüklenmesi; D: Jel görüntüleme sistemi % 1.7 Agoroz jelde koşularak elde edilmiş 100 bp büyüklüğündeki DNA markörü... Fusarium inokulumunun hazırlanması ve uygulanmasına ait resimler; A: Petri kapları içerisinde PDA ortamında geliştirilen Fusarium izolatları; B: Gelişen kolonilerin ortam yüzeyinden steril VIII

11 Şekil 4.1. Şekil 4.2. Şekil 4.3. Şekil 4.4. Şekil 4.5. Şekil 4.6. Şekil 4.7. Şekil 4.8. Şekil 4.9. Şekil spatül yardımıyla sıyrılması ve tülbentten süzülmesi; C: Thoma lamı üzerine spor süspansiyonun pipetle damlatılması; D: Spor süspansiyon yoğunluğunun mikroskop altında incelenmesi; E: İnokulum enjekte edilecek fide köklerinin spatül yardımıyla yaralanması; F: Otomatik pipetle 5 ml spor süspansiyonunun fidelere tek tek enjekte edilmesi Cgb4765 SSR primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü... ASUW19 SSR primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü... SSR markörleri ile elde edilen dendrogram... SSR verileriyle yapılan temel koordinat analizi sonucu elde edilen iki boyutlu grafik... me1em11 SRAP primer kombinasyonuna ait agaroz jel görüntüsü... me1em6 SRAP primer kombinasyonuna ait agaroz jel görüntüsü... SRAP markörleri ile elde edilen dendrogram... SRAP verileriyle yapılan temel koordinat analizi sonucu elde edilen iki boyutlu grafik... Barnes (1972) tarafından geliştirilen hastalık değerlendirme skalası A: 0; hiçbir hastalık belirtisi göstermeyen sağlıklı bitkiler, B: 1; bodurlaşma gösteren bitkiler, C: 2; sararma gösteren bitkiler, D: 3; nekrozlaşma gösteren bitkiler, E: 5; ölü bitkiler... RAPD primeri OPP01 ile yapılan tarama sonucu elde edilen agaroz jel görüntüleri IX

12 SİMGELER ve KISALTMALAR AFLP bp cdna CFU cm CTAB dk DNA EDTA EST EtOH FON g ha HCI ISSR ITS Kar Kg ma MgCI 2 ml mm ng NaCI NTSYS PDA PCR POGP : Amplified Fragment Length Polymorphism : Base Pair : Chloroplast Deoxyribonucleic Acid : Colony Forming Unit : Cantimorgan : Cetytrimethylamoniumbromide : Dakika : Deoxyribonucleic Acid : Etylendiamintetraaceticacid : Expressed Sequence Tags : Ethanol : Fusarium oxysporum f.sp. niveum : Gram : Hektar : Hidroklorikasit : Inter Simple Sequence Repeats : Internal Transcribed Spacer : Karpuz : Kilogram : Miliamper : Magnezyumklorür : Mililitre : Milimolar : Nanogram : Sodyumklorür : Numerical Taksonomy and Multivariate Analysis System : Patates Dekstroz Agar : Polymerase Chain Reaction : Peroxidase Gene Polymorphism X

13 PI : Plant Introduction RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RGA : Resistant Gene Analog RNAase : Ribonuclease rpm : Revolution Per Minute SAS : Statistical Analysis Systems SC : Similarity Coefficient SCAR : Sequence Characterized Amplified Region sn : Saniye SNP : Single Nucleotide Polymorphism SRAP : Sequence Related Amplified Polymorphism SSR : Simple Sequence Repeats TAE : Tris-Acetate Taq : Thermus aquaticus TBE Tampon : Tris/Borate/EDTA (buffer) TE : Tris-EDTA (buffer) TEMED : Tetrametil-Etilendiamin UPGMA : Unweighted Pair-Group Method Analysis UPOV : International Union For The Protection of New Varieties of Plants USDA : United States Department of Agriculture UV : Ultraviolet V : Volt µl : Mikrolitre µm : Mikromolar o C % : Yüzde : Santigrad Derece XI

14 1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ 1. GİRİŞ Karpuz [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. ve Nakai], Cucurbitaceae familyasının ekonomik öneme sahip en önemli türlerinden birisidir. Citrullus cinsinin taksonomisi ile ilgili pek çok çalışma (Whitaker ve Davis, 1962; Fursa, 1972; Jeffrey, 1975; Whitaker ve Bemis, 1976) yapılmış olmakla birlikte, son yıllarda Afrika, Asya ve Akdeniz in sıcak bölgelerinde yetişen 4 diploid (n=11) tür içerdiği kabul edilmektedir (Robinson ve Decker-Walters, 1997; Jarret ve Newman, 2000; Levi ve ark., 2001a; Wehner, 2008). Dünya da tropik ve subtropik bölgelerde yetiştirilen C. lanatus (Thunb.) Matsum. ve Nakai, Citrullus cinsi içerisinde en fazla çeşitlilik gösteren tür olup (Maynard, 2001), kültür formu C. lanatus var. lanatus ve yabani form olan C. lanatus var. citroides (L.H. Bailey Mansf.) alt türlerini içermektedir (Whitaker ve Bemis, 1976; Bates ve Robinson, 1995; Robinson ve Decker-Walters, 1997; Wehner, 2008). Tüm dünyada ticari olarak yetiştiriciliği yapılan karpuzlar, C. lanatus var. lanatus alt türüne ait olup. çekirdekli ve çekirdeksiz (triploid) tiplere sahiptir. Meyveleri boyut, şekil ve kabuk özellikleri bakımından oldukça zengin bir çeşitlilik göstermektedir. Meyvelerde boyut; mini, küçük, orta, büyük ve çok büyük, şekil; yuvarlak, oval, eliptik ve silindirik, kabuk; düz ya da çizgili, kabuk rengi; yeşilin farklı tonlarında (koyu, orta, açık) ve gri, çizgiler; açık veya koyu yeşil zemin üzerine geniş, orta ve dar, et rengi; beyaz, sarı, turuncu ve kırmızı olabilmektedir. Taze meyve olarak tüketilebildiği gibi, küçük parçalar halinde meyve salatalarında, meyve suyu ve şekerleme sanayiinde ve kabukları da turşu yapımında kullanılır. Yenilebilir tohumları çerez olarak tüketilebilir (Robinson ve Decker-Walters, 1997; Wehner, 2008). C. lanatus var. citroides (L.H. Bailey Mansf.) citron, citron kavunu, konservelik kavun olarak bilinir. Yabani ilkel formlarına Güney Afrika da rastlanmakla birlikte, kültürel yetiştiriciliği de yapılmaktadır. Kabukları turşu, konserve ve reçel yapımında kullanılmakta ve meyvelerinden de hayvan yemi olarak yararlanılmaktadır (Laghetti ve Hammer, 2007). Beyaz veya açık yeşil olan meyve 1

15 1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ eti tatsız ve acıdır. Tohumları haşlanarak veya un haline getirilerek tüketilir (Robinson ve Decker- Walters, 1997). Acı elma ve acı kabak olarak bilinen C. colocynthis (L.) Schrad, Kuzey ve Batı Afrika ya özgü, kuraklığa dayanıklı, çok yıllık yabani bir tür olup, Güneybatı Asya ve Akdeniz in kumsal bölgelerinde de yetişmektedir (Zamir ve ark., 1984; Burkill, 1985; Jarret ve ark., 1997; Robinson ve Decker-Walters, 1997). Günümüzde Afrika nın Sahra-Arap fitocoğrafik bölgesinde ve Akdeniz de yaygın durumdadır (Dane ve ark., 2007). C. colocynthis, bitkisel organlarının boyutları bakımından C. lanatus tan farklıdır (Mohr, 1988). Çiçekleri, yaprakları, meyveleri ve tohumları küçüktür. Zayıf ve tüylü gövdesi, derin 3-7 loblu, tüylü, 5-10 cm uzunluğundaki yaprakları ve uçuk sarı çiçekleri bu türün karakteristik özellikleridir. Bir bitki yaklaşık 7-10 cm çapa sahip, yeşil zemin üzerine sarı çizgili arasında meyve verir (Robinson ve Decker-Walters, 1997). Meyve eti sıkı, beyaz ve acı olup yenilmemektedir, ancak meyvelerden üretilen colocynth maddesi ilaç sanayiinde kullanılmaktadır. Değerli bir yağ kaynağı olan ve acı olmayan tohumları, öğütülerek ekmek yapımında kullanılmakta ve Afrika da pişirilerek tüketilmektedir (Robinson ve Decker-Walters, 1997; Dane ve ark., 2007). Çok yıllık C. ecirrhosus Cogn. (Meeuse, 1962) ve tek yıllık C. rehmii De Winter (De Winter, 1990) Namibya çöllerinde yetişen endemik türlerdir (Levi ve ark., 2005; Dane ve Liu, 2007). Praecitrullus fistulosus (Stocks) Pangolo, Hindistan ve Pakistan da yetişen bir tür olup, birçok araştırıcı tarafından (Whitaker ve Davis, 1962; Khoshoo ve Vij, 1963; Singh, 1990) farklı bir Citrullus olarak değerlendirilmektedir. Her ne kadar morfolojik özellikleri Citrullus türleriyle benzerlik gösterse de kromozom sayısı bakımından (2n=2x=24) farklıdır (Robinson ve Decker-Walters, 1997; Levi ve ark., 2005). Günümüzde, kültürü yapılan karpuzun atası konusunda çelişkiler hala devam etmektedir. Bazı araştırıcılar karpuzun çok yıllık C. colocynthis den türediğini, bazıları da C. lanatus var. citroides in karpuzun yabani atası olduğunu düşünmektedirler (Maynard, 2001; Wehner, 2008). Dane ve Liu (2007) ise kültür ve yabani formaların her ikisinin de ortak bir atadan geldiğini ve bu atanın 2

16 1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ Namibya da yetişen endemik bir tür olan Citrullus ecirrhosus olabileceğini bildirmişlerdir. Citrullus türlerinin tümünün orijini Afrika olup, özellikle Güney Afrika da en yüksek düzeyde çeşitlilik görülmektedir. Çin, ikincil gen merkezidir, ayrıca Hindistan da da bazı yakın akraba formlar bulunmaktadır. Orta Doğu ve Akdeniz e yakın bölgelerin eski yerel genotiplerin ve yabani formların toplanabileceği yerler olduğu bilinmektedir (Robinson ve Decker-Walters, 1997; Wehner, 2008). Karpuz yetiştiriciliğinin Orta Doğu ve Afrika da uzun bir geçmişi vardır. Karpuz, 4000 yıldır Mısır da oldukça önemli bir sebzedir. 10. yy da Çin ve Rusya da yetiştirilmeye başlanmış ve yeni dünya ile tanışması 16.yy da İspanyollar sayesinde olmuştur (Robinson ve Decker-Walters, 1997). Kalp krizini ve bazı kanser türlerini önlemede son derece yararlı bir karetenoid olan likopen yönünden zengin olan karpuzun üretimi, geçtiğimiz yüzyıl boyunca düzenli olarak artmıştır (Güner ve Wehner, 2004). Dünya da ha alanda ton karpuz üretilmektedir. Türkiye, ha alanda ton luk karpuz üretimi ile Çin in ardından ikinci sırada yer almaktadır. Karpuz üretiminde önemli rol oynayan diğer ülkeler ise, İran ( ton), Brezilya ( ton) ve ABD ( ton) dir (Anonymous, 2008a). Türkiye de ton ile Akdeniz Bölgesi, bu bölgede ise ton ile Adana üretimde lider durumdadır (Anonymous, 2008b). Bitki genetik kaynakları, yerel çeşitler olarak nitelendirilen köy populasyonları; bunların yabani akrabaları, kullanılmayan eski çeşitler ve kalıtsal özellikleri net olarak belirlenmiş hatlardan oluşmaktadır. Özellikle yabani türlerin korunması, gelecekte yapılacak olan bitki ıslahı çalışmaları için son derece önemlidir. Bu değerli kaynaklar bulundukları yörelerde çevresel ve diğer baskılarla azalma, hatta yok olma tehlikesiyle karşı karşıyadır. Genetik kaynakların korunması, geleceğin bitkisel üretiminin, dolayısıyla insanlığın geleceğinin güvence altına alınması bakımından zorunludur (Tan, 2003). Bitki genetik kaynakları; klasik ıslah yöntemleri için çeşitli özelliklere sahip başlangıç materyalleri sağlamasının yanında, içerdikleri genetik çeşitlilik nedeniyle son yıllarda hızla ilerleme kaydeden biyoteknoloji alanında da üstün nitelikli bitki 3

17 1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ çeşitlerinin geliştirilmesi için gerekli hammadde niteliğindedir. Günümüzde birçok yeni çeşit geliştirilmiş olmasına rağmen, hastalık ve zararlılara dayanıklılığın iyileştirilmesi konusunda çalışmaların devam etmesi gerekmektedir (Levi ve ark., 2001a). Kültür çeşitleri, gen yapıları bakımından homojen hale gelmiş olup, ilkel formlara ve yabani akrabalarına oranla çok daha az genetik çeşitlilik içermektedir. Yabani türler ise, geniş bir genetik tabanı olan ve kültür bitkilerinin ileride çıkabilecek sorunlarının giderilmesinde ya da bitkilere yeni özelliklerin kazandırılmasında önemli birer kaynak oluşturan gen depolarıdır (Özgen ve ark., 1995). Genetik kaynağın değeri, en kısa sürede yarar sağlanabilmesi ve en uzun süre korunabilmesine bağlıdır (Kresovich ve McFerson, 1992). Bitkisel gen kaynaklarının korunmasında ve ıslah programlarında daha etkin biçimde kullanılmasında başarı, materyalin cins ve tür özelliklerinin sistematik biçimde belirlenmesine, bu konudaki kayıtların ayrıntılı bir biçimde tutulmasına, materyaldeki genetik değişimin izlenmesine ve kullanım için gerekli olan özelliklerin saptanmasına bağlıdır. Genetik kaynaklardan etkin bir şekilde yararlanabilmek için germplazm içerisindeki çeşitliliğin araştırılması gerekmektedir (Che ve ark., 2003). Genetik kaynakların karakterizasyonu; morfolojik, agronomik ve genetik olarak yapılabilir. Morfolojik karakterizasyon güvenilir, kolay ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Günümüzde genetik kaynakların karakterizasyonu büyük ölçüde morfolojik karakterizasyona dayanmaktadır. Kullanımını sınırlayan önemli faktörler, canlı bitkiye ihtiyaç duyması ve gerek değerlendirmeyi, gerekse de bilgi paylaşımını zorlaştıran çevre şartlarından etkilenmesidir (Ferreira, 2005). Büyük alanlarda deneme kurmanın zor olması ve yüksek maliyet nedenleriyle agronomik karakterizasyon, büyük germplazmların değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılamamaktadır. Agronomik karakterler genellikle polimorfik yapıda olduğundan çevreden önemli ölçüde etkilenirler (Ferreira, 2005). Bu nedenle genetik değişiklikleri izlemenin önemi büyüktür. Genetik karakterizasyonda kullanılan moleküler tekniklerin, çevresel koşullardan etkilenmemesi, analizin bitkinin herhangi bir parçasında ya da büyüme döneminde yapılabilmesi, analiz 4

18 1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ sayısının zamanla ve materyalle sınırlı olmaması, analizin bitkinin çok küçük örneklerinde yapılabilmesi, DNA analizleri ile stabilitenin en duyarlı biçimde belirlenebilmesi ve cansız örneklerde de karakterizasyonun yapılabilmesi gibi olumlu özelliklerinin yanında; geniş bir genetik tarama için uygun olmaması, sonuçların genomun çok küçük bir bölümünü karakterize etmesi ve agronomik önemi olan genlerin analizinde istenilen düzeye gelinmemiş olunması gibi olumsuz özellikleri de vardır (Özgen ve ark., 2000). Gen bankalarında muhafaza edilen bitkisel genetik kaynakların ıslah programlarında etkin bir şekilde kullanımı sınırlı olmakla birlikte, bu bankalarda depolanan materyal sayısı sürekli bir artış göstermektedir. Bu çelişkinin ana nedeni olarak germplazm karakterizasyonunun yavaş yapılması gösterilebilir. Moleküler markör teknolojisi sayesinde aynı materyalin gen bankasına girişi engellenir, genotiplerin tam olarak parmakizi oluşturulur, germplasm içerisindeki çeşitlilik ve genetik ilişkiler belirlenerek, büyük koleksiyonlarda allelik zenginliğin önemli bir kısmını en az örnekle temsil edebilen çekirdek (core) koleksiyonlar oluşturulur. Bu çekirdek koleksiyonlarda yer alan materyallerde agronomik öneme sahip karakterler açısından daha detaylı bir fenotipik değerlendirme yapılabilir (Dodds ve Watanabe, 1990; Ferreira, 2006). Böylece muhafaza edilen genetik kaynakların ıslah programlarında kullanım olanakları artar. Karpuzlarda yapılan klasik taksonomi çalışmalarında kullanılan meyve şekli, meyve kabuk rengi, tohum şekli ve tohum rengi gibi morfolojik karakterler bazı genotiplerin ayrımında yeterli olmamakla birlikte (Che ve ark., 2003), birçoğu çevresel koşullar tarafından düzenlenmekte veya etkilenmektedir (Provvidenti, 1994). Tek lokus ile idare edilen morfolojik özellikler, değişik çevre koşullarında ifade edilebildiği sürece genetik markör olarak kullanılabilir. Kodominant morfolojik markörler seleksiyonla genetik tepkiyi önceden bildirse de çevresel ve genetik (epistasis) faktörlerden etkilenirler (Staub ve ark., 1996). Protein ya da DNA da bulunan polimorfizme dayanan moleküler markörlerin geliştirilmesi; taksonomi, filogeni, ekoloji, genetik ve bitki ıslahı alanlarında yürütülen çalışmaları büyük oranda kolaylaştırmaktadır. Bitki dokusuna ve çevresel 5

19 1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ faktörlere bağımlı olmamaları ve bitki gelişiminin erken aşamalarında dahi kullanılabilmeleri, moleküler markörlerin çok yararlı araçlar olduğunu göstermektedir (Espósito ve ark., 2007). Moleküler markörler, germplasm içerisindeki çeşitliliğin araştırılması, genotipler arasındaki genetik yakınlıkların ortaya çıkarılması, çeşitlerin tanımlanması, tohum saflığının belirlenmesi, sistematik çalışmaları, genetik kaynak koleksiyonlarının bazı spesifik genler bakımından taranması ve genom haritalamasında etkin bir şekilde kullanılmaktadır. Böylece klasik bitki ıslahı sürecinde karşılaşılan sorunların çözümünde bitki ıslahçılarına yeni ufuklar açmaktadırlar (Kumar, 1999; Levi ve ark., 2001a). Karpuz genetik kaynak koleksiyonlarında genetik çeşitlilik ve filogenetik ilişkilerin belirlenmesinde biyokimyasal markörler kullanılmış, ancak test edilen izoenzimlerin çoğunun monomorfik olduğu tespit edilmiştir (Navot ve Zamir, 1987; Biles ve ark., 1989). Genetik çeşitliliğin belirlenmesinde enzim sistemlerinin etkin şekilde kullanılamamasının nedeni, enzim sisteminin sınırlı sayıda ve izoenzimlerle elde edilen varyasyonun da kısıtlı olmasıdır (Che ve ark., 2003). Protein markörleri ile karşılaştırıldığında DNA markörleri (RAPD, SSR, AFLP vb.), diğer türlerde olduğu gibi karpuzlarda da genetik çeşitliliğin araştırılmasında daha etkin ve güvenilirdir (Jarret ve ark., 1997; Levi ve ark., 2001a; Levi ve ark., 2001b; Che ve ark., 2003; Levi ve ark., 2004). DNA markörleri hibridizasyona dayalı markörler (RFLP) ve PCR a dayalı markörler (RAPD, SSR, AFLP, SRAP vb.) şeklinde iki grupta incelenebilir, ancak günümüzde PCR a dayalı markörlerin kullanımı daha yaygındır. PCR ın geliştirilmesi ile birlikte varyasyonun moleküler karakterizasyonunda modern devrim başlamıştır. Southern blotting olarak da adlandırılan RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) markörü, hibridizasyona dayalı ko-dominant bir markör sistemidir (Sambrook ve ark., 1989). Türler arasındaki farklılıkları kolayca belirleyebilmesi ve aynı tür içerisinde etkili olması avantajken, fazla miktarda DNA ya gereksinim duyması, pahalı olması, fazla zaman ve işgücü gerektirmesi olumsuz özellikleridir (Aka-Kaçar, 2001). RFLP, karpuzlarda genetik çeşitliliğin tanımlanmasında (Dane 6

20 1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ ve ark., 2004, Levi ve ark., 2005; Dane ve Liu, 2007) ve haritalama çalışmalarında (Hashizume ve ark., 1996; 2003) kullanılmıştır. Zorluk, güvenilirlik, maliyet ve bilgi üretme bakımından birbirinden farklı olan PCR a (Polymerase Chain Reaction) dayalı her bir markör sisteminin (RAPD, AFLP, SSR vb.) avantaj ve dezavantajları bulunmaktadır (Lee, 1995; Rafalski ve ark., 1996). RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) tekniği, Williams ve ark. (1990) tarafından geliştirilmiş olup, düşük maliyetli ve kolay uygulanabilir olmasının yanı sıra, tekrarlanabilirliğinin zor olması ve dominant kalıtım özelliği gibi dezavantajlara sahiptir. Karpuzlarda genetik çeşitliliğin belirlenmesinde, filogenetik ilişkilerin araştırılmasında ve genetik haritaların oluşturulmasında kullanılmıştır (Hashizume ve ark., 1996; Lee ve ark., 1996; Hawkins ve ark., 2001; Levi ve ark., 2001a; 2001b; 2001c; 2006; 2007; Solmaz ve ark., 2010). ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats) tekniği, uygulama bakımından RAPD tekniğine benzemekle birlikte, bu yöntemin dezavantajlarını gidermek üzere geliştirilmiştir. Tekrarlanabilirliği RAPD tekniğinden yüksek, maliyeti ise AFLP tekniğinden daha düşüktür (Zietkiewicz ve ark., 1994; Reddy ve ark., 2002). ISSR tekniği karpuzlarda genetik çeşitliliğin araştırılmasında (Levi ve ark., 2004) ve haritalama (Hashizume ve ark., 2003; Levi ve ark., 2006) çalışmalarında kullanılmıştır. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), yüksek tekrarlanabilirlik oranı nedeniyle oldukça fazla uygulama alanı bulmuştur (Vos ve ark., 1995). Polimorfizm oranı çok yüksek olan bu markör tekniği, kuruluş aşamasında oldukça maliyetlidir. En önemli dezavantajı, sistemin optimizasyonunun zor olmasıdır (Li ve Quiros, 2001). Karpuz genotipleri arasındaki polimorfizmin araştırılmasında (Che ve ark., 2003; Levi ve ark., 2004; 2007; Nimmakayala ve ark., 2009), çeşitler arasındaki filogenetik ilişkilerin belirlenmesinde ve genetik haritaların oluşturulmasında (Levi ve ark., 2006) başarıyla kullanılmıştır. Mikrosatellit DNA dizinleri, ökaryatik genomlar için mükemmel bir polimorfizm kaynağıdır. SSR (Simple Sequence Repeat), polimorfizm seviyesi düşük olan türlerde genetik çeşitliliğin araştırılmasında, çeşit tayininde ve genetik 7

21 1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ haritaların oluşturulmasında son derece etkin bir şekilde kullanılmaktadır (Staub ve ark., 1996). Kodominant kalıtım özelliği göstermesi SSR markörleri için bir avantajken; pahalı ve zaman alıcı olması, fazla miktarda emek gerektirmesi yanında yeni markörlerin geliştirilmesinin güçlüğü en önemli dezavantajlarındandır (Li ve Quiros, 2001; Büyükünal Bal, 2001). SSR, polimorfizm seviyesi oldukça düşük olan karpuzlarda genetik çeşitliliği belirleme (Jarret ve ark., 1997; Guerra-Sanz, 2002; Levi ve ark., 2007; Kwon ve ark., 2007; Verma ve Arya, 2008; Nimmakayala ve ark., 2009) ve genetik haritalama çalışmaları (Hawkins ve ark., 2001; Levi ve ark., 2006) için son derece uygun bir yöntemdir. Kolay uygulanabilen, güvenilir ve etkin olan SRAP (Sequence Related Amplified Polymorphism), Li ve Quiros (2001) tarafından geliştirilmiş, PCR temelli yeni bir markör sistemidir. Genomda kodlanan sekansları hedef alan ve ortalama sayıda kodominant markörler oluşturan SRAP tekniği, iki primer amplifikasyonuna dayanmaktadır. Primerler nükleotitten meydana gelmekte ve bunlardan biri forward (ileri), diğeri ise reverse (ters) primer olarak adlandırılmaktadır. Bu primerlerde nükleotitten oluşan bir çekirdek sekans kısmı vardır. Spesifik bir yapısı olmayan bazlık dizinin (filler sequence) ardından forward primerde CCGG, reverse primerde ise AATT dizini gelmektedir. Bu kısımdan sonra 3 seçici nükleotitten oluşan bölüm bulunmaktadır (Li ve Quiros, 2001). RAPD markörlerine göre daha tutarlı sonuçlar veren, AFLP markörlerine göre de daha ucuz ve az işçilik gerektiren bir markör tekniği olan SRAP; genetik haritaların oluşturulması, gen etiketlenmesi, genomik DNA ve cdna parmak izinin çıkarılması ve haritaya dayalı klonlama gibi birçok farklı amaca hizmet edebilmektedir (Li ve Quiros, 2001). SRAP markörleri farklı türlere adapte olabilen bir sistem olup, karpuzlarda genetik çeşitliliğin araştırılmasında (Yan ve Zhang., 2005; Levi ve ark., 2007) ve haritalama (Levi ve ark., 2006) çalışmalarında başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Karpuzda Fusarium solgunluğu etmeni Fusarium oxysporum f.sp. niveum, (E.f.sm.) W.C. Synder & H. N. olup, ilk olarak Smith (1894) tarafından ABD de Güney Carolina ve Georgia da tanımlanmıştır (Martyn ve Netzer, 1991). Toprak kökenli olan fungus, bulaşık olduğu topraklarda uzun yıllar canlı kalabilmekte ve 8

22 1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ günümüzde yetiştiriciliği yapılan tüm ülkelerde karpuz üretimini önemli ölçüde sınırlamaktadır (Martyn ve McLaughlin, 1983; Notz ve ark., 2002; Zhang ve ark., 2005). Fungus, karpuz bitkilerini tüm gelişim evrelerinde etkileyebilmektedir. Çok genç fidelerde enfeksiyon, çökerten ve bodurlaşma ile sonuçlanır. Ergin bitkilerde ise solgunluğun ardından ölüm gerçekleşir. Hastalığın ilerleyen safhalarında kökler çürür ve ölür. Solgunluk, genellikle sürgün uçlarından başlar ve bitkinin alt kısımlarına doğru ilerler. Hasta bitkilerin gövde ve sürgünlerinin rengi sarı veya kahverengiye dönüşür, gövdeler üzerindeki nekrotik alanlarda fungus sporları gelişir. Toprakta yaşayan fungus, bitkilere kök uçlarındaki açıklıklardan girmektedir. Fungus tohumla, yetiştirme ortamlarıyla, sulama sularıyla, alet makinalarla ve hayvanlarla kolayca taşınabilir (Blancard ve ark., 1991). Fusarium solgunluğunun kontrolünde uzun dönem ürün rotasyonu (5-10 yıl) ve toprağı dinlendirmek, topraktaki patojen populasyonunun azalmasına yardımcı olur (Martyn ve Netzer, 1991). Solarizasyon (Martyn ve Hartz, 1986), fumigasyon (Hopkins ve Elmstrom, 1976), aşılama (Kuniyasu, 1981) gibi yöntemlerin de olumlu etkileri görülmüştür. Hastalığın kontrolünde güvenilir, ekonomik ve etkili bir kimyasal yöntem bulunmamaktadır (Forsyth ve ark., 2006). Bunun nedeni Fon sporlarının kendini kimyasal fumigasyona yüksek düzeyde dayanıklı ve kalın duvarlı klamidosporlara dönüştürebilmesidir (Shi ve ark., 1991). Hastalığın kontrolünde en etkin yöntem dayanıklı çeşitlerin ıslah edilmesi ve üretimde kullanılmasıdır (Hopkins ve Elmstrom, 1984; Martyn, 1996; Diener ve Ausubel 2005). Dayanıklı çeşit kullanımı sadece verim ve kalitenin artışını değil, aynı zamanda kimyasal kullanımını da azaltmaktadır. Günümüzde ticari çeşitlerin çoğu 0 ve 1 no lu ırklara karşı dayanıklı iken, 2 no lu ırka karşı duyarlıdır (Chen ve ark., 2003; Wehner, 2008). Konukçunun dayanım etkinliği üzerinde patojenin spesifik ırkının yaygınlığının ve topraktaki inokulum seviyesinin büyük oranda etkisi vardır (Martyn ve McLaughlin, 1983; Martyn, 1996). Hastalıkla mücadelede dayanıklı çeşitlerden yararlanılmakta, ancak patojen populasyonlarındaki değişimlerden dolayı dayanıklılık, patojenin yeni, virülent populasyonuna karşı etkili olamamaktadır. Bu 9

23 1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ nedenle sürekli olarak dayanıklı çeşitlerin geliştirilmesi gerekmektedir (Biles ve Martyn, 1989). Fungusun 0, 1 ve 2 olmak üzere 3 ırkı olduğu bilinmektedir (Biles ve Martyn, 1989). Agresiflik açısından etkinliği en az olan ırk 0 olup, sadece Sugar Baby gibi hiç dayanıklılık geni taşımayan çeşitlerde görülmektedir. En yaygın görülen 1 no lu ırk, hafif ve orta derecede solgunluklara neden olmaktadır ve çoğu karpuz çeşidinin bu ırka karşı dayanıklı olduğu bilinmektedir (Zhou ve Everts, 2003). 1 no lu ırka dayanıklılık tek bir dominant gen (Fon-1) tarafından kontrol edilmektedir (Hawkins ve ark., 2001). Son olarak tanımlanan ırk 2, ilk defa İsrail de tespit edilmiştir (Netzer, 1976). En agresif ırk olan 2 no lu ırk günümüzde dayanıklı olarak bilinen karpuz çeşitlerini tehdit etmektedir (Martyn ve Netzer, 1991). Ancak son zamanlarda yapılan bir çalışmada (Zhou ve ark., 2010), ABD Maryland de ırk 2 için kullanılan referans genotip PI bitkilerinin % 90 dan fazlasını öldüren ve ırk 2 den daha agresif olan üçüncü bir ırk (ırk 3) olduğu bildirilmiştir. Ülkemizde Marmara ve Ege Bölgesi nde Fusarium oxysporum f.sp. niveum un 0 ve 1 no lu ırkları görülmektedir (Zengin ve ark., 1975). Filiz ve Turhan (1991) ın yaptığı bir çalışmada Ege Bölgesi nde 2 no lu ırkın varlığı da tespit edilmiştir. Çukurova Bölgesi nde ise her 3 ırk ın (0, 1, 2) varlığı saptanmıştır (Yücel ve ark., 1999). Kurt ve ark. (2008) nın bildirdiğine göre Doğu Akdeniz Bölgesi nde 0, 1 ve 2 no lu ırklar, Güneydoğu Anadolu Bölgesi nde de 0 ve 1 no lu ırklar görülmektedir. Fusarium solgunluğuna dayanıklı çeşit ve genotiplerin belirlenmesinde ve genetik materyalin seleksiyonunda klasik tarama (screening) yöntemlerinden faydalanılmaktadır (Capelli ve ark., 1995). Ancak bu yöntemler hem zaman alıcı olup, hem de fazla miktarda materyalin değerlendirilmesi söz konusu olduğunda yoğun emek gerektirmektedir. Klasik inokulasyon testleriyle dayanıklılığın araştırılması için yaklaşık 1 aylık süreye ihtiyaç duyulmaktadır. Fusarium solgunluğuna dayanıklılığı sağlayan genlerle bağlantılı DNA markörlerinin tespiti, dayanıklı bireylerin seçimini hızlandırarak ıslah çalışmalarına yardımcı olur (Lin ve ark., 2009a). Karpuzda Fusariuma dayanıklılığın tespiti 10

24 1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ amacıyla moleküler markörlerin geliştirilmesine yönelik çalışmalar (Xu ve ark., 1999; Harris ve ark., 2008; Xu ve ark., 2008; Lin ve ark., 2009a) yapılmış olup, günümüzde de devam etmektedir. Florasında 163 familyaya ilişkin 1225 cins ve 9000 tür bulunan ve bunlardan 3000 türü endemik nitelikte olan Türkiye nin; 203 familyaya bağlı 2500 ü endemik, türe sahip tüm Avrupa ülkeleri ile karşılaştırıldığında bitkisel gen kaynakları bakımından ne kadar zengin bir ülke konumunda olduğu kolaylıkla anlaşılır. Bu nedenle, genetik materyalin korunması ve kullanımına ilişkin çalışmaların Türkiye için ayrı bir önemi vardır (Özgen ve ark., 2000). Türkiye nin Avrupa-Sibirya, Akdeniz ve İran-Turan fitocoğrafik bölgelerinin kesiştiği yerde bulunması, Avrupa ile Güneybatı Asya arasında köprü görevi yapan bir göç yolu olması ve birçok cinste çeşitliliğin görüldüğü bir merkez olması (Tan, 1998) Türkiye nin önemli bir genetik çeşitlilik merkezi olduğunun kanıtıdır. Türkiye karpuzun gen merkezi olmamasına rağmen, Zhukovsky (1933) Anadolu da yabani türler olduğunu rapor etmiştir. Güneydoğu Anadolu, Akdeniz, İç Anadolu, Ege ve Marmara bölgelerinde karpuzda çok sayıda genetik kaynak mevcuttur. Diyarbakır, Şanlıurfa, Mardin, Adıyaman, Adana, Hatay ve Çanakkale dolaylarında hala yetiştirilmekte olan Tat Karpuzu, Sürme Hırsızı, Beyaz Kışlık Karpuz, Siyah Kışlık Karpuz, Mardin Karpuzu, Gelin Karpuzu, Komando Karpuzu ve Halep Karası gibi genotiplerin yerini yabancı kökenli F 1 çeşitler almaya başlamıştır ve bu genotipler zamanla yok olma tehlikesiyle karşı karşıyadırlar (Solmaz ve Sarı, 2009). Türkiye deki en büyük kabakgil genetik kaynak koleksiyonu Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü nde bulunmaktadır. Çalışmalar 1964 yılında başlamış ve 1600 den fazla genetik materyal toplanmıştır. Bu koleksiyonda yer alan karpuz genotiplerinin sayısı 358 dir (Sarı ve ark., 2008). Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü nde de 1990 yılından itibaren bir koleksiyon oluşturulmuş ve 2010 kayıtlarına göre toplanan karpuz materyalinin sayısı 365 e ulaşmıştır. Bu koleksiyon farklı tarihlerde yapılan ziyaretlerde Türkiye nin değişik bölgelerinin il, ilçe, köy ve mezraları dolaşılarak ulaşılan yerel genotipleri, açık tozlanan çeşitleri; Mısır, Fransa, Macaristan, Özbekistan, Güney Kore Cumhuriyeti, 11

25 1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ Çin, Kuzey Kıbrıs Türk Cumhuriyeti gibi bazı ülkelerdeki açık tozlanan karpuz genotiplerini, Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü Gen Bankası ndan sağlanan bazı genotipleri ve ABDTarım Bakanlığı ndan temin edilen farklı türlere ait genotipleri içermektedir. Bu genotiplerin çoğunun morfolojik karakterizasyonu UPOV deskriptör listesine göre tamamlanmış (Solmaz, 2003; Solmaz ve ark., 2007; Sarı ve ark, 2007a; Solmaz ve Sarı, 2009); 305 adedinin ise moleküler karakterizasyonu RAPD tekniğiyle yapılmıştır (Solmaz ve ark., 2010). Bu çalışmanın amacı; Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü karpuz genetik kaynak koleksiyonunda yer alan ve farklı orijinlere sahip olan 93 adetlik bir çekirdek koleksiyondaki genetik çeşitliliğin SSR ve SRAP markör teknikleriyle araştırılması ve Fusarium solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na dayanımlarının klasik ve moleküler yöntemlerle belirlenmesidir. 12

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Karpuzlarda Yapılan Moleküler Karakterizasyon Çalışmaları Biles ve ark. (1989), Fusarium oxysporum f.sp. niveum un 0, 1 ve 2 no lu ırklarına karşı farklı oranlarda duyarlılık gösteren 8 karpuz çeşidini, 6 farklı enzim sistemi kullanarak genel proteinler ve spesifik enzimler yönünden değerlendirmişlerdir. Sekiz karpuz çeşidinin yaprak, kotiledon, gövde ve ksilem öz suyunda izozim varyasyonunun araştırıldığı çalışmada, farklı bitki dokuları arasında izozimik farklılıklar gözlenmemiştir. Gövde ve ksilem özsuyunda belirlenen elektromorfik değişikliklerin Fusarium solgunluğuna dayanıklılık açısından önemli markörler olabileceği bildirilmiştir. Zhang ve ark. (1994), karpuz genotipleri arasındaki polimorfizmi RAPD yöntemi ile araştırmışlardır. Bitkisel materyal olarak, erkek kısır 617AB, Dixilee, Fusarium solgunluğunun 1 ve 2 no lu ırklarına dayanıklı PI ve tüm ırklarına karşı duyarlı New Hampshire Midget (NHM), 8 genotip ve NHM x PI melezi kullanılmıştır. Test edilen 53 primerden 3 ü (% 5.6) amplifikasyon sağlayamazken, 14 primer (% 26.4) bazı genotiplerde başarılı olabilmiştir. Genotiplerin tamamında amplifikasyonu sağlayan 36 primer, toplam 159 adet bant oluşturmuştur. Bu bantların % 56.0 ı 4 genotipte, % 51.6 sı NHM ve PI de ve % 10.1 i de sadece 3 genotipte polimorfik bulunmuştur. Katzir ve ark. (1996), Cucurbitaceae familyasına ait farklı türler arasındaki polimorfizmi, SSR markörleri ile araştırmışlardır. Kavun (Cucumis melo) genomik kütüphanesinden 5 ve hıyar (Cucumis sativus) sekans veritabanından 2 SSR izole edilerek primerler dizayn edilmiştir. Elde edilen 7 SSR primeri, 8 kavun, 11 hıyar, 5 kabak, 1 balkabağı ve 3 adet karpuz genotipinde test edilmiştir. SSR primerlerinden 5 i kavunlarda, 4 ü hıyarlarda, 3 ü kabaklarda polimorfizmi tespit ederken; denemede yer alan 3 karpuz genotipinde polimorfizm bulunamamıştır. Çalışmada Cucurbitaceae familyası üyelerinden herhangi birine özgü SSR primerlerinin familyada yer alan diğer cinslerde de kullanılabileceği sonucu ortaya çıkmıştır. 13

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ Lee ve ark. (1996), otuz dokuz karpuz genotipi arasındaki genetik çeşitliliği RAPD markörleri ile 15 primer kullanarak araştırmışlardır. Primerlerden 14 ü polimorfik bant oluşturmuş ve elde edilen toplam 162 bantın % 62 si polimorfik, % 38 i monomorfik bulunmuştur. Jarret ve ark. (1997), Afrika, Avrupa, Asya ve Meksika kökenli, morfolojik olarak birbirinden farklı 33 adet karpuz genotipi arasındaki genetik çeşitliliği SSR markörleri ile değerlendirmişlerdir. Kullanılan 8 adet SSR primerinden 7 si başarıyla amplifikasyon vermiş ve elde edilen allel sayısı 3-7 arasında değişmiştir. Kümeleme (cluster) analizleri sonucunda Citrullus genotiplerinin çoğunun birbirinden ayrıldığı tespit edilmiş ve % 25 genetik benzerlik seviyesinde 4 grup oluşmuştur. En büyük grup C. lanatus var. lanatus genotiplerini içermektedir ve kendi içerisinde 4 alt gruba ayrılmıştır. Genetik benzerlik bakımından birbirine en yakın genotipler bu grupta yer almakla birlikte, genotiplerin coğrafi kökeni veya meyve et rengi gibi özellikler ile alt grupların oluşması arasında herhangi bir korelasyon bulunmamıştır. Çalışmada yer alan 3 adet egusi tipi genotip de C. lanatus var. lanatus genotipleri ile birlikte gruplanmıştır. Bu genotiplerin meyve eti açık renkli olup, tohumları tipik bir şekilde yuvarlak ve ten rengidir. Kümeleme analizlerinde egusi tipi karpuzların Citrullus lanatus var. lanatus genotipleri ile birlikte gruplanması, egusi tipine özel morfolojik karakterlerin ifadesinde az sayıda genin rol aldığı düşüncesini ortaya koymaktadır. İkinci büyük grup ise citron olarak da adlandırılan C. lanatus var. citroides alt türünün yabani ve kültüre alınmış genotiplerinden oluşmaktadır. Bu grupta yer alan genotiplerin tamamı Güney Afrika kökenli olup, meyve etleri açık (beyaz veya sarı) renklidir ve bazıları karpuz hastalıklarına dayanıklıdır. Dördüncü grup da C. colocynthis türüne ait tek bir genotipten oluşmaktadır. Jarret ve Newman (2000), Citrullus türleri arasındaki filogenetik ilişkileri ve C. rehmii De Winter in türler arasındaki yerini ITS (internal transcribed spacer) ile belirlemişlerdir. Çalışmada C. lanatus var. lanatus, C. lanatus var. citroides, C. colocynthis, C. ecirrhosus, C. rehmii ve Aconthosicycos naudinianus türlerinin ITS bölgeleri PCR da amplifiye edilmiş ve direkt olarak sekanslanmıştır. Analizler neticesinde türler arasındaki ilişkiler karpuzlarda daha önce yapılan taksonomik 14

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ çalışmalarla uyumlu bulunmuş ve C. rehmii nin kültürü yapılan karpuzlara, C. colocynthis den daha yakın olduğu tespit edilmiştir. Levi ve ark. (2000), hastalıklara dayanıklı olarak rapor edilen 34 karpuz genotipi ve 5 adet ticari karpuz çeşidi arasındaki genetik akrabalık ilişkilerini RAPD markörleri ile araştırmışlardır. Çalışmada 28 RAPD primeri kullanılmıştır. Kümeleme (Cluster) analizleri sonucunda 3 ana grup oluşmuştur. Birinci ana grup 5 adet ticari karpuz çeşidi (C. lanatus var. lanatus), C. lanatus var. citroides genotipleri ve C. lanatus var. citroides genleri taşıyan C. lanatus var. lanatus genotiplerinden oluşan 3 alt grup içermiştir. İkinci ana grup C. lanatus var. citroides genotiplerinden ve 3. ana grup da C. colocynthis türüne ait genotiplerden oluşmuştur. Her iki C. lanatus grubu birbirinden % 58.8 ve C. colocynthis grubundan da % 38.9 benzerlik seviyesinde ayrılmıştır. C. colocynthis ve C. lanatus var. citroides genotipleri kendi içlerinde C. lanatus var. lanatus genotiplerine göre daha fazla genetik çeşitlilik göstermiştir. Genotipler arasındaki genetik benzerlik seviyesi sırasıyla C. colocynthis de % 74.2, C. lanatus var. citroides de % 82.2 ve C. lanatus da % 87.5 dir. Beklenildiği üzere en düşük genetik varyasyon (% 93.1) ticari karpuz çeşitleri arasında bulunmuştur. Levi ve ark. (2001a), Citrullus cinsine ait 42 adet genotip ve 5 ticari çeşit arasındaki genetik çeşitliliği RAPD markör tekniği ile değerlendirmişlerdir. Kullanılan 30 RAPD primerinden toplam 662 bant elde edilmiştir. Kümeleme (Cluster) analizleri sonucunda genotipler 3 ana gruba ayrılmıştır. Birinci grup ticari karpuz çeşitleri (C. lanatus var. lanatus), C. lanatus var. citroides genotipleri ve C. lanatus var. citroides genleri içeren C. lanatus var. lanatus genotiplerinden oluşmuştur. İkinci grup C. lanatus var. citroides genotiplerini ve 3. grup da C. colocynthis türüne ait genotipleri içermiştir. C. lanatus var. lanatus genotipleri, C. lanatus var. citroides ve C. colocynthis genotiplerine göre genetik yapı bakımından birbirine daha yakın bulunmuştur. Levi ve ark. (2001b), karpuzda üretimde kullanılan ticari çeşitler ve farklı türlere ait genotipler arasındaki akrabalığı belirlemek ve genetik çeşitliliği araştırmak amacıyla RAPD markör tekniğini kullanmışlardır. Denemede morfolojik özellikler bakımından birbirinden oldukça farklı 46 Amerikan çeşidi (C. lanatus var. lanatus) 15

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ ve 12 karpuz genotipi yer almıştır. Çalışmada 128 primer denenmiş, ancak 25 i polimorfik bant oluşturmuştur. Bu bantların moleküler büyüklükleri bp arasında değişmiş olup, 26 adedi tüm çeşitler ve genotiplerde monomorfik, 9 u çeşitler arasında polimorfik, genotipler arasında monomorfik, 168 i genotipler arasında polimorfik, çeşitler arasında monomorfik ve 85 adedi ise hem çeşitlerde hem de genotiplerde polimorfik bulunmuştur. Ticari çeşitler % , C. lanatus var. lanatus genotipleri % genetik benzerlik seviyesinde birbirinden ayrılmıştır. C. lanatus var. citroides ve C. colocynthis genotipleri ise % ve % 70.5 benzerlik seviyesinde farklılık göstermiştir. Çalışma sonucunda üretimde kullanılan çeşitlerin genetik yapı bakımından zengin bir çeşitlilik göstermediği saptanmıştır. Guerra-Sanz (2002) ın yaptığı çalışmada, 19 mikrosatellit primerinden 18 i ticari çeşitler, lokal populasyonlar, C. colocynthis genotipleri ve türlerarası melez bireylerden oluşan karpuz koleksiyonunda polimorfizmi başarıyla belirleyebilmiştir. Elde edilen allel sayısı C. lanatus genotipleri ve çeşitlerinde 1-8, C. colocynthis genotiplerinde 0-2 ve hibritlerde 0-4 arasında değişim göstermiştir. Che ve ark. (2003), orijinleri farklı, ıslah hatları ve ticari çeşitleri içeren 30 karpuz genotipi arasındaki genetik çeşitliliği, AFLP markör tekniği ile değerlendirmişlerdir. Altmış dört primer kombinasyonundan seçilen 8 primer kombinasyonu polimorfik bulunmuştur. Denemede yer alan 28 adet Citrullus lanatus genotipi arasındaki polimorfizm oranı % iken, tüm genotipler (30 adet) arasında % olarak bulunmuştur. Kümeleme (Cluster) analizleri sonucunda 3 grup oluşmuştur. Birinci grup sadece PI (C. lanatus var. citroides) genotipini içerirken, ikinci grupta da tek bir genotip (C. lanatus var. lanatus/egusi) yer almıştır. Sonuçlar egusi tipi karpuzlar ile yetiştiriciliği yapılan çeşitler arasında güçlü bir genetik benzerlik (SC: 0.72) olduğunu göstermiştir. Üçüncü grup ise 28 adet C. lanatus var. lanatus genotipinden oluşmuştur. Bu genotipler farklı coğrafi orijinlere sahip olmalarına rağmen, genetik olarak birbirleriyle çok yakından (SC: ) ilişkilidir. AFLP yöntemi kullanılarak oluşturulan genetik gruplama, genotipler arasındaki pedigri ilişkilerini ve coğrafi orijinleri doğru şekilde 16

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ yansıtmıştır. Sonuçlar, AFLP markörlerinin hem genotipler arasındaki genetik çeşitliliğin belirlenmesinde, hem de çeşit ayrımında kullanılabileceğini göstermiştir. Levi ve ark. (2004), genetik çeşitliliği az olan karpuz çeşitleri arasındaki akrabalık ilişkilerini, ISSR ve AFLP markörleri ile araştırmışlardır. Otuzsekiz ISSR primerinden 31 i (% 81.6) polimorfik bant oluşturmuştur. Elde edilen 111 adet bandın 72 si (% 64.5), çeşitler arasında polimorfik bulunmuştur. ISSR markörleri ile % 80.2, AFLP markörleri ile de % 97.8 seviyesinde genetik benzerlik tespit etmiştir. Sonuç olarak ISSR ve AFLP markörlerinin RAPD ve izoenzim markörlerine göre genetik altyapısı dar olan çeşitler arasında daha polimorfik olduğu tespit edilmiştir. Levi ve ark. (2005), Hindistan da yetişen bir kabakgil türü olan Praecitrullus fistulosus (Stocks) Pangalo ile karpuz türleri (Citrullus lanatus var. lanatus, C. lanatus var. citroides, C. colocynthis), kavun (Cucumis melo L.), hıyar (Cucumis sativus L.) ve bazı yabani Cucumis türleri (C. africanus, C. metuliferus, C. anguria, C. meeusei ve C. zeyheri) arasındaki filogenetik ilişkilerin belirlenmesinde ISSR ve RAPD markörlerini kullanmışlardır. Cucumis ve Citrullus türleri arasındaki genetik benzerlik oranı % 8 olarak tespit edilmiştir. Citrullus türleri arasındaki genetik benzerliğin (% 25-55), Cucumis türlerine (% 14-68) göre daha fazla olduğu görülmekle birlikte, Praecitrullus fistulosus un hem Citrullus, hem de Cucumis türleri ile genetik benzerliği % 3 den daha az bulunmuştur. Denemede yer alan 3 adet ticari karpuz çeşidi genetik olarak birbirine % 95 benzerlik seviyesinde yakınken, ticari karpuz çeşitleri ile C. lanatus var. lanatus genotipleri arasındaki genetik benzerlik % olarak tespit edilmiştir. C. lanatus var. lanatus un C. lanatus var. citroides ve C. colocynthis ile yakınlığı, sırasıyla % 55 ve % 25 bulunmuştur. Levi ve Thomas (2005), 5 karpuz çeşidi ve farklı coğrafik bölgelerden toplanmış Citrullus cinsinin ana türlerini temsil eden 21 adet karpuz genotipi arasındaki polimorfizmin araştırılmasında, 20 kloroplast DNA (cpdna) ve 10 mitokondriyal DNA (mtdna) RFLP markörlerini kullanmışlardır. Yapılan kümeleme (Cluster) analizleri sonucunda genotipler 3 gruba ayrılmıştır. Birinci grup C. lanatus subsp. vulgaris (C. lanatus var. lanatus olarak da bilinir), genotipleri ve çeşitlerinden; 2. grup C. lanatus subsp. lanatus un alt türü olan C. lanatus var. citroides genotiplerinden ve 3. grup da C. colocynthis genotiplerinden oluşmuştur. 17

31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ Karpuz çeşitlerinin kloroplast ve mitokondriyal genomları farklı olup, C. lanatus var. lanatus genotiplerininki ile yakın ilişkili bulunurken, yabani bir tür olan C. colocynthis genotiplerininkiler de C. lanatus var. citroides genotiplerininkilere benzer olarak tespit edilmiştir. Yan ve Zhang (2005), yeni bir moleküler markör sistemi olan SRAP markör tekniğini, 20 hibrit karpuz çeşidi arasındaki genetik çeşitliliği değerlendirmek için kullanmışlardır. Yirmi beş primer çiftinden 20 adedi toplam 135 adet polimorfik bant amplifiye etmiştir. Her bir primer çifti için elde edilen ortalama polimorfik bant sayısı 7.11 dir. Yapılan kümeleme (Cluster) analizleri sonucu 20 karpuz çeşidi 3 farklı gruba ayrılmıştır. Silva ve ark. (2006), gen bankasında yer alan Brezilya nın 3 farklı bölgesinden toplanmış karpuzlarda morfolojik ve moleküler karakterizasyon yapmışlardır. Çalışmada toplam 43 adet karpuz genotipi kullanılmış olup, Crimson Sweet çeşidi kontrol olarak denemede yer almıştır. RAPD tekniğiyle 6 primer kullanılarak yürütülen çalışmada, 31 i polimorfik olan toplam 64 bant elde edilmiştir. Kümeleme (Cluster) analizine göre, 24 adedi tek bir genotip içeren 28 grup oluşmuştur. Elde edilen sonuçlar neticesinde, RAPD markör tekniğinin polimorfizmi açıklayabildiği ve karpuz gen bankasında yer alan genotiplerin karakterizasyonunda kullanılabileceği bildirilmiştir. Dane ve Liu (2007), kültür formu ve citron tipi karpuzların (Citrullus lanatus) çeşitliliğini ve kökenini, kloroplast DNA da PCR-RFLP ve sekans yöntemleriyle araştırmışlardır. Çalışmada farklı coğrafi orijinlere sahip 70 adet C. lanatus var. citroides, 20 adet C. lanatus var. lanatus ve grup dışı olarak da 1 adet C. colocynthis genotipi yer almıştır. Filogenetik analizler neticesinde C. lanatus var. lanatus ve C. colocynthis genotiplerinin bir grup (% 98 bootstrap değeri) ve C. lanatus var. citroides genotiplerinin ise üç alt gruba ayrılan bir diğer grubu (% 93 bootstrap değeri) oluşturduğu tespit edilmiştir. Çalışma sonucunda kloroplast farklılıklarının morfolojik farklılıklarla ilişkisinin olmadığı belirlenmiş, ayrıca kültür formu ve yabani karpuzların tek bir atadan, muhtemelen Namibya orijinli C. ecirrhosus dan ayrı ayrı farklılaştıkları anlaşılmıştır. 18

32 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ Dane ve ark. (2007), C. colocynthis genotipleri arasındaki filocoğrafik ilişkileri araştırmışlardır. Çalışmada kullanılan C. colocynthis genotipleri farklı kökenlere (Hindistan, Pakistan, Afganistan, Fas, Cezayir, Etiyopya, Kıbrıs, İsrail, Çad, Avustralya) sahiptir. Namibya dan C. rehmii ve Hindistan dan temin edilen Praecitrullus fistulosus genotipleri ise grup dışı genotipler olarak yer almıştır. Kloroplast DNA varyasyonuna göre, C. colocynthis genotipleri 4 farklı gruba ayrılmış, ancak aynı ülkeden toplanan genotipler arasında farklılık tespit edilmemiştir. Kloroplast DNA sekans analizleri neticesinde göç yolunun Afrika dan Orta Doğu ve Uzak Doğu ya doğru olduğu belirlenmiştir. Avustralya dan toplanan genotipler, en fazla Kıbrıs ve Fas genotipleriyle sekans homolojisi göstermiştir. Levi ve Thomas (2007), büyük bir melezleme populasyonu kullanılarak oluşturulan karpuz genetik haritasının farklı bağlantı (linkage) bölgelerinde yer alan toplam 146 markör (RAPD, ISSR, AFLP, SRAP) ile genetik çeşitliliği oldukça düşük seviyede olan 24 karpuz genotipinde polimorfizmi araştırmışlardır. Kullanılan 53 RAPD marköründen 5 i (% 9.4), 15 ISSR marköründen 6 sı (% 40.0), 37 AFLP marköründen 30 u (% 81.0) ve 41 SRAP marköründen 33 ü (% 80.5) karpuz genotiplerinde polimorfik bulunmuştur. Çalışmada kullanılan bu polimorfik markörler karpuz genomu boyunca dağılmış bir şekilde yer almıştır. En yüksek polimorfizm SRAP markörlerinden elde edilmiş olup, bu markörlerin karpuz genomunda farklı bağlantı (linkage) bölgelerini temsil ettiği belirlenmiştir. Kwon ve ark. (2007), SSR markörlerinin farklı kabakgil türleri arasında kullanımını araştırmışlardır. Kavun ve hıyardan elde edilen SSR markörleri karpuzda (Citrullus lanatus) genetik çeşitliliğin karakterizasyonu amacıyla kullanılmıştır. Kavundan elde edilen 200 ve hıyardan elde edilen 96 SSR marköründen 82 si karpuz çeşitlerinde çalışmış ve 15 i 24 karpuz çeşidinde polimorfik bulunmuştur. Toplam 72 adet polimorfik bant elde edilmiş ve yapılan kümeleme (Cluster) analizleri sonucu 24 karpuz çeşidi 4 farklı gruba ayrılmıştır. Sarı ve ark. (2007b), 134 adedi Türkiye nin farklı bölgelerinden toplanan, 172 adedi Menemen Tarımsal Araştırma Ensitüsü nden sağlanan ve yabani türlerin de ABD den (USDA) temin edildiği toplam 326 karpuz genotipinde RAPD markörleriyle genetik karakterizasyon yapmışlardır. Çalışmada 22 adet RAPD 19

33 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ primeri kullanılmış, bunlardan büyüklükleri bp arasında değişen toplam 241 adet bant elde edilmiş ve polimorfizm oranı % 60.6 bulunmuştur. Kümeleme (Cluster) analizi sonuçlarına göre yabani türlere ait genotipler ayrı bir grup oluştururken, diğer genotiplerin çoğu birlikte gruplanmış ve genetik olarak birbirlerine yakın bulunmuşlardır. Levi ve ark. (2008), tarafından yapılan çalışmada genetik çeşitliliği az olan 25 Amerikan karpuz çeşidi ve 13 adet Amerika bitki introdüksiyonu (4 adet C. lanatus var. lanatus genotipi, 5 adet C. lanatus var. citroides genotipi ve 4 adet C.s colocynthis genotipi) arasındaki genetik çeşitlilik 40 adet EST-SSR ve 60 adet SSR motifi içermeyen EST primer çifti ile araştırılmıştır. Çalışma sonucunda toplam 250 EST-PCR markörü elde edilmiş olup, bunlardan 108 i EST-SSR primerlerinden, 142 si SSR motifi içermeyen EST primerlerinden üretilmiştir. EST-SSR primerlerinden elde edilen 108 EST-PCR markörünün 103 ü Citrullus PI larında gözlenirken, 64 ü çeşitler arasında gözlenmiş olup, bunların da 45 adedi (% 70.3) polimorfik bulunmuştur. SSR motifi içermeyen EST primerlerinden elde edilen 142 adet EST-PCR markörünün 134 ü Citrullus PI larında, 108 i de çeşitlerde görülmüş ve bunların da 86 adedi (% 79.6) çeşitler arasında polimorfik bulunmuştur. EST-PCR markörlerinin çoğu Citrullus PI ları ve çeşitleri arasında polimorfik bulunurken, çeşitlerin kendi arasındaki polimorfizm oranının önemli derecede azaldığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak kullanılan toplam 250 EST-PCR markörünün 3 ana Citrullus türünü birbirinden ayırabildiği saptanmıştır. Dört adet C. colocynthis genotipi diğer türlere uzakken, C. lanatus var. citroides PI larının gerek C. lanatus var. lanatus PI ları, gerekse de çeşitlerine daha yakın olduğu görülmüştür. EST-PCR markörleri C. lanatus var. lanatus PI ları ve 25 karpuz çeşidini de birbirinden ayırabilmiştir. Meyve karakterleri bakımından farklı özelliklere sahip olan Allsweet, AU Golden Producer ve Black Diamond çeşitleri genetik olarak yakın ilişkili bulunmuş ve birlikte gruplanarak diğer çeşitlerden ayrılmıştır. Spesifik primer çiftleri kullanılarak farklı gen sekanslarını amplifiye eden EST-PCR markörlerinin çeşitlerin ve ıslah hatlarının DNA parmakizinin çıkartılmasında, genetik ilişkilerin belirlenmesinde ve karpuz genetik haritalama çalışmalarında kullanılabileceği bildirilmiştir. 20

34 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ Verma ve Arya (2008), karpuzlarda EST-SSR markörleri geliştirmiş ve bunların Cucumis spp. türlerinde kullanım olanaklarını araştırmışlardır. EST sekanslarının analizi sonucu sentezlenen 40 adet yeni SSR primeri, 7 karpuz, 2 kavun ve 2 de hıyar çeşidinde amplifikasyon ve polimorfizm için test edilmiştir. Kullanılan 40 primerden 9 u amplifikasyon sağlayamamıştır. Karpuzlarda 7 SSR primer çifti polimorfik bulunmuş ve toplamda 14, lokus başına ise ortalama 2 allel elde edilmiştir. Allel büyüklükleri 110 ile 430 bp arasında değişim gösterirken, çeşitler arasındaki genetik uzaklık arasında değerler almış ve 2 çeşit de birbirinden ayrılamamıştır. EST-SSR ların farklı kabakgil türlerinde kullanımının araştırılması amacıyla amplifikasyon sağlayan 31 primer ile çalışılmış ve bunların, % 45.2 si kavunda, % 64.5 i hıyarda amplifikasyon sağlamıştır. Nimmakayala ve ark. (2009), C lanatus var. lanatus, C. lanatus var. citroides ve C. colocynthis türlerine ait 31 genotipin filogenetik analizini, AFLP ve SSR markörleriyle yapmışlardır. AFLP analizlerinde 35 primer çiftinden 3089 u (% 45) polimorfik olan, toplam 6879 AFLP markörü elde edilmiştir. Her tür kendi içerisinde polimorfik bant sayısı açısından değerlendirilmiş olup, C. lanatus var. lanatus a özgü 583, C. lanatus var. citroides e özgü 505 ve C. colocynthis e özgü de 194 polimorfik bant elde edilmiştir. Türlerarası ilişkileri belirlemek amacıyla türler arasında paylaşılan bant sayısı da sayılmıştır. C. lanatus var. lanatus ve C. lanatus var. citroides arasında 652 bant paylaşılırken, C. lanatus var. lanatus ve C. colocynthis arasında 756, C. lanatus var. citroides ve C. colocynthis arasında ise 620 bant paylaşılmıştır. SSR analizlerinde ise 30 SSR primer çifti, 169 allel amplifiye etmiştir. Primer başına 2-12 arasında allel elde edilmiştir. Türe özgü allel sayısı bakımından yapılan değerlendirmede, C. lanatus var. lanatus a özgü 50, Citrullus lanatus var. citroides e özgü 60 ve C. colocynthis e özgü 59 adet allel tespit edilmiştir. AFLP ve SSR analizlerinin kombinasyonu sonucu elde edilen farklı türlere ait genotiplerin kendi arasındaki genetik uzaklıları ise C. lanatus var. lanatus ta % 42, C. lanatus var. citroides de % 38 ve C. colocynthis de ise % 34 olarak bulunmuştur. Türler arasındaki genetik uzaklık beklenildiği üzere tür içi genetik uzaklıktan daha fazla olup, C. lanatus var. lanatus ile C. lanatus var. citroides arasında % 40, C. colocynthis ile C. lanatus var. citroides arasında % 43 ve 21

35 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ C. lanatus var. lanatus ile C. colocynthis arasında ise % 46 olarak tespit edilmiştir. Yapılan kümeleme (Cluster) analizleri neticesinde her üç türde klasik taksonomik sınıflandırmaya uyumlu bir şekilde gruplanmıştır. Szamosi ve ark. (yayınlanmamış), Macaristan ve Türkiye orijinli kavun ve karpuz genotipleri arasındaki genetik ilişkileri SSR markörleriyle değerlendirmişlerdir. Çalışmada otuz adet karpuz genotipi kullanılmış ve 11 adet primer çiftinden 28 i polimorfik, toplam 29 bant elde edilmiştir. Primer başına düşen polimorfik bant sayısı en fazla 4 iken, bantların büyüklükleri 102 ile 230 bp arasında değişmiştir. Kümeleme (Cluster) analizleri neticesinde karpuz genotipleri iki ana gruba ayrılmıştır. Çalışmada yer alan C. lanatus var. citroides genotipleri olan G34 ve G benzerlik seviyesinde diğer tüm genotiplerden ayrılarak 2 ana gruptan birini oluşturmuşlardır. İkinci ana grup ise 3 alt gruba ayrılmıştır. Bunlardan birincisi hem Macaristan hem de Türkiye orijinli genotipleri içerirken, ikincisi sadece Macaristan orijinli genotipleri, üçüncüsü ise sadece Türkiye orijinli genotipleri içermektedir. Bu alt gruplar içerisinde fenotipik olarak birbirinden belirgin şekilde farklı olan bazı genotiplerin genetik olarak ayrılamadığı görülmüştür. Türkiye den toplanan Kar 216 ve Macaristan orijinli G14 genotipleri her ne kadar morfolojik olarak farklı olsalar da % 95 seviyesinde genetik benzerlik göstererek birbirleriyle oldukça yakın ilişkili bulunmuşlardır Farklı Kabakgil Türlerinde SSR Markörleri ile Yapılan Karakterizasyon Çalışmaları Staub ve ark. (2000), Cucumis melo L. subsp. melo ve subsp. agrestis alt türlerine ait 46 kavun genotipi arasındaki genetik ilişkileri, RAPD ve SSR markörleri ile belirlemişlerdir. Kullanılan 64 RAPD primerinden 135, 17 SSR primerinden 54 bant elde edilmiştir. Genotipler arasındaki polimorfizmin değerlendirilmesinde RAPD primerlerinin 21 i ve SSR primerlerinin 7 si etkili olmuştur. Sonuç olarak her iki markör sisteminden elde edilen veriler arasında güçlü bir korelasyonun olduğu ve çalışmada yer alan kavun genotipleri arasındaki genetik ilişkilerin belirlenmesinde kullanılabilecekleri bildirilmiştir. 22

36 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ Danin-Poleg ve ark. (2001), tarafından genetik çeşitlilik çalışmalarında kullanılmak üzere Cucumis türlerinde toplam 61 SSR markörü geliştirilmiştir. Bunların 46 adedi kavun genomik kütüphanesinden elde edilmiştir. Karakterize edilen markörlerin 40 ı (30 kavun ve 10 hıyar SSR ı), 13 kavun ve 11 hıyar (Cucumis sativus L.) genotipinde polimorfizmin tespiti için kullanılmıştır. Primer başına kavunlarda en fazla 6, hıyarlarda ise 5 adet allel belirlenmiş, genetik uzaklık değerleri de kavun için 0.52 ve hıyar için 0.28 bulunmuştur. Değerler arasındaki bu fark, hıyarın dar olarak bilinen genetik temeliyle uyumludur. Kavunlarda, egzotik ve tatlı kavun grupları arasında, hıyarda ise iki alt tür (C. sativus var. sativus ve C. sativus var. hardwickii) arasında belirgin bir farklılık tespit edilmiştir. Decker-Walters ve ark. (2002), Kuzey Amerika daki yabani kavun (Cucumis melo) populasyonlarının, kökeni ve genetik akrabalıkları üzerine çalışmışlardır. Araştırmada, genotipler 45 i kantitatif, 10 u kalitatif olacak şekilde morfolojik ve fizyolojik karakterler bakımından değerlendirilmiştir. Toplanan materyalle birlikte var. chito ve var. dudaim türlerine ait kültürü yapılan 10 genotip, Asya kökenli 10 adet küçük meyveli genotip ve var. conomon, var. flexuosus, var cantalupensis ve var. inodorus alt türlerine ait 1 er genotip arasındaki genetik akrabalık ilişkileri RAPD ve SSR markörleriyle araştırılmıştır. Elde edilen veriler ışığında Kuzey Amerika genotiplerinin diğerlerinden farklı olduğu ortaya çıkmış ve araştırıcılar tarafından var. texanus Naudin olarak sınıflandırılmaları gerektiği savunulmuştur. Bu tür genetik olarak en fazla var. chito genotiplerine ve var. conomon alt türüne ait Doğu Asya kökenli çeşitlere yakın bulunmuştur. López-Sesé ve ark. (2002), çoğunluğu inodorus grubundan olan 15 İspanyol kavun (C. melo L.) çeşidi arasındaki polimorfizmi RAPD ve SSR markörleriyle araştırmışlardır. Çalışmada 36 RAPD primeri, polimorfik 100 bant, 12 SSR primeri de 23 allel üretmiştir. Her iki markör tekniğiyle de genotipler birbirinden ayrılmış, RAPD markörleriyle % 25.6, SSR markörleriyle de % 66.7 oranında polimorfizm elde edilmiştir. Aynı çeşit grubu içerisinde yer alan genotiplerin kendi aralarında da yüksek seviyede genetik çeşitlilik göstermesi İspanyol kavunlarının oldukça geniş bir genetik temele sahip olduğunu ortaya koymaktadır. 23

37 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ Chiba ve ark. (2003), kavunda (Cucumis melo L.) 31 adet mikrosatellit markörü geliştirmiş ve bunların temel kabakgil familyası türlerinde uygulanabilirliğini araştırmışlardır. Bu mikrosatellitler öncelikle, Cucumis melo nun 6 farklı türüne ait 12 hat ve çeşitten oluşan kavun genotipleri arasındaki genetik çeşitliliğin belirlenmesinde kullanılmış ve toplam 28 markör polimorfizm göstermiştir. Markörlerin kabakgil familyasının farklı türlerinde kullanılabilirliğini araştırmak amacıyla 9 farklı türde uygulamalar yapılmış ve temel türler olan; hıyar, kabak, karpuzda 13 markör lokusu belirlenmiştir. Türler arasında en fazla markör Momordica charantia (24 adet), Cucumis sativus (20 adet) ve Cucurbita maxima (18 adet) dan elde edilmiştir. Monforte ve ark. (2003), yabani ve kültür formlarını temsil eden 27 genotipten oluşan kavun (Cucumis melo L.) koleksiyonunda genetik çeşitliliği SSR markörleri ile araştırmışlardır. Çalışmada 18 SSR markörü kullanılmış ve tamamı polimorfik olan toplam 114 allel elde edilmiştir. Lokus başına düşen alllel sayısı 2-10 arasında değişmiş ve ortalama 6.3 olarak belirlenmiştir. Kümeleme analizleri neticesinde genotiplerin 2 ana gruba ayrıldığı ve gruplaşmanın Cucumis melo nun iki alt türü agrestis ve melo ile çoğunlukla uyumlu olduğu tespit edilmiştir. Genotipler genelde yer aldıkları alt türlere göre gruplanmış, ancak çalışmada gözlenen SSR değişkenliğine göre dudaim ve cihito alt türlerinde yer alan genotiplerin agrestis alt türünde yer alması gerektiği saptanmıştır. Paris ve ark. (2003), meyve karakterleri bakımından son derece farklı, özellikle kültür formalarından oluşan 45 genotiplik Cucurbita pepo gen havuzundaki genetik akrabalık ilişikilerini AFLP, ISSR ve SSR markörleri ile değerlendirmişlerdir. Analizleri sonucunda AFLP den 280 adedi polimorfik (% 63) 448, ISSR dan 108 i polimorfik 147 (% 74) ve SRR dan da 20 adet amplifikasyon ürünü elde edilmiştir. Çalışma sonucunda her üç markör sistemi arasında yüksek korelasyon bulunmuştur. Genotipler arasındaki gruplanmanın Cucurbita pepo nun 3 alt türü (fraterna, texana ve pepo) ile uyumlu olduğu ve subps. fraterna nın subsp. texana ya, subsp. pepo dan daha yakın olduğu tespit edilmiştir. Garcia-Mas ve ark. (2004), Cucumis cinsi içerisinde 17 türe ait toplam 25 genotipte filogenetik ilişkileri, ITS bölgesinin sekans analizleri ve SSR markörleri 24

38 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ ile araştırmışlardır. Ticari kavun ve hıyar çeşitlerinin yanı sıra karpuz ve kabak olmak üzere iki farklı kabakgil türü de çalışmada yer almıştır. ITS bölgesi sekans analiz verilerine göre Cucumis türleri; hıyar, kavun, C. metuliferus genotiplerini ve yabani Afrika türlerini içeren 4 ana grup oluşturmuştur. SSR analizlerinde 14 adedi kavundan, 3 adedi hıyardan geliştirilen 17 SSR primer çifti, 18 SSR lokusu amplifiye etmiş ve Cucumis türlerini kavun, hıyar ve yabani Afrika türleri olmak üzere 3 gruba ayırmıştır. Kavun SSR larının % 43 ü hıyarda, hıyar SSR larının ise tamamı kavunlarda başarıyla amplifikasyon sağlarken, karpuz ve kabakta amplifikasyon veren SSR ların oranı daha düşük olup, sırasıyla % 22 ve % 16 olarak belirlenmiştir. Zhuang ve ark. (2004), farklı Cucumis türleri (C. sativus var. sativus L., C. sativus. var. hardwickii (R.) Alef., C. hystrix, C. hytivus Chen & Kirkbride, C. melo ve C. metuliferus Meyer and Naudin) arasındaki genetik ilişkileri belirlemek için RAPD ve SSR markörlerini kullanmışlardır. 31 RAPD primerinden bp aralığında % 96 sı polimorfik toplam 398 bant elde edilmiştir. SSR analizlerinde ise 15 SSR primeri 109 bant üretmiştir. Bu primerlerden 14 ü C. sativus var. sativus da amplifiye olmuş ve 9 u (% 64) polimorfik olarak belirlenmiştir. Her bir SSR dan 1 ile 8 arasında olmak üzere toplam 55 allel elde edilirken, C. s. var. hardwickii de 41 allel, C. hytivus da 53 allel elde edilmiştir. C. hystrix de 15 primerin 12 si (% 80) amplifiye olmuş ve 31 adet allel üretmiştir. C. melo da ise primerlerin % 57 si polimorfik olup, toplam 53 allel tespit edilmiştir. C. melo var. conomon, C. melo var. agrestis ve C. metuliferus türlerinde ise sırasıyla 38, 35 ve 29 adet allel amplifiye olmuştur. Araştırma sonucunda, SSR ve RAPD markörleri kullanılarak belirlenen genetik ilişkiler yüksek oranda uyumlu (r=0.94) bulunmuştur. SSR ve RAPD analizleri 22 adet genotipi CS ve CM olarak iki ayırmıştır. CS grubu; 11 adet C. sativus genotipi ile C. hytivus ve C. hystrix genotipleri, diğer grup CM ise 6 adet C. melo genotipi ile C. metuliferus u içermektedir. SSR ve RAPD markörleri ile C. hystrix ve C. sativus arasındaki genetik farklılıklar sırasıyla 0.59 ve 0.57, C. hystrix ve C. melo arasında ise 0.87 ve 0.70 olarak tespit edilmiştir. Gonzalo ve ark. (2005), kavunda, genomik kütüphane ve EST veritabanı kaynaklı 118 SSR markörü geliştirmişlerdir. Bu markörlerin % 49 u haritalama 25

39 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ populasyonu için ebeveyn olarak kullanılan Piel de Sapo ve PI kavun genotipleri arasında polimorfizm göstermiştir. Genomik SSR lardan (% 51.2) ve EST-SSR lardan (% 45.5) elde edilen polimorfizm seviyeleri de benzer bulunmuştur. Nakata ve ark. (2005), 67 Japon kavun (C. melo L.) çeşidi arasındaki genetik çeşitliliği, 25 RAPD ve 9 adet SSR primeri ile araştırmışlardır. Çalışmada yer alan kavun çeşitleri var. cantalupensis (Earl s, House, Galia, Charentais ve Ogen çeşit tipleri), var. inodorus [(Honeydew ve Casaba kavunları); Amarillo, Piel de Sapo, Rochet, Negro, Crenshaw ve Tendral çeşit tipleri] ve var. conomon (Oriental çeşitlerini) olmak üzere 3 farklı türe aittir. RAPD primerlerinden boyutları bp arasında değişen, primer başına ortalama 2.4 olacak şekilde toplam 56 adet polimorfik bant elde edilmiştir. SSR primerlerinden ise lokus başına ortalama 4 ve toplamda da 36 adet allel elde edilmiştir. Her iki markör sistemi ile tespit edilen en yüksek polimorfizm oranı [% 79 (RAPD), % 89 (SSR)] var. conomon a ait Oriental kavun çeşitlerinde belirlenmiştir. Genel olarak RAPD markörlerinden SSR markörlerine göre daha yüksek polimorfizm elde edilmiş ve araştırıcılar bunun nedeninin SSR markörlerinde incelenen lokus sayısının az olmasına bağlamışlardır. Szabó ve ark. (2005), 47 kavun (C. melo) genotipi ve 15. yüzyıldan kaldığı bilinen yerel bir genotip arasındaki genetik varyasyonu ITS, SSR ve SNP yöntemleriyle araştırmışlardır. SSR analizlerinde 20 primer kullanılmış ve bunların 8 inden 40 allel elde edilmiştir. Primer başına düşen allel 2 ile 7 arasında değişmiş ve ortalama olarak 5.7 bulunmuştur. Çalışma sonucunda tarihi yerel genotipin 47 genotip arasında genetik olarak eski bir yerel Macar genotipinden selekte edilen Hogolyo adlı bir çeşide çok yakın olduğu tespit edilmiştir. Dhillon ve ark. (2007), tarafından Hindistan ın 2 farklı ekolojik bölgesinden toplanan 36 Cucumis melo var. momordica genotipi arasındaki çeşitlilik morfolojik, biyokimyasal ve genetik olarak (RAPD ve SSR markörleriyle) tespit edilmiştir. RAPD analizlerinde sadece 3 ü monomorfik toplam 104 adet bant elde edilmiş ve polimorfizm oranı % 96.6 olarak bulunmuştur. RAPD verileriyle yapılan kümeleme analizlerinde 36 genotipin 6 gruba ayrıldığı ve aralarında yüksek seviyede genetik varyasyon olduğu tespit edilmiştir. Hindistan orijinli bu 36 C. melo var. momordica genotipi İspanya, İsrail, Kore, Japonya, Maldivler, Irak, Pakistan ve Hindistan dan 26

40 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ gelen ve daha önce karakterize edilen referans genotiplerle SSR markörleri ile karşılaştırılmıştır. SSR analizlerinde Danin Poleg ve ark. (2001) ve Gonzalo ve ark. (2005) tarafından geliştirilen markörlerden 18 adedi kullanılmıştır. Analiz sonucunda toplam 232 SSR alleli gözlenmiştir. Lokus başına düşen ortalama allel sayısı Hindistan C. melo var. momordica genotiplerinde 10.3, referans genotiplerde ise 7.5 olarak tespit edilmiştir. Allelerin çoğu (% 85) tüm genotiplerde, 89 u (% 38.4) C. melo var. momordica genotiplerinde ve 36 sı da (% 15.5) sadece referans genotiplerde görülmüştür. Çalışma neticesinde Hindistan orijinli C. melo var. momordica genotiplerinin yüksek oranda genetik çeşitlilik gösterdiği saptanmıştır. Kong ve ark. (2007), kavun gen bankasını tarayarak 5747 EST den toplam 383 SSR markörü geliştirmişlerdir. Bunlar arasından daha önceki çalışmalarda tanımlanmamış olan 56 adedi, 27 kavun ve 3 hıyar çeşidinde polimorfizmin ve markörlerin türler arası transferini araştırmak amacıyla kullanılmıştır. 56 potansiyel SSR marköründen 47 adedi beklenen şekilde amplifikasyon verirken, 4 adet primer çifti hiç amplifikasyon vermemiş ve 5 primer seti de beklenenden çok büyük ürünler oluşturmuştur. Başarıyla amplifikasyon veren primerlerin 22 adedi test edilen kavun genotiplerinde polimorfik bulunmuştur. Lokus başına gözlenen allel sayısı 2 ile 5 arasında değişmiş ve ortalama 2.9 olarak tespit edilmiştir. Çalışma sonucunda EST- SSR markörlerinin, kavunlarda ıslah programlarında genetik varyasyon analizlerinde ve marköre dayalı seleksiyon çalışmalarında kullanılabileceği bildirilmiştir. Fukino ve ark. (2007), kavunda SSR markörleri geliştirmiş ve bu markörlerle farklı kavun genotipleri arasındaki polimorfizmi araştırmışlardır. Toplam 183 SSR markörü geliştirilmiş ve bunlar arasından rastgele seçilen 50 adedi 7 farklı türe ait 19 kavun genotipi arasındaki polimorfizmin değerlendirilmesinde kullanılmıştır. SSR markörlerinin tamamı genotiplerin çoğunda amplifikasyon verirken, 42 adedi (% 85.7) polimorfik bulunmuştur. Polimorfik SSR markörlerinin aynı türe ait en az 2 adet genotip arasındaki varyasyonu belirleyebildiği tespit edilmiştir. Elli SSR markörünün 36 adedi (% 72) hıyarda (C. sativus L.) başarıyla amplifiye olmuştur. Çalışma sonucunda geliştirilen SSR markörlerinin yüksek oranda polimorfik ve transfer edilebilir olduğu belirlenmiştir. 27

41 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ Fukino ve ark. (2008), hıyarda (Cucumis sativus L.) SSR larca zengin genomik kütüphaneden SSR markörleri geliştirmişler ve genetik haritalama yapmışlardır. Toplam 2304 klonun sekans analizi sonucu 313 SSR tespit edilmiş ve bunlardan hem hıyarda (C. sativus L.), hem de kavunda (C. melo L.) belirgin şekilde amplifikasyon veren ve polimorfik olan 101 primer çifti geliştirilmiştir. Hıyarda 101 SSR markörünün tamamı amplifikasyon göstermiş ve 91 i test edilen 3 genotipte polimorfik bulunmuştur. Kavunda ise test edilen 3 genotipte 41 adedi polimorfik olarak belirlenirken, 32 adedinde hiç amplifikasyon gerçekleşmemiştir. Hıyar için geliştirilen SSR ların hem hıyar, hem de kavunda amplifikasyon ve polimorfizm göstermeleri bu markörlerin her iki tür için de kullanıma uygun olduğunu açıklamaktadır. Gong ve ark. (2008), kabaklarda (Cucurbita) mikrosatellit (SSR) markörleri geliştirmiş ve bunların türler arası kullanım olanaklarını araştırmışlardır. Bu amaçla C. pepo subsp. pepo çeşidi Ölkürbis in ve C. moschata çeşidi Solar ın SSR larca zengin kısmi genomik kütüphaneleri oluşturulmuş ve 2400 klon sekanslanmıştır. Bu sekansların 1058 adedi (% 44) SSR içermiş ve 532 SSR primeri dizayn edilmiştir. Primerlerden toplam 500 adet (193 adet C. pepo, 307 adeti C. moschata) allel elde edilmiştir. Geliştirilen SSR markörlerinin türler arası aktarılabilirliğini araştırmak için 3 adet C. moschata, 1 adet C. ecuadorensis ve 8 çeşit grubunu temsil eden 8 adet C. pepo genotipinden oluşan toplam 12 genotip kullanılmıştır. C. pepo dan geliştirilen 193 primerin 155 adeti (% 80.3) polimorfik olup, 2-9 arasında allel üretirken, C. moschata dan geliştirilen 307 primerin 250 adeti (% 81.4) polimorfik olarak tespit edilmiş ve 2-7 arasında allel oluşturmuştur. Her iki türde lokus başına düşen ortalama allel sayısı 3.3 dür. Toplamda geliştirilen 500 primerin 405 i (% 81) polimorfik bulunmuştur. Geliştirilen 193 C. pepo SSR markörünün 147 si (% 76.2), 307 C. moschata SSR markörünün 215 i (% 70) C. ecuadorensis türüne aktarılabilmiş ve çoğu durumda sadece tek bir allel elde edilirken SSR ların C. pepo C. moschata arasında transferi daha yüksek oranlarda bulunmuştur. C. pepo SSR larının % 88 i C. moschata da kullanılabilir olup, bunların % 30.1 i 3 adet C. moschata genotipi arasında polimorfik bulunmuştur. C. moschata dan elde edilen SSR ların ise % 87.3 ü C. pepo da kulanılabilir olup, % 50.5 i 8 adet C. pepo 28

42 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ genotipinde polimorfizm üretmiştir. Sonuç olarak geliştirilen SSR ların türler arasında yüksek oranda transfer olabileceği ortaya konmuştur. Watcharawongpaiboon ve Chunwongs (2008), hıyarda (Cucumis sativus L.) genomik kütüphaneden mikrosatellit markörleri karakterize etmişlerdir. 860 klon arasından 170 i SSR sekansı içermiş, bunların da 86 adedinden (% 50.6) primer dizayn edilmiştir. Bu primerlerin 57 adedi (% 66.3) beklenen boyutlarda, 10 adedi de (% 11.6) beklenmeyen boyutlarda PCR ürünleri oluştururken, 19 adedi hiç amplifikasyon vermemiştir. Test edilen 57 primerin 45 adedi (% 52.3) 16 adet hıyar genotipinde polimorfizm oluştururken, 12 adedi (% 14) monomorfik bulunmuştur. Lokus başına düşen allel sayısı 7 ye kadar çıkmış ve ortalama 3.6 olmuştur. Geliştirilen markörler hibrit testlerinde tohum saflığının belirlenmesinde de başarıyla kullanılmıştır. Ayrıca markörlerinin farklı türlere (kavun, karpuz, balkabağı, Momordica charantia) transferi de araştırılmıştır. Bu amaçla 20 adet markör test edilmiş ve kavunda 13 adedi (65 %), Momordica charantia da 11 adedi (55 %), karpuzda 10 adedi (% 50) ve kabakta 7 adedi (35 %) PCR ürünü üretmiş ve böylece çalışmada geliştirilen hıyar SSR larının farklı türlere de transfer edilebileceği tespit edilmiştir. Tzitzikas ve ark. (2009), geleneksel Yunanistan ve Güney Kıbrıs Rum Kesimi kavun (C. melo L.) çeşitleri arasındaki genetik çeşitliliği ve populasyon yapısını 17 SSR markörü ile araştırmışlardır. Çalışmada 7 adedi Yunanistan dan, 5 adedi Güney Kıbrıs Rum Kesimi nden, 2 adedi ticari çeşit ve 7 adedi de farklı türlere ait referans genotipler olmak üzere toplam 22 adet çeşit kullanılmıştır. Tüm SSR markörleri polimorfik bulunmuş ve toplam 81 adet allel üretmiştir. Çeşitlerin tamamı (43 ve 41 hariç) en az bir SSR markörü ile birbirinden ayrılmıştır. Referans genotipler arasındaki genetik varyasyon daha yüksek olup, lokus başına ortalama 4 adet allel elde edilirken, Yunanistan ve Güney Kıbrıs Rum Kesimi çeşitlerinde bu sayı 2.47 olarak tespit edilmiştir. Heterozigoti oranının ise çok düşük olduğu belirlenmiştir. Yapılan analizler neticesinde Yunanistan ve Güney Kıbrıs Rum Kesimi çeşitleri ile referans genotipler 5 ayrı gruba ayrılmıştır. Tüm çeşitler ayırt edilebilmiş ve Güney Kıbrıs Rum Kesimi genotiplerinin inodorus türüne ait Piel de Sapo çeşidi ile daha yakın olduğu, Yunanistan çeşitlerinin ise inodorus türüne ait Piel 29

43 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ de Sapo ile cantalupensis türüne ait Védrantais çeşidi arasında yer aldığı tespit edilmiştir. Çalışma sonucunda Yunanistan ve Güney Kıbrıs Rum Kesimi geleneksel çeşitleri arasında yüksek oranda genetik varyasyon olduğu ve Batı Akdeniz çeşitlerine göre daha geniş bir germplazmdan geliştirildikleri bildirilmiştir Kabakgil Türlerinde ve Farklı Türlerde SRAP Markörleri ile Yapılan Karakterizasyon Çalışmaları Li ve Quiros (2001), yeni bir moleküler markör olan SRAP markör sistemini geliştirmişlerdir. Araştırıcılar bu sistemi ilk olarak lahanada (Brassica oleracea L.) rekombinant saf hatlardan (RIL) ve dihaploid hatlardan oluşan bir populasyonda test etmişlerdir. Sekans analizleri sonucunda elde edilen markörlerin % 20 sinin kodominant olduğu tespit edilmiştir. SRAP protokolü geliştirilirken PCR amplifikasyonu için önce tek primer kullanılmış, ancak istenilen sonuçlar elde edilememiştir. Farklı boyutlarda primerle de denemeler yapılmış ve sonuçta optimal SRAP primerinin bp uzunluğunda olduğu belirlenmiştir. Ferriol ve ark. (2003), Cucurbita pepo nun 2 alt türüne (ssp. pepo ve ssp. ovifera) ait morfolojik olarak 8 gruba ayrılan 69 adet genotipi morfolojik ve moleküler olarak karakterize etmişlerdir. Moleküler karakterizasyonda SRAP ve AFLP markörleri kullanılmıştır. Analizler sonucunda 11 SRAP primer kombinasyonu toplam 88 bant üretmiş ve bunlardan 64 adedi (% 72.7) polimorfik bulunmuştur. SRAP markörleri ile AFLP markörlerine göre morfolojik çeşitlilikle daha uyumlu bilgiler elde edilmiştir. Budak ve ark. (2004a), 53 çim [Buchloe dactyloides (Nutt.) Elgelm.] genotipi arasındaki genetik çeşitliliği SRAP markörleri ile incelemişlerdir. Araştırmada 34 SRAP primer kombinasyonu denenmiş ve büyüklüğü bp arasında değişen toplam 243 adet bant elde edilmiştir. Bu bantlardan 231 adedi polimorfik olarak tespit edilmiştir. Kümeleme (Cluster) analizleri UPGMA metodu kullanılarak yapılmış ve genotipler arasındaki benzerlik oranı arasında bulunmuştur. Temel bileşenler analizlerinde de kümeleme analizlerine benzer gruplar 30

44 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ elde edilmiştir. Her iki analiz metodu da genotipleri ploidi seviyelerine göre ayırabilmiştir. Ferriol ve ark. (2004a), Cucurbita maxima nın lokal populasyonlarından oluşan bir koleksiyonun morfolojik ve moleküler karakterizasyonunu yapmışlardır. Araştırmada moleküler markör tekniği olarak SRAP ve AFLP kullanılmıştır. SRAP markör tekniği genotipleri agronomik özelliklerine göre gruplarken, AFLP markör tekniği coğrafi orijinlerine göre gruplamıştır. Ferriol ve ark. (2004b), morfolojik ve orijin olarak birbirinden farklı 47 Cucurbita moschata genotipinin moleküler karakterizasyonunda SRAP ve AFLP markör tekniklerini kullanmışlardır. SRAP analizleri sonucunda 11 primer kombinasyonu 148 bant oluşturmuş ve bunlardan 98 adedi (% 66.2) polimorfik olarak tespit edilmiştir. Sonuçlar morfolojik karakterizasyon verileriyle uyumlu bulunmuştur. Gülşen ve ark. (2005), farklı coğrafik orijinlere sahip 56 adet çim [Buchloe dactyloides (Nutt.) Elgelm.] genotipinde genetik çeşitliliği SRAP markörleriyle araştırmışlardır. Çalışmada 25 primer kombinasyonu kullanılarak toplam 95 adet markör elde edilmiştir. Genotiplerin tamamı birbirinden ayrılmış ve genetik benzerlik oranlarının 0.70 ile 0.95 arasında olduğu tespit edilmiştir. Ruiz ve Garcia-Martinez (2005), İspanya da birbiriyle yakın ilişkili yerli domates çeşitlerinde genetik çeşitliliği araştırmak amacı ile SSR ve SRAP markörlerini kullanmışlardır. Çalışmada farklı bölgelerden 3 tipi temsil eden yerel çeşitler yanında, bazı ticari çeşitler ve birkaç yabani genotip yer almıştır. Her iki markör sistemi de farklı gruplarda yer alan genotipleri birbirinden ayırmış, ancak SSR markörleri aynı gruba giren bazı genotipleri ayırmada başarılı olamamıştır. Cravero ve ark. (2007), yabani [Cynara cardunculus var. sylvestris (Lam.) Fiori ve Cynara cardunculus var. cardunculus] ve kültür (Cynara cardunculus var. scolymus) tiplerinden oluşan 26 enginar genotipinde genetik çeşitliliği SRAP markörleriyle değerlendirmişlerdir. Çalışmada toplam 15 primer çifti kullanılmış, ancak bunların 7 adedinden güvenilir ve parlak bantlar elde edilmiştir. Yapılan kümeleme (Cluster) analizleri neticesinde yabani tipler, kültür tiplerinden belirgin bir 31

45 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ şekilde ayrılmıştır. Sonuç olarak SRAP markörlerinin genetik çeşitliliğin araştırılması için uygun bir yöntem olduğu bildirilmiştir. Espósito ve ark. (2007), 40 adet bezelye (Pisum sativum L.) çeşidinde genetik çeşitliliği SRAP ve morfolojik markörlerle araştırmışlardır. Çalışmada toplam 7 primer kombinasyonu kullanılmış ve büyüklükleri bp arasında değişen toplam 162 bant elde edilmiştir. Her bir primer başına düşen ortalama bant sayısı 23 tür. Yapılan kümeleme analizleri neticesinde genotipler 4 farklı gruba ayrılmıştır. Her ne kadar moleküler ve morfolojik markörlerden elde edilen verilerle ayrı ayrı yapılan analizler, genotipler arasındaki genetik çeşitliliği ortaya koyma açısından benzerlik gösterse de, grupların oluşmasında genotiplerin orijinlerinin herhangi bir rolü olmadığı tespit edilmiştir. Her iki yöntemin verileriyle elde edilen benzerlik indeksleri arasında 0.70 korelasyon bulunmuştur. Gülşen ve ark. (2007), 23 bamya (Abelmoschus esculentus L. Moench.) genotipinde genetik çeşitliliği SRAP ve fenotipik markörlerle araştırmışlardır. Yirmi biri Türkiye den, 2 si ise ABD den seçilen genotiplerin değerlendirilmesinde 39 primer kombinasyonu kullanılmış ve % 50 si polimorfik olan toplam 97 skorlanabilir bant elde edilmiştir. Primer başına elde edilen bant sayısı 2-6 olup, büyüklükleri bp arasında değişmiştir. Genotiplerin 17 si (% 74) ortalama 0.93 benzerlik seviyesinde birbirinden ayrılmıştır. Benzerlik matriksi ve dendrogram arasında yüksek düzeyde korelasyon (r=0.94) bulunmuştur. SRAP markör tekniğinin bamyalarda genetik çeşitliliğin ve ilişkilerin araştırılmasında, marköre dayalı seleksiyon (MAS) ve genetik haritalama çalışmalarında kullanılabileceği bildirilmiştir. İnan (2008), Cucurbita pepo, Cucurbita moschata ve Cucurbita maxima türlerine ait toplam 24 adet kabak genotipinde morfolojik ve moleküler karakterizasyon yapmıştır. Çalışmada moleküler teknik olarak SRAP ve ISSR markörleri kullanılmıştır. Sekiz SRAP primer kombinasyonu test edilmiş ve tamamı polimorfik olan toplam 71 adet bant elde edilmiştir. Primer başına düşen toplam polimorfik bant sayısı 3-19 (ortalama 8.88) arasında değişmiştir. Kabak genotipleri arasında genetik benzerlik indeksi ise 0.13 ile 1.00 arasında değerler almıştır. Veriler NTSYS programında analiz edilmiş ve dendrogramlar UPGMA metoduyla 32

46 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ oluşturulmuştur. SRAP analizleri sonucunda genotiplerin tamamının birbirinden ayrılmadığı görülmüştür. ISSR ve SRAP arasındaki korelasyonun çok yüksek (r=0.947) olduğu gözlenmiştir. Li ve ark. (2008), 20 adet yeşil soğan (Allium fistulosum L.) çeşidi arasındaki genetik çeşitliliği SRAP ve SSR markörleri ile araştırmışlardır. SRAP analizlerinde 256 primer çifti test edilmiş ve bunlardan 161 adedi (% 62.9) toplam 336 adet polimorfik bant oluşturmuştur. Her bir primer başına elde edilen bant sayısı 1 ile 6 arasında değişmiş ve ortalama 2.1 olarak tespit edilmiştir. Yapılan analizler sonucu 20 çeşit arasındaki genetik benzerlik (GS) katsayısı ise ile arasında değişmiş, ortalama olarak bulunmuştur. Çalışma sonucunda SRAP markörleriyle elde edilen genetik çeşitliliğe ait bilgilerin, SSR markörlerine göre morfolojik verilerle daha uyumlu olduğu bildirilmiştir. Genetik çeşitliliğin araştırılmasında SRAP markörlerinin, genetik saflığın belirlenmesi ve çeşit tespitinde ise SSR markörlerinin kullanımı önerilmiştir. Mutlu ve ark. (2008), patlıcanda Fusarium solgunluğuna dayanıklılık geni ile bağlantılı SRAP, SRAP-RGA, RAPD ve SCAR markörleri geliştirmek amacıyla F2 ve BC1 populasyonuna ait DNA ları 2316 primer kombinasyonuyla taramışlardır. SRAP analizlerinde 208 farklı primer kombinasyonu kullanılmış ve primer başına ortalama 2.9 bant elde edilmiştir. Çalışma sonucunda, ko-dominant SRAP markörü Me8/ Em 5 ve dominant SRAP-RGA markörü Em12/GLPL2 nin birbiriyle bağlantılı oldukları ve dayanıklılık genine 1.2 cm mesefade yer aldıkları tespit edilmiştir. Tamam (2008), avokadonun iki ırkını temsil eden 13 çeşit ile Meksika Guatemala melezi olan 7 çeşit içeren toplam 20 çeşitte SRAP ve RAPD markörleri ile moleküler karakterizasyon yapmıştır. Çalışmada kullanılan 18 RAPD primerinden 116, 21 SRAP primer kombinasyonundan ise 122 bant elde edilmiştir. SRAP primerleri ile elde edilen 122 bantın 27 adedi monomorfik, 95 adedi ise polimorfik olup, polimorfizm oranı % 77 dir. Bant büyüklüklerinin bp arasında olduğu saptanmıştır. Genotipler arasındaki benzerlik indeksi arasında değişmiştir. Çalışma sonucunda iki markör sistemi karşılaştırıldığında RAPD ile % 96, SRAP ile % 77 oranında polimorfizm elde edilmiş ve RAPD yönteminin avokado çeşitlerini ayırmada daha başarılı olduğu saptanmıştır. 33

47 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ Wang ve ark. (2008), 35 turp çeşidinde genetik çeşitliliği RAPD, ISSR ve SRAP markörleriyle araştırmışlardır. Çalışmada 35 RAPD, 22 ISSR primeri ve 17 SRAP primer kombinasyonu kullanılmıştır. Bu markör sistemlerinden sırasıyla % 85.44, % ve % oranında polimorfizm elde edilirken, genotiplerin ortalama benzerlik katsayısı da 0.781, 0.787, olarak bulunmuştur. Her 3 markör sisteminin tüm çeşitleri ayırmada başarılı olduğu belirlenmiştir. Dendrogramlar UPGMA metoduna göre oluşturulmuştur. RAPD ve ISSR markörleri çeşitleri 3 gruba ayırırken, SRAP markörleri 2 gruba ayırmıştır. Üç markör sisteminden elde edilen verilerin birleştirilmesiyle oluşturulan dendrogramda 35 çeşit orijinleri ve genel özellikleriyle yüksek oranda uyumlu 3 ana gruba ayrılmıştır. Sonuçlar her 3 markör sisteminin de turp çeşitlerinde genetik çeşitliliğin belirlenmesinde etkili olduğunu ortaya koymuştur. Gülşen ve ark. (2009), Türkiye den toplanmış 182 adet çim (Cynodon dactylon) genotipinde ploidi seviyesini, ploidi seviyesi ile genetik çeşitlilik arasındaki ilişkileri, genetik çeşitlilik ile coğrafi dağılım ve ploidi seviyesi arasındaki ilişkileri, ayrıca genetik çeşitliliğin araştırılmasında kullanılan 4 farklı markör sistemi (SRAP, RAPD, POGP, ISSR) arasındaki korelasyonu araştırmışlardır. Çalışmada 34 SRAP primer kombinasyonundan 185, 13 POGP primer kombinasyonundan 85, 8 ISSR primerinden 61 ve 8 RAPD primerinden 85 adet olmak üzere toplam 407 adet polimorfik bant elde edilmiştir. Genotipler arasındaki genetik farklılık ise 0.50 ile 0.98 arasında değişmiştir. Sonuç olarak 4 farklı markör sisteminin genotipler arasındaki genetik çeşitliliği belirlemede farklılık gösterdiği saptanmıştır. Uzun (2009), Türkiye turunçgil koleksiyonlarında bulunan turunçgil türleri ve bunların akraba gruplarına ait toplam 825 adet genotipte genetik çeşitliliği SRAP markör tekniği ile araştırmıştır. Çalışmada 21 adet primer kombinasyonu kullanılmış ve materyaller tür gruplarına göre 8 ayrı gruba ayrılarak çalışılmıştır. Veriler her grup için ayrı ayrı ve daha sonra gruplar kombine edilerek değerlendirilmiştir. Bütün genotiplerin benzerlik düzeyleri 0.21 ile 1.00 arasında değişmiştir. Turunçgil türlerinden; portakal, limon, altıntop ve turunç türleri içerisinde varyasyonun çok düşük düzeyde olduğu saptanmıştır. SRAP markörleri kullanılarak yapılan bu 34

48 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ çalışma ile Türkiye nin turunçgil genetik kaynaklarının genetik çeşitliliği ortaya konulmuştur Karpuzlarda Fusarium Solgunluğu Üzerine Yapılan Çalışmalar Netzer (1976), İsrail de lokal Fusarium oxysporum f.sp. niveum (Fon) izolatları ile 3 ü ABD den, 1 i Yunanistan dan getirilen ve çok virülent olarak değerlendirilen izolatların patojenisitesini karşılaştırmıştır. Lokal izolatların hepsi ve Yunanistan dan getirilen 1 izolat Fusarium solgunluğuna dayanıklı 5 ABD çeşidinin tamamında solgunluk oluştururken, ABD izolatları solgunluk oluşturmamıştır. Martyn ve Mclaughlin (1983), karpuz çeşitlerinin.(fon) a karşı dayanımlarında farklı inokulum konsantrasyonlarının etkilerini araştırmışlardır. İnokulum konsantrasyonu olarak 1x10 3, 1x10 4, 1x10 5 ve 1x10 6 konidi/ml denenmiştir. Dayanıklılık düzeyi için bir skala yapılmış ve solgunluk % 80 den fazla ise duyarlı, % arasında ise düşük seviyede dayanıklı, % arasında ise orta seviyede dayanıklı ve % 20 den azsa dayanıklı olarak 4 grup oluşturulmuştur. Çeşitlerin çoğu inokulum konsantrasyonunun artmasıyla birlikte dayanıklılık açısından bir alt seviyeye düşmüştür. Dixilee ve Smokylee çeşitleri ise 1x10 6 konsantasyonunda dahi yüksek oranda dayanıklılıklarını koruyabilmişlerdir. Martyn (1987), Teksas da karpuz yetiştirilen alanlardan izole ettiği 2 adet izolatın, Fusarium solgunluğuna yüksek oranda dayanıklı çeşitlerde dahi % 90 oranında ölüme neden olduğunu ve bu izolatların ırk 2 ye ait olduğunu bildirmiştir. Wang ve Zhang (1988), karpuz Fusarium solgunluğuna dayanıklılık açısından farklı inokulasyon metodlarının karşılaştırmasını yapmışlardır. Araştırıcılar, kök daldırma yönteminin daha hızlı olduğu ve doğru sonuç verdiğini tespit etmişlerdir. İnokulasyon için optimum spor konsantrasyonu 5x10 3 spor/ml, kök daldırma süresi ise 3 dakika olarak belirlenmiştir. Orijini farklı 79 karpuz genotipi Fusarium solgunluğuna dayanım bakımından kök daldırma inokulasyon yöntemi kullanılarak testlenmiştir. Afrika, Batı Avrupa ve bazı Amerika orijinli genotipler dayanıklı, Xingliang, Rusya ve Huabei orijinli genotipler ise hassas olarak tespit edilmiştir. 35

49 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ Netzer ve Martyn (1989), Fon un 2 no lu ırkının İsrail ve ABD de tespit edildiğini ve bu ırka karşı dayanıklı çeşit geliştirme çalışmalarının 1978 yılında başladığını bildirmişlerdir. Yapılan testler sonucunda yabani karpuz genotipi PI in İsrail, Oklahama ve Teksas dan izole edilen 2 no lu ırka dayanıklı iken, Calhoun Gray çeşidinde bitkilerin tamamının öldüğü tespit edilmiştir. Biles ve Martyn (1989), Fusarium oxysporum un farklı alt türleri ile yapılan ön inokulasyonun karpuzlarda Fon a karşı dayanıklılığı arttırdığını saptamışlardır. Denemede Fon a farklı düzeylerde dayanıklı karpuz çeşitlerine ait fideler, karpuzda solgunluk oluşturmayan F. oxysporum f.sp. cucumerinum ve virulent olmayan F. oxysporum f.sp. niveum ırk 0 ve 1 ile inokule edilmiştir. Ön inokulasyondan 24 ve 72 saat sonra virulent ırk olan Fon ırk 2 nin inokulasyonu gerçekleştirilmiştir. Sonuçta yapılan tüm ön inokulasyonların karpuzlarda Fusarium solgunluğu belirtilerini önemli ölçüde azalttığı saptanmıştır. Fon un virulent olmayan ırklarının F. oxysporum f. sp. cucumerinum a göre ve inokulasyonlar arası 72 saatlik zaman diliminin de 24 saate göre daha etkin bir koruma sağladığı tespit edilmiştir. Filiz ve Turhan (1991), Ege Bölgesi nin İzmir, Manisa ve Aydın illerinde karpuz Fusarium solgunluğu ırklarını ve bu ırklara karşı karpuz çeşitlerinin dayanıklılığını araştırmışlardır. Elde edilen 37 adet Fon izolatından 2 si ırk 0, 8 i ırk 1 ve 27 si ırk 2 olarak tanımlanmıştır. Ioannou ve Poullis (1991), Güney Kıbrıs Rum Kesimi nde karpuz üretimi yapılan bölgelerde Fon un görülme oranını belirlemek amacıyla survey çalışması yapmışlardır. Üretimde dayanıklı çeşitler (genellikle Crimson Sweet) kullanılmasına rağmen, örnek alınan tüm tarlalarda hastalık tespit edilmiştir. On iki Fusarium izolatının patojenisitesi sera koşullarında, 1 hassas ve 3 dayanıklı çeşit kullanılarak testlenmiştir. Testler sonucunda izolatlar 3 gruba ayrılmış, bunlardan biri 4 çeşitte de yüksek oranda virülent bulunmuştur. Bu izolat, 21 i Fon a dayanıklı olarak rapor edilen 30 yeni karpuz çeşidinde testlenmiş, ancak çeşitlerin tamamı bu izolata karşı çok duyarlı bulunmuştur. Martyn ve Netzer (1991), PI karpuz genotipinin Fon un 0, 1 ve 2 no lu ırklarına karşı dayanıklılığını araştırmışlardır. Çalışmada farklı coğrafi bölgelerden toplanan Fon un 0, 1 ve 2 no lu ırklarına ait izolatlar ve farklı 36

50 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ inokulasyon metodları (kök uçlarına inokulasyon, fide tepsilerini inokuluma daldırma ve inokule edilen patojen topraklara ekim) denenmiştir. Sonuçta PI genotipinin, 3 farklı inokulasyon yönteminde 2 no lu ırk a karşı % 0-5 oranında solgunluk oluşturduğu gözlenirken, 3 ünün ırk 1 ve 1 inin ırk 0 izolatına karşı % 100 dayanıklı olduğu tespit edilmiştir. Freeman ve Rodriguez (1993), Fon un patojenisitesinin değerlendirilmesi amacıyla hızlı bir inokulasyon tekniği geliştirmişlerdir. Bu teknikte, kökleri traşlanmış fideler konidi süspansiyonuna daldırılmış ve. inokulasyon sonucunda hastalık hızla gelişmiştir. Uygulamadan 4-6 gün sonra karpuz fidelerinin % 50 si ölmüştür. Patojenisitenin hızlı bir şekilde değerlendirilebilmesiyle birlikte, daha az zaman ve işgücü gerektirmesinin yöntemin avantajları olduğu bildirilmiştir. Yücel ve ark. (1999), karpuzda Fon un rklarının ve bu ırklara karşı bazı karpuz çeşitlerinin reaksiyonlarının belirlenmesi üzerine çalışmışlardır. Solgun bitki örneklerinden 67 Fusarium izolatı elde edilmiş, ancak 47 sinin patojen olduğu tespit edilmiştir. Test sonuçlarına göre Fusarium izolatlarının 3 ü ırk 0, 30 u ırk 1 ve 14 ü ırk 2 olarak saptanmıştır. Denemede 19 karpuz çeşidi, Fon un 3 ırkına karşı testlenmiştir. Bu çeşitler, 0 ve 1 no lu ırka karşı yüksek veya orta derecede dayanıklı bulunurken, tüm çeşitler ırk 2 ye duyarlı veya az dayanıklı bulunmuşlardır. Xu ve ark. (1999), yabani karpuz türü Citrullus lanatus var. citroides genotipi olan PI de RAPD yöntemini kullanarak Fusarium solgunluğunun 1 no lu ırkına karşı dayanıklılık sağlayan gene bağlı moleküler markör geliştirmişlerdir. Fusarium solgunluğunun 1 no lu ırkına dayanıklılık tek bir dominant gen tarafından kontrol edilmektedir. RAPD markörü OPP01/700 ün dayanıklılık genine bağlantısı kanıtlanmıştır. Çalışma neticesinde moleküler markör yardımıyla (MAS) Fusarium solgunluğunın 1 no lu ırkına dayanıklılık bakımından seleksiyon yapılmıştır. Michail ve ark. (2002), tohum kökenli Fon infeksiyonunun bitkilerde oluşturduğu solgunluk üzerine araştırma yapmışlar ve bu amaçla 5 farklı karpuz çeşidinden tohum örnekleri almışlardır. Karpuz tohum parçalarından yapılan izolasyonda, Fon un tohumda testa, kotiledon ve embriyo ekseninde varlığı tespit edilmiştir. Fungus çoğunlukla testada yer almıştır. Karpuzlarda hastalıkla bulaşık 37

51 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ tohumların bitkilerde solgunluk oluşumu üzerine önemli etkileri bulunmuştur. Tohumlar yüksek (% ) ve orta derecede (% ) bulaşık iken, hastalığın görülme oranı sırasıyla % ve % olacak şekilde artmıştır. Tohum bulaşıklığı düşük seviyelerde (% ) iken, bitkilerde solgunluk oranı % 5-10 u geçmemiştir. Boyhan ve ark. (2003), ABD Tarım Bakanlığı bünyesinde yer alan karpuz genetik kaynak koleksiyonunun Fon ırk 2 ye karşı dayanıklılığını değerlendirmişlerdir. Çalışmada 58 farklı ülkeden toplanan 1411 genotip 0-9 skalası iletest edilmiştir. Hiç hastalık belirtisi göstermeyen genotiplerin skala puanı 0 olarak belirlenmiş, gövdedeki renk bozuklukları ve lezyonların artış seviyesine göre skala değerleri artmış ve ölü bitkiler de 9 puan almıştır. Test edilen genotiplerin 11 adedi 3.5 ve daha altında ve büyük bir çoğunluğu da 5-8 arasında puan alırken, 63 genotipte hiçbir belirti görülmemiştir. Chen ve ark. (2003), etmeni Fon olan Fusarium solgunluğuna karşı 128 karpuz genotipini kök daldırma yöntemiyle testlemişlerdir. Genotiplerden 7 si yüksek derecede dayanıklı (HR), 18 i orta derecede dayanıklı (MR), 22 si orta derecede duyarlı (MS) ve 81 i duyarlı (S) bulunmuştur. Yetişir ve ark. (2003), karpuzda aşılama amacıyla kullanılan Lagenaria, Luffa, Benincasa gibi bazı kabakgillerin ve ticari anaçların Fusarium solgunluğuna karşı dayanıklılığını değerlendirmişlerdir. Testler sonucunda tüm aşılı bitkiler ve anaçlar Fon un bilinen 3 ırkına (0, 1, 2) dayanıklı iken, aşısız ticari karpuz çeşidi Crimson Tide 2 no lu ırka karşı duyarlı bulunmuştur. Zhou ve Everts (2003), Maryland ve Delaware de ticari olarak karpuz yetiştiriciliği yapılan tarlalarda Fon ırklarının ve inokulum yoğunluğunun belirlenmesi üzerine bir araştırma yapmışlardır. Yirmibeş farklı tarladan 63 izolat elde edilmiş ve bu izolatların çeşitler üzerindeki virülenslikleri test edilmiştir. İzolatlardan 13 adedi (% 21) 0 no lu ırk, 36 adedi (% 57) 1 no lu ırk ve 14 adedi (% 22) de 2 no lu ırk olarak tespit edilmiştir. Irk 0, 12 (% 48) tarlada görülürken, ırk 1, 10 (% 40) tarlada görülmüştür. En agresif ırk olan 2 no lu ırk ise Maryland de 5, Delaware de ise 1 tarlada olmak üzere toplam tarlaların % 24 ünde tespit edilmiştir. Karpuz hasat zamanında Fon un topraktaki inokulum yoğunluğu CFU/g 38

52 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ arasında değişmiştir. Fon un patojenisite oranı inokulum yoğunluğunun artmasıyla doğrusal oranda artmıştır. Zhou ve Everts (2004a), Fon un 1 no lu ırkının karpuz kök ve gövde dokularındaki kolonizasyonunu ve kolonizasyonun dayanıklılık üzerine etkilerini incelemişlerdir. İnokulasyondan 6 gün sonra yüksek derecede dayanıklı, orta derecede dayanıklı ve duyarlı çeşitlerin fidelerinde gövdenin alt kısımlarındaki taze dokularda yapılan sayımlarda, Fon ırk 1; 10 2, 10 3, 10 4 CFU/g bulunmuştur. Fidelerdeki solgunluk oranı ile köklerdeki ve gövdenin alt kısımlarındaki Fon un kolonizasyonu arasında pozitif korelasyon tespit edilmiştir. Verim, dokulardaki kolonizasyonun artmasıyla birlikte azalmıştır. Zhou ve Everts (2004b), tüylü fiği (Vicia villosa) karpuzda Fusarium solgunluğunu kontrol etmek amacıyla kullanmışlardır. Yapılan sera çalışmalarında toprağa karıştırılan % oranındaki kuru fiğin hastalık çıkışında % oranında azalma sağladığı tespit edilmiştir. Fiğ ile birlikte siyah malç kullanımı da hastalıkta % oranında azalma sağlamıştır. Bu yöntemin dayanıklı çeşit kullanımı ve ürün rotasyonuna alternatif olabileceği bildirilmiştir. Egel ve ark. (2005), Amerika da, Güneybatı Indiana da Knox ve Gibson kasabalarında yer alan ticari karpuz tarlalarında tipik Fusarium solgunluğu belirtileri gözlemişlerdir. Karpuz çeşitlerinin 0 ve 1 no lu ırklara dayanıklı olmasından dolayı, solgunluk nedeninin Fon un 2 no lu ırkı olduğundan şüphelenilmiştir. İki ticari tarladaki solgun bitkilerden 2 adet, Fusarium oxysporum f.sp. niveum izolatı elde edilmiş ve serada patojenisite testleri yapılmıştır. İzolatlar, Black Diamond çeşidinde % 100, Charleston Gray çeşidinde % 95 ve Calhoun Gray çeşidinde ise % 80 oranında solgunluk oluşturmuştur. Bu oranlar ırk 2 nin bu çeşitlerde oluşturduğu daha önce tespit edilen oranlarla uyumlu olup, çalışma ABD nin Indiana ve Ortabatı bölgesinde ırk 2 nin tespiti ile ilgili ilk rapordur. Ay (2008) ın Çukurova da Fon un ırklarını ve bu ırklara karşı karpuz çeşitlerinin reaksiyonlarını belirlemek amacıyla yaptığı çalışmada, Adana ve Mersin illerinden toplanan 25 izolatın, 14 ü ırk 2, 7 si ırk 1 ve 4 ü ırk 0 olarak saptanmıştır. Çukurova bölgesinde yoğun olarak yetiştirilen 23 karpuz çeşidinin ırklara karşı 39

53 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ verdikleri reaksiyonlar karşılaştırıldığında tüm çeşitlerin, ırk 2 ye karşı hassas olduğu ve ortalama hastalık şiddetinin % 30.6 ile % 68.1 arasında değiştiği belirlenmiştir. Kurt ve ark. (2008), Doğu Akdeniz ve Güneydoğu Anadolu bölgelerindeki karpuz ekim alanlarında Fon un fizyolojik ırklarını ve inokulum yoğunluklarını araştırmışlardır. Hastalığın ortalama oluşum düzeyi ve yaygınlığı Güneydoğu Anadolu Bölgesi nde Akdeniz Bölgesi ne göre daha yüksek olmuştur. Ortalama hastalık yaygınlığı % 14.3 ile % 77.3 arasında değişmiştir. Akdeniz Bölgesi nden elde edilen izolatların % 47.5 i ırk 0, % 38.1 i ırk 1 ve % 14.3 ü de ırk 2 olarak tespit edilmiştir. Güneydoğu Anadolu Bölgesi nden elde edilen izolatların ise 4 ünün ırk 0, 8 inin ırk 1 olduğu tanımlanmış olmakla birlikte, bu bölgede ırk 2 saptanmamıştır. Her iki bölgede inokulum yoğunluğu ile CFU g -1 arasında değişmiş ve Güneydoğu Anadolu Bölgesi nde ortalama inokulum yoğunluğunun ( CFU g - 1 ) Akdeniz Bölgesiyle karşılaştırıldığında daha yüksek olduğu görülmüştür. Lin ve ark. (2009a), Fusarium solgunluğuna dayanıklı çeşit ıslah programlarını hızlandırmak amacıyla, dayanıklı çeşitlerin belirlenmesini hızlı ve güvenilir şekilde sağlayan PCR a dayalı bir teknik geliştirmişledir. G05-SCAR primer seti olan GsF5/GsR5, OPG05 RAPD primerinin dayanıklı bireylerde amplifiye ettiği bandın sekans analizi sonucu elde edilmiştir. Bu SCAR primeri (GsF5/GsR5) sadece Fusariuma dayanıklı veya tolerant olan genotiplere spesifik olmak üzere 898 bp de bant oluşturmuştur. Fusariuma duyarlı 12 çeşit, 1 hat (SB) ve dayanıklı 8 hatta SCAR primeri (GsF5/GsR5) ile yapılan tarama çalışmasında OPG markörü tüm dayanıklı hatlarda tespit edilirken, duyarlı olarak bilinen hat ve çeşitlerde görülmemiştir. Zhou ve ark. (2010), Maryland de solgunluk gösteren karpuz bitkilerinden ve hastalıklı topraklardan toplanan 4 adet Fon izolatının virülensliğini, konukçu çeşitliliğini ve vejetatif uyumluluğunu hastalığın 0, 1 ve 2 no lu ırklarının referans izolatlarıyla karşılaştırmışlardır. Irk tanımlamasında referans çeşitler olan Sugar Baby, Charleston Gray, Dixilee, Calhoun Gray ve PI FR kullanılmıştır. İnokulasyon yöntemi olarak kök daldırma, tepsi daldırma ve pipet yöntemlerinden yararlanılmıştır. Maryland izolatlarının dördü de oldukça virülent bulunmuş ve 2 no lu ırka karşı yüksek düzeyde dayanıklı olan PI FR nin de yer aldığı ırk 40

54 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ ayırıcı çeşitlerde % 78 ile % 100 arasında solgunluk oluşturmuştur. İzolatlar, PI FR bitkilerinde gövdenin alt kısımlarında referans ırk 2 izolatından çok daha yoğun bir şekilde kolonize olmuşlardır. Mini tarla parsellerinde yapılan denemelerde de, 2 izolat, ırk 2 nin hastalık oluşturmadığı PI FR genotipinde % 90 ın üstünde solgunluğa neden olmuştur. İzolatların kavun, hıyar, balkabağı ve kabakta hastalık oluşturmaması, karpuza spesifik olduklarını göstermiştir. Ayrıca Maryland izolatlarının vejetatif olarak birbirleriyle uyumlu olup, referans ırk 2 izolatlarıyla uyumlu bulunmamaları genetik olarak ırk 2 den farklı olduklarını doğrulamıştır. Bu çalışma ile, Maryland izolatlarının Fon un yeni ve bugüne kadar tanımlanan en agresif ırkı olan ırk 3 olduğu önerilmektedir. 41

55 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlknur SOLMAZ 42

56 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ 3. MATERYAL ve METOD Araştırma, Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü moleküler biyoloji laboratuvarı ile araştırma ve uygulama serasında yürütülmüştür Materyal Çalışmada, Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü ne ait karpuz genetik kaynak koleksiyonundan seçilen 88 adet genotip ile 5 adet ticari çeşitten oluşan toplam 93 adet genotip kullanılmıştır. Söz konusu genotiplerin çoğu TÜBİTAK tarafından desteklenen 104O073 no lu Karpuz Genetik Kaynaklarının Morfolojik ve Genetik Karakterizasyonu (Sarı ve ark., 2007b) adlı proje kapsamında Türkiye nin farklı bölgelerine yapılan ziyaretler sonucu toplanmıştır. Genotiplerin adı, orijini ve türlerine ait detaylar Çizelge 3.1 de, genotiplerin olgun meyve resimleri ise Şekil 3.1 de sunulmuştur. Çalışmada yer alan genotiplerin bölgelere göre dağılımına bakıldığında, ilk sırayı 32 adet (% 34.40) genotiple yerel karpuzlar bakımından son derece zengin olan Güneydoğu Anadolu Bölgesi nin aldığı görülmektedir. Ege ve Marmara Bölgeleri de 8 er genotiple temsil edilmektedir. Orta Anadolu Bölgesi nden 6 (% 6.45) ve Akdeniz Bölgesi nden de 4 adet (% 4.30) genotip çalışmada yer almaktadır. Yedi adet (% 7.53) genotip, Türkiye Gen Bankası olan Menemen Tarımsal Araştırma Enstitüsü nden temin edilmiş, ayrıca yurtdışından getirilen materyallere (4 adet KKTC den, 2 adet Mısır dan, 1 adet Fransa dan ve 1 adet Özbekistan dan) de yer verilmiştir. Çalışmada Citrullus lanatus var. citroides alt türü 2 (PI , PI ), Citrullus colocynthis türü 2 (PI , PI ), Citrullus rehmii alt türü 1 (PI ) ve Citrullus cinsine ait olmamasına rağmen yakın bir tür olan Praecitrullus fistulosus da 2 (PI , PI ) genotiple temsil edilmiş ve bu yabani genotiplere ait tohumlar ABD Tarım Bakanlığı (USDA) ndan temin edilmiştir. Bir diğer Citrullus lanatus var. citroides genotipi olan Kar 26 ise Fransa nın INRA kuruluşundan sağlanmıştır. Bu genotiplerin yanı sıra PI , Calhoun Gray, Charleston Gray ve Congo çeşitleri Seminis ABD den, Crimson Sweet Çukurova 43

57 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ Tohumculuk tan, Crimson Tide ve Celebration Syngenta dan ve Bolkan da Multi Tarım dan temin edilmiştir (Çizelge 3.1). Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan bitkisel materyal Genotip no Adı Orijin Tür Kar 23 Tat Karpuzu Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 24 - İskenderiye-Mısır Citrullus lanatus var. lanatus Kar 25 - İskenderiye-Mısır Citrullus lanatus var. lanatus Kar 26 Pastèque à chair vert Fransa Citrullus lanatus var. citroides Kar 28 Beyaz Kışlık Karpuz Diyarbakır (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 29 Beyaz Karpuz Diyarbakır (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 35 Sugar Baby -- Citrullus lanatus var. lanatus Kar 36 Sugar Baby DH -- Citrullus lanatus var. lanatus Kar 37 Halep Karası -- Citrullus lanatus var. lanatus Kar 38 Halep Karası DH -- Citrullus lanatus var. lanatus Kar 58 TR ETAE Citrullus lanatus var. lanatus Kar 59 TR ETAE Citrullus lanatus var. lanatus Kar 70 TR ETAE Citrullus lanatus var. lanatus Kar 77 TR ETAE Citrullus lanatus var. lanatus Kar 78 TR ETAE Citrullus lanatus var. lanatus Kar 84 TR ETAE Citrullus lanatus var. lanatus Kar 86 TR ETAE Citrullus lanatus var. lanatus Kar 92 Yerli karpuz KKTC Citrullus lanatus var. lanatus Kar 93 Beyaz karpuz KKTC Citrullus lanatus var. lanatus Kar 97 Adsız Taşan-Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 98 Adsız Birecik-Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 100 Adsız Taşanköy-Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 102 Adsız Nusaybin-Cizre arası (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 104 Adsız Sülük-Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 105 Adsız Sürekli/Kızıltepe-Mardin (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 109 Adsız Ömerli-Mardin (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 114 Adsız Nusaybin-Cizre arası (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 116 Adsız Nusaybin-Cizre arası (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 117 Adsız Viranşehir-Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 121 Adsız İnanlı-Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 129 Adsız Birecik-Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 139 Adsız Nusaybin-Cizre arası (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 142 Çakal karpuzu Tatköy/Hilvan-Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 146 Çakal karpuzu Tatköy/Hilvan-Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 147 Medine Karpuzu Bozova-Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 149 Beyaz kışlık karpuz Erimli-Diyarbakır (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 150 Amerikan karpuzu Bozova-Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 151 Yaylak karpuzu Bozova-Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 152 Yerli yuvarlak Bozova-Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar.153 Sürme Erimli-Diyarbakır (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 154 Adsız Batman (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 160 Adsız Bozova-Şanlıurfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 162 Adsız Kurtalan-Siirt (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 163 Gelin karpuzu Kurtalan-Siirt (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar164 Adsız Kurtalan-Siirt (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 171 Adsız Manisa (EGE) Citrullus lanatus var. lanatus 44

58 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ Çizelge 3.1. Devamı Genotip no Adı Orijin Tür Kar 173 Adsız Akhisar-Manisa (EGE) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 174 Adsız Akhisar-Manisa (EGE) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 175 Adsız Akhisar-Manisa (EGE) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 176 Adsız Barbaros-Tekirdağ (MAR) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 177 Adsız Barbaros-Tekirdağ (MAR) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 178 Komando karpuzu Akhisar-Manisa (EGE) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 181 Adsız Akhisar-Manisa (EGE) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 192 Adsız Tekirdağ (MAR) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 197 Adsız Silivri-İstanbul (MAR) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 200 Adsız Uşak-Kula arası (EGE) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 203 Adsız Gediz-Uşak arası (EGE) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 205 Adsız Şereflikoçhisar-Ankara (OA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 208 Adsız Karapınar-Konya (OA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 212 Adsız Karapınar-Konya (OA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 215 Akkarpuz Aşağıokçular-Çanakkale (MAR) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 216 Kore karpuzu Elmacık-Çanakkale (MAR) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 217 Söbü karpuz Elmacık-Çanakkale (MAR) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 218 Kara karpuz Elmacık-Çanakkale (MAR) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 222 Adsız Birecik-Urfa (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 224 Adsız Kızıltepe- Mardin (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar Hatay (AKD) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 232 Congo (PI ) Seminis Tohum, ABD Citrullus lanatus var. lanatus Kar 233 Calhoun Gray Seminis Tohum, ABD Citrullus lanatus var. lanatus Kar 234 PI Seminis Tohum, ABD Citrullus lanatus var. citroides Kar 235 Charleston Gray Seminis Tohum, ABD Citrullus lanatus var. lanatus Kar 237 All Sweet - Citrullus lanatus var. lanatus Kar 238 Dixilee - Citrullus lanatus var. lanatus Kar 241 Adsız Özbekistan Citrullus lanatus var. lanatus Kar 242 Adsız Yayladağı-Hatay (AKD) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 243 Zerzuri Hatay (AKD) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 254 Adıbudu Altunhisar-Niğde (OA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 268 Adsız Nevşehir (OA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 277 Adsız Sulusaray-Nevşehir (OA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 285 Adsız Adıyaman (GDA) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 298 Adsız Kadirli-Osmaniye (AKD) Citrullus lanatus var. lanatus Kar 310 Adsız Güzelyurt-KKTC Citrullus lanatus var. lanatus Kar 318 PI (Afganistan) USDA-ABD Citrullus colocynthis Kar 319 PI (Kıbrıs) USDA-ABD Citrullus colocynthis Kar 324 PI (Güney Afrika) USDA-ABD Citrullus lanatus var. citroides Kar 327 PI (Zimbabwe) USDA-ABD Citrullus lanatus var. citroides Kar 330 PI (Fransa) USDA-ABD Citrullus rehmii Kar 331 PI (Hindistan) USDA-ABD Praecitrullus fistulosus Kar 333 PI (Pakistan) USDA-ABD Praecitrullus fistulosus C. Tide F 1 Syngenta-Türkiye Citrullus lanatus var. lanatus Celebration F 1 Syngenta-Türkiye Citrullus lanatus var. lanatus Bolkan F 1 Multi Tarım-Türkiye Citrullus lanatus var. lanatus Crimson Sweet Çukurova Tohumculuk-Türkiye Citrullus lanatus var. lanatus ABD: Amerika Birleşik Devletleri; AKD: Akdeniz Bölgesi; ETAE: Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü; GDA: Güneydoğu Anadolu; KKTC: Kuzey Kıbrıs Türk Cumhuriyeti; MAR: Marmara Bölgesi; OA: Orta Anadolu; USDA: United States Department of Agriculture 45

59 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ Şekil 3.1. Çalışmada kullanılan genotiplerin olgun meyve resimleri 46

60 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ Şekil 3.1. Devamı 47

61 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ Şekil 3.1. Devamı 48

62 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ Şekil 3.1. Devamı 49

63 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ Şekil 3.1. Devamı 50

64 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ Şekil 3.1. Devamı 3.2. Metod Tez çalışması kapsamında bazı karpuz genotiplerinin SSR ve SRAP markörleri ile karakterizasyonu gerçekleştirilmiş, ayrıca Fusarium Solgunluğuna dayanımları klasik ve moleküler yöntemlerle araştırılmıştır. Yapılan çalışmalar ayrı başlıklar altında aşağıda belirtilmiştir Moleküler Karakterizasyon Çalışmaları DNA İzolasyonu Yaprak örneği almak amacıyla 93 adet genotipe ait tohumlar Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Araştırma ve Uygulama Alanı nda yer alan fidelik serasında, 2:1 oranında karıştırılmış torf:perlit ortamı içeren 4x4 cm boyutlarındaki hücrelerden oluşan viyollere, tarihinde ekilmiştir. DNA izolasyonu için iki üç yapraklı genç fidelerden yaprak örnekleri alınarak alüminyum folyoya sarılmış, sıvı azota daldırılarak -196 o C de dondurulmuş ve -85 o C de muhafaza edilmiştir. Yapılan işlemlere ait resimler Şekil 3.2 de sunulmuştur. DNA izolasyonu, Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Bitki Biyoteknolojisi Laboratuvarında MiniPrep DNA izolasyon yöntemi (Edwards ve ark., 1991) ile gerçekleştirilmiştir. İzolasyonda kullanılan ekstraksiyon tampon çözeltisinin içeriği Çizelge 3.2 de belirtilmiş olup; bunun dışında kloroform izoamilalkol (24:1 oranında), Tris-EDTA (Tris 1 M ph:8, EDTA: 0.5 M ph:8), RNase A (10 mg/ml) solüsyonu, izopropanol ve etanol (% 99) DNA izolasyonunda kullanılmıştır. 51

65 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ A B C Şekil 3.2. A: DNA izolasyonu amacıyla yaprak örneği alınan genç fideler; B: Yaprak örneklerinin alüminyum folyoya sarılması; C: Örneklerin -196 o C de sıvı azota daldırılması; D: -85 o C de muhafaza Çizelge 3.2. DNA izolasyonunda kullanılan tampon çözeltisinin içeriği Solüsyon CTAB % 2.0 NaCl (5 M) EDTA (0.5 M) ph: 8.0 TRIS-HCl (1 M) ph: 8.0 D Konsantrasyon 1.4 M 0.2 M 0.1 M DNA İzolasyon Aşamaları 1. Her bir genotipten 0.1 g tartılan yaprak örnekleri -196 o C sıvı azotla porselen havan içerisinde öğütülerek 1.5 ml lik santrifüj tüpleri içerisine aktarılmıştır. 2. Her bir örneğin içerisine 396 µl ekstraksiyon tampon çözeltisi ve 4 µl β- 52

66 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ merkaptoetanol den oluşan 400 µl ekstraksiyon solüsyonu eklenmiştir. 3. Tüpler homojenlik sağlanıncaya kadar karıştırılmış ve sonra 65 o C de 20 dakika boyunca bekletilmiştir. Bu süre zarfında tüpler iki defa karıştırılmıştır. 4. Her bir tüpe 400 µl kloroform izoamilalkol (24:1) eklenmiş ve 15 dakika boyunca karıştırıcı yardımıyla karıştırılmıştır. Tüpler 5 dakika devirde santrifüj edilmiştir. 5. Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra süpernatant, içerisine 400 µl -20 o C de muhafaza edilmiş soğuk izopropanol eklenen yeni 1.5 ml lik santrifüj tüplerine aktarılmıştır. 6. Tüpler dikkatli bir şekilde karıştırılarak 1 saat süreyle -20 o C de bekletilmiştir. Bu bir saatlik süre tamamlandığında tüpler 5 dakika devirde santrifüj edilmiştir. 7. Süpernatant dikkatli bir şekilde döküldükten sonra pelletin kuruması amacıyla tüpler ters çevrilerek oda sıcaklığında 15 dakika bekletilmiştir. 8. Kuruyan pellet 100 µl TE (Tris-EDTA) içerisinde çözülmüştür. Her bir tüpe 4 µl RNAase A eklenmiş ve 15 dakika oda sıcaklığında bekletilmiştir. 9. Her tüpe 500 µl -20 o C de muhafaza edilen soğuk EtOH (% 100) eklenmiş ve tüpler dikkatli bir şekilde karıştırılarak 1 saat süreyle -20 o C de bekletilmiştir. 10. Tüpler devirde 5 dakika santrifüj edilmiştir. 11. Süpernatant dökülerek pelletin kuruması amacıyla tüpler ters çevrilerek oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bekletilmiştir. 12. Pellet 100 µl TE (Tris-EDTA) içerisinde çözülmüştür. 13. Tüpler 2000 devirde 20 saniye santrifüj edildikten sonra -20 o C de saklanmıştır. DNA izolasyonu aşamaları Şekil 3.3 de gösterilmiştir. 53

67 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ A B C D E F G Şekil 3.3. DNA izolasyon aşamaları A: Porselen havanda sıvı azotla öğütülmüş yaprak örnekleri; B: Örneklerin tüplere aktarılması; C: Ekstraksiyon çözeltisinin eklenmesi; D: Örneklerin 65 o C de bekletilmesi; E: Örneklerin homojenizasyonu; F: Santrifüj işlemi; G: Tüplerin ters çevrilerek pelletin kurutulması; H: Pelletin TE içerisinde çözülmesi H 54

68 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ DNA Kalitesi ve Kantitesinin Belirlenmesi İzole edilen DNA ların miktar ve kaliteleri, 1.5 µl DNA örneği kullanılarak spektrofotometre (Nanodrop ND-100) ile ölçülmüştür (Şekil 3.4). A B Şekil 3.4. A: DNA kalite ve kantitesinin ölçümlerinde kullanılan spektrofotometre aleti; B: Spektrofotometrede DNA kalite ve kantitesinin okunması SSR Analizleri (1). SSR Analizleri PCR Çalışmaları PCR Reaksiyon Koşulları PCR ürünleri Li-Cor jel sisteminde görüntüleneceğinden sentetik olarak hazırlanan SSR Forward primerlerinin 5 ucuna M13 forward (ileri) (CACGACGTTGTAAAACGAC) ya da M13 reverse (geri) (GGATAACAATTTCACACGG) primerleri eklenmiştir. Eklenen bu primerler 700 ya da 800 nm dalga boyunda etiketlenmiş PCR ürünleri Li-Cor jel sisteminde rahatlıkla gözlenebilmektedir. PCR reaksiyon bileşenleri hazırlanırken kullandığımız M13 primerinin ışığa duyarlılığı nedeniyle daha karanlık bir ortamda çalışılmış ve tüm PCR reaksiyon bileşenleri DNA amplifikasyonu amacıyla termalcyler (Eppendorf-Master Gradient 55

69 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ Model) içerisine yerleştirilmiştir. Çalışmada kullanılan PCR reaksiyon koşulları (Çizelge 3.3) ve PCR döngü programı aşağıda sunulmuştur. Çizelge 3.3. SSR analizleri PCR reaksiyon koşulları Kullanılan Kimyasallar Her Örnek İçin Kullanılan Miktar (μl) PCR Master Mix 2X 8.00 ddh 2 O 5.00 MgCl M13 primer (forward veya reverse) 0.50 F + R primer 1.00 DNA (5ng) 5.00 Toplam Hacim 20 μl PCR Döngü Programı 95 o C 5 dk ön denatürasyon 95 o C 1 dk DNA nın çift iplikçiğinin ayrılması denatürasyon 55 o C 30 sn primer bağlanması annealing 35 döngü 72 o C 1dk yeni iplikçiğin yazılımı extension 72 o C 6 dk son yazılım 4 o C PCR döngü programı tamamlandıktan sonra M13 primerinin ışığa hassasiyeti nedeniyle PCR ürünleri alüminyum folyoya sarılarak +4 o C de buzdolabında muhafaza edilmiştir (2). PCR Çalışmalarında Kullanılan SSR Primerleri Mikrosatellit analizlerinde toplam 14 adet SSR primer çifti kullanılmıştır. Bu primerlerden 7 adedi Levi ve ark. (2006) tarafından, karpuz genomik DNA kütüphanesinden elde edilmiştir. Dört adet SSR primer çifti ise Jarret ve ark. (1997) tarafından New Hamphshire Midget karpuz çeşidinin genomik DNA 56

70 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ kütüphanesinden geliştirilmiştir. Danin-Poleg ve ark. (2001) tarafından kavun genomik kütüphanesinden elde edilen 3 adet SSR primer çifti de çalışmada kullanılmıştır. Araştırmada kullanılan SSR primerlerine ait bilgiler Çizelge 3.4 de sunulmuştur (3). Li-Cor için Poliakrilamid Jel Hazırlığı PCR ürünleri % 6.5 luk poliakrilamid jelde koşturulmuştur. Bu jelin hazırlanmasında kullanılan kimyasalların listesi ve kullanılan miktarları aşağıdaki belirtilmiştir. Üre 8.4 g %50 Long Range Akrilamide 2.6 ml 10X TBE Tampon 2.0 ml TEMED 15 µl Amonyum Persülfat (APS-%10) 150 µl (4). Li-Cor Elektroforez Koşulları Jel hazırlandıktan sonra dikkatli ve hızlı bir şekilde enjektör yardımıyla aparatına dökülmüş ve yaklaşık 2.5 saat polimerizasyonu beklenmiştir. Polimerizasyon tamamlandıktan sonra aparat Li-Cor DNA Analyzer 4200 (Licor Biosciences, Bad Homburg, Germany) aletine yerleştirilmiş, eşit miktarda formamid yükleme tamponu eklenmiş ve 1000 V, 35 ma, 25 W 45 o C de yaklaşık 30 dk. ön ısıtma yapılmıştır. Amplifikasyon ürünü içeren her bir tüpün içerisine eşit miktarlarda % 95 formamide, 10 mm EDTA (ph 8.0), % xylene cyanol ve % bromophenol blue içeren formamid yükleme bafırı eklenmiş ve örnekler PCR da 95 o C de 5 dk. denatüre edilmiştir. Denatürasyon işlemi tamamlandıktan sonra örnekler buz üzerinde soğutulmuş ve her bir örnekten 1.0 µl 25 cm lik poliakrilamid jele (Long Ranger, FMC Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany) pipet yardımıyla yüklenmiştir. Poliakrilamid jelin hazırlanması ve yüklenmesine ait resimler Şekil 3.5 de sunulmuştur. 57

71

72 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ A B C Şekil 3.5. A: Poliakrilamid jelin döküleceği camlar; B: Jel donduktan sonra tarağın jel içerisine yerleştirilmesi; C: Jel aparatının cihaza yerleştirilmesi; D: Poliakrilamid jelin yüklenmesi Elektroforez işlemi 1.5 saat süreyle 1500 V, 35 ma, 50 W, ve 48 C çalışma koşullarına sahip Li-Cor aletinde gerçekleştirilmiştir. Bantların değerlendirilmesinde bp DNA markörü (MWG Biotech AG, Ebersberg, Germany) kullanılmıştır. D SRAP Analizleri (1). SRAP Analizleri PCR Çalışmaları PCR Reaksiyon Koşulları PCR reaksiyon koşullarının optimizasyonu için reaksiyon bileşenlerinin 26 farklı kombinasyonu denenmiş ve en iyi sonucu veren Çizelge 3.5 de içeriği belirtilen protokol kullanılmıştır. 59

73 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ Çizelge 3.5. SRAP analizleri PCR reaksiyon koşulları Kullanılan Kimyasallar Her örnek için kullanılan miktar (μl) PCR Master Mix 2X ddh 2 O MgCl 2 (1.5 μm) Taq DNA Polimeraz (500 ünite) F + R primer (0.3 μm) DNA (50ng) Toplam Hacim Tüm PCR reaksiyon bileşenleri DNA amplifikasyonu amacıyla Master Gradient model termal cyler (Eppendorf) içerisine yerleştirilmiştir. PCR hazırlık aşamaları Şekil 3.6 da sunulmuştur. A B C Şekil 3.6. PCR hazırlık aşamaları A: PCR bileşenlerinin 1.5 ml lik tüp içerisinde hazırlanması; B: PCR bileşenlerinin vortex ile karıştırılması; C: PCR bileşenlerinin santrifüj yardımıyla homojenizasyonu; D: tüplerin PCR a yerleştirilmesi D 60

74 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ PCR Döngü Programı PCR döngüsü aşağıda belirtilen şekilde (Li ve Quiros, 2001) a göre yapılmıştır. 94 o C 2 dk ön denatürasyon 94 o C 1 dk DNA nın çift iplikçiğinin ayrılması denatürasyon 37 o C 1 dk primer bağlanması annealing 5 döngü 72 o C 2 dk yeni iplikçiğin yazılımı extension 94 o C 1dk DNA nın çift iplikçiğinin ayrılması denatürasyon 50 o C 1dk primer bağlanması annealing 35 döngü 72 o C 2dk yeni iplikçiğin yazılımı extension 72 o C 5 dk son yazılım 4 o C (2). PCR Çalışmalarında Kullanılan SRAP Primerleri Çalışmada SRAP Analizleri Li ve Quiros (2001) a göre yapılmıştır. Dokuz adet forward (ileri) ve 10 adet reverse (geri) primerinin farklı kombinasyonları kullanılmış ve bu primerlere ait bilgiler Çizelge 3.6 ve Çizelge 3.7 de sunulmuştur. Çizelge 3.6. SRAP analizlerinde kullanılan forward (ileri) primerleri Primer Adı Baz Dizini (3-5 ) Baz uzunluğu (bp) me1 TGA GTC CAA ACC GGA TA 17 me2 TGA GTC CAA ACC GGA GC 17 me3 TGA GTC CAA ACC GGA AT 17 me4 TGA GTC CAA ACC GGA CC 17 me5 TGA GTC CAA ACC GGA AG 17 me6 TGA GTC CAA ACC GGA CA 17 me7 TGA GTC CAA ACC GGA CG 17 me9 TGA GTC CAA ACC GGA GG 17 me13 TGA GTC CAA ACC GGA AG 17 61

75 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ Çizelge 3.7. SRAP analizlerinde kullanılan reverse (geri) primerleri Primer Adı Baz Dizini (5-3 ) Baz uzunluğu (bp) em1 GAC TGC GTA CGA ATT AAT 18 em2 GAC TGC GTA CGA ATTTGC 18 em3 GAC TGC GTA CGA ATT GAC 18 em4 GAC TGC GTA CGA ATT TGA 18 em5 GAC TGC GTA CGA ATT AAC 18 em6 GAC TGC GTA CGA ATT GCA 18 em8 GAC TGC GTA CGA ATT CAC 18 em10 GAC TGC GTA CGA ATT CAT 18 em11 GAC TGC GTA CGA ATT CTA 18 em12 GAC TGC GTA CGA ATT CTC 18 Dokuz adet forward (ileri) ve 10 adet reverse (geri) SRAP primerinin farklı kombinasyonları farklı Citrullus türlerine ait 7 adet genotip (Kar 23, Kar 26, Kar 37, Kar 97, Kar 104, Kar 318, Kar 324) ve Praecitrullus fistulosus türüne ait 1 genotip (Kar 333) için taranmış ve amplifikasyon sağlanan toplam 31 adet primer (me1em3, me1em4, me1em6, me1em11, me2em3, me2em4, me2em5, me2em6, me3em1, me3em2, me3em3, me3em4, me3em5, me3em6, me4em1, me4em2, me4em3, me4em4, me4em6, me5em1, me5em2, me5em3, me5em4, me5em5, me5em6, me5em10, me5em12, me6em6, me7em8, me13em4, me9em11) kombinasyonu SRAP analizlerinde kullanılmıştır (3). Agaroz Jel Elektroforez ve Jel Görüntüleme PCR işleminden sonra 25 µl PCR ürününe 6 µl 6X yükleme bufferı (Fermentas) ilave edilmiştir. Bu 31 µl lik karışım, içerisine % 0.1 lik etidium bromid eklenmiş % 2.5 luk agaroz jele yüklenmiş ve 1X TAE buffer (40 mm Tris-Acetate, 1 mm EDTA, ph:8.0) içerisinde, 110 volt elektrik akımı altında 3.5 saat süreyle koşturulmuştur. Elektroforez işleminden sonra jellerin UV ışığı altında fotoğrafları 62

76 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ çekilmiştir. Agaroz jel elektroforez ve jel görüntüleme aşamalarına ait resimler Şekil 3.7 de sunulmuştur. A B C D Şekil 3.7. Agaroz jel eektroforez ve jel görüntüleme aşamaları; A: Agaroz jelin hazırlanması; B: Jelin dökülmesi; C: PCR ürünlerinin agaroz jele yüklenmesi; D: Jel görüntüleme sistemi SRAP analizlerinde agaroz jel elektroforez sonucunda her bir lokus (primer) için bantların değerlendirilmesinde 100 bp lik DNA markörü (GeneRuler Fermentas) kullanılmıştır (Şekil 3.8) Primerlerin Polimorfizm Oranlarının Belirlenmesi Çalışmada kullanılan SSR ve SRAP primerlerinin polimorfizm oranları, primerlerden elde edilen toplam polimorfik bant sayısının, toplam bant sayısına bölünerek 100 ile çarpılması sonucu aşağıda belirtilen formül ile bulunmuştur. Polimorfizm Oranı (%) = (Polimorfik bant sayısı / Toplam bant sayısı) x

77 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ Şekil 3.8. % 1.7 agoroz jelde koşularak elde edilmiş 100 bp büyüklüğündeki DNA markörü Benzerlik İndeksleri ve Dendrogramların Oluşturulması SSR ve SRAP markörleri ile yapılan moleküler analizler sonucunda elde edilen jel görüntülerine bakılmış ve bant varlığı durumunda (1), yokluğu durumunda (0) ve amplifikasyonun olmadığı durumlarda (9) değerleri verilerek ikili (binary) matriks veri dosyası hazırlanmıştır. Bantlardan sadece güvenilir olanları değerlendirilmiştir. Dendrogramların oluşturulmasında NTSYS (Numerical Taksonomy and Multivariate Analysis System Version 2.0) paket programı kullanılmıştır (Rohlf, 1998). Öncelikle Jaccard (1908) yöntemi kullanılarak bir benzerlik matriksi oluşturulmuştur. Bu matriks kullanılarak UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Average) metodu ile kümeleme (Cluster) analizleri yapılmış ve dendrogramlar elde edilmiştir. Dendrogramların benzerlik matriksini ne ölçüde temsil ettiği Mantel Matriks Uyum Testi (Mantel's matrix correspondence test) ile belirlenmiştir (Mantel, 1967). Bu test sonucunda kofenetik korelasyon katsayısı (cophenetic correlation coefficient), r, değeri elde edilmiştir. Temel koordinat analizleri (Principle Coordinate Analysis) de aynı benzerlik matriksi kullanılarak SAS (SAS, 2006) programında yapılmıştır. 64

78 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ Karpuz Genotiplerinin Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımlarının Klasik ve Moleküler Yöntemlerle Araştırılması Çalışmada; genetik çeşitliliği SSR ve SRAP markörleriyle araştırılan karpuz genotiplerinin, günümüzde üretimi olumsuz etkileyen en önemli fungal hastalıklardan biri olan Fusarium solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na karşı tepkileri de belirlenmiştir. Bu amaçla, tüm genotipler klasik inokulasyon testiyle her 3 ırka (0, 1 ve 2) karşı testlenmiş ve 1 no lu ırka dayanıklılık da RAPD markörüyle (OPP01) taranmıştır Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp niveum) na Dayanımın Klasik Yöntemle Araştırılması Çalışmada kullanılan 93 adet genotiple birlikte Fusarium solgunluğunun her 3 ırkına da dayanıklı olduğu bildirilen PI (Dane ve ark., 1998) genotipi de Fusarium oxysporum f.sp. niveum un 3 ırkına (0, 1, 2) karşı dayanımlarının belirlenmesi amacıyla testlenmiştir. Tohumlar, sterilize edilmiş dere kumu:torf:perlit (1:1:1, v/v/v) içeren 4x4 cm boyutlarında hücrelerden oluşan viyollere 02/04/2007 tarihinde, her genotipten 15 er adet ekilmiştir. Her 3 ırk için 1 er izolat (WFo17= ırk 0, WFo 12= ırk 1, WFo6= Irk 2 ) kullanılmıştır. İzolatlar, Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü nden temin edilmiştir. Bu izolatlar konidial inokulum üretmek için patates dekstroz agar (PDA) ortamı içeren 6 cm lik petri kaplarına aktarılmış ve 27 o C de 5-7 gün inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda inokulasyonun yapılacağı gün gelişen koloniler petri yüzeyinden steril spatüllerle sıyrılmış, saf suyla yıkanmış, 4 katlı tülbentten süzülerek her bir izolat için spor süspansiyonu elde edilmiştir. Elde edilen spor süspansiyonlarının spor yoğunluğu Thoma lamı yardımıyla 10 6 konidi/ml ye ayarlanmıştır. İnokulasyon, fideler ilk gerçek yaprak aşamasındayken 18/04/2007 tarihinde pipet yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu yönteme göre fidelerin etrafı spatül yardımıyla 4 farklı yönden açılmış ve her bir bitkinin kök bölgesine 5 ml spor 65

79 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ süspansiyonu verilmiştir. Fusarium inokulumunun hazırlanması ve uygulanması aşamaları Şekil 3.9 da gösterilmiştir. Deneme 3 tekerrürlü ve her tekerrürde 5 bitki olacak şekilde kurulmuştur. Böylece her genotipten 3 ırk için ayrı ayrı 15 er fide seçilerek ırk 0, 1 ve 2 ile inoküle edilmiştir. Şahit olarak her 3 ırka da hassas olan Sugar Baby, ırk 0 a dayanıklı, ırk 1 e ve ırk 2 ye duyarlı Charleston Gray, ırk 0 ve ırk 1 e dayanıklı, ırk 2 ye duyarlı Calhoun Gray ve her 3 ırka da dayanıklı PI FR ve PI kullanılmıştır. İnoküle edilen tüm bitkiler, o C sıcaklığa sahip serada tutulmuş ve gerekli oldukça sulanmıştır. Değerlendirme 16/05/2007 tarihinde Barnes (1972) tarafından geliştirilen hastalık değerlendirme skalasına göre yapılmıştır. Bu skalaya göre; 0: Hiçbir hastalık belirtisi göstermeyen sağlıklı bitkiler 1: Bodurlaşma gösteren bitkiler 2: Sararma gösteren bitkiler 3: Nekrozlaşma gösteren bitkiler 4: Ölü bitkiler olarak değerlendirilmiştir. Ayrıca, genotiplerin hastalık oluşum düzeyi (%) de hesaplanmıştır. Elde edilen değerlere göre genotiplerin dayanıklılık düzeyleri Barnes (1972) tarafından geliştirilen ve aşağıda detayları verilen skala kullanılarak belirlenmiştir. % 0-35 Yüksek düzeyde dayanıklı (HR) % Orta düzeyde dayanıklı (MR) % Düşük düzeyde dayanıklı (LR) % Duyarlı (S) (1). İstatistiksel Analiz Deneme sonucunda elde edilen verilerin analizi Costat istatistik programında yapılmış, ortalamaların karşılaştırılmasında Tukey testinden yararlanılmıştır. 66

80 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ A B C D E Şekil 3.9. Fusarium inokulumunun hazırlanması ve uygulanması; A: Petri kapları içerisinde PDA ortamında geliştirilen Fusarium izolatları; B: Gelişen kolonilerin PDA ortamı yüzeyinden steril spatül yardımıyla sıyrılması ve tülbentten süzülmesi; C: Thoma lamı üzerine spor süspansiyonun pipetle damlatılması; D: Spor süspansiyon yoğunluğunun mikroskop altında incelenmesi; E: İnokulum enjekte edilecek fide köklerinin spatül yardımıyla yaralanması; F: Otomatik pipetle 5 ml spor süspansiyonunun fidelere tek tek enjekte edilmesi F 67

81 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımın Moleküler Yöntemle Araştırılması Genotiplerin Fusarium solgunluğunun 1 no lu ırkına karşı dayanımları Xu ve ark. (1999) tarafından tespit edilen RAPD OPP01/700 markörü ile araştırılmıştır (1). DNA Amplifikasyonu Çalışmada OPP01 (Operon Technologies Inc.) RAPD primeri kullanılmıştır. PCR reaksiyon koşulları (Çizelge 3.8) ve PCR döngüsü aşağıda belirtildiği şekilde gerçekleştirilmiştir. Çizelge 3.8. RAPD analizleri PCR reaksiyon koşulları Kullanılan Kimyasallar Her Örnek İçin Kullanılan Miktar (μl) PCR Master Mix 2X 6.00 ddh 2 O 1.45 MgCl Primer (30 ng) 1.00 DNA (5ng) 3.00 Taq DNA polimeraz 0.05 Toplam Hacim Tüm PCR reaksiyon bileşenleri DNA amplifikasyonu amacıyla PCR (Eppendorf-Master Gradient Model) içerisine yerleştirilmiştir. PCR Döngü Programı 94 o C 2 dk ön denatürasyon 94 o C 2 dk DNA nın çift iplikçiğinin ayrılması denatürasyon 37 o C 1 dk primer bağlanması annealing 55 döngü 72 o C 2 dk yeni iplikçiğin yazılımı extension 72 o C 10 dk son yazılım 4 o C 68

82 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ (2). RAPD Agaroz Jel Elektroforezi Elde edilen PCR ürünlerinden 12 µl çekilerek üzerine 3 µl yükleme bafırı eklenmiş ve bu karışım % 1.5 luk agaroz jel içerisine 1XTAE (Trizma Base, Glacial Asetic Acid, EDTA (Na 2.EDTA.H 2 O) bafır eklenmiş yatay elektroforez aletinde (Thermo), 70 volt elektrik akımı altında 4 saat süreyle koşturulmuştur. Elektroforez işleminden sonra % 0.1 lik etidium bromide ile jel boyaması yapılmış ve UV ışığı altında görüntülenmiştir. Bantların değerlendirilmesinde 100 bp DNA markörü kullanılmıştır (3). Sonuçların Değerlendirilmesi Çalışmada kullanılan OPP01 RAPD primeri Fusarium oxysporum f.sp. niveum un 1 no lu ırkına karşı dayanıklı olan genotiplerde 700 bp büyüklüğünde spesifik bir bant vermektedir (Xu ve ark., 1999). Tüm genotipler bu bantın olma durumunda dayanıklı, olmama durumunda ise duyarlı olarak değerlendirilmiştir. 69

83 3. MATERYAL ve METOD İlknur SOLMAZ 70

84 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Çalışmada ele alınan toplam 93 adet karpuz genotipin SSR ve SRAP markör teknikleriyle moleküler karakterizasyonu ve bu genotiplerin Fusarium solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na dayanımları klasik ve moleküler yöntemlerle araştırılmış ve elde edilen bulgular iki bölüm halinde incelenmiştir Moleküler Çalışmalar SSR Analizleri Karpuz Genotiplerinin SSR Tekniği ile Karakterizasyonunda Polimorfizmin Değerlendirilmesi Çalışmada yer alan 93 adet karpuz genotipi arasındaki genetik çeşitlilik SSR markörleri ile araştırılmıştır. Çalışmada, toplam 14 adet SSR primeri kullanılmıştır. Jel görüntüleme işlemi Li-Cor DNA Analyzer 4200 (Licor Biosciences, Bad Homburg, Germany) aleti ile yapılmış ve daha sonra bu görüntülere bakılarak bant varlığı durumunda (1), yokluğu durumunda (0) ve amplifikasyonun olmadığı durumlarda (9) değerleri verilerek değerlendirme yapılmıştır. Bu değerlendirme sonucunda her bir primer çifti için bant uzunluk aralıkları (bp), elde edilen toplam bant sayısı (adet), polimorfik bant sayısı (adet) ve polimorfizm oranı (%) Çizelge 4.1. de sunulmuştur. Çalışmada kullanılan 14 adet SSR lokusundan büyüklükleri bp arasında olan toplam 66 adet allel elde edilmiş ve bunların tamamı polimorfik bulunmuştur. Primer başına düşen toplam allel sayısı 2 ile 7 (ortalama 4.7) arasında değişmiştir. Polimorfik allel sayısı ise yine 2 ile 7 (ortalama 4.7) arasındadır. Elde edilen toplam allel sayısı bakımından Cgb4765 ve Cgb4767 lokusları en fazla (7 adet), CLG7992 ve ASUW2 lokusları ise en az (2 adet) sayıda alleli üretmiştir. Çalışmada kullanılan SSR primerlerinden Cgb4765 ve ASUW19 primerlerine 71

85 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ ait poliakrilamid jel görüntüleri Şekil 4.1 ve Şekil 4.2 de sunulmuştur. Primer çiftlerinden elde edilen toplam polimorfizm oranı ise % 100 bulunmuştur. Çizelge 4.1. SSR primerlerinin amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam allel sayısı (adet), polimorfik allel sayısı (adet), allel büyüklükleri (bp), polimorfizm oranı (%) No Primer Adı Toplam Allel Sayısı (adet) Polimorfik Allel Sayısı (adet) Allel büyüklükleri ( bp) Polimorfizm oranı (%) 1 CMCT , 120, 125, CMACC , 168, CMTC , 163, 175, 200, Cgb , 160, 161, 175, 185, 200, CLG , Cgb , 185, 188, 195, 198, 204, 206, ASUW , ASUW , 140, 142, ASUW , 143, 160, Cgb , 187, 220, 225, 230, C , 155, 157, C , 170, 173, 177, 180, C , 200, 205, 208, 225, C , 208, Toplam Ortalama Şekil 4.1. Cgb4765 SSR primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü 72

86 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Şekil 4.2. ASUW19 SSR primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü Çoğunluğunu farklı coğrafi orijinlere sahip C. lanatus var. lanatus türüne giren karpuz genotiplerinin oluşturduğu, ayrıca farklı türlerle (C. lanatus var. citroides, C. colocynthis, C. rehmii ve akraba tür olan Praecitrullus fistulosus genotiplerini de içeren karpuz koleksiyonundaki genetik çeşitlilik, 3 ü Danin-Poleg ve ark. (2001) tarafından kavun genomik kütüphanesinden geliştirilen (CMCT44, CMACC146, CMTC168), 7 si Levi ve ark. (2006) tarafından Dixilee karpuz çeşidinin genomik DNA sından geliştirilen (Cgb4765, CLG7992, Cgb4767, ASUW2, ASUW13, ASUW19, Cgb5009) ve 4 ü de Jarret ve ark. (1997) tarafından New Hampshire Midget çeşidinin genomik DNA kütüphanesinden geliştirilen (C , C , C , C ) toplam 14 adet SSR primeri kullanılmıştır. Elde edilen polimorfizm (% 100) oranı göz önüne alındığında ve karpuzlarda genetik çeşitliliğin SSR markörleriyle araştırıldığı çalışmalarla karşılaştırıldığında kullanılan SSR primer sayısının yeterli olduğu görülmektedir. Jarret ve ark. (1997) farklı türlere ait 33 karpuz genotipi arasındaki genetik çeşitliliği, geliştirdikleri 8 primer ile değerlendirmişlerdir. Bunlar arasından 7 adedi genotipler arasındaki polimorfizmi türlerine uyumlu bir şekilde tespit etmiştir. Karpuzlarda SSR markörü geliştirmek amacıyla yapılan bir başka çalışmada (Guerra Sanz, 2002) ise geliştirilen 19 SSR primerinin 18 inin başarıyla amplifikasyon sağladığı görülmüştür. Tzitzikas ve ark. (2009), SSR markörlerinin az sayıda primer kullanılması durumunda dahi test edilen genotipleri birbirinden ayırabileceğini bildirmişlerdir. 73

87 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Farklı Cucurbitaceae türlerinde yapılan moleküler karakterizasyon çalışmalarında da benzer sayıda SSR primerlerinin kullanıldığı ve başarılı sonuçlar alındığı görülmüştür. Örneğin, Staub ve ark. (2000) subsp. melo ve subsp. agrestis alt türlerine ait toplam 46 genotip arasındaki genetik çeşitliliği Katzir ve ark. (1996) ve Danin-Poleg ve ark. (2001) tarafından geliştirilen 17 primerle araştırmışlardır. Çoğunluğu inodorus alt türünden olan 15 adet İspanyol kavun genotipinde López-Sesé ve ark. (2002) 12 primer, 22 farklı Cucumis genotipinde Zhuang ve ark. (2004) 15 primer, 67 adet Japon kavun çeşidinde Nakata ve ark. (2005) 9 primer, 22 adet Yunanistan ve Kıbrıs kavun genotipinde Tzitzikas ve ark. (2009) 17 primer, 47 Macar kavun genotipinde Szabó ve ark. (2005) 20 primer, 45 adet kabak genotipinde Paris ve ark. (2003) 7 primer kullanarak çalışmalarını yürütmüşlerdir. Çalışmada kullanılan primerlerden CMCT44 den 4, CMACC146 den 3 ve CMTC168 den 5 adet allel elde edilmiştir. Bu primerleri geliştiren araştırıcılar (Danin-Poleg ve ark., 2001) farklı türlerde çalışmış olsalar da CMTC168 primeri hariç üretilen allel sayısının (CMCMCT44 den kavunda 4, hıyarda 2; CMACC146 den kavunda 3, hıyarda 2; CMTC168 den kavunda 4, hıyarda 0) uyumlu olduğu görülmüştür. Bu primerler farklı türlerde yapılan pek çok araştırmada da kullanılmıştır. CMCT44 den Staub ve ark. (2000) 2; López-Sesé ve ark. (2002) 2; Nakata ve ark. (2005) 3, Szabó ve ark. (2005) 2, CMACC146 dan Staub ve ark. (2000), 2; López-Sesé ve ark. (2002) 2; Nakata ve ark. (2005) 3; Garcia- Mas ve ark. (2004) 11 adet allel elde edildiğini bildirmişlerdir. CMTC168 primerinden ise Garcia-Mas ve ark. (2004) 9; Monforte ve ark. (2003) ise 7 adet allel üretildiğini rapor etmişlerdir. Literatürde bu primerlerin karpuzlarda kullanıldıklarına dair herhangi bir bilgiye ulaşılamamıştır. Aynı primerlerden elde edilen allel sayıları kullanılan türe göre değişebilmektedir. Cucumis türünde temel bir araştırma olarak bilinen Danin-Poleg ve ark. (2001) tarafından yapılan çalışmada, geliştirilen 40 SSR primeri kavunda 118 allel üretirken, hıyarda ise 53 allel üretmiştir. Fazla sayıda türün kullanıldığı durumlarda da elde edilen toplam allel sayısının arttığı bilinmektedir. Garcia-Mas ve ark. (2004) tarafından yapılan çalışma buna iyi bir örnek olarak gösterilebilir. 74

88 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Araştırıcılar Cucumis cinsinin 17 farklı türünde 18 SSR primeri kullanmışlar ve lokus başına ortalama 7.4 allel elde etmişlerdir ki, bu sayı oldukça fazladır. Aynı türde farklı sayılarda allel elde edilmesi ise; kullanılan germplazmın içerdiği çeşitliliğe ve germplazmdaki materyal sayısına bağlıdır. Annealing sıcaklığında meydana gelen farklılıkların da değişik sayılarda ve uzunluklarda allelerin oluşumuna neden olabileceği Zhuang ve ark. (2004) tarafından bildirilmiştir. Çalışmada kullanılan Cgb4765, CLG7992, Cgb4767, ASUW2 ASUW13 ASUW19 ve Cgb5009 primerlerinin polimorfizm oranları Levi ve ark. (2006) tarafından Griffin (C. lanatus var. citroides), New Hampshire Midget (C. lanatus. var. lanatus ve PI (C. colocynthis) genotiplerinde test edilmiştir. Cgb5009 hariç diğerlerinin tamamı karpuz bağlantı haritasında (linkage map) farklı bağlantı gruplarında yer alan markörler üretmiştir. Tez çalışması kapsamında bu primerlerden Cgb4765 den 7, CLG7992 den 2, Cgb4767 den 7, ASUW2 den 2, ASUW13 den 4, ASUW19 dan 4 ve Cgb5009 dan 6 adet polimorfik bant elde edilmiştir. Szamosi ve ark. (yayınlanmamış), karpuzlarda yaptıkları çalışmada farklı orijinlere sahip genotipler arasındaki genetik çeşitliliği araştırmak amacıyla bu primerleri kullanmışlar ve Cgb4765 den 3, Cgb4767 den 4, ASUW2 den 2, ASUW13 den 1, ASUW19 dan 3 ve Cgb5009 dan 3 adet allel elde etmişlerdir. CLG7992 de ise amplifikasyon sağlayamamışlardır. Karpuz haritasında farklı bağlantı bölgelerinde yer alan polimorfik markörlerin (RAPD, ISSR, AFLP, SRAP) birbirine çok yakın karpuz çeşitleri arasındaki genetik çeşitliğin araştırılmasında kullanıldığı bir çalışma da Levi ve ark. (2007) tarafından yapılmıştır. Araştırıcılar özellikle AFLP ve SRAP markörlerinden başarılı sonuçlar elde etmişler ve kodominant SSR markörlerinin ıslah programlarında daha etkili olabileceğini, ancak karpuzlarda kodominant SSR markörü geliştirmenin zor olduğunu bildirmişlerdir. Araştırmada kullanılan bir diğer primer grubu olan C , C , C , C primerlerinden ise sırasıyla 4, 6, 6 ve 3 adet tamamı polimorfik alleller elde edilmiştir. Bu primerler Jarret ve ark. (1997) tarafından geliştirilmiş ve ve araştırıcılar C den 3, C den 5, C den 4 ve C dan 6 75

89 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ adet allel üretildiğini bildirmişlerdir. Farklı germplazm kullanımının ve germplazm yapısının elde edilen allel sayılarındaki farklılıkları oluşturduğu düşünülmektedir. Her iki çalışmada da farklı türlerde karpuzlar yer alsa da Jarret ve ark. (1997) nın kullandığı germplazmda bulunan C. lanatus var. lanatus genotiplerinin karpuzun anavatanı olan ve yabani türlerin bulunduğu Afrika da yer alan Somali, Etiyopya, Zimbabve, Çad, Sudan, Kenya, Güney Afrika, Zambiya, Zaire, Gana, Botsvana gibi ülkelerden toplanmışken, tez çalışmasında kullanılan C. lanatus var. lanatus genotiplerinin ise sadece 1 adedinin Özbekistan, 4 adedinin Kıbrıs dan, geri kalanların tümünün ise Türkiye den toplanmış olması her iki germplazmın genetik çeşitlilik bakımından farklı olduğunu göstermektedir. Tez çalışması kapsamında SSR analizlerinden elde edilen bulgulara bakıldığında 14 adet primerden 2-7 arasında allel elde edildiği görülmektedir. Karpuzlarda ve diğer Cucurbitaceae türlerinde SSR markörlerinin kullanıldığı farklı çalışmalarda bu sayı ile uyumlu değerler olduğu gibi, daha az veya daha çok allelin görüldüğü çalışmalar da bulunmaktadır. Karpuzlarda Jarret ve ark. (1997) nın C. lanatus var. lanatus, C. lanatus var. citroides ve C. colocynthis türlerine ait 33 genotiple yaptıkları çalışmada 3-7 arasında, Guerra-Sanz (2002), C. lanatus genotipleri ve çeşitlerinde 1-8 adet arasında, C colocynthis genotiplerinde 0-2 adet arasında ve hibritlerde 0-4 adet arasında allel tespit etmişlerdir. Nimmakayala ve ark. (2009) ise 30 SSR primer çiftinin 2-12 arasında allel ürettiğini bildirmişlerdir. Kavunlarda ise Danin Poleg ve ark. (2001) 2-6; Monforte ve ark. (2003) 2-10; Szabo ve ark. ( 2005) 2-7; Tzitzikas ve ark. (2009) 2-9; Fukino ve ark. (2007) 2-10; farklı Cucumis türlerinde Zhuang ve ark. (2004) 1-8; hıyarda Danin-Poleg ve ark (2001) 2-5; Watcharawongpaiboon ve Chunwongs (2008) 2-7 arasında allel elde edildiğini rapor etmişlerdir. Düşük sayıda allelerin elde edilmesinin çalışılan türün ve germplazmın genetik temelinin dar olmasından kaynaklandığı Danin Poleg ve ark. (2001) tarafından bildirilmiştir. Ortalama polimorfik allel sayısı bakımından 4.66 adet allel elde edilmiştir. Bu değer, SSR markörleri için makul bir değer olup, farklı çalışmalarda daha fazla veya daha az ortalama polimorfik allel sayısı görmek mümkündür. Örneğin karpuzlarda 76

90 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Jarret ve ark. (1997) 4.7; kavunlarda Danin-Poleg ve ark. (2001) 3.5; López-Sesé ve ark. (2002) 1.5; Monforte ve ark. (2003) 6.3; Nakata ve ark. (2005) 4; Szabó ve ark. (2005) 5.7; Tzitzikas ve ark. (2009) 7.6; Cucumis melo var. momordica alt türünde, Dhillon ve ark. (2007) 10.2; hıyarda Danin-Poleg ve ark. (2001) 2.5; Watcharawongpaiboon ve Chunwongs (2008) 3.6 adet polimorfik allel tespit etmişlerdir. Primerlerden elde edilen bant uzunlukları ise bp arasında değişmiş olup, Szamosi ve ark. (yayınlanamış) nın elde ettiği bulgularla ( bp) uyum içindedir. Ancak her bir primer tek tek ele alındığında bazı farklılıklar dikkati çekmiştir. Araştırıcılar, tez çalışmasında da kullanılan primerlerden olan Cgb4765 den bp, Cgb4767 den bp, ASUW2 den , ASUW13 den 125, ASUW19 dan , Cgb5009 dan , C dan , C den , C den bp, C dan ise bp aralığında alleller tespit etmişlerdir. Tez çalışmasında kullanılan CMACC146 primerinden bp, CMTC168 primerinden ise bp aralığında alleller elde edilmiştir. Bu primerleri Garcia-Mas ve ark. (2004) kavunlarda kullanmış ve sırasıyla bp ve bp aralığında alleller tespit etmişlerdir. Monforte ve ark. (2003) ise, CMTC168 primerinin bp aralığında alleller ürettiğini bildirmişlerdir. Karpuzlarda farklı primerlerle yapılan çalışmalardan birinde ise bant aralıkları Citrullus lanatus genotipleri ve çeşitlerinde bp, Citrullus colocynthis genotiplerinde bp ve hibritlerde bp arasında değişim göstermiştir (Guerra-Sanz, 2002). Verma ve Arya (2008) da karpuzlarda elde edilen allellerin 110 ile 430 bp arasında olduğunu bulmuşlardır. Toplam ve polimorfik allel sayısı ve elde edilen allellerin uzunluk aralığındaki değişimler farklı türlerin kullanılmasından kaynaklanmaktadır. Sözkonusu parametreler aynı türde yapılan çalışmalarda da farklılık gösterebilir ki, bu durum ise farklı genotiplerin kullanılmasının bir sonucudur. Çalışmada tespit edilen % 100 polimorfizm oranı karpuzlarda farklı markörlerle elde edilen polimorfizm oranlarına (RAPD % 5, Levi ve ark., 2007; % 60.2, Solmaz ve ark., 2010; ISSR % 80.2, Levi ve ark., 2004; % 40.0, Levi ve ark., 2007; AFLP % 97.8, % 81; Levi ve ark., 2004; 2007; SRAP % 80.5, Levi ve ark., 77

91 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ 2007) göre oldukça yüksek bir değerdir. Benzer sonuçlar Szamosi ve ark. (yayınlanmamış) nın çalışmalarında da elde edilmiş, araştırıcılar polimorfizm oranını % 96.6 olarak tespit etmişlerdir. Kavunlarda, Monforte ve ark. (2003) ile Tzitzikas ve ark. (2009) tarafından yapılan araştırmalarda da tez çalışmasıyla uyumlu polimorfizm değerleri (% 100) bulunmuştur. Monforte ve ark. (2003), 27 kavun genotipinde genetik çeşitliliği 18 primerle araştırmış ve kavunlarda Katzir ve ark. (1996) nın elde ettiği % 71 ve Danin ve Poleg ve ark. (2001) nın elde ettiği % 86 polimorfizm oranından daha yüksek bir değer elde etmişlerdir. Araştırıcılar bu durumun daha fazla genetik materyalle çalışmalarına ve kavunun kendi içerisinde oldukça zengin bir genetik varyasyon göstermesine bağlamışlardır. Tzitzikas ve ark. (2009) da daha önce RAPD markörleri (Staub ve ark., 2004) ile ayrılamayan var. flexuosus ve var. inodorus genotiplerini SSR markörleriyle ayırmayı başarmışlar ve bu durumun SSR markörlerinin RAPD markörlerine göre daha yüksek ayırma gücüne sahip olmasından veya farklı bir germplazm kullanılmasından kaynaklanabileceğini açıklamışlardır. PCR a dayalı bir markör sistemi olan SSR yöntemi güvenilir, tekrarlanabilir, polimorfizm oranı yüksek ve kodominanttır. Birçok bitki türünde genetik haritaların oluşturulması, populasyon analizleri, markör yardımıyla seleksiyon (MAS) ve başka amaçlarla kullanılmaktadır (Gupta ve Varshney, 2000). Ender görülen ve türe özgü tanılayıcı markörler üreten SSR tekniği aynı zamanda tür karmaşasının olduğu durumlarda da başarıyla kullanılabilmektedir (Nimmakayala ve ark., 2009). Özellikle polimorfizm seviyesinin düşük olduğu durumlarda tercih edilen SSR da markör geliştirilmesinin pahalı ve zahmetli bir işlem olduğu, zaman aldığı Staub ve ark. (1996) tarafından bildirilmiştir. SSR markör tekniği, Cucurbitaceae familyasında özellikle kavun başta olmak üzere (Katzir ve ark., 1996; Staub ve ark., 2000; Danin-Poleg ve ark., 2001; López-Sesé ve ark., 2002; Chiba ve ark., 2003; Monforte ve ark., 2003; Szabó ve ark., 2005; Fukino ve ark., 2007; Kong ve ark., 2007; Escribano ve ark., 2008; Tzitzikas ve ark., 2009), hıyar (Fukino ve ark., 2008; Watcharawongpaiboon ve Chunwongs, 2008), kabak (Paris ve ark., 2003; Gong ve ark., 2008) ve karpuz 78

92 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ türlerinde (Jarret ve ark., 1997; Guerra Sanz., 2002; Kwon ve ark., 2007; Levi ve ark., 2008; Nimmakayala ve ark., 2009) gerek genetik çeşitliliğin araştırılması gerekse genetik haritalama çalışmalarında etkin bir şekilde kullanılmakla birlikte, karpuz ıslah çalışmalarında kullanılmak üzere daha fazla SSR markörünün geliştirilmesi gerekmektedir (Verma ve Arya, 2008). SSR markörlerinin farklı türler arasında transfer edilebileceği Cucurbitaceae familyasında pek çok türde yapılmış çalışmalarla kanıtlanmıştır. Bir türde geliştirilen SSR ların aynı cins içerisindeki diğer türlerde kullanım olanakları daha yüksek taksonomik seviyelerde genetik ve evrimsel çalışmalar yapılmasını mümkün kılmaktadır (Garcia-Mas ve ark., 2004). Bu konu üzerine yapılan ilk araştırmada (Katzir ve ark., 1996) kavun genomik kütüphanesinden 5 ve hıyar sekans veritabanından elde edilen 2 SSR primeri, 8 Cucumis melo, 11 Cucumis sativus, 4 Cucurbita pepo, 1 Cucurbita moschata, 1 Cucurbita maxima ve 3 adet Citrullus lanatus genotipinde test edilmiştir. Bunlardan Cucurbita moschata ve Citrullus lanatus da başarı sağlanamamıştır. Bu durum bir türde amplifikasyon veren ve polimorfik olan primerlerin farklı türlerde aynı performansı göstermeyebileceği şeklinde yorumlanmıştır. Benzer şekilde kavunlarda geliştirilen SSR markörlerinin % 37 sinin hıyarlarda, hıyarlarda geliştirilenlerin ise % 40 ının kavunlarda polimorfizmi belirleyebildiği Danin-Poleg ve ark. (2001) tarafından bildirilmiştir. Araştırıcıların geliştirdiği bu primerler pek çok çalışmada kullanılmış ve yüksek seviyede polimorfizm elde edilmiştir. Cucumis türlerinde filogenetik ilişkilerin değerlendirildiği bir diğer çalışmadan elde edilen bulgulara göre de 14 adedi kavundan, 3 adedi hıyardan geliştirilen SSR lardan kavundan elde edilenlerin % 43 ünün hıyarda, hıyardan elde edilenlerin ise tamamının kavunlarda başarıyla amplifikasyon sağladığı, ancak karpuz (% 22) ve kabakta (% 16) amplifikasyon veren SSR ların oranının düşük olduğunu bildirilmiştir (Garcia-Mas ve ark., 2004). Aynı araştırıcılar transfer edilebilen SSR ların yavaş evrimleşen genomik bölgelerde, transfer edilemeyenlerin ise daha hızlı mutasyon oranlarının olduğu bölgelerde yer aldığını rapor etmişlerdir. Benzer çalışmalar ilerleyen yıllarda kavunda Fukino ve ark. (2007) ve hıyarda Fukino ve ark. (2008) tarafından yapılmış ve geliştirilen primerlerin hem 79

93 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ kavunda hem de hıyarda polimorfik olduğu ve türler arasında transfer edilebileceği bildirilmiştir. Watcharawongpaiboon ve Chunwongs (2008) de hıyar genomik kütüphanesinden mikrosatellit markörleri geliştirmişler ve bunlar arasından 20 adedini seçerek farklı türlere transferini araştırmışlardır. Çalışma sonucunda kavunda 13 adedi (% 65), Momordica charantia da 11 adedi (% 55), karpuzda 10 adedi (% 50) ve kabakta 7 adedi (% 35) amplifiye olmuş ve böylece hıyar SSR larının farklı kabakgil türlerine de transfer edilebileceği belirlenmiştir. Karpuzlarda genetik çeşitliği belirlemek amacıyla yürütülen bu tez çalışmasında da Danin-Poleg ve ark. (2001) tarafından kavun genomik kütüphanesinden geliştirilen CMTC44, CMACC146, CMTC168 primerleri kullanılmış, her üçünden de amplifikasyon sağlanmış ve % 100 oranında polimorfizm elde edilmiştir. Literatürlerde de bildirildiği üzere SSR ların kabakgillerde farklı türler arasında transfer edilebileceği ortaya konulmuştur SSR Analizleri Sonucu Elde Edilen Benzerlik İndeksinin Değerlendirilmesi Karpuz genotipleri arasındaki genetik çeşitliliği belirlemek amacıyla yapılan çalışmada SSR tekniğiyle elde edilen veriler NTSYS (Numerical Taksonomy and Multivariate Analysis System Version 2.0, Rohlf, 1998) paket programı kullanılarak analiz edilmiştir. İlk olarak genotipler arasındaki benzerlik indeksi Jaccard (Jaccard, 1908) yöntemi kullanılarak hesaplanmış ve elde edilen benzerlik indeks değerleri EK 1 de sunulmuştur. Toplam 93 karpuz genotipi arasındaki benzerlik indeksi değerleri 0.00 ile 1.00 arasında değişmiştir. Benzerlik indeksi açısından birbirine en yakın genotipler 1.00 değeri ile Kar 78 ile Kar 200, Kar 86 ile Kar 162, Kar 154 ile Kar 162, Kar 162 ile Kar 171 olmuştur. Bu genotiplerden Kar 78 ve Kar 86 ETAE den temin edilen genotiplerdir. Kar 78 koyu yeşil kabuklu, oval şekilli ve orta irilikte olup, meyve eti koyu kırmızıdır. Kar 86 açık yeşil kabuk üzerinde koyu yeşil damarlara sahiptir. Meyve şekli yuvarlak, et rengi de kırmızıdır. Kar 171 Ege Bölgesi nin Manisa ilinden, Kar 200 ise Uşak ilinden toplanmıştır. Kar 171 koyu yeşil kabuklu, oval 80

94 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ şekilli ve kırmızı etlidir. Kar 200 de benzer şekilde yeşil kabuklu, oval şekilli olup, kırmızı et rengine sahiptir. Kar 154 ve Kar 162 ise Güneydoğu Anadolu Bölgesi nden toplanmıştır. Her iki genotipin kabuk rengi koyu yeşil ve meyve et rengi de kırmızıdır. Kar 154 yuvarlak, Kar 162 oval şekillidir. Genetik olarak birbirine yakın diğer genotipler 0.93 benzerlik indeksi değeri ile Kar 77 ile Kar 173, Kar 154 ile Kar 200, Kar 222 ile Kar 277 ve ticari çeşitlerden Crimson Sweet ile Celebration dır. Kar 77 ETAE den temin edilen bir genotip iken, Kar 173 Ege Bölgesi nin Manisa ilinden toplanan bir genotip olup, her ikisinin de kabuk rengi düz koyu yeşil, meyve şekli oval ve et rengi de kırmızıdır. Kar 222 Güneydoğu Anadolu Bölgesi nin Şanlıurfa ilinden, Kar 277 ise Orta Anadolu Bölgesi nin Nevşehir ilinden toplanmıştır. Kar 222 oval şekli, düz koyu yeşil kabuk rengi ve kırmızı et rengine sahip bir genotipken, Kar 277 basık yuvarlak şekilli açık yeşil zemin üzerine yeşil çizgilidir. Çalışmada yer alan ticari çeşitler ise morfolojik olarak birbirine çok yakın bir görüntü sergilemiştir. Kar 38 ile Kar 162, Kar 59 ile Kar 162, Kar 78 ile Kar 162, Kar 92 ile Kar 162, Kar 100 ile Kar 162, Kar 160 ile Kar 162, Kar 162 ile Kar 200 ve Kar 162 ile Bolkan arasındaki genetik benzerlik indeksi değeri ise 0.92 dir. Bu genotipler arasında Kar 38, Kar 59, Kar 78 ve Kar 200 ün kabuk rengi düz koyu yeşil, meyve şekli oval ve meyve et rengi kırmızıdır. Kar 92 nin orta yoğunlukta düz yeşil bir kabuğu olup, Kar 100 açık yeşil zemin üzerine bol damarlı bir kabuk yapısına sahiptir. Kar 160 ise uzunca meyve şekli ve açık yeşil kabuk rengi ile diğer genotiplerden morfolojik olarak farklılık ortaya koymaktadır. Genotipler arasında en düşük genetik benzerlik indeksi değeri ise 0.00 dır. Bu değer Praecitrullus fistulosus genotipleri Hindistan orijinli PI ve Pakistan orijinli PI ile çalışmada yer alan Citrullus cinsine ait genotiplerin yaklaşık tamamı arasında görülmüştür. Her ne kadar Praecitrullus fistulosus karpuza yakın bir akraba olarak değerlendirilse de (Robinson ve Deckers Walters, 1997; Wehner, 2008), kromozom sayısı farklı (2n=2x=24) bir tür olmasından dolayı, bu durum beklenen bir sonuçtur. Praecitrullus fistulosus türüne ait 13 adet genotipin Cucumis ve Citrullus cinslerine ait farklı türlerle arasındaki genetik ilişkilerin RAPD markörleriyle araştırıldığı Levi ve ark. (2005) tarafından yapılan çalışmada genetik benzerlik seviyesinin % 3 den daha az olduğu tespit edilmiştir. Bu iki Praecitrullus 81

95 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ fistulosus genotipi arasındaki genetik benzerlik indeksi değeri ise 0.73 olarak bulunmuştur. Citrullus lanatus var. citroides genotipi olan Kar 26 nın da diğer genotiplerle arasındaki genetik benzerlik oranının düşük olduğu saptanmıştır. Bu genotipin tüm genotipler arasında en yakın olduğu genotipler 0.22 benzerlik indeksi değeri ile PI ve 0.33 benzerlik indeksi değeri ile PI dir. Kar 26 dışında kalan diğer Citrullus lanatus var. citroides genotipleri olan PI , PI ve PI arasındaki genetik benzerlik indeksi ise 0.60 ile 0.86 arasında değişmiştir. Tek bir genotiple temsil edilen Citrullus rehmii türüne ait PI in genetik olarak en yakın olduğu genotip (benzerlik indeksi değeri=0.45) bir Citrullus colocynthis genotipi olan PI dir. İki adet Citrullus colocynthis genotipi, Afganistan orijinli PI ve Kıbrıs orijinli PI arasındaki genetik benzerlik indeksi değeri ise 0.59 olarak tespit edilmiştir. Çalışmada yer alan Citrullus lanatus var. lanatus genotipleri arasındaki en düşük benzerlik indeksi değeri ise 0.21 ile Crimson Tide ile Kar 163 arasında elde edilmiştir. Bu iki genotip morfolojik olarak da birbirine benzememektedir. Crimson Tide eliptik şekilli ve kabuğu çizgili bir çeşitken, Kar 163 Siirt ten toplanan ve Gelin Karpuzu olarak bilinen uzun eliptik şekilli, meyve kabuğu düz, açık yeşil üzerine bol damarlı olan genotiptir. Genetik olarak birbirine uzak olan diğer genotipler ise 0.24 benzerlik indeksi değeri ile Kar 129 ile Kar 139 ve Kar 163 ile Kar 177 dir. Kar 129 ve Kar 139 genotiplerinin her ikisi de Güneydoğu Anadolu Bölgesi nden toplanmıştır. Kar 129 silindirik şekilli olup, kabuk rengi düz yeşil üzerine koyu yeşil bol damarlıdır. Kar 139 ise eliptik şekilli olup, düz açık yeşil bir kabuğa sahiptir. Tekirdağ dan toplanan bir genotip olan Kar 177, açık tozlanan Crimson Sweet çeşidine çok benzemektedir ve bu çeşidin açılım generasyonu olduğu düşünülmektedir SSR Analizleri Sonucu Elde Edilen Dendrogramın Değerlendirilmesi Benzerlik indeksinden yararlanılarak UPGMA (Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Average) metodu ile kümeleme (Cluster) analizleri yapılmış ve dendrogram (Şekil 4.3) elde edilmiştir. Dendrogramın benzerlik matriksini ne ölçüde temsil ettiği Mantel Matriks Uyuşma testi (Mantel's Matrix 82

96 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Correspondence Test) ile değerlendirilmiştir (Mantel, 1967). Bu test sonucunda kofenetik korelasyon katsayısı (Cophenetic Correlation Coefficient), r, değeri elde edilmiştir. SSR analizleri sonucu oluşturulan dendrogram incelendiğinde, genotipler arasındaki genetik benzerlik oranının 0.02 ile 1.00 arasında değiştiği görülmüştür. Kar 78 ile Kar 200 ve Kar 86 ile Kar 162 hariç, diğer tüm genotiplerin ve çeşitlerin birbirinden ayrıldığı saptanmıştır. Benzer bir durum Jarret ve ark. (1997) tarafından yapılan bir araştırmada gözlenmiştir. Bu çalışmada birbiriyle çok yakın ilişkili genotipleri ayırmada son derece başarılı olan SSR markörlerinin, farklı orijinlere sahip genotiplerin oluşturduğu germplazmda bazı genotipleri birbirinden ayıramadığı saptanmıştır. Genetik benzerlik oranları 1.00 olan Kar 78-Kar 100 ile Kar 86-Kar 162 genotiplerinin toplandıkları bölgeler farklıdır. Morfolojik olarak Kar 78 ile Kar 100 birbirine benzerken, Kar 86 ve Kar 162 arasında özellikle dış kabuk rengi bakımından böyle bir benzerlik söz konusu değildir. Dendrogram 0.02 benzerlik oranıyla 1 ve 2 olarak numaralandırılmış 2 ana gruba ayrılmıştır. Birinci ana grup (1) da 0.28 benzerlik oranıyla 2 alt gruba (1.1 ve 1.2) ayrılmıştır. Birinci alt grup (1.1) Praecitrullus fistulosus türüne ait 0.73 oranında benzerlik gösteren PI ve PI genotiplerini, 2. alt grup (1.2) da Citrullus lanatus var. citroides genotipi olan Kar 26 yı içermiştir. Karpuzlarda genetik çeşitliliğin RAPD markörleriyle araştırıldığı çalışmada (Solmaz ve ark., 2010) Praecitrullus fistulosus genotipleri tüm Citrullus genotiplerine 0.26 oranında benzerlik göstermiş ve ayrı bir grup oluşturmuştur. Citrullus türlerinin akrabalık ilişkilerini belirlemek amacıyla Navot ve Zamir (1987) in izoenzimlerle yaptıkları çalışmada Praecitrullus fistulosus un diğer tüm Citrullus türlerinden farklı olduğu ortaya konmuştur. Levi ve ark. (2005) tarafından RAPD markörlerinin kullanıldığı bir diğer araştırma da bu bulguyu desteklemiş ve Praecitrullus fistulosus un hem Citrullus hem de Cucumis türleri ile genetik benzerliğinin % 3 den daha az olduğu bildirilmiştir. 83

97 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Şekil 4.3. SSR markörleri ile elde edilen dendrogram 84

98 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ İkinci ana grup (2), birinci ana grup dışında kalan diğer 90 adet karpuz genotipi içermekle birlikte, 0.23 benzerlik oranında iki alt gruba (2.1 ve 2.2) ayrılmıştır. İkinci ana grubun (2) 1. alt grubunun da (2.1), 0.33 benzerlik oranında yeniden 2 alt gruba (2.1.A ve 2.1.B) ayrıldığı görülmüştür. Bu alt gruplardan 2.1.A da Citrullus lanatus var. citroides genotipleri PI , PI ve PI yer almıştır. PI genotipi, PI ve PI genotiplerinden 0.68 benzerlik oranında ayrılarak tek başına 2.1.A1 alt grubunu oluştururken, PI ve PI genotipleri de 2.1.A2 alt grubunu oluşturmuş ve 0.86 benzerlik oranında birbirlerinden ayrılmışlardır. Diğer alt grup 2.1.B ise 0.43 benzerlik oranında 2.1.B1 ve 2.1.B2 şeklinde numaralandırılmış 2 yeni alt gruba ayrılmıştır. 2.1.B1 alt grubu çalışmada tek bir genotip ile temsil edilen Citrullus rehmii türüne ait PI i içerirken, diğer alt grup olan 2.1.B2 ise Citrullus colocynthis türüne ait PI ile PI genotiplerini içermektedir. Bu iki genotipin benzerlik oranı ise 0.59 olarak tespit edilmiştir. İkinci ana grubun 2. alt grubu (2.2) ise 0.48 benzerlik oranında yeniden 2 alt gruba (2.2.A ve 2.2.B) ayrılmıştır. Bu alt gruplardan 2.2.A alt grubu tek bir genotipi (Kar 109), diğer alt grup olan 2.2.B ise çalışmada yer alan Citrullus lanatus var. lanatus türüne ait tüm genotiplerle birlikte hibrit ve açık tozlanan çeşitlerin tamamını kapsamaktadır. Bu alt grup temel olarak 0.49 benzerlik oranında yeniden 2 alt gruba (2.2.B1 ve 2.2.B2) ayrılmıştır. 2.2.B1 grubu 2.2.B2 grubuna göre daha fazla genotipten oluşmuş ve kendi içinde de yeniden I, II, III, IV ve V olarak adlandırılan 5 alt gruba ayrılmıştır. Grupların oluşmasında gerek coğrafi orijin gerekse de morfolojik özelliklerin herhangi bir etkisi görülmemiştir. Bu alt gruplardan I, genetik benzerlik oranları 0.63 ile 1.00 arasında değişen ve daha küçük gruplardan oluşan toplam 42 adet genotip (Kar 24, Kar 25, Kar 92, Kar 195, Kar 150, Kar 116, Kar 146, Kar 38, Kar 78, Kar 200, Kar 230, Kar 86, Kar 162, Kar 154, Kar 171, Kar 100, Kar 160, Kar 97, Kar 310, Kar 142, Kar 197, Kar 242, Kar 192, Kar 208, Kar 215, Kar 218, Kar 37, Kar 104, Kar 59, Kar 164, Kar 77, Kar 177, Kar 173, Kar 117, Kar 121, Kar 114, Kar 205, Kar 181, Kar 70, Kar 152, Kar 151, Kar 23, Kar 149) içermiştir. Genotiplerin çoğu Türkiye nin farklı 85

99 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ bölgelerinden toplanmış olmakla birlikte, ağırlıkla Güneydoğu Anadolu Bölgesi ndendir. Mısır dan toplanan ve morfolojik olarak diğer genotiplerden farklı olan Kar 24 ve Kar 25 (Solmaz, 2003), KKTC den toplanan Kar 92 ve Kar 310 ile birlikte Kar 37 kodlu Halep Karası çeşidi de bu grupta yer almıştır. SSR analizleri neticesinde birbirinden ayrılamayan Kar 78 ve Kar 200 ile Kar 86 ve Kar 162 genotiplerinin de bu grupta olduğu görülmüştür. Bununla birlikte grup içerisinde genetik olarak birbirine çok yakın genotipler de tespit edilmiştir. Kar 154, Kar 86 ve Kar 162 ye 0.94 oranında, Kar 77 ile Kar oranında ve Kar 192 ile Kar 208 de 0.93 oranında birbirine benzemektedir. 2.2.B1 alt grubunun 2. alt grubu olan ve dendrogramda II olarak gösterilen grupta Kar 58, Kar 175, Kar 176, Kar 129, Kar 177 ve Kar 147 genotipleriyle birlikte Crimson Sweet ve Allsweet gibi açık tozlanan çeşitler ve Celebration ve Crimson Tide gibi hibrit çeşitler de yer almıştır. Grup I de olduğu gibi Grup II yi oluşturan genotipler de farklı bölgelerden olmakla birlikte, ticari çeşitlerin çoğunun bu grupta yer alması dikkat çekmektedir. Bu grup içerinde birbirine en çok benzeyenler 0.94 oranıyla Crimson Sweet ve Allsweet çeşitleri olmuştur. Şanlıurfa dan toplanan Kar 129 uzun meyve şekliyle morfolojik olarak diğer genotip ve çeşitlerden daha farklı bir görüntü sergilemiştir. Diğer genotipler ise her ne kadar kabuk rengi bakımından farklı olsalar da gerek şekil gerekse meyve et rengi bakımından birbirlerine benzemektedirler. Tekirdağ dan toplanan Kar 177 genetik olarak 0.87 benzerlik oranında Kar 129 ile birlikte gruplansa da II no lu grup içerisinde morfolojik olarak ticari çeşitlere en yakın genotiptir. Üçüncü alt grup dendrogramda III olarak numaralandırılmış ve 6 genotipten (Kar 36, Kar 102, Kar 93, Kar 98, Kar 217, Kar 285) oluşmuştur. Genetik benzerlik oranları 0.71 ile 0.85 arasında değişen genotiplerin toplandıkları bölgeler de diğer gruplarda olduğu gibi farklıdır. Meyve özellikleri bakımından Kar 36, Kar 285 e, Kar 102 de Kar 217 ye benzemektedir. Bir diğer alt grup olan IV de orijinleri farklı, ancak meyve şekilleri bakımından birbirine benzeyen 4 genotip (Kar 212, Kar 222, Kar 241, Kar 277) ve 2 adet açık tozlanan (Charleston Gray ve Calhoun Gray) çeşidi içermektedir. 2.2.B1 alt grubunun son alt grubu V ise Osmaniye den toplanan tek bir genotipten (Kar 298) oluşmuş ve 0.52 benzerlik oranında 2.2.B1 alt grubunda yer alan diğer tüm genotiplerden ayrılmıştır. 86

100 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ 2.2.B2 alt grubu da kendi içinde dendrogramda VI, VII, VIII ve IX şeklinde gösterilen 4 gruba ayrılmıştır. Bu gruplardan VI Kar 28, Kar 84, Kar 174, Kar 139, Kar 163 ve Kar 268 genotiplerini içermektedir. Grup içerisinde birbirine en yakın genotipler 0.79 benzerlik oranı ile ETAE nden temin edilen Kar 84 ile Manisa ilinden toplanan Kar 174 dür. Dendrogramda VIII olarak gösterilen alt grupta ise Kar 29, Kar 35, Kar 153, Kar 216, Kar 224 genotipleriyle birlikte Dixilee ve Congo da yer almaktadır. Grup içerisinde Kar 29 ve Kar 35, 0.79 benzerlik oranıyla birbirine en yakın genotiplerdir. Basık yuvarlak meyvesi ve sarı et rengiyle Kar 29, Kar 35 den morfolojik olarak son derece farklıdır. Bir diğer alt grup olan VIII ise Kar 178, Kar 203 ve Kar 254 genotiplerinden oluşmuştur. Bu grup içerisinde Antakya dan toplanan ve Zerzuri olarak bilinen Kar 243, 0.66 benzerlik oranı ile diğer 2 genotipten ayrılmıştır. Niğde den toplanan Kar 254 ise 2.2.B1 grubunda yer alan diğer genotiplerden 0.53 benzerlik oranında ayrılarak tek başına IX grubunu oluşturmuştur. Sonuç olarak SSR analizleri verileriyle elde edilen dendrogramda Citrullus lanatus var. lanatus alt türüne ait Türkiye nin farklı bölgelerinden toplanan karpuzların diğer Citrullus türlerinden (C.l. var. citroides, C. colocynthis, C. rehmii ve akraba türden (Praecitrullus fistulosus) genetik olarak farklı olduğu ortaya konmuştur. Büyük bir grupta toplanan (2.2) bu karpuzların genetik benzerlik oranları 0.48 ile 1.00 arasında değişen farklı alt gruplara ayrıldığı ve bu alt grupların oluşmasında gerek karpuzların toplandığı orijin, gerekse morfolojik özelliklerin herhangi bir etki yaratmadığı görülmüştür. Bu bulguyu Jarret ve ark. (1997) tarafından yapılan çalışma sonuçları da desteklemiştir. Araştırıcılar SSR markörlerini kullanmışlar ve C. lanatus var. lanatus türünde yer alan alt grupların oluşmasıyla genotiplerin coğrafi orijinleri ya da meyve et rengiyle arasında güçlü bir korelasyon olmadığını tespit etmişlerdir. Türkiye nin farklı bölgelerinden toplanan ve C. lanatus var. lanatus alt türüne giren karpuzların genetik çeşitliliğinin RAPD markörleriyle araştırıldığı bir çalışmada (Sarı ve ark., 2007b), genotiplerin benzerlik oranlarının arasında değiştiği ve bu karpuzların genetik yapı bakımından birbirine son derece yakın olduğu belirlenmiştir. Kültürü yapılan karpuz genotipleri ve çeşitleri (C. lanatus var. lanatus), kabuk rengi ve kalınlığı, meyve şekli ve büyüklüğü, meyve eti 87

101 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ yapısı ve rengi, şeker içeriği, tohum şekli ve rengi gibi morfolojik karakterler açısından son derece değişken olmalarına rağmen, DNA düzeyinde sınırlı polimorfizme sahip (Navot ve Zamir, 1987) olmalarının nedeninin, karpuzun orijin merkezinin dışında kültüre alınması olabileceği bildirilmiştir (Jarret ve ark., 1997). Meyve özellikleri bakımından farklı olan karpuz çeşitleri arasındaki genetik çeşitliliğin RAPD markörleriyle araştırıldığı çalışmalarda karpuz çeşitleri arasında görülen düşük DNA polimorfizminin bu çeşitlerin dar bir genetik yapıya sahip olmalarından kaynaklandığı rapor edilmekle birlikte (Levi ve ark., 2000; Levi ve ark., 2001b), meyve özelliklerinde gözlenen farklılıkların gen mutasyonlarının bir sonucu olduğu ve RAPD markörleri ile tespit edilemeyebileceği açıklanmıştır (Levi ve ark., 2008). Çalışma sonucunda elde edilen bulgular neticesinde SSR markörlerinin genetik yapı bakımından çok da zengin olmayan kültür karpuzlarının genetik çeşitliliğinin araştırılmasında daha etkili olduğu sonucu ortaya çıkmıştır. SSR markörleri, karpuzlarda farklı türlere ait genotipler arasındaki genetik çeşitliliğin belirlenmesinde başarıyla kullanılmaktadır. Örneğin Jarret ve ark. (1997) tarafından yapılan bir çalışmada farklı orijinlere sahip karpuzlarda genetik çeşitliliğin SSR markörleri ile araştırılmasında kümeleme analizleri Citrullus genotiplerinin çoğunu birbirinden ayırmış ve % 25 genetik benzerlik seviyesinde 4 grup oluşmuştur. En büyük grubu Citrullus lanatus var. lanatus genotipleri içermiş ve kendi içinde de farklı alt gruplara ayrılmıştır. İkinci büyük grup ise citron olarak da adlandırılan Citrullus lanatus var. citroides alt türünün yabani ve kültüre alınmış genotipleri oluşturmuştur. Üçüncü grup Citrullus lanatus var. lanatus olarak tanımlanan, ancak Citrullus lanatus var. lanatus ile Citrullus lanatus var. citroides melezi olduğu düşünülen bir genotipten ve dördüncü grup da Citrullus colocynthis türüne ait tek bir genotipten oluşmuştur. Levi ve ark. (2008) tarafından yapılan bir diğer çalışmada da genetik çeşitliliği az olan 25 Amerikan karpuz çeşidi ve farklı türlere ait (4 adet C. lanatus var. lanatus genotipi, 5 adet Citrullus lanatus var. citroides genotipi ve 4 adet Citrullus colocynthis genotipi) 13 adet Amerika bitki introdüksiyonu arasındaki genetik ilişkiler EST-SSR markörleriyle belirlenmiş ve 3 ana Citrullus türünün 88

102 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ birbirinden ayrıldığı saptanmıştır. Dört adet Citrullus colocynthis genotipinin diğer türlere daha uzak, Citrullus lanatus var. citroides PI larının ise gerek Citrullus lanatus var. lanatus PI larına, gerekse de çeşitlerine daha yakın olduğu görülmüştür. Karpuzlarda türler arasındaki genetik uzaklığın beklenildiği üzere tür içi genetik uzaklıktan daha fazla olduğu (Citrullus lanatus var. lanatus ile Citrullus lanatus var. citroides arasında % 40, Citrullus colocynthis ile Citrullus lanatus var. citroides arasında % 43 ve Citrullus lanatus var. lanatus ile Citrullus colocynthis arasında ise % 46) Nimmakayala ve ark. (2009) tarafından tespit edilmiştir. SSR analizleri sonucunda benzerlik indeksi ile dendrogram arasındaki kofenetik korelasyon katsayısı 0.90 olarak tespit edilmiştir ve bu değer benzerlik indeksleri ile dendrogram arasındaki korelasyonun çok yüksek olduğunu göstermektedir (Mohammadi ve Prasna, 2003) SSR Verileriyle Yapılan Temel Koordinat Analizinin Değerlendirilmesi Temel koordinat analizlerinde kümeleme (Cluster) analizlerinde kullanılan benzerlik matriksinden yararlanılmış ve iki boyutlu dağılım grafiği SAS (SAS, 2006) programında oluşturulmuştur (Şekil 4.4). Temel Koordinat Analizi sonucu elde edilen iki boyutlu grafiğin birinci boyutu (D1) toplam moleküler varyansın % ini, 2. boyutu (D2) ise % ini açıklamıştır. Grafik incelendiğinde Praecitrullus fistulosus (PI ve PI ), Citrullus colocynthis (PI ve PI ), Citrullus rehmii (PI ) ve Citrullus lanatus var. lanatus (PI , PI , PI , Kar 26) genotiplerinin Citrullus lanatus var. lanatus türüne ait Türkiye den toplanan ve ticari çeşitlerden uzakta gruplandığı görülmüştür. Türkiye den toplanan genotiplerle birlikte açık tozlanan ve hibrit çeşitler arasında bazı genotiplerin çok yoğun ilişkili olduğu tespit edilmiş ve bu genotipler grafikte A ve B kümeleri içerisinde gösterilmiştir. Bu kümelerden A kümesi 10 adet (Kar 58, Kar 59, Kar 78, Kar 142, Kar 151, Kar 152, Kar 164, Kar 205, Kar 242, Kar 310) genotipi içermektedir. Bu kümelerden daha büyük olan B kümesi ise 18 genotipten (Kar 86, Kar 92, Kar 97, Kar 105, Kar 116, Kar 117, Kar 129, Kar 146, Kar 147, Kar 150, Kar 160, Kar 171, 89

103 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Kar 175, Kar 177, Kar 192, Kar 208, Kar 215, Kar 218) ve 2 ticari çeşitten (Allsweet ve Bolkan) oluşmaktadır. Bu genotipler ağırlıklı olarak Güneydoğu Anadolu ve Marmara Bölgeleri nden toplanan genotipler olup, kırmızı meyve et rengi hariç, diğer meyve karakterleri morfolojik bakımından varyasyon göstermektedir. A ve B kümelerinde yer almayan diğer Citrullus lanatus var. lanatus genotipleri çok belirgin bir gruplanmaya dahil olmasalar da kendi aralarında yakın ilişkiler sergileyerek yabani türlerden ayrılmışlardır. Türkiye den toplanan karpuzlarda genetik çeşitliliğin RAPD markörleriyle araştırıldığı bir çalışmada elde edilen moleküler veriler Temel Koordinat Analizine tabi tutulmuş ve Praecitrullus fistulosus genotiplerinin, diğer Citrullus türlerinden ayrı gruplandığı ve Türkiye den toplanan Citrullus lanatus var. lanatus türüne ait genotiplerin yoğun bir şekilde bir arada kümelendiği tespit edilmiştir (Solmaz ve ark., 2010). Şekil SSR verileriyle yapılan temel koordinat analizi sonucu elde edilen iki boyutlu grafik 90

104 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ SRAP Analizleri Karpuz Genotiplerinin SRAP Tekniği ile Karakterizasyonunda Polimorfizmin Değerlendirilmesi Çalışmada 93 adet karpuz genotipini moleküler olarak karakterize etmek ve aralarındaki genetik ilişkiyi belirlemek amacıyla SRAP tekniği kullanılmıştır. On adet forward (ileri) ve 10 adet reverse (geri) primerinin farklı kombinasyonları denenmiş ve polimorfizm oranı yüksek 31 primer kombinasyonu ile çalışma yürütülmüştür. Jel görüntüleme işleminden sonra bantların belirgin olanları dikkate alınmış, bant varlığında (1), bant yokluğunda (0) ve amplifikasyon yokluğunda (9) rakamı verilerek değerlendirme yapılmıştır. Bu değerlendirme sonucunda her bir primer çifti için elde edilen toplam bant sayısı (adet), polimorfik bant sayısı (adet) bant uzunluk aralıkları (bp) ve polimorfizm oranı (%) Çizelge 4.2 de sunulmuştur. Çalışmada kullanılan 31 primer kombinasyonundan elde edilen bant büyüklükleri bp arasında değişmiştir. En küçük bant uzunluğu 100 bp ile me1em4, me1em11 me3em1, me3em3, me3em4, me4em2, me4em3, me5em1, me5em4, me7em8 ve me11em1 kombinasyonlarından, en büyük bant uzunluğu ise 1000 bp ile me1em6, me2em6, me3em2, me3em3, me3em6, me4em6, me5em2, me5em6, me5em12 kombinasyonlarından elde edilmiştir. Değerlendirilen 31 primer kombinasyonu, 461 i polimorfik toplam 472 adet bant üretmiştir. Primer başına elde edilen toplam bant sayısı (ortalama 15.2) arasında, toplam polimorfik bant sayısı ise 8-25 (ortalama 14.9) arasında değişmiştir. En fazla bant me5em12 (25 adet) kombinasyonundan, en az bant ise me5em1 (10 adet) kombinasyonundan elde edilmiştir. Polimorfik bant sayısı bakımından ise me5em12 kombinasyonu en çok (25 adet), me4em1 kombinasyonu ise en az (8 adet) bandı üretmiştir. Çalışmada kullanılan SRAP primer kombinasyonlarından me1em11 ve me1em6 ya ait agaroz jel görüntüleri Şekil. 4.5 ve Şekil 4.6 da sunulmuştur. Primerlerin toplam polimorfizm oranı ise % 97.3 olarak tespit edilmiştir. Polimorfizm oranı en yüksek primer kombinasyonları % 100 ile me1em4, me2em3, me2em4, me2em5, me2em6, me3em1, me3em2, me3em3, me3em4, me3em5, 91

105 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ me3em6, me4em2, me4em3, me4em4, me4em6, me5em2, me5em3, me5em5, me5em6, me5em12, me6em6, me9em11, me11em1 iken, en düşük oran ise % 72.7 ile me4em1 primer kombinasyonuna aittir. Çizelge 4.2. SRAP primerlerinin amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayısı (adet), polimorfik bant sayısı (adet), bant uzunluk aralıkları (bp), polimorfizm oranı (%) Primer Çifti Toplam Bant Sayısı (adet) Polimorfik Bant Sayısı (adet) Bant Uzunluk Aralıkları (bp) Polimorfizm Oranı (%) me1em me1em me1em me1em me2em me2em me2em me2em me3em me3em me3em me3em me3em me3em me4em me4em me4em me4em me4em me5em me5em me5em me5em me5em me5em me5em me5em me6em me7em me9em me13em Toplam Ortalama

106 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Şekil 4.5. me1em11 SRAP primer kombinasyonuna ait agaroz jel görüntüsü Şekil 4.6. me1em6 SRAP primer kombinasyonuna ait agaroz jel görüntüsü Kolay uygulanabilen, tekrarlanabilen aynı zamanda ucuz ve etkili bir markör sistemi olan SRAP ın (Li ve Quiros, 2001) aynı zamanda çok sayıda polimorfik bant 93

107 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ verebilen bir markör sistemi olduğu Guo ve Luo (2006) tarafından bildirilmiştir. Araştırmada kullanılan 31 SRAP primer kombinasyonundan elde edilen toplam bant (472) ve toplam polimorfik bant sayısının (461) araştırıcıların tespitiyle uyumlu bulunduğu görülmektedir. Karpuzlarda SRAP markör tekniği kullanılarak yapılan genetik çeşitlilik çalışmalarında elde edilen primer başına ortalama bant sayısının ve polimorfizm oranının yürütülen tez çalışması ile karşılaştırıldığında daha düşük değerler aldığı dikkati çekmektedir. Örneğin Levi ve Thomas (2007), genetik çeşitlilik seviyesi oldukça düşük olan 24 karpuz genotipinde polimorfizmi, toplam 146 markör (RAPD, ISSR, AFLP, SRAP) kullanarak araştırmış ve 53 RAPD marköründen 5 inin (% 9.4), 15 ISSR marköründen 6 sının (% 40.0), 37 AFLP marköründen 30 unun (% 81.0) ve 41 SRAP marköründen 33 ünün (% 80.5) polimorfik olduğunu tespit etmişlerdir. Araştırıcılar, SRAP markörlerinin AFLP markörleri kadar etkili olduğunu ve karpuz genomunda farklı bağlantı (linkage) bölgelerini temsil ettiğini bildirmişlerdir. Karpuzlarda yürütülen bir diğer çalışmada ise Yan ve Zhang (2005), hibrit çeşitler arasındaki genetik çeşitliliği SRAP markörleri ile değerlendirmişler ve 25 primer kombinasyonunun 20 adedinin (%80) toplam 135 adet polimorfik bant ürettiğini, primer başına elde edilen ortalama bant sayısının ise 7.11 olduğunu tespit etmişlerdir. Her iki çalışmada da karpuz gibi genetik temeli dar olan bir türde, birbirine yakın genotiplerin ve çeşitlerin kullanılması polimorfizm oranının düşük olmasına neden olmuştur. Yürütülen tez çalışması kapsamında ise elde edilen % 97.3 lük polimorfizm oranı, ticari çeşitlere göre genetik çeşitlilik bakımından nispeten daha zengin olan yerel genotiplerin, farklı Citrullus türlerine ve akraba türe (Praecitrullus fistulosus) ait genotiplerin kullanılmış olmasından kaynaklanmaktadır. Farklı Cucurbitaceae türleri ve diğer bitki türlerinde genetik çeşitlililiğin SRAP yöntemi ile araştırıldığı çalışmalarda da polimorfizm oranı bakımından SRAP, başarılı sonuçlar ortaya koymuş ve bu çalışmalardan birçoğunun tez çalışması ile uyumlu bulgular verdiği görülmüştür. Örneğin İnan (2008), 24 kabak genotipinde SRAP ve ISSR markör tekniklerini kullanarak moleküler karakterizasyon yapmış ve 94

108 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ 8 farklı SRAP primer kombinasyonundan tamamı polimorfik (% 100) toplam 71 adet bant elde etmiştir. Morfolojik ve orijin olarak birbirinden farklı 47 Cucurbita moschata genotipinin moleküler karakterizasyonunda SRAP ve AFLP markör tekniklerini kullanan Ferriol ve ark. (2004b), 11 SRAP primer kombinasyonundan 148 bant elde edildiğini ve bunlardan 98 adedinin (% 66.2) polimorfik olduğunu tespit etmişlerdir. Kabaklarda (Cucurbita pepo L.) Ferriol ve ark. (2003) tarafından SRAP markör tekniği ile yapılan bir diğer moleküler karakterizasyon çalışmasında ise 11 adet SRAP primer kombinasyonundan 88 bant elde edilmiş ve bunlardan 64 adedi (% 72.7) polimorfik bulunmuştur. Araştırıcılar SRAP markörlerinden, AFLP markörlerine göre, morfolojik çeşitlilikle daha uyumlu bilgiler elde edildiğini bildirmişlerdir. Turpta (Raphanus sativus L.) yapılan bir çalışmada ise 35 adet genotipin genetik çeşitliliği RAPD, ISSR ve SRAP markörleri kullanılarak belirlenmiştir (Wang ve ark., 2008). Araştırıcılar, SRAP analizleri sonucunda uzunlukları bp arasında değişen toplam 233 bantın 199 adedinin (% 85.2) polimorfik olduğunu tespit etmişlerdir. RAPD yöntemiyle elde edilen polimorfizm % iken, ISSR da ise % bulunmuştur. Her ne kadar polimorfizm oranı bakımından benzer değerlere ulaşılsa da ortalama polimorfik bant sayısı bakımından SRAP ın (11.76 adet), RAPD (10.06) ve ISSR (9.68) a göre daha yüksek değerlere sahip olması, bu markör sisteminin araştırıcılar tarafından genetik çeşitliliğin tespitinde etkin bir markör sistemi olarak değerlendirilmesine neden olmuştur. Gülşen ve ark. (2007) ise bamyalarda yaptıkları çalışmada 39 adet primer kombinasyonundan toplam 97, primer kombinasyonu başına ise ortalama 2-6 bant elde edildiğini, bant uzunluklarının bp arasında ve polimorfizm oranının da % 50 olduğunu bildirmişlerdir. Araştırıcılar genotipler arasındaki yüksek benzerlik düzeyinin ( ) ise bamyanın büyük oranda kendine tozlanan bir tür olmasından kaynaklandığını belirtmişlerdir. Bezelyede (Pisum sativum L.) genetik çeşitliliği SRAP markörleriyle belirlemek amacıyla Espósito ve ark. (2007), toplam 7 adet primer kombinasyonu kullanmışlar ve uzunlukları bp arasında değişen toplam 162 adet 95

109 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ polimorfik bant elde etmişlerdir. Primer kombinasyonu başına ortalama bant sayısı ise 23 adet olup, bu değer genelde SRAP markörlerinden elde edilen ortalama bant sayısından (10-20 adet) yüksek bulunmuştur. Turunçgillerde genetik çeşitliliği SRAP markörleriyle karakterize eden Uzun (2009) ise, farklı türlerde polimorfizm oranının % 34 ile % 98 arasında değiştiğini saptamıştır. En düşük polimorfizm oranının portakallardan, en yüksek polimorfizmin ise akraba ve diğer gruplardan elde edildiği çalışmada, polimorfizm seviyesindeki değişimin portakal grubunda mutasyon sonucu gelişmiş çeşit ve genotiplerin, akraba ve diğer gruplar içinde ise alt soy ve hatta soy düzeyinde farklı cins ve türlerin yer almasından kaynaklandığı bildirilmiştir. Fu ve ark. (2008) tarafından farklı türlere ait 22 karanfil genotipinin genetik çeşitliliği SRAP ve ISSR moleküler markörleriyle ayrıca morfolojik olarak değerlendirilmiştir. Her üç sistemin etkinliği SRAP>ISSR>morfolojik karakterizasyon şeklinde olmuştur. SRAP analizlerinde kullanılan 11 primer kombinasyonu % sı polimorfik, toplam 158 bant üretmiştir. Vandermark ve ark. (2006) nın 5 yonca (Medicago sativa L.) genotipi arasındaki genetik ilişkileri SRAP markörleriyle araştırdığı çalışmada ise 14 adet primer kombinasyonu kullanılmış ve 226 adedi polimorfik olmak üzere toplam 249 adet bant elde edilmiştir. Budak ve ark. (2004a) ise, 53 çim [Buchloe dactyloides (Nutt.) Elgelm.] genotipi arasındaki genetik çeşitliliği SRAP markörleriyle değerlendirmiş ve kullanılan 34 primer kombinasyonundan uzunlukları bp arasında değişen 231 adedi polimorfik toplam 243 adet bant ve % 95 oranında polimorfizm elde etmişlerdir. Aynı araştırıcıların (Budak ve ark., 2004b) çimlerde filogenetik ilişkileri RAPD, ISSR, SSR ve SRAP markörleriyle inceledikleri bir diğer araştırmada ise elde edilen polimorfizm oranı RAPD ile (% 79), ISSR ile (% 81), SSR ile (% 87) ve SRAP ile (% 95) olarak tespit edilmiş ve SRAP yönteminin genotipler arasındaki farklılıkların belirlenmesinde en etkili yöntem olduğu bildirilmiştir. Genetik çeşitliliği belirlemede son derece başarılı olan SRAP markör tekniğinin (Cravero ve ark., 2007; Li ve ark., 2008; Wang ve ark., 2008) genetik 96

110 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ ilişkilerin açıklanmasında, markör yardımıyla seleksiyonda (MAS), çekirdek koleksiyonların oluşturulmasında ve genetik haritalama çalışmalarında kullanılabileceği bildirilmiştir (Gülşen ve ark., 2007). Toplam 93 adet karpuz genotipinin moleküler karakterizasyonu amacıyla 31 primer kombinasyonu kullanılarak yapılan çalışmada elde edilen polimorfizm oranı (% 97.3) bakımından SRAP markörlerinin RAPD (% 62; Lee ve ark., 1996; % 60.6; Sarı ve ark., 2007b), AFLP (% ; Che ve ark., 2003) ve ISSR (% 81.6; Levi ve ark., 2004) gibi moleküler markörlerden daha üstün olduğu görülmüştür SRAP Analizleri Sonucu Elde Edilen Benzerlik İndeksinin Değerlendirilmesi Karpuz genotipleri arasındaki genetik çeşitliliği belirlemek amacıyla yapılan çalışmada SRAP tekniğiyle elde edilen veriler NTSYS (Numerical Taksonomy and Multivariate Analysis System Version 2.0, Rohlf, 1998) paket programı kullanılarak analiz edilmiştir. Öncelikle genotipler arasındaki benzerlik indeksi Jaccard (Jaccard, 1908) yöntemi kullanılarak hesaplanmış ve elde edilen benzerlik indeks değerleri EK 2 de sunulmuştur. Toplam 93 karpuz genotipi arasındaki benzerlik indeks değeri 0.18 ile 0.97 arasında değişmiştir. Genetik benzerlik açısından birbirine en yakın genotiplerin 0.97 benzerlik indeksi değeri ile Kar 142 ile Kar 146 ve Kar 146 ile Kar 152 olduğu görülmüştür. Bu genotiplerin her üçünün de orijini Güneydoğu Anadolu Bölgesi dir. Kar 142 ve Kar 146 Şanlıurfa nın Bozova ilçesinin Tatköy ünden toplanan genotiplerdir. Morfolojik olarak da birbirine benzeyen bu genotipler yuvarlak şekilli olup çizgilidirler. Kabuk zemin rengi açısından farklı olan bu iki genotipin her ikisinin de kabuğu kalındır. Kar 152 ise yine Şanlıurfa dan toplanan ve Yerli Yuvarlak olarak bilinen bir genotiptir. Şekilsel olarak Kar 146 ya benzemekle birlikte, kabuğu düz koyu yeşildir. Genotiplerin üçünün de meyve eti kırmızıdır. Genetik olarak birbirine yakın diğer genotipler 0.96 benzerlik indeksi değeri ile Kar 28 ile Kar 29, Kar 35 ile Kar 36, Kar 78 ile Kar 84, Kar 84 ile Kar 92, Kar 92 ile Kar 35, Kar 92 ile Kar 93, Kar 93 ile Kar 35, Kar 93 ile Kar 97, Kar 121 ile Kar 117, Kar 97

111 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ 149 ile Kar 142, Kar 149 ile Kar 146, Kar 150 ile Kar 146, Kar 152 ile Kar 142, Kar 152 ile Kar 149, Kar 152 ile Kar 150, Kar 163 ile Kar 162 dir. Genetik olarak en uzak genotipler ise 0.18 benzerlik indeksi değeri ile Praecitrullus fistulosus genotipi olan Hindistan orijinli PI ile Citrullus colocynthis genotipleri olan Afganistan orijinli PI ve Kıbrıs orijinli PI dir. Citrullus colocynthis türüne ait PI ve PI genotipleri arasındaki benzerlik indeksi değeri 0.66 iken, Citrullus lanatus var. citroides genotipleri arasındaki değer 0.58 ile 0.72 arasında değişmiştir. Citrullus rehmii genotipi PI in genetik olarak en yakın olduğu genotip (benzerlik indeksi=0.51) bir Citrullus colocynthis genotipi olan PI dir. Genetik benzerlik açısından diğer genotiplerden daha düşük değerlere sahip iki genotip de Mısır ın İskenderiye şehrinden toplanan Kar 24 ve Kar 25 dir. Bu genotipler morfolojik olarak da diğer C. lanatus var lanatus genotiplerinden farklı olmakla birlikte (Solmaz, 2003), genetik olarak birbirlerine 0.91 oranında benzemektedirler. Çalışmanın büyük çoğunluğunu oluşturan C. lanatus var. lanatus genotipleri ve çeşitleri arasındaki genetik benzerlik indeksi değerleri ise 0.61 ile 0.97 arasında değişmiştir. Elde edilen bulgular önceki çalışmalarla (Levi ve ark., 2000; 2001a; 2001b) uyum içerisinde olmuş ve morfolojik olarak birbirinden oldukça farklı C. lanatus var. lanatus karpuz genotiplerinin genetik olarak birbirlerine benzedikleri tespit edilmiştir SRAP Analizleri Sonucu Elde Edilen Dendrogramın Değerlendirmesi Benzerlik indeksinden yararlanılarak UPGMA (Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Average) metodu ile kümeleme (Cluster) analizleri yapılmış ve dendrogram (Şekil 4.7) elde edilmiştir. Dendrogramın benzerlik matriksini ne ölçüde temsil ettiği Mantel Matriks Benzerlik testi (Mantel's Matrix Correspondence Test) ile testlenmiştir (Mantel, 1967). Bu test sonucunda kofenetik korelasyon katsayısı (Cophenetic Correlation Coefficient), r, değeri elde edilmiştir. 98

112 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Dendrogram incelendiğinde genotiplerin tamamının birbirinden ayrıldığı, 93 adet genotipin genetik benzerlik düzeyinin 0.22 ile 0.97 arasında değiştiği ve temelde 2 ana grup oluştuğu (1 ve 2) görülmüştür. Birinci ana grupta (1) yer alan Praecitrullus fistulosus genotipleri (PI ve PI ) 0.22 benzerlik düzeyinde Citrullus cinsine giren tüm genotipleri içeren ikinci ana gruptan (2) ayrılmıştır. Karpuzlarda genetik çeşitliliğin RAPD markörleriyle araştırıldığı Solmaz ve ark. (2010) tarafından yapılan çalışmada da benzer sonuçlar elde edilmiş, Praecitrullus fistulosus genotipleri diğer tüm Citrullus genotiplerinden 0.26 benzerlik düzeyinde ayrılmış ve genetik olarak da birbirlerine % 98 oranında yakın bulunmuştur. İkinci ana grup (2), 91 adet karpuz genotipi içermekle birlikte 0.51 benzerlik düzeyinde iki alt gruba (2.1 ve 2.2) ayrılmıştır. Birinci alt grubun da (2.1) 0.68 benzerlik düzeyinde yeniden 2 alt gruba ayrıldığı görülmüştür. Bu alt gruplardan biri (2.1.A) Citrullus rehmii türüne ait tek genotip olan PI i, diğeri ise (2.1.B) Citrullus colocynthis türüne ait PI ile PI genotiplerini içermiştir. İkinci ana grubun ikinci alt grubu (2.2) ise 0.55 benzerlik seviyesinde yeniden 2 alt gruba (2.2.A ve 2.2.B) ayrılmıştır. Bu alt gruplardan 2.2.A alt grubu Citrullus lanatus var. lanatus genotipleri ile birlikte hibrit ve açık tozlanan çeşitlerin tamamını kapsamış ve 2 alt gruptan (2.2.A1 ve 2.2.A2) oluşmuştur. 2.2.A.1 alt grubu birbirine genetik olarak son derece yakın (%91 oranında) olan ve her ikisi de Mısır dan toplanan Kar 24 ve Kar 25 genotiplerini içermiştir. Bu genotipler morfolojik özellikleri bakımından da diğer Citrullus lanatus genotiplerinden farklıdır. Yaprakları koyu yeşil ve çok parçalı olup, ana gövdeleri oldukça tüylü ve incedir. Çiçekleri açık sarı renkli olup yumurtalıkları yoğun tüyle kaplıdır. Meyveleri 1 kg civarında ve kabuk rengi gri yeşil renklidir. Meyve eti beyaz olup, tohumları küçük ve yeşildir (Solmaz, 2003). RAPD markörleriyle Kar 24 ve Kar 25 in genetik olarak da diğer Citrullus lanatus var. lanatus lardan farklı grupda olduğu bildirilmiştir (Sarı ve ark., 2007b). Genetik kaynak kütüğünde türleri Citrullus lanatus var. lanatus olarak kaydedilmişse de bu iki genotipin Citrullus lanatus var. lanatus ile Citrullus colocynthis türleri arasında yer alan bireyler olabileceği düşünülmektedir. 99

113 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Şekil 4.7. SRAP markörleri ile elde edilen dendrogram 100

114 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Oldukça fazla sayıda alt gruba sahip 2.2.A2 grubuna bakıldığında Citrullus lanatus var. lanatus genotiplerinin tamamının bu grupta yer aldığı ve her ne kadar morfolojik özellikler açısından çok çeşitli olsalar da genetik olarak birbirine yakın oldukları tespit edilmiştir. Crimson Sweet, Crimson Tide, Celebration ve Bolkan F1 ticari çeşitleri de bu genotiplerlerle aynı gurupta yer almıştır. Çalışmada yer alan 4 adet Citrullus lanatus var. citroides genotipi (PI , PI , PI , Kar 26) 2.2.B alt grubunu oluşturmuştur. Bu alt grup da kendi içerisinde genetik benzerlik oranı 0.66 olan PI ve Kar 26 genotiplerini içeren 2.2.B1 ve genetik benzerlik oranı 0.76 olan PI ile PI genotiplerini içeren 2.2.B2 alt gruplarına ayrılmıştır. Kümeleme (Cluster) analizi ile genotiplerin türlerine göre gruplanmaları ve bu grupların hem birbirleriyle hem de kendi aralarında ortaya konan genetik ilişkiler daha önce bu konuda yapılan çalışmalarla (Jarret ve ark., 1997; Levi ve ark., 2000, 2001a, 2005) uyumlu bulunmuştur. Dendrogramdan elde edilen veriler ışığında karpuz genotiplerinin yer aldıkları türler bazında gruplandığı ve grupların oluşmasında coğrafi orijinlerinin etkili olmadığı belirlenmiştir. Ferriol ve ark. (2004b) tarafından SRAP ve SSR markörleriyle Cucurbita maxima da genetik çeşitliliğin araştırıldığı çalışmada da benzer şekilde genotiplerin coğrafi orijin ve morfolojik özelliklerine göre gruplanmadığı bildirilmiştir. SRAP analizleri sonucunda benzerlik indeksleri ile dendrogram arasındaki kofenetik korelasyon katsayısı 0.99 olarak tespit edilmiştir ki, bu değer benzerlik indeksleri ile dendrogram arasındaki korelasyonun çok yüksek olduğunu göstermektedir. Mohammadi ve Prasna (2003), bu katsayının 0.9 değerine eşit ve büyük olması halinde benzerlik indeksleri ile elde edilen dendrogram arasında çok yüksek bir korelasyonun olduğunu ve dendrogramın benzerlik indeksini çok iyi temsil ettiğini bildirmişlerdir. Çalışmadan elde edilen bu sonuç da farklı araştırmalarla uyumlu bulunmuştur. Budak ve ark. (2004a), tarafından çimde yapılan bir çalışmada da SRAP analizleriyle elde edilen dendrogram ve benzerlik indeksi arasındaki kofenetik korelasyon katsayısı 0.92 bulunmuş ve aralarında güçlü 101

115 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ bir ilişkinin olduğu belirlenmiştir. Benzer şekilde kofenetik korelasyon katsayısı Ferriol ve ark. (2003) tarafından Cucurbita maxima da 0.94 ve Gülşen ve ark. (2007) tarafından da bamyada 0.94 olarak tespit edilmiştir. SSR ve SRAP yöntemleri sonucu elde edilen benzerlik indeksleri arasındaki kofenetik korelasyon katsayısı ise 0.75 olarak bulunmuştur. Bu durum SSR markörleriyle elde edilen allel sayısının (66) SRAP la elde edilen bant sayısına (472) göre daha düşük olmasından kaynaklanmaktadır SRAP Verileriyle Yapılan Temel Koordinat Analizinin Değerlendirilmesi Temel koordinat analizlerinde (Principle Coordinate Analysis) kümeleme (Cluster) analizlerinde kullanılan benzerlik matriksinden yararlanılmış ve iki boyutlu dağılım grafiği SAS (SAS, 2006) programında oluşturulmuştur (Şekil 4.8). Grafiğin birinci boyutu (D1) toplam moleküler varyansın % 20 sini, 2. boyutu (D2) ise %7 sini açıklamıştır. Grafik incelendiğinde 2 ayrı küme oluştuğu (A ve B) görülmüştür. Bu kümelerden büyük olan A kümesi 72 adet (Kar 23, Kar 26, Kar 28, Kar 29, Kar 35, Kar 36, Kar 37, KAR 38, Kar 58, Kar 59, Kar 70, Kar 77, Kar 78, Kar 84, Kar 86, Kar 92, Kar 93, Kar 98, Kar 100, Kar 104, Kar 105, Kar 109, Kar 114, Kar 116, Kar 117, Kar 121, Kar 129, Kar 139, Kar 142, Kar 146, Kar 147, Kar 149, Kar 150, Kar 151, Kar 152, Kar 153, Kar 154, Kar 162, Kar 163, Kar 164, Kar 171, Kar 173, Kar 174, Kar 175, Kar 176, Kar 177, Kar 178, Kar 181, Kar 192, Kar 197, Kar 200, Kar 203, Kar 205, Kar 208, Kar 212, Kar 216, Kar 217, Kar 218, Kar 222, Kar 224, Kar 230, Kar 238, Kar 242, Kar 254, Kar 268, Kar 298, Kar 310, Congo, Charleston Gray, Calhoun Gray, Allsweet, Dixilee) Citrullus lanatus var. lanatus genotipini içermiştir. Bu genotiplerin morfolojik olarak birbirlerinden farklı olmalarına rağmen, aynı küme içerisinde ve çok yakın bir şekilde gruplanmaları aralarındaki genetik varyasyonun düşük olmasından kaynaklanmaktadır. 102

116 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Şekil 4.8. SRAP verileriyle yapılan temel koordinat analizi sonucu elde edilen iki boyutlu grafik İkinci küme B ise yine Citrullus lanatus var. lanatus genotipleri olan Kar 243, Kar 277, Kar 285 ile Crimson Tide, Crimson Sweet, Celebration ve Bolkan gibi ticari çeşitlerden oluşmuştur. Citrullus lanatus var. citroides genotipleri (Kar 26, PI , PI , PI ) Citrullus colocynthis genotipleri (PI ve PI ) ve Citrullus rehmii genotipi (PI ), düzlemde bu iki kümeden ayrı olarak yer almakla birlikte, aynı türe ait genotipler birbirine yakın şekilde konumlanmıştır. Citrullus lanatus var. lanatus ile Citrullus colocynthis melezi olabilecekleri düşünülen Kar 24 ve Kar 25 de Citrullus lanatus var. lanatus genotiplerinin oluşturduğu kümelerden ayrı olarak yerleşmişlerdir. İki Praecitrullus fistulosus genotipi (PI ve PI ) ise tüm Citrullus türlerinden oldukça uzak bir noktada ve birbirine yakın bir şekilde düzlemde yerini almıştır. Temel koordinat analizi sonucu elde edilen iki boyutlu grafik, çalışmada yer alan genotiplerin dağılımında türlerin etkili olduğunu ve Citrullus lanatus var. 103

117 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ lanatus türüne ait genotiplerin düşük polimorfizm nedeniyle birbirine yakın şekilde gruplandığını net bir şekilde açıklamaktadır Karpuz Genotiplerinin Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımlarının Klasik ve Moleküler Yöntemlerle Araştırılması Çalışmada yer alan Türkiye nin farklı bölgelerinden ve farklı ülkelerden toplanan yerel materyaller, açık tozlanan ve hibrit çeşitler ile farklı Citrullus türlerini temsil eden toplam 91 adet genotip, tüm dünyada ve ülkemizde karpuz üretimini sınırlayan en önemli fungal hastalıklardan biri olan Fusarium solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na dayanımlarının araştırılması amacıyla klasik ve moleküler yöntemle test edilmiştir. Çalışmadan elde edilen bulgular iki ana başlık altında sunulmuştur Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımın Klasik Yöntemle Araştırılması Karpuz genotipleri Fusarium solgunluğunun (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) 0, 1 ve 2 no lu ırklarına karşı testlenmiştir. Değerlendirme Barnes (1972) tarafından geliştirilen hastalık değerlendirme skalasına göre yapılmıştır. Skala değerlerini gösteren fide resimleri Şekil 4.9 da sunulmuştur. Değerlendirmede her bir genotipin hastalık oluşum (%) düzeyi hesaplanmıştır. Ortalamaların karşılaştırılmasında Tukey testinden yararlanılmıştır. Genotiplerin dayanıklılık düzeyleri de Barnes (1972) tarafından geliştirilen skalaya göre belirlenmiş ve sonuçlar Çizelge 4.3 de sunulmuştur. 104

118 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ A B C D E Şekil 4.9. Barnes (1972) tarafından geliştirilen hastalık değerlendirme skalası A: 0; hiçbir hastalık belirtisi göstermeyen sağlıklı bitkiler, B: 1; bodurlaşma gösteren bitkiler, C: 2; sararma gösteren bitkiler, D: 3; nekrozlaşma gösteren bitkiler, E: 5; ölü bitkiler 105

119 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Çizelge 4.3. Karpuz genotiplerinin Fusarium oxysporum f.sp. niveum un 0, 1 ve 2 no lu ırklarına karşı reaksiyonları Genotip Irk 0 Irk 1 Irk 2 No HOD DD HOD DD HOD DD Kar a-j MR 45.6 a-m MR 67.3 c-j LR Kar abc MR 52.1 a-g LR 73.3 cde S Kar abc MR 56.9 abc LR 69.4 c-h LR Kar ab MR 58.3 a LR 64.6 c-k LR Kar a-m HR 52.4 a-g LR 73.3 cde S Kar c-q HR 55.0 a-d LR a S Kar a-d HR 50.0 a-j MR 97.3 a S Kar g-s HR 45.0 a-n MR 46.3 mno MR Kar j-s HR 36.1 a-s MR 52.1 j-n LR Kar a-f MR 56.9 abc LR 66.7 c-j LR Kar a-h MR 58.0 ab LR 68.3 c-i LR Kar m-s HR 32.6 dts HR 51.7 c-n LR Kar r-s HR 18.8 q-t HR 48.3 l-o LR Kar p-s HR 40.4 a-s MR 53.5 i-n LR Kar qrs HR 17.1 st HR 60.0 d-m LR Kar h-s HR 25.0 l-s HR 55.0 h-m LR Kar a-g MR 46.7 a-m MR 65.0 c-k LR Kar b-n HR 45.8 a-m MR 68.3 c-i LR Kar b-o HR 45.6 a-m MR 65.0 c-k LR Kar d-r HR 37.1 a-s MR 75.0 cd S Kar a-k MR 36.0 a-s MR 75.0 cd S Kar a-i MR 48.3 a-l MR 75.0 cd S Kar k-s HR 47.2 a-l MR 65.0 c-k LR Kar a-g MR 46.7 a-m MR 66.7 c-j LR Kar a-f MR 50.0 a-j MR 66.7 c-j LR Kar j-s HR 51.7 a-h LR 75.0 cd S Kar b-o HR 54.2 a-e LR 61.1 c-m LR Kar b-n HR 43.2 a-p MR 73.3 cde S Kar a-e MR 54.9 a-e LR 75.0 cd S Kar a-i MR 48.3 a-l MR 75.0 cd S Kar b-p HR 49.3 a-k MR 75.0 cd S Kar j-q HR 51.1 a-i LR 68.3 c-i L Kar j-s HR 36.7 a-s MR 60.0 d-m LR Kar m-s HR 40.0 a-s MR 60.8 d-m LR Kar a-l MR 50.0 a-j MR 75.0 cd S Kar a-m HR 41.9 a-q MR 68.3 c-i LR Kar f-s HR 40.0 a-s MR 64.7 c-k LR Kar i-s HR 43.3 a-p MR 71.7 c-g S Kar a LR 42.4 a-p MR 68.3 c-i LR Kar n-s HR 31.5 e-s HR 67.0 c-j LR Kar m-s HR 41.7 a-q MR 75.0 cd S Kar a-i MR 41.7 a-q MR 70.0 c-h LR Kar l-s HR 30.0 f-s HR 73.6 cde S Kar b-q HR 35.8 a-s MR 76.7 bc S Kar b-p HR 55.0 a-d LR 73.3 cde S Kar a-m HR 42.4 a-p MR 73.3 cde S Kar b-p HR 43.3 a-p MR 75.0 cd S Kar ab LR 53.1 a-f LR 71.7 c-g S 106

120 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Çizelge 4.3. Devamı Genotip Irk 0 Irk 1 Irk 2 No HOD (%) DD HOD (%) DD HOD (%) DD Kar p-s HR 21.7 n-t HR 65.0 c-k LR Kar f-s HR 31.7 d-s HR 71.9 c-f S Kar g-s HR 46.7 a-m MR 61.9 c-m LR Kar b-p HR 44.4 j-e MR 63.3 c-l LR Kar ab LR 50.0 a-o MR 75.0 cd S Kar d-r HR 41.4 a-r MR 68.5 c-i LR Kar g-s HR 40.3 a-s MR 73.3 cde S Kar e-s HR 27.8 i-s HR 61.7 c-m LR Kar a-l MR 40.7 a-r MR 71.7 c-g S Kar qrs HR 29.2 g-s HR 63.3 c-l LR Kar o-s HR 26.4 k-s HR 66.7 c-j LR Kar a-i MR 51.7 a-h LR 75.0 cd S Kar h-s HR 29.7 f-s HR 68.5 c-i LR Kar o-s HR 38.3 a-s MR 71.7 c-g S Kar e-s HR 45.0 a-n MR 75.0 cd S Kar a-g MR 50.4 a-i MR 62.5 c-l LR Kar f-s HR 38.9 a-s MR 71.7 c-g S Kar p-s HR 18.2 rst HR 33.5 o HR Kar h-s HR 33.3 d-s HR 56.1 g-m LR Kar j-q HR 35.0 a-s HR 73.3 cde S PI d-s HR 48.8 a-k MR 39.3 no HR Kar g-s HR 45.0 a-n MR 66.7 c-j LR Kar d-r HR 29.8 f-s HR 67.3 c-j LR Kar i-s HR 50.0 a-j MR 72.9 cde S Kar a-l MR 48.3 a-l MR 75.0 cd S Kar h-s HR 30.0 f-s HR 73.3 cde S Kar p-s HR 25.0 l-s HR 56.7 f-m LR Kar m-s HR 35.0 a-s HR 65.0 c-k LR Kar i-s HR 34.7 b-s HR 60.4 d-m LR Kar i-s HR 26.7 j-s HR 58.3 e-m LR Kar i s HR 23.6 m-s HR 60.0 d-m LR Kar m-s HR 20.1 p-t HR 72.2 c-f S Kar qrs HR 21.5 o-t HR 52.4 j-n LR Kar o-s HR 28.3 h-s HR 67.2 c-j LR Kar c-q HR 33.3 d-s HR 50.0 k-n LR Kar e-s HR 28.3 h-s HR 73.3 cdn S Kar e-s HR 34.4 c-s HR 66.7 c-j LR PI s HR 0.0 t HR 2.4 p HR Crimson Sweet 20.5 h-s HR 28.5 h-s HR 95.2 a S Crimson Tide 12.1 n-s HR 31.7 d-s HR 66.7 ab LR Crisby 8.3 p-s HR 28.6 h-s HR 91.7 d-m S Celebration 9.0 p-s HR 18.9 q-t HR 60.0 d-m LR Bolkan 18.5 i-s HR 30.0 f-s HR 73.6 cde S Ortalama LSD% HOD: Hastalık oluşum düzeyi; DD: Dayanıklılık düzeyi; S: Duyarlı; LR: Düşük düzeyde dayanıklı; MR: Orta düzeyde dayanıklı; HR: Yüksek düzeyde dayanıklı 107

121 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Irk 0 için hastalık oluşum düzeyi ortalama % 25.9 olarak tespit edilmiştir. Genotipler arasında en düşük hastalık oluşum değeri (% 3.6) her 3 ırka da dayanıklı olarak bilinen PI dan elde edilirken, en yüksek değer (% 56.7) Diyarbakır ın Sürme olarak adlandırılan yerel materyali Kar 153 den elde edilmiştir. Kar 77 (% 8.3), Kar 84 (% 6.7), Kar 208 (% 6.6) ve Kar 324 (% 7.1) oldukça düşük hastalık oluşum düzeylerine sahip genotiplerken, Kar 175 (% 50.7) ve Kar 192 (% 51) ise hastalık oluşum düzeyi bakımından yüksek değerlere sahiptir. Genotipler ırk 1 için değerlendirildiğinde hastalık oluşum düzeyinin ortalama % 39.4 olduğu görülmüştür. En düşük değer (% 0) ırk 0 da olduğu gibi PI genotipine aitken, en yüksek değer (% 58.3) ise bir Citrullus lanatus var. citroides genotipi olan Kar 26 genotipine aittir. Kar 84 (% 17.1), Kar 230 (% 18.2) ve Kar 77 (% 18.8) hastalık oluşum düzeyi düşük genotipler olarak tespit edilmiştir. Genotiplerin ırk 2 ye karşı reaksiyonlarına bakıldığında, ortalama hastalık oluşum düzeyinin en yüksek değeri (% 67.0) aldığı görülmektedir. Genotipler arasında en düşük hastalık oluşum düzeyi PI dan elde edilirken (% 2.4), en yüksek düzey % 100 ile Kar 35 kodlu Sugar Baby çeşidine aittir. Koyu yeşil kabuk rengi ve iri tohumlara sahip yerel bir genotip olan Halep Karası (% 97.3) ile açık tozlanan bir çeşit olan Crimson Sweet (% 95.2) de hastalık oluşum düzeyi yüksek olarak tespit edilen genotipler olmuşlardır. Antakya dan toplanan Kar 231 (% 33.5) ve PI (% 39.3) ise hastalık oluşum düzeyi düşük genotipler olarak dikkati çekmektedir. Genotipler dayanıklılık düzeyleri bakımından incelendiğinde ırk 0 için hiçbiri duyarlı (S) bulunmamıştır. Üç adet genotip Kar 153, Kar 175 ve Kar 192 düşük düzeyde dayanıklı (LR) iken, genotiplerin % 20.9 u orta düzeyde dayanıklı (MR) ve % 75.8 i yüksek düzeyde dayanıklı (HR) olarak belirlenmiştir. Irk 1 için ise, ırk 0 da olduğu gibi genotiplerin hiçbiri duyarlı (S) olarak tespit edilmemiştir. Genotiplerin % 15.4 ü düşük düzeyde dayanıklı (LR) iken, % 47.3 ü orta düzeyde duyarlı (MR) ve % 37.4 ü yüksek düzeyde dayanıklı (HR) olarak bulunmuştur. Irk 2, ırklar içerisinde en agresif ırk olarak belirlenmiştir. Genotiplerin % 41.8 i duyarlı (S), % 53.8 i düşük düzeyde dayanıklı (LR), % 1.1 i orta düzeyde dayanıklı (MR) ve % 3.3 ü yüksek düzeyde dayanıklı (HR) olarak tespit edilmiştir. 108

122 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Fusarium oxysporum f.sp. niveum un tanımlanan 3 ırkı (0, 1, 2) arasında ırk 0 virülensliği düşük bir ırk olup, dayanıklılık genlerine sahip olmayan eski çeşitlerde solgunluğa sebep olmakta iken; ırk 1, ırk 0 dan daha virülenttir ve hafif-orta düzeyde solgunluklara neden olur. Irk 2 nin ise en agresif ırk olduğu belirlenmiştir ve günümüzde dayanıklı olarak bilinen pek çok çeşidi önemli düzeyde etkilemektedir (Netzer, 1976; Martyn ve Netzer, 1991; Wehner, 2008). Zhou ve ark. (2010) tarafından tüm 3 ırktan daha agresif 4. bir ırk (ırk 3) da tanımlanmıştır. Her 3 ırka da dayanıklılık sadece PI (Netzer ve Martyn, 1989) ve PI (Dane ve ark., 1998) genotiplerinden elde edilmiştir. Özetle, denemede yer alan tüm genotiplerin ırk 0 a karşı ırk 1 ve ırk 2 den daha dayanıklı oldukları belirlenmiştir. Irk 0 ve ırk 1 e dayanıklı genotiplerin ise aynı performansı ırk 2 için göstermedikleri açıkça görülmüş, bu sonuç farklı karpuz çeşitlerinin Fusarium solgunluğunun 3 ırkına (0, 1 ve 2) karşı verdikleri reaksiyonun araştırıldığı birçok çalışmayla uyumlu bulunmuştur. Ay (2008) ın, Adana ve Mersin illerinde Fusarium solgunluğuna neden olan ırkların tespiti ve bu bölgelerde yoğun olarak yetiştirilen karpuz çeşitlerinin Fusarium ırklarına karşı dayanımlarının belirlenmesi amacıyla yaptığı çalışmada tüm çeşitlerin ırk 2 ye karşı daha duyarlı olduğu tespit edilmiştir. Benzer şekilde Filiz ve Turhan (1991) ın yılında yaptığı çalışmada da denemede yer alan tüm karpuz çeşitlerinin ırk 2 ye karşı duyarlı olduğu bildirilmiştir. Tez çalışması kapsamında değerlendirilen ticari çeşitlerin (Crimson Tide Fı, Crisby Fı, Celebration Fı, Bolkan Fı ve Crimson Sweet) tamamı ırk 0 ve ırk 1 e karşı yüksek düzeyde dayanıklı (HR) iken, ırk 2 ye karşı duyarlı (S) veya düşük düzeyde dayanıklı (LR) olarak tespit edilmiştir. Yücel ve ark. (1999) tarafından yapılan bir diğer çalışmada ise 19 karpuz çeşidi 3 ırka karşı test edilmiş ve elde edilen sonuçta tümünün ırk 0 ve ırk 1 e yüksek veya orta düzeyde dayanıklı, ırk 2 ye ise düşük düzeyde dayanıklı veya duyarlı olduğu ortaya konmuştur. Son yıllarda Kurt ve ark. (2008) nın yaptığı bir araştırmada ise Doğu Akdeniz ve Güneydoğu Anadolu bölgelerinin karpuz ekim alanlarından elde edilen izolatların ırk tayinleri yapılmış ve her 3 ırkın ırk ayırıcı çeşitlerde oluşturduğu hastalık oluşum düzeyleri incelenmiştir. 109

123 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Irk 0 tüm çeşitlerde ortalama % 29.5, ırk 1 % 47.1 ve ırk 2 % 64.1 düzeyinde hastalık oluşumuna neden olmuştur Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımın Moleküler Yöntemle Araştırılması Karpuzlarda Fusarium oxysporum f.sp. niveum un 1 no lu ırkına dayanıklılık geni ile bağlantılı OPP01/700 RAPD markörü, yabani karpuz türü Citrullus lanatus var. citroides genotipi olan PI de Xu ve ark. (1999) tarafından geliştirilmiştir. Tez çalışması kapsamında yer alan toplam 93 adet genotipin fusariumun 1 no lu ırkına karşı dayanıklı olanlarını seçmek amacıyla OPP01 RAPD primeri ile tüm genotipler moleküler olarak taranmıştır. Elde edilen jel görüntüleri Şekil 4.10 da sunulmuştur. Tarama neticesinde Citrullus lanatus var. lanatus genotipleri olan Kar 26 ve PI da 700 bp de bant verirken, çalışmada yer alan ve ırk 1 e karşı dayanıklı olarak tespit edilen diğer genotiplerde (Kar 70, Kar 77, Kar 84, Kar 86, Kar 154, Kar 163, Kar 176, Kar 177, Kar 203, Kar 208, Kar 212, Kar 216, Kar 230, Kar 232, Kar 233, Kar 237, Kar 242, Kar 243, Kar 254, Kar 268, Kar 277, Kar 285, Kar 298, Kar 324 (PI ), Kar 327 (PI ), Kar 330 (PI ), Kar 331(PI ), Kar 333 (PI ), PI , Kar 235 (Charleston Gray), Kar 39 (Crimson Sweet), Crimson Tide, Crisby, Celebration ve Bolkan) ve markörün geliştirildiği Kar 234 (PI ) de bu bant elde edilememiştir. Bu durumun nedenleri olarak referans çalışmada (Xu ve ark., 1999) kullanılan genotiplerden farklı genotiplerde taramanın yapılması, PI genotipine ait tohumların farklı kaynaklardan elde edilmesi, RAPD primerlerinin hedeflenmeyen DNA sekanslarını çoğaltması ve tekrarlanabilirlik seviyesinin düşüklüğü gösterilebilir. Fusariuma dayanıklılığın klasik ve moleküler yöntemlerle karşılaştırmalı olarak belirlendiği bazı çalışmalarda da benzer sonuçlar elde edilmiştir. 110

124 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Şekil RAPD primeri OPP01 ile yapılan tarama sonucu elde edilen agaroz jel görüntüleri 111

125 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ Şekil Devamı Örneğin kavunda (Cucumis melo L.) Şensoy ve ark. (2007) tarafından yapılan çalışmada Türkiye nin farklı yerlerinden toplanan 56 genotip, 5 lokal çeşit ve 18 yabancı genotipten oluşan toplam 79 adet genotipin Fusarium oxysporum f.sp. melonis in 1 no lu ırkına karşı reaksiyonları klasik test ve RAPD (E07 ve G17 ve 596) markörleriyle belirlenmiştir. Primerlerden 596 nın MR1 dayanıklı genotipinde bulunan ve Fom 2 genine 2 cm yakınlıkta markör oluşturduğu Zheng ve Wolff 112

126 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ (2000) tarafından bildirilmiş olsa da, 596 dan kaliteli bantlar oluşturmadığı ve daha sonraki tekrarlamalarda bu primerden hiç bant elde edilemediği için değerlendirilmeye alınamadığı bildirilmiştir. E07 primeri 1.25 kb, G17 primeri ise 1.0 kb büyüklüğünde tekrarlanabilir bantlar oluşturmuştur. Klasik test sonuçlarıyla karşılaştırıldığında yanlış eşleşme oranı (mismatch ratio) E07 primeri için % 5.06, G17 primeri içinse % olarak bulunmuştur. Sonuç olarak E07 markörünün Türkiye kavunlarında moleküler tarama için kullanılabileceği bildirilmiştir. Genetik materyalin Fusarium solgunluğuna dayanıklılığının değerlendirilmesinde yapay inokulasyon yöntemlerinden yararlanılmaktadır, ancak bu yöntemler hem zaman alıcı hem de yoğun emek gerektiren işlemlerdir. Değerlendirmenin sararma, solma, ölüm gibi dıştan gözlenebilecek simptomların gelişmesine bağlı olması nedeniyle bazı durumlarda duyarlı bitkilerin belirlenmesinde sorunlar olabilmektedir (Burger ve ark., 2003). Dayanıklılık genine sıkı bağlı DNA markörlerinin belirlenmesi ve kullanımı ile bahsedilen bu problemler ortadan kaldırılarak ıslah programlarına yardımcı olunabilecektir.. Kavun (Wechter ve ark., 1995; Zheng ve Wolff; 2000; Oumouloud ve ark., 2008); patlıcan (Mutlu ve ark., 2008); muz (Lin ve ark., 2009b) gibi farklı bitki türlerinde ve karpuzda (Xu ve ark., 1999; 2000; Lin ve ark., 2009a) Fusarium solgunluğuna dayanıklılığı spesifik olarak belirleyebilecek moleküler markörlerin geliştirilmesi konusunda pek çok araştırma yapılmış olup, günümüzde de devam etmektedir. 113

127 4. BULGULAR ve TARTIŞMA İlknur SOLMAZ 114

128 5. SONUÇLAR ve ÖNERİLER İlknur SOLMAZ 5. SONUÇLAR ve ÖNERİLER Karpuz, Cucurbitaceae familyasının ekonomik öneme sahip türlerinden birisidir (Jeffrey, 1990). Özellikle sıcak yaz aylarında serinletici etkisiyle son derece popüler bir sebze olan karpuz, Türkiye de hemen hemen her bölgede yetiştirilmekle birlikte, en fazla ticari üretim, erkencilik potansiyeline sahip Akdeniz Bölgesi nde (Adana) yapılmaktadır. Üretimde yabancı kökenli hibrit çeşitlerin hakimiyeti söz konusudur. Türkiye coğrafi konumu gereği bitkisel gen kaynakları bakımından son derece zengin ve önemli bir ülkedir (Küçük ve ark., 2002). Karpuzun gen merkezi olmamasına rağmen birçok bölgede, bazıları günümüzde yok olmuş değerli genotipler ve lokal çeşitler bulunmaktadır. Ancak bu değerli kaynaklar gerek ekonomik, gerekse çevre ve diğer baskıların da etkisiyle azalma, hatta yok olma tehlikesiyle karşı karşıyadırlar. Genetik kaynaklar ileride ıslah çalışmalarında kullanılabilecek yararlı genleri içermeleri bakımından oldukça önemli bir potansiyele sahiptirler. Bu nedenle korunmaları, toplanmaları, kaydedilmeleri, tanımlanmaları, morfolojik ve genetik olarak karakterize edilmeleri gerekli olup, ayrıca biyotik ve abiyotik stres koşullarına, hastalık ve zararlılara dayanımları da araştırılmalıdır. Karpuz, Türkiye için önemli bir sebze ve genetik kaynaklar da sürdürülebilir tarımın doğal rezervleri olmasına rağmen ülkemizde karpuz genetik kaynakları konusunda yapılmış çalışma sayısı son derece sınırlıdır. Bu araştırma kapsamında ise Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü karpuz genetik kaynak koleksiyonunda yer alan, farklı bölgeleri temsil eden, özellikle meyve karakterleri (meyve şekli, meyve büyüklüğü, meyve kabuk rengi, meyve kabuk deseni, meyve et rengi, tohum büyüklüğü, tohum rengi ve deseni) bakımından çeşitlilik gösteren genotiplerden 93 adedi çekirdek koleksiyon seçilmiş ve bunlar arasındaki genetik çeşitlilik SSR ve SRAP moleküler markörleri ile araştırılmıştır. Ayrıca genotiplerin Fusarium solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na karşı dayanımları da klasik ve moleküler yöntemlerle belirlenmeye çalışılmıştır. 115

129 5. SONUÇLAR ve ÖNERİLER İlknur SOLMAZ Araştırmada elde edilen sonuçlar aşağıda maddeler halinde özetlenmiştir. 1. Genotipler arasındaki genetik çeşitliliğin belirlenmesinde 14 adet SSR primeri ve 31 adet SRAP primer kombinasyonu kullanılmış ve bu primerlerin polimorfizm seviyelerinin oldukça yüksek olduğu belirlenmiştir. 2. Elde edilen polimorfizm oranı bakımından her iki markör tekniği benzer değerler vermiştir. En yüksek polimorfizm oranı % 100 ile SSR tekniğinden elde edilirken, SRAP tekniğinden elde edilen polimorfizm oranı ise % 97.3 olmuştur. SSR tekniğinde elde edilen toplam 66 allelin tamamının, SRAP tekniğinde ise elde edilen 472 bantın 461 inin polimorfik olduğu saptanmıştır. 3. SSR analizlerinde lokus başına düşen toplam allel sayısı 2 ile 7 (ortalama 4.7) arasında, polimorfik bant sayısı da yine 2 ile 7 (ortalama 4.7) arasında değişmiştir. SRAP analizlerinde ise primer başına elde edilen toplam bant sayısı (ortalama 15.2) arasında, primer başına elde edilen toplam polimorfik bant sayısı ise 8-25 (ortalama 14.9) arasında bulunmuştur. 4. SSR analizleri sonucunda genotipler arasındaki benzerlik indeksi değerleri 0.00 ile 1.00 arasında değişmiştir. Benzerlik indeksi açısından birbirine en yakın genotipler 1.00 değeri ile Kar 78 ile Kar 200, Kar 86 ile Kar 162, Kar 154 ile Kar 162, Kar 162 ile Kar 171 iken; Praecitrullus fistulosus genotipleri olan PI (Kar 331) ve PI (Kar 333), çalışmada yer alan Citrullus cinsine ait genotiplerin yaklaşık tamamına en uzak genotipler olarak belirlenmiştir. 5. SRAP analizlerinde ise genotipler arasındaki benzerlik indeks değeri 0.18 ile 0.97 arasında değişmiştir. Genetik benzerlik açısından birbirine en yakın genotiplerin 0.97 benzerlik indeksi değeri ile Kar 142 ile Kar 146 ve Kar 146 ile Kar 152 olduğu görülmüştür. Genetik olarak en uzak genotipler ise 0.18 benzerlik indeksi değeri ile Praecitrullus fistulosus genotipi PI ile Citrullus colocynthis genotipleri olan PI (Kar 318) ve PI (Kar 319) dir. 6. SSR analizleri sonucu oluşturulan dendrogramda genotipler arasındaki genetik benzerlik oranının 0.02 ile 1.00 arasında değiştiği tespit edilmiştir. Kar 78 ile Kar 100 ve Kar 86 ile Kar 162 hariç, diğer tüm genotiplerin ve çeşitlerin birbirinden ayrıldığı saptanmıştır. SRAP analizleri sonucu oluşturulan dendrogramda da genotiplerin genetik benzerlik oranlarının 0.22 ile 0.97 arasında değiştiği ve tüm 116

130 5. SONUÇLAR ve ÖNERİLER İlknur SOLMAZ genotiplerin başarıyla birbirinden ayrıldığı tespit edilmiştir. SSR ve SRAP markörlerinden elde edilen verilerle ayrı ayrı yapılan kümeleme analizlerinin her ikisinde de Türkiye den toplanan genotiplerin birlikte gruplandığı ve kendi içlerinde de alt gruplar oluşturduğu görülmüştür. Bu grupların oluşmasında morfolojik özelliklerin ve coğrafi orijininin herhangi bir etki yaratmadığı saptanmıştır. 7. SSR da Temel Koordinat Analizi sonucu elde edilen iki boyutlu grafiğin birinci boyutu (D1) toplam moleküler varyansın % ini, 2. boyutu (D2) ise % ini açıklarken, SRAP ta birinci boyut (D1) % 20 sini 2. boyut (D2) da % 7 sini açıklamıştır. 8. Karpuz genotiplerinin Fusarium solgunluğu na (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) dayanımlarının klasik inokulasyon yöntemiyle (pipet yöntemi) belirlendiği çalışmada, ortalama hastalık oluşum düzeyleri ırk 0 da % 25.9, ırk 1 de % 39.4 ve ırk 2 de % 67.0 olarak tespit edilmiştir. 9. Karpuzlar dayanıklılık düzeyleri bakımından değerlendirildiğinde ırk 0 için 3 adedi düşük düzeyde dayanıklı (LR), 19 adeti orta düzeyde dayanıklı (MR) ve 69 adeti yüksek düzeyde dayanıklı (HR) bulunurken, duyarlı (S) genotipe rastlanılmamıştır. Irk 1 içinse, 14 genotip düşük düzeyde dayanıklı (LR), 43 adet genotip orta düzeyde dayanıklı (MR) ve 34 adet genotip de yüksek düzeyde dayanıklı (HR) olarak bulunmuş olup, genotipler arasında ırk 0 da olduğu gibi duyarlı (S) genotip tespit edilmemiştir. Irk 2 için genotipler arasından 38 adedi duyarlı (S), 49 adedi düşük düzeyde dayanıklı (LR), 1 adedi orta düzeyde dayanıklı (MR) ve 3 adedi de (% 3.29) yüksek düzeyde dayanıklı (HR) olarak tespit edilmiştir. Genel bir değerlendirme yapacak olursak denemede yer alan tüm genotiplerin ırk 0 a karşı ırk 1 ve ırk 2 den daha dayanıklı oldukları, en agresif ırkın ise ırk 2 olduğu belirlenmiştir. 10. Tez çalışması kapsamında toplam 93 adet genotipin Fusarium solgunluğunun 1 no lu ırkına karşı dayanıklı olanlarını seçmek amacıyla RAPD OPP01/700 primeriyle moleküler olarak tarama yapılmıştır. Genotipler arasında Kar 26 ve PI dışında bu banta (700 bp) sahip bir genotip tespit edilememiştir. DNA seviyesinde polimorfizmin belirlenmesini sağlayan moleküler markör teknikleri son yıllarda hızla gelişmiştir ve genetik kaynak koleksiyonlarının 117

131 5. SONUÇLAR ve ÖNERİLER İlknur SOLMAZ değerlendirilmesinde yoğun bir şekilde kullanılmaktadırlar. Karpuzlarda DNA markörleri ile genetik çeşitliliğin araştırıldığı pek çok çalışma yapılmış ancak morfolojik olarak birbirinden çok farklı olan kültür karpuzlarının genetik olarak polimorfik bir yapı sergilemediği bildirilmiştir. Karpuzlarda morfolojik çeşitliliğe etki eden gen bölgelerinin kullanılan bu markör sistemleri ile amplifiye olamama olasılığı da düşük polimorfizmin nedenlerinden olabilir. Bu çalışma ile Türkiye nin farklı bölgelerinden toplanan karpuzlarda genetik çeşitlilik ilk kez moleküler olarak SSR ve SRAP markör teknikleri ile araştırılmıştır. Sonuç olarak her ne kadar morfolojik özellikler açısından çok farklı olsalar da kültürü yapılan Citrullus lanatus var. lanatus alt türünde yer alan bu genotiplerin genetik olarak yüksek düzeyde polimorfizme sahip olmadıkları saptanmıştır. Bu durumun Türkiye nin karpuzun gen merkezinden uzak olmasından ve yabani formların ülkemizde yetişmemesinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Elde edilen veriler, karpuzlarda genetik çeşitlilik konusunda yapılacak çalışmalara önemli bir kaynak olup, yol gösterecektir. Bundan sonra yapılacak çalışmalarda karpuzlarda meyve kalitesini ve hastalıklarını kontrol eden genlerin haritalanması ve bu genlerle bağlantılı markörlerin geliştirilerek ıslahta kullanımı üzerinde durulmalıdır. Genetik kaynak koleksiyonunda yer alan karpuz genotiplerinin morfolojik ve genetik çeşitliliğinin araştırılmasının yanı sıra fungal, bakteriyel ve virüs kökenli hastalıklar ile abiyotik stres koşullarına dayanımları da incelenmelidir. Böylece koleksiyon tüm özellikleri bakımından değerlendirilir ve gelecekte planlanan ıslah programlarında daha etkin kullanıma olanak sağlanır. 118

132 KAYNAKLAR AKA-KAÇAR, Y., Türkiyede Yetiştirilen Önemli Kiraz (Prunus avium L.) ve Vişne (Prunus cerasus L.) Çeşit ve Tiplerinin DNA Parmak İzi Yöntemi ile Sınıflandırılması. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, Doktora Tezi, Adana, 192 s. ANONYMOUS, 2008a. FAOSTAT. Statistic Database. ANONYMOUS, 2008b. AY, T., Çukurova da Karpuz Fusarium Solgunluğu Etmeni Fusarium oxysporum f.sp. niveum Irklarının ve Bu Irklara Karşı Karpuz Çeşitlerinin Reaksiyonlarının Belirlenmesi. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi, Adana, 32 s. BARNES G.L., Differential Pathogenicity of Fusarium oxysporum f.sp. niveum to Certain Wilt Resistant Watermelon Cultivars. Plant Dis. Rep., 56: BATES, D.M., ROBINSON, R.W., Cucumbers, Melons and Water-Melons: (Cucumis and Citrullus (Cucurbitaceae) In: Smartt J, Simmonds NW (ed.) Evolution of Crop Plants, 2 nd Edn. Longman Scientific, Harlow, Essex, UK, BILES, C.L., MARTYN, R.D., Local and Systemic Resistance Induced in Watermelons by Formae Speciales of Fusarium oxysporium. Phytopatology : , MARTYN, R.D., WILSON, H.D., Isozymes and General Proteins from Various Watermelon Cultivars and Tissue Types. HortScience, 24: BLANCARD, D., LECOQ, H., PITRAT, M., Maladies des Cucurbitaceaes INRA, 292 p. BOYHAN, G.E., LANGSTON, D.B., GRANBERRY, D.M., LEWIS, P.M., LINTON, D.O., Resistance to Fusarium Wilt and Root-Knot Nematode in Watermelon Germplasm. Cucurbit Genetics Cooperative Report, 26:

133 BUDAK, H., SHERMAN, R.C., PARMAKSIZ, L., GAUSSOIN, R.E., RIORDAN, T.P.,DWEIKAT, I., 2004a. Molecular Characterization of Buffalograss Germplasm Using Sequence-Related Amplified Polymorphism Markers. Theor. Appl. Genet., 108: BUDAK, H., SHERMAN, R.C., PARMAKSIZ, I., DWEIKAT., 2004b. Comparative Analysis of Seeded and Vegetative Biotype Buffalograsses Based on Phylogenetic Relationship Using ISSRs, SSRs, RAPDs and SRAPs. Theor. Appl. Genet., 109: BURGER, Y., KATZIR, N., TZURI, G., PORTNOY, V., SAAR, U., SHRIBER, S., PERI-TREVES, R., COHEN, R., Variation in the Response of Melon Genotypes to Fusarium oxysporum f. sp. melonis Race 1 Determined by Inoculation Tests and Molecular Markers. Plant. Pathol., 52: BURKILL, H.M., The Useful Plants of West Tropical Africa. Vol nd ed. Royal Botanic Gardens, Kew. BÜYÜKÜNAL BAL, E.B., Arpa Mikrosatellitlerinin Ekmeklik Buğdaydaki Genetik Çalışmalar için Kullanım Olanaklarının Araştırılması. KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi., 6(2): CAPELLI, C., STRAVATO, V.M., ROTINO, G.L., BOUNAURIO, R., Source of Resistance Among Solanum spp. to an Italian Isolate of Fusarium oxysporum f. sp. melongenae. IX th Eucarpia Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum and Eggplant, Budapest, Hungary, CHE, K., LIANG, C., WANG, Y., JIN, D., WANG, B., Genetic Assesment of Watermelon Germplasm Using the AFLP Technique. Hortscience, 38 (1): CHEN, K.S., LIOU, T.D., CHANG, P.F.L., HUANG, J.W., Selection for Resistance of Watermelon Varieties (lines) to Fusarium wilt and Their Genetic Analysis of Inheritance. Plant Pathology Bulletin, 12(3): CHIBA, N., SUWABE, K., NUNOME, T., HIRAI, M., Development of Microsatellite Markers in Melon (Cucumis melo L.) and Their Application to Major Cucurbit Crops. Breeding Science, 53: CRAVERO, V., MARTIN, E., COINTRY, E., Genetic Diversity in Cynara 120

134 cardunculus Determined by Sequence-Related Amplified Polymorphism Markers. JASHS, 132(2): DANE, F., HAWKINS, L.K., NORTON, J.D., New Resistance to Race 2 of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in Watermelon. Cucurbit Genet. Coop. Report, 21: , LANG, P., BAKHTIYAROVA, R., Comparative Analysis of Chloroplast DNA Variability in Wild and Cultivated Citrullus Species. Theor. Appl. Genet., 108: , LIU, J., Diversity and Origin of Cultivated and Citron Type Watermelon (Citrullus lanatus). Genet. Resour. Crop. Evol., 54(6): , LIU, J., ZHANG, C., Phylogeography of the Bitter Apple, Citrullus colocynthis. Genet. Resour. Crop. Evol., 54: DANIN-POLEG, Y., REIS, N., TZURI, G., KATZIR, N., Development and Characterization of Microsatellite Markers in Cucumis. Theor. Appl. Genet., 102: DE WINTER, B., A New Species of Citrullus (Benincaseae) from The Namib Desert, Namibia. Bothalia 20: DECKER-WALTERS, D.S., CHUNG, S.M., STAUB, J.E., QUEMADA, H.D., LÓPEZ-SESÉ, A.I., The Origin and Genetic Affinities of Wild Populations of Melon (Cucumis melo, Cucurbitaceae) in North America. Plant. Syst. Evol., 233: DHILLON, N.P.S., RANJANA, R., SINGH, K., EDUARDO, I., MONFORTE, A.J., PITRAT, M., DHILLON, N.K., SINGH, P.P., Diversity Among Landraces of Indian Snapmelon (Cucumis melo var. momordica). Genet. Resour. Crop. Evol., 54: DIENER, A.C., AUSUBEL, F.M., Resistance to Fusarium oxysporum 1, a Dominant Arabidopsis Disease-Resistance Gene, is not Race Specific. Genetics, 171: DODDS, J.H., WATANABE, K., Biotechnological Tools for Plant Genetic Resources Management Diversity, 6:

135 EDWARDS, K., JHONSTONE, C., THOMPSON, C., A Simple and Rapid Method for The Preparation of Plant Genomic DNA for PCR Analysis. Nuc. Acid. Res., 19(6): ESCRIBANO, S., LÁZARO, A., STAUB, J.E., Genetic Diversity of Spanish Melons (Cucumis melo) of The Madrid Provenance. Proceedings of The IX th EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae, INRA, Avignon (France), ESPÓSITO, M. A., MARTIN, E.A., CRAVERO, V.P., COINTRY, E., Characterization of Pea Accessions by SRAP's Markers. Sci. Hort., 113(4): EGEL, D.S., HARIKRISHNAN, R., MARTYN, R., First Report of Fusarium oxysporum f.sp. niveum Race 2 as Casual Agent of Fusarium Wilt of Watermelon in India. Plant Disease, 89(1): 108. FERREIRA, M.E., Molecular Analysis of Genebanks for Sustainable Conservation and Increased Use of Crop Genetic Resources. In Proceedings of the International Workshop on the Role of Biotechnology for the Characterisation and Conservation of Crop, Forestry, Animal and Fishery Genetic Resources. (available at FERREIRA, M.E., The Role of Biotechnology in Exploiring and Protecting Agricultural Genetic Resources. (Editor: J. Ruane and A. Sannino) Food and Agricultural Organization of The United Nations FERRIOL, M., PICO, B., NUEZ, F., Genetic Diversity of A Germplasm Collection of Cucurbita pepo Using SRAP and AFLP Markers. Theor. Appl. Genet., 107: , PICO, B., CORDOVA, P.F., NUEZ, F., 2004a. Molecular Diversity of A Germplasm Collection of Squash (Cucurbita moschata) Determined by SRAP and AFLP Markers. Crop Sci., 44: , PICO, B., NUEZ, F., 2004b. Morphological and Molecular Characterization of Cucurbita maxima Landraces. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 129(1): FİLİZ, N., TURHAN, G., Karpuzlarda Fusarium Solgunluğu Etmeninin 122

136 Reaksiyonları Üzerinde Araştırmalar. VI. Türkiye Fitopatoloji Kongresi Bildirileri, FORSYTH, L.M., SMİTH, L.J.,AITKEN, E.A.B., Identification and Characterization of Non-Pathogenic Fusarium oxysporum Capable of Increasing and Decreasing Fusarium Wilt Severity. Mycol. Res., 110: FREEMAN, S., RODRIGUEZ, R.J., A Rapid Inoculation Technique for Assessing Pathogenicity of Fusarium oxysporum f.sp. niveum and Fusarium oxysporium f.sp. melonis on Cucurbits. Plant Disease, 77(12): FU, X.P., NING, G.G., GAO, L.P., BAO, M.Z., Genetic Diversity of Dianthus Accessions as Assessed Using Two Molecular Marker Systems (SRAPs and ISSRs) and Morphological Traits. Scientia Horticulturae, 117: FUKINO, N., SAKATA, Y., KUNIHISA, M., MATSUMOTO, S., Characterisation of Novel Simple Sequence Repeat (SSR) Markers for Melon (Cucumis melo L.) and Their Use Efor Genotype Identification. Jour. of Hort. Sci. & Biotech., 82(2): , YOSHIOKA, Y., KUBO, N., HIRAI, M., SUGIYAMA, M., SAKATA,Y., MATSUMOTO, S., Development of 101 Novel SSR Markers and Construction of an SSR-Based Genetic Linkage Map in Cucumber (Cucumis sativus L.). Breeding Science, 58: FURSA, T.B., K Sistematike Roda Citrullus Schrad. [On the taxonomy of genus Citrullus Schrad.]. Botanicheski Zhurnal, 57: GARCIA-MAS, J., MONFORTE, A. J., ARÚS, P., Phylogenetic Relationships Among Cucumis Species Based on the Ribosomal Internal Transcribed Spacer Sequence and Microsatellite Markers. Plant. Syst. Evol., 248: GONG, L., STIFT, G., KOFLER, R., PACHNER, M., LELLEY, T., Microsatellites for the Genus Cucurbita and an SSR-Based Genetic Linkage Map of Cucurbita pepo L. Theor. Appl. Genet., 117: GONZALO, M.J., OLIVER, M., GARCIA-MAS, J., MONFORT, A., DOLCET- SANJUAN, R., KATZIR, N., ARÚS, P., MONFORTE, A.J.,

137 Simple-Sequence Repeat Markers Used in Merging Linkage Maps of Melon (Cucumis melo L.). Theor. Appl. Genet., 110: GUERRA-SANZ, J.M., Citrullus Simple Sequence Repeats Markers from Sequence Databases. Moleculer Eccology Notes, 2: GULSEN, O., SHERMAN, R.C., VOGEL, K.P., LEE, D.J., BAENZIGER, P. S., HENG-MOSS, T.M., BUDAK, H., Nuclear Genome Diversity and Relationships Among Naturally Occurring Buffalograss Genotypes Determined by Sequence-Related Amplified Polymorphism. HortScience, 40: , KARAGUL, S., ABAK, K., Diversity and Relationships Among Turkish Okra Germplasm by SRAP and Phenotypic Marker Polymorphism. Biologia Bratislava, 62(1): , SEVER-MUTLU, S., MUTLU, N., TUNA, M., KARAGUZEL, O., SHEARMAN, R.C., RIORDAN, T.P., HENG-MOSS, T.M., Polyploidy Creates Higher Diversity Among Cynodon Accessions as Assessed by Molecular Markers. Theor. Appl. Genet. 118: GUNER, N., WEHNER., T.C., The Genes of Watermelon. HortScience, 39 (6): GUO, D.L., LUO, Z.R., Genetic Relationships of Some PCNA Persimmons (Diospyros kaki Thunb.) from China and Japan Revealed by SRAP Analysis. Genetic. Resour. Crop. Evol., 53: GUPTA, P.K., VARSHNEY, R.K., The Development and Use of Microsatellite Markers for Genetic Analysis and Plant Breeding with Emphasis on Bread Wheat. Euphytica, HARRIS, K.R., WECHTER, W.P., LANINI, B., VIVODA, E., LEVI, A., In Search of Markers Linked to Fusarium Wilt Race 1 Resistance in Watermelon. HortScience, 43(4): HASHIZUME, T., SKIMAMOTO, I., HARUSHIMA, Y., YUI, M., SATO, T., IMAI, T., HIRAI., M., Construction of A Linkage Map for Watermelon [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai] Using Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Euphytica, 90:

138 ., SKIMAMOTO, I., HIRAI, M., Construction of a Linkage Map and QTL Analysis of Horticultural Traits for Watermelon [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai] Using RAPD, RFLP and ISSR Markers. Theor. Appl. Genet.. 106(5): HAWKINS, L.K., DANE, F., KUBISIAK, T.L., RHODE, B.B., JARRET, R.L., Linkage Mapping in A Watermelon Population Segregating for Fusarium Wilt Resistance. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 126: HOPKINS, D.L., ELMSTROM, G.W., Evaluation of Soil ph and Nitrogen Source on Fusarium Wilt of Watermelon Land Previously Crooped in Watermelons. Proc. Fla. State Hort. Soc., 89: , ELMSTROM, G.W., Fusarium Wilt in Watermelon Cultivars Grown in A 4 Year Monoculture. Plant Dis., 68: INAN, N., Çekirdek Kabaklarında Morfolojik ve Moleküler Karakterizasyon. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoteknoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi, Adana, 70 s. IOANNOU, N., POULLIS, C., Fusarium Wilt Resistant Watermelon Cultivars Associated with A Highly Virulent Local Strain of Fusarium oxysporum f.sp. niveum. Agricultural Research Inst. Minist. of Agric. and Natural Resources. Technical Bulletin 129 Nicosia, Cyprus. JACCARD, P., Nouvelles Reserches sur la Distribution Florale. Bull. Soc. Vaud. Sci. Nat., 44: JARRET, R.L., MERRICK, L.C., HOLMS, T., EVANS, J., ARADHYA, M.K., Simple Sequence Repeats in Watermelon (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai). Genome, 40(4): , NEWMAN, M., Phylogenetic Relationships Among Species of Citrullus and the Placement of C. rehmii De Winter as Determined by Internal Transcribed Spacer (ITS) Sequence Heterogeneity. Genet. Resour. and Crop Evol., 47(2): JEFFREY, C., Further Notes on Cucurbitaceae: III. Some African taxa. Kew Bu. 30:

139 ., Appendix, An Outline Classification of The Cucurbitaceae, in Biology and Utilization of the Cucurbitaceae, Bates, D.M., Robinson, R.W. and Jeffrey, C., eds., Cornell University, Ithaca, N.Y., p 449. KATZIR, N., DANIN-POLEG, Y., TZURI, G., KARCHI, Z., LAVI, U., CREGAN, P.B., Length Polymorphism and Homologies of Microsatellites in Several Cucurbitaceae Species. Theor. Appl. Genet., 93: KHOSHOO, T., VIJ, P., Biosystematics of Citrullus vulgaris var. fistulosus. Caryologia, 16: KONG, Q., XIANG, C., YU, Z., ZHANG, C., LIU, F., PENG, C., PENG, X., Mining and Charactering Microsatellites in Cucumis melo Expressed Sequence Tags From Sequence Database. Molecular Ecology Notes, 7: KRESOVICH, S., MCFERSON, J.R., Assesment and Management of Plant Genetic Diversity Considerations of Intraspecific and Interspecific Variation. Field Crop Research, 29: KUCUK, A., ABAK, K., SARI, N., Cucurbit Genetic Resources in Turkey. Cucurbit Genetic Resources in Europe, Ad Hoc Meeting, 19 January 2002 Adana-Turkey, KUMAR, L.S., DNA Markers in Plant Improvement: An Overwiew. Biotechnology Advances, 17: KUNIYASU, K., Seed Transmission of Fusarium Wilt of Bottle Gourd, Lagenaria siceraria, Used as a Rootstock of Watermelon. Jpn. Agr. Res. Quart., 14: KURT, S., DERVIS, S., SOYLU, E.M., TOK, M.F., YETİŞİR, H., SOYLU, S., Pathogenic Races and Inoculum Density of Fusarium oxysporum f.sp. niveum in Commercial Watermelon Fields in Southern Turkey. Phytoparasitica 36 (2): KWON, Y.S., PARK, E.K., LEE, W.S., YI, S.I., BAE, K.M., AN, J.S., KIM, H.Y., Resistance to Races 0, 1 and 2 of Fusarium Wilt of Watermelon in Citrullus sp. PI FR. Korean Journal of Genetics, 29(2):

140 LAGHETTI, G., HAMMER, K., The Corsican Citron Melon (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. et Nakai subsp. lanatus var. citroides (Bailey) Mansf. Ex Greb.) a Traditional and Neglected Crop. Genet. Resour. Crop Evol., 54: LEE, M., DNA Markers and Plant Breeding Programs. Adv. Argon. 55: LEE, S.J., SHIN, J.S., PARK, K.W., HONG, Y.P., Detection of Genetic Diversity Using RAPD-PCR and Sugar Analysis in Watermelon (Citrullus lanatus (Thunb.) Mansf.) Germplasm. Theor. Appl. Genet., 92: LEVI, A., THOMAS, C.E., KEINATH, A.P., WEHNER, T.C., Estimation of Genetic Diversity Among Citrullus accessions Using RAPD Markers. Acta Hort.i 510: , THOMAS, C.E., KEINATH, A.P., WEHNER, T.C., 2001a. Genetic Diversity Among Watermelon (Citrullus lanatus and Citrullus colocynthis) Accessions. Genet. Resour. Crop. Evol., 48: , THOMAS, C.E., WEHNER, T.C., ZHANG, X., 2001b. Low Genetic Diversity Indicates the Need to Broaden the Genetic Base of Cultivated Watermelon. HortScience, 36: , THOMAS, C.E., ZHANG, X.P., JOOBEUR, T., DEAN, R.A., WEHNER, T.C., CARLE, B.R., 2001c. A Genetic Linkage Map for Watermelon Based on RAPD Markers. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 126: , THOMAS, C.E., NEWMAN, M., REDDY, O.U.K., ZHANG, X., XU, Y., ISSR and AFLP Markers Sufficiently Differentiated Among American Watermelon Cultivars with Limited Genetic Diversity. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 129: , THOMAS, C.E., Polymorphisms Among Chloroplast and Mitocondrial Genomes of Citrullus Species and Subspecies. Genet. Resour. Crop Evol., 52: , THOMAS, C.E., SIMMONS, A.M., THIES, J.A., Analysis Based on RAPD and ISSR Markers Reveals Closer Similarities Among Citrullus and Cucumis species than with Praecitrullus fistulosus (Stocks) Pangalo. Genet. 127

141 Resour. and Crop Evol., 52: , THOMAS, C.E., TREBITSH, T., SALMAN, A., KING, J., KARALIUS, J., NEWMAN, M., REDDY, O.U.K., XU, Y., ZHANG, X., An Extended Linkage Map for Watermelon Based on SRAP, AFLP, SSR, ISSR, and RAPD Markers J. Amer. Soc. Hort. Sci., 131(3): , WECHTER, W.P., DAVIS, A., KATZIR, N., TADMOR, Y.K., LING, K.S., REDDY, U.O.U., Interspecific Transferability of Watermelon EST-SSR Markers in Cucurbit Species. Hortscience, 42 (4): , THOMAS, C.E., DNA Markers from Different Linkage Regions of Watermelon Genome Useful in Differentiating Among Closely Related Watermelon Cultivars. Hort. Sci. 42(2): , WECHTER, P., DAVIS, A., EST-PCR Markers Representing Watermelon Fruit Genes are Polymorphic Among Watermelon Heirloom Cultivars Sharing a Narrow Genetic Base. Plant Genetic Recources: Characterization and Utilization, 7 (1): LI, G., QUIROS, C.F., Sequence-Related Amplified Polymorphism (SRAP), A New Marker System Based on a Simple PCR: Its Application to Mapping and Gene Tagging in Brassica. Theor. Appl. Genet,. 103: LI, H.Z., YIN, Y.P., ZHNAG, C.Q., ZHANG, M., LI, J.M., Comparison of Characteristics of SRAP and SSR Markers in Genetic Diversity Analysis of Cultivars in Allium fistulosum L. Seed Science and Technology, 36(2): LIN, H.Y., CHEN, S.K., LIOU, D.T., HUANG, W.J., CHANG, L.F.P., 2009a. Development of a Molecular Method for Rapid Differentiation of Watermelon Lines Resistant to Fusarium oxysporum f.sp. niveum. Botanical Studies,50: LIN, H.Y.., CHANG, J.Y., LIU, E.T., CHAO, C.P., HUANG, W.J., CHANG, L.F.P., 2009b. Development of a Molecular Marker for Specific Detection of Fusarium oxysporum f.sp. cubense Race 4. Eur. J. Plant Pathol., 123: LÓPEZ-SESÉ, A.I., STAUB, J., KATZIR, N., GÓMEZ-GUILLAMÓN, L.S.,

142 Estimation of Between and Within Accession Varation in Selected Spanish Melon Germplasm Using RAPD and SSR Markers to Assess Strategies for Large Collection Evalution. Euphytica,127: MANTEL, N., The Detection of Disease Clustering and a Generalized Regression Approach. Cancer Res., 27: MARTYN., R.D., MCLAUGHLIN, R.J., Effects of Inoculum Concentration on the Apparent Resistance of Watermelons to Fusarium oxysporum f.sp. niveum. Phytoparasitica, 4: , HARTZ, T.K., Use of Soil Solarization to Control Fusarium Wilt of Watermelon. Plant Dis., 70: , Fusarium oxysporum f.sp. niveum Race 2; A Highly Aggressive Race New to the United State, Plant Dis., 71: , NETZER, D., Resistance to Race 0, 1 and 2 of Fusarium Wilt of Watermelon in Citrullus sp. PI FR. HortScience, 26: , Fusarium Wilt of Watermelon. Pages in Compendium of Cucurbit Diseases. T.A.Zitter, D. L. Hopkins, and C.E. Thomas eds. The American Phytopatological Society. St. Paul, MN. MAYNARD, D.N., An Introduction to the Watermelon. ASHS Press, Alexandria, VA, USA. MEEUSE, A.D., The Cucurbitaceae of Southern Africa. Bothalia, 8: MICHAIL, S.H., REHIM, M.A.A., TARABEIH, A.M., ALY, M.A., Effect of Fusarium Seed Borne Infection Levels on Watermelon Wilt Incidence. Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica, 37(4): MOHR, H.C., Watermelon Breeding. In: Breeding Vegetable Crops (M.I.Basset,ed.) Avi Publishing Company, Westport, CN, USA, 363 p. MOHAMMADI, S. A., PRASANNA, B. M., Analysis of Genetic Diversity in Crop Plants-Salient Statistical Tools and Considerations. Crop Sci., 43: MONFORTE, A. J., GARCIA-MAS, J., ARÚS, P., Genetic Variability in Melon Based on Microsatellite Variation. Plant Breeding, 122: MUTLU, N., BOYACI, H. F., GOCMEN, M., ABAK, K., Development of 129

143 SRAP, SRAP-RGA, RAPD and SCAR Markers Linked With a Fusarium Wilt Resistance Gene in Eggplant. Theor. Appl. Genet., 117: NAKATA, E., STAUB, J. E., LÓPEZ-SESÉ, A. I., KATZIR, N., Genetic Diversity of Japanese Melon Cultivars (Cucumis melo L.) as Assessed by Random Amplified Polymorphic DNA and Simple Sequence Repeat Markers. Genet. Resour. and Crop Evol., 52: NAVOT, N., ZAMIR, D., Isozyme and Seed Protein Phylogeny of Genus Citrullus (Cucurbitaceae). Plant Syst. Evol., 156: NETZER, D., Physological Races and Soil Population Level of Fusarium Wilt of Watermelon. Phtoparasitica, 4: , MARTYN, R.D., PI , A Source of Resistance in Watermelon to Race 2 of Fusarium oxysporum f. sp. niveum. Plant Dis., 73: 518. NIMMAKAYALA, P., TOMASON, R.Y., JEONG, J., PONNIAH, K.S., KARUNATHILAKE, A., LEVI, A., PERUMAL, R., REDDY, K.U., Genetic Reticulation and Interrelationships Among Citrullus Species as Revealed by Joint Analysis of Shared AFLPs and Species-Specific SSR Alleles. Plant Genetic Resources Characterization and Utilization, NOTZ, R., MAURHOFER, M., DUBACH, H., HAAS, D., DÉFAGO, G., Fusaric Acid-Producing Strains of Fusarium oxysporum Alter 2, 4- Diacetylphloroglucinol Biosynthetic Gene Expression in Pseudomonas fluorescens CHA0 in vitro and in the Rhizosphere of Wheat. Appl. Environ. Microbiol., 68: OUMOULOUD, A., ARNEDO-ANDRES, M.S., GONZALES-TORRES, R., ALVAREZ, J.M., Development of Molecular Markers Linked to Fom- 1 Locus for Resistance to Fusarium Race 2 in Melon. Euphytica, 164: ÖZGEN, M., ADAK, S., KARAGÖZ, A. ULUKAN, H., Bitkisel Gen Kaynaklarının Korunma ve Kullanımı. Türkiye Ziraat Mühendisliği 4. Teknik Kongresi, 9-13 Ocak 1995, Ankara, Ziraat Bankası Kültür Yayınları, 26: , ADAK, M.S., SÖYLEMEZOĞLU, G., ULUKAN, H., Bitkisel Gen 130

144 Kaynaklarının Korunma ve Kullanımında Yeni Yaklaşımlar. V. Türkiye Ziraat Mühendisliği Teknik Kongresi, Ocak 2000, Ankara. PARIS, H.S., YONASH, N., PORTNOY, V., MOZES-DAUBE, N., TZURI, G., KATZIR, N., Assessment of Genetic Relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) Using DNA Markers. Theor. Appl. Genet. 106: PROVVIDENTI, R., Inheritance of a Partial Chlorophyll Deficiency in Watermelon Activated by Low Temperature at the Seedling Stage. HortScience, 29: RAFALSKI, J.A., VOGEL, J. M., MORGANTE, M., POWELL, W., ANDRE, C., TINGEY, S., In: Birren B, Lai E (eds) Non-Mammalian Genome Analysis: A Practical Guide. Academic Press, New York, REDDY, M.P., SARLA, N., SIDDIQ, E.A., Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) Polymorphism and Its Application in Plant Breeding. Euphytica, 128: ROBINSON, R.W., DECKER-WALTERS, D.S., Cucurbits. CAB International, New York, NY, USA ROHLF., NTSYS-PC Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. Version Exeter Software, Setauket, New York. RUIZ, J.J., GARCIA-MARTINEZ, S., Genetic Variability and Relationship of Closely Related Spanish Traditional Cultivars of Tomato as Detected by SRAP and SSR Markers. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 130: SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F., MANIATIS, T., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2 nd Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Harbor Laboratory Press. SARI, N., SOLMAZ, I., UNLU, H., YETISIR, H., 2007a. Watermelon Genetic Resources in Turkey and Their Characteristics. Acta Hortic., 731: SARI, N., AKA-KAÇAR, Y., YALÇIN-MENDİ, Y., SOLMAZ, İ., AKTAŞ, H., 2007b. Karpuz Genetik Kaynaklarının Morfolojik ve Genetik Karakterizasyonu. TÜBİTAK, Proje No: 104O073 Sonuç Raporu. SARI, N., TAN, A.,YANMAZ, R., YETİŞİR, H., BALKAYA, A., SOLMAZ İ., AYKAS, L., General Satatus of Cucurbit Genetic Resources in 131

145 Turkey, Proceedings of the IX th EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae, INRA, Avignon (France), SAS Institute Inc, SAS Users Guide; SAS/STAT, Version 6. SAS Ins. Inc.Cary. SENSOY, S., DEMIR, S., BUYUKALACA, S., ABAK, K., Response of Turkish Melon Genotypes to Fusarium oxysporum f. sp. melonis Race 1 Determined by Inoculation Tests and RAPD Markers. Europ. J. Hort. Sci., 72(5): SHI, J., MUELLER, W., BECKMAN, C.H., Ultrastructural Responses of Vessel Contact Cells in Cotton Plants Resistant or Susceptible to Infection by Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Physiol. Mol. Plant Pathol., 38: SINGH, A.K., Cytogenetic and Evolution in the Cucurbitaceae. In: Bates D.M., Robinson R.W. and Jeffrey C. (eds), Biology and Utilization of the Cucurbitaceae, Comstock Publishing Association, Ithaca, New York, U.S.A, SILVA, M.L., QUEIROZ, M.A., FERREIRA, M.A.J., BUSO, G.S.C., Morphological and Molecular Characterization of Watermelon. Horticultura Brasileira, 24 (4): SMITH, E.F., The Watermelon Disease of the South. Proc. Amer. Assn. Adv. Sci., 43: SOLMAZ, İ., Bazı Karpuz Çeşit ve Tiplerinde Karakterizasyon. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Adana, 89 s.., SARI, N., KASAPOĞLU, S., Orta Anadolu ve Akdeniz Bölgelerinden Toplanan Karpuz Genetik Kaynaklarının Morfolojik Karakterizasyonu. Türkiye V. Ulusal Bahçe Bitkileri Kongresi, Eylül 2007, Erzurum, , SARI, N., Characterization of Watermelon (Citrullus lanatus) Accessions Collected from Turkey for Morphological Traits. Genet. Resour. Crop Evol., 56(2):

146 ., SARI, N., AKA-KACAR, Y., YALCIN-MENDI, Y., The Genetic Characaterization of Turkish Watermelon (Citrullus lanatus) Accessions Using RAPD Markers. Genet. Resour. and Crop Evol, DOI: /s , Published Online: 29 Jan STAUB, J.E, SERQUEN, F.C., GUPTA, M., Genetic Markers, Map Construction and Their Application in Plant Breeding. HortScience, 31: , DANIN-POLEG, Y., FAZIO, G., HOREJSI, T., REIS, N., KATZIR, N., Comparative Analysis of Cultivated Melon Groups (Cucumis melo L.) Using Random Amplified Polymorphic DNA and Simple Sequence Repeat Markers. Euphytica, 115: , LÓPEZ-SESÉ, A.I., FANOURAKIS, N., Diversity Among Melon Landraces (Cucumis melo L.) from Greece and Their Genetic Relationships with Other Melon Germplasm of Diverse Origins. Euphytica, 136: SZABÓ, Z., GYULAI, G., HUMPHREYS, M., HORVÁTH, L., BITTANSÁNSZKY, A., LÁGLER, R., HESZKY, L., Genetic Variation of Melon (C. melo) Compared to an Extinct Landrace from the Middle Ages (Hungary).I. rdna, SSR and SNP Analysis of 47 Cultivars. Euphytica, 146: TAMAM, A., Bazı Avokado (Persea americana Mill.) Çeşitlerinin Morfolojik ve Moleküler Karakterizasyonu. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoteknoloji Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Adana, 116 s. TAN, A., Current Status of Plant Genetic Resources Conservation in Turkey. Proceeding of International Symposium on in situ Conservation of Plant Genetic Diversity, 4-8 November 1996, Antalya, Turkey, , TZITZIKAS, E.M., MONFORTE, A.J., FATIHI, A., KYPRIOTAKIS, A., IACOVIDES, T.A., IOANNIDES, I.M., KALAITZIS, P., Genetic Diversity and Population Structure of Traditional Greek and Cypriot Melon 133

147 Cultigens (Cucumis melo L.) Based on Simple Sequence Repeat Variability. HortScience, 44(7): UZUN, A., Turunçgillerde Genetik Çeşitliliğin SRAP Markırları ile Karakterizasyonu. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, Doktora Tezi, Adana, 369 s. VANDEMARK, G.J., ARISS, J.J., BAUCHAN, G.A., Estimating Genetic Relationships Among Historical Sources of Alfaalfa Germplasm and Selected Cultivars with Sequnce Related Amplified Polymorhisms. Euphytica, 152: VERMA, M., ARYA, L., Development of EST-SSRs in Watermelon (Citrullus lanatus var. lanatus) and Their Transferability to Cucumis spp. Journal of Horticultural Science & Biotechnology, 83 (6): VOS, P., HOGERS, R., BLEEKER, M., REIJANS, M., VAN DE LEE, T., HORNES, M., FRIJTERS, A., POT, J., PELEMAN, J., KUIPER, M., ZABEAU, M., AFLP: A New Technique for DNA Fingerprinting. Nucleic Acids Res., 23: WANG, M., ZHANG, X., Studies on Watermelon Germplasm Sources Resistant to Fusarium Wilt Disease at the Seedling Stage. Cucurbit Genetics Cooperative, USA (No:11): 68. WANG, L.L., PING, Z.L., QIN, G.Y., XIA, W.M., MING, C.L., LAN, Y.J., YAN, W., MIN, Y.F., ZHI, W.L., DNA Fingerprinting and Genetic Diversity Analysis of Late-Bolting Radish Cultivars with RAPD, ISSR and SRAP Markers. Scientia Horticulturae, 116: WATCHARAWONGPAIBOON, N., CHUNWONGSE, J., Development and Characterization of Microsatellite Markers from An Enriched Genomic Library of Cucumber (Cucumis sativus). Plant Breeding, 127: WECTHER, W.P., WHITEHEAD, M.P., THOMAS, C.E., DEAN, R.A., Identification of a Randomly Amplified Polymorphic DNA Marker Linked to The Fom 2 Fusarium Wilt Resistance Gene in Muskmelon MR-1. Phytopathology, 85: WEHNER, T.C., Watermelon In: Prohens J. and Nuez F. (eds.) Handbook of 134

148 Plant Breeding; Vegetables I: Asteraceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae, and Cucurbitaceae. Springer Science+Business LLC, New York, NY, WHITAKER, T.W., DAVIS, G.N., Cucurbits: Botany, Cultivation and Utilization. Leonard Hill, London.., BEMIS, W.B., Cucurbits. In: Simmonds N.W. (ed.), Evolution of crop plants. Longman, London, WILLIAMS, J.G.K., KUBELIK, A.R., LIVAK, K.J., RAFAELSKI, J.A., TINGEY, S.V., DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers are Useful as Genetic Markers. Nucleic Acid. Res., 18(22): XU, Y., OUYANG, X.X., ZHANG, H.Y., KANG, G.B., WANG Y.J., CHEN, H., Identification of a RAPD Marker Linked to Fusarium Wilt Resistant Gene in Wild Watermelon Germplasm (Citrullus lanatus var. citroides) Acta Botanica Sinica, 41(9): , ZHANG, H.Y., KANG, G.B., WANG, Y.J., CHEN, H., Studies of Molecular Marker-Assisted-Selection for Resistance to Fusarium Wilt in Watermelon (Citrullus lanatus) Breeding. Acta Genetica Sinica, 27 (2): , GUO, S., ZHANG, H., GONG, G., MAO, A., GENG, L., Construction of Watermelon SSH cdna Libraries Induced by Fusarium oxysporum and Analysis of Expressed Sequence Tags. Proceedings of the IX th EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae, INRA, Avignon (France), YAN, L., ZHANG, C.Q., Studies on Genetic Diversity with the Molecular Marker SRAP of Watermelon Hyrids. Acta Hort. Sinica, 32(4): YETISIR, H., SARI, N., YUCEL, S., Rootstock Resistance to Fusarium Wilt and Effect on Watermelon Fruit Yield and Quality. Phytoparasitica, 31(2): YUCEL, S., PALA, H., SARI, N., ABAK, K., Determination of Fusarium oxysporum f. sp. niveum Races in the Eastern Meditteranean Region of Turkey and Response of Some Watermelon Genotypes Proc.1 st Symp. on Cucurbits. Acta Hort., 492:

149 ZAMIR, D., NAVOT, N., RUDICH, J., Enzyme Polymorphism in Citrullus lanatus and C. colocynthis in Israel and Sinai. Plant Syst. Evol., 146: ZENGİN, H., YILDIRIM, G., GÜLSOY, E., Marmara Bölgesindeki Kavunda Fusarium oxysporum f.sp. melonis, Karpuzda Fusarium oxysporum f.sp. niveum Solgunluk Etmenleri ve Kimyasal Savaş Olanakları Üzerinde Araştırmalar. Erenköy Zirai Mücadele Araştırma. Enstitüsü. E-108, 829 no lu proje. ZHANG, X.P., RHODES, B.B., SKORUPSKA, H., RAPD Molecular Markers in Watermelon. Cucurbits Genetics Cooperative Report, 17: ZHANG, Z., ZHANG, J., WANG, Y., ZHENG, X., Molecular Detection of Fusarium oxysporum f.sp. niveum and Mycosphaerella melonis in Infected Plant Tissues and Soil. FEMS Microbiol. Lett., 249: ZHENG, X.Y., WOLFF, D.W., Randomly Amplified Polymorphic DNA Markers Linked to Fusarium Wilt Resistance. HortScience, 35: ZHOU, X.G., EVERTS, K.L., Races and Inoculum Density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in Comercial Fields in Maryland and Delaware. Plant Disease, 87(6): , EVERTS, K.L., 2004a. Quantification of Root and Stem Colonization of Watermelon by Fusarium oxysporum f.sp. niveum and Its Use in Evaluating Resistans. Phytopatology, 94: , EVERTS, K.L., 2004b. Suppression of Fusarium Wilt of Watermelon by Soil Amendment With Hairy Vetch. Plant Disease, 88: , EVERTS, K.L., BRUTON, B.D., Race 3, a New and Highly Virulent Race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum Causing Fusarium Wilt in Watermelon. Plant Disease, 94(1): ZHUKOVSKY, P.M., La Turquie Agricole Selkhozghiz, Moscou. ZHUANG, F.Y., CHEN, J.F., STAUB, J.E., QIAN, C.T., Assesment of Genetic Relationships Among Cucumis spp. by SSR and RAPD Marker Analysis. Plant Breeding, 123:

150 ZIETKIEWICZ, E., RAFALSKI, A., LABUDA, D., Genome Fingerprinting by Simple Sequence Repeat (SSR)-Anchored Polymerase Chain Reaction Amplification. Genomics, 20:

151 ÖZGEÇMİŞ 1977 yılında Adana da doğdu. İlk öğrenimini İsmet İnönü İlkokulu nda, orta ve lise öğrenimini Kurttepe Anadolu Lisesi nde tamamladı yılında Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü nde lisans eğitimine başlayıp 2000 yılında Ziraat Mühendisi olarak mezun oldu. Aynı yıl içerisinde Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı nda yüksek lisans eğitimine başladı yılları arasında SAPEKSA A.Ş. de Üretim Mühendisi olarak çalıştı. Kasım-2002 de Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı na Araştırma Görevlisi olarak atandı yılında yüksek lisans öğrenimini tamamladı ve aynı yıl Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı nda doktora öğrenimine başladı. Şubat 2010 da Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi nde Ziraat Mühendisi kadrosuna atandı ve Bahçe Bitkileri Bölümü nde çalışmalarına devam etmektedir. 138

152

153