DOMATES BAKTERĐYEL KANSER HASTALIĞI

Transkript

1 DOMATES BAKTERĐYEL KANSER HASTALIĞI (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) NA KARŞI DAYANIKLI DOMATES BĐTKĐLERĐNDE GENETĐK KALITIMIN BELĐRLENMESĐ Demet ÇELĐK Yüksek Lisans Tezi Bitki Koruma Anabilim Dalı Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIŞ 2011 Her hakkı saklıdır

2 T.C. GAZĐOSMANPAŞA ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ BĐTKĐ KORUMA ANABĐLĐM DALI YÜKSEK LĐSANS TEZĐ DOMATES BAKTERĐYEL KANSER HASTALIĞI (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) NA KARŞI DAYANIKLI DOMATES BĐTKĐLERĐNDE GENETĐK KALITIMIN BELĐRLENMESĐ DEMET ÇELĐK TOKAT 2011 Her hakkı saklıdır

3

4

5 ÖZET Yüksek Lisans Tezi DOMATESTE BAKTERĐYEL KANSER HASTALIĞI (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) NA KARŞI DAYANIKLI DOMATES BĐTKĐLERĐNDE GENETĐK KALITIMIN BELĐRLENMESĐ Demet ÇELĐK Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı Danışman: Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIŞ Domates, toplam ekiliş alanı, üretimi ve ticareti açıdan Türkiye de yaş sebze grubunun en önemli ürünlerinden birisini oluşturmaktadır. Domateslerde yetiştiricilik sırasında fungal ve viral hastalık etmenlerinin yanı sıra pek çok bakteriyel etmende önemli ürün kayıplarına neden olmaktadır. Bu bakteriyel hastalıklardan biri olan Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al., in (Cmm) neden olduğu bakteriyel kanser hastalığıdır. Bu hastalığın mücadelesinde dayanıklı çeşit kullanımı en etkin, ekonomik, çevre dostu ve insan sağlığını koruyan bir yöntem olarak görülmektedir. Bu hastalığa dayanıklı kültür domates çeşitleri bulunmamakta olup, bakteriyel kanser hastalığına karşı dayanıklılık kaynağı domatesin yabani akrabalarıdır. Çalışmada kültür domatesinin NCEBR3 homozigot hattı, bu domatesin kimyasal mutasyonu ile oluşturalan M3 mutant domatesleri ve yabani domates LA 1579 hattının Cmm nin en virulent ırkı olan Cmm2 ye karşı patojenisite testlerinde reaksiyonları belirlenmiştir. Testler sonucunda dayanıklı M3 ( ) hattı ile orta derecede dayanıklı LA 1579 ( ) hattı melezlenerek F 1 populasyonu oluşturulmuştur. Yapılan moleküler çalışmalarda ebeveynler arasında polimorfizmi ortaya koyabilmek için 11 adet Simple Sequence Repeats (SSR) markörü kullanılmış olup 8 adet SSR markörü NCEBR3, M3 ve LA 1579 arasında polimorfik bulunmuştur. Test edilen markörlerin ebeveynler üzerinde polimorfizm oranı %73 olarak ortaya konmuştur. 2011, 76 sayfa Anahtar Kelimeler: Domates, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Bakteriyel kanser hastalığı, SSR markörleri i

6 ABSTRACT Master of Science Thesis IDENTIFICATION OF GENETIC INHERITANCE OF RESISTANT TOMATOES AGAINST BACTERIAL CANKER (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) DISEASE By Demet ÇELĐK Gaziosmanpaşa University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Plant Protection Supervisor: Asst. Prof. Dr. Özer ÇALIŞ Tomato is one of the most important product in terms of area, production and trade of fresh vegetable in Turkey. During the tomato production, several fungal and viral pathogens cause diseases, additionally, bacterial diseases result significant crop losses. One of the bacterial diseases is bacterial wilt and canker disease caused by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al., (Cmm). The resistant tomato plants are able to use for controlling the bacterial canker disease because the method is the most effective, economical, environmental, and human frendly. There is no disease-resistant tomato cultivars; however, resistant plants are present in wild tomato accessions. In this study, we used original tomato cultivar NCEBR3, mutant M3 and wild LA 1579 tomato lines to identify resistance reactions to the most virulent isolate (Cmm2) of bacterial canker disease in pathogenicity tests. The pathogenicity test results revaled that resistant M3 ( ) plants and intermediate resistant LA1579 ( ) plants where the two lines were crossed to produce F 1 populations. Moleculer studies conducted to determine polimorphism between the parents, 11 Simple Sequence Repeats (SSR) markers were analysed in PCR reactions. The analyses shown that 6 SSR markers were polymorphic between NCEBR3, M3 and LA 1579 plants. Among tested markers, 73% of them gave polymorphism to use in future studies. 2011, 76 pages Key Words: Tomato, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Bacterial Canker Disease, SSR markers ii

7 ÖNSÖZ Çalışma konumun belirlenmesinde, hazırlanmasında ve yazımında benden hiçbir zaman güler yüzünü, desteğini, ilgisini eksik etmeyen, yapıcı ve yönlendirici fikirleriyle bana her zaman doğru yolu gösteren sayın danışman hocam Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIŞ a sonsuz teşekkürler. Yüksek lisans tez savunmamın jüri üyeleri olan ve değerli fikirleriyle katkıda bulunan sayın hocalarım Doç. Dr. Yusuf YANAR ve Yrd. Doç. Dr. Çetin ÇEKĐÇ e teşekkür ederim. Çalışmalarım sırasında emeği geçen mutlu ve sıkıntılı anlarımın yoldaşları olan değerli arkadaşlarım Arş. Gör. Đbrahim SAYGILI, Zir. Yük. Müh. Zeliha Selcen BAYAZIT a ve Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bitki Koruma Bölümü Öğretim Elemanları, Doktora, Yüksek Lisans ve Lisans öğrencilerine en içten teşekkürlerimi sunarım. Hayatımın her aşamasında olduğu gibi yüksek lisans çalışmalarım esnasında da benden maddi ve manevi desteğini esirgemeyen, zorluklarla savaştıkça hep daha güçlü olacağımı öğreten sevgili annemcim, babamcım ve biricik kardeşim iyi ki varsınız. Sizler benim bu dünyadaki en büyük hazinemsiniz. Girdiğim her yolda beni başarıya odakladınız, her halime katlandınız, destek oldunuz, sabrettiniz size yürekten sonsuz teşekkürler Demet ÇELĐK 06/2011 iii

8 ĐÇĐNDEKĐLER Sayfa ÖZET.. i ABSTRACT... ii ÖNSÖZ... iii ĐÇĐNDEKĐLER.. iv ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ... v TABLOLAR DĐZĐNĐ vii 1. GĐRĐŞ LĐTERATÜR ÖZETLERĐ 8 3. MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Çalışmada Kullanılan Fitopatojen Bakteriler Çalışmada Kullanılan Test Bitkileri Kullanılan Çözeltilerin ve Besi yerlerinin Hazırlanışı Yöntem Bitkilerin Yetiştirilmesi Bakteriyel Hastalık Etmeni Cmm2 nin GYCA Besi Ortamında Geliştirilmesi Patojenisite Testi Melez Bitkilerin Oluşturulması Bitkilerden DNA Đzolasyonu PCR Analizleri Agarose Jel Elektroforezi Moleküler Markörler BULGULAR Patojeniste Test Sonuçları Moleküler Analiz Sonuçları SONUÇLAR ve TARTIŞMA KAYNAKLAR ÖZGEÇMĐŞ iv

9 ŞEKĐLLER LĐSTESĐ Sayfa Şekil 2.1. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu sistemik enfeksiyon sonucu oluşan solgunluk görünümü 9 Şekil 2.2. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu yaprak yanıklığı.. 10 Şekil 2.3. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu iletim demetlerinde ki renklenme belirtileri.. 10 Şekil 2.4. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu lokalize enfeksiyon sonucu oluşan lokal yaprak yanıklıkları. 11 Şekil 3.1. NCEBR3, M3 ve LA1579 hattına ait domates fidelerinin 7 no lu saksılara aktarıldıktan sonra Biyoteknoloji serasında gelişmeleri 36 Şekil 3.2. Bakteriyel etmen Cmm2 nin GYCA besi ortamındaki gelişimi. 37 Şekil 3.3. Steril şartlarda besi ortamında geliştirilen Cmm2 bakteri izolatlarının steril kürdan yardımıyla domates fidelerinin gövdelerine batırılarak inokulasyonun gerçekleştirilmesi Şekil 3.4. Đnokule grubu bitkilerdeki bakteriyel etmenin gelişimi Şekil 3.5. Polen ana hücrelerinin dişicik borusuna zarar vermeyecek şekilde pens yardımıyla uzaklaştırılması Şekil 3.6. Yalnız bırakılan dişicik borusuna hassas ebeveynin polenlerinin değdirilmesi. Şekil 3.7. Melez meyvelerin gelişimi Şekil 3.8. PCR amplifikasyonu sonunda elde edilen PCR ürünlerinin loading dye boyası eklendikten sonra (A) %1.5 luk agarose jele yüklenmesi (B) ve yükleme sonrası jeldeki görünümü (C). Şekil 3.9. PCR ürünlerinin 100 V luk akıma bağlı %1.5 luk agarose jelde saat süreli koşturulması Şekil Koşma işleminden sonra agarose jel içerisindeki DNA bantlarının Bio Capt programı kullanılarak görüntülenmesi v

10 ŞEKĐLLER LĐSTESĐ Sayfa Şekil 4.1. NCEBR3 bitkisinin patojenisite testinden 28 gün sonraki durumu ve kontrol bitkisiyle karşılaştırılması... Şekil 4.2. M3 bitkisinin patojenisite testinden 28 gün sonraki durumu ve kontrol bitkisiyle karşılaştırılması.. Şekil 4.3. LA 1579 bitkisinin patojenisite testinden 14 ve 28 gün sonraki durumu Şekil 4.4. Çalışmada kullanılan SSR38, SSR70 ve SSR349 markörleri kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonun görünümü. SSR70 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 119 bp lik band verirken LA1579 ile 103 bp lik bant oluşturmuştur. SSR349 ve SSR38 markörleri test edilen DNA lar arasında bir ploymorfizm oluşmamıştır. Çalışmada Ladder olarak 50 bp lik moleküler size markör ve Negatif kontrol olarakta distile steril su kullanılmıştır. (1: M3, 2: LA 1579, 3: NCEBR3).. Şekil 4.5. Çalışmada kullanılan SSR47, TOM184, SSR13, TOM210 ve SSR70 markörleri kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonun görünümü. SSR47 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 189 bp lik band verirken LA1579 ile 193 bp lik bant oluşturmuştur. TOM210 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 216 bp lik band verirken LA1579 ile 204 bp lik bant oluşturmuştur. SSR70 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 119 bp lik band verirken LA1579 ile 103 bp lik bant oluşturmuştur. TOM184 primeri NCEBR3 ve M3 DNA larıyla amplifikasyon oluşturmamıştır. SSR13 markörü test edilen DNA lar arasında bir polymorfizm vermemiştir. Çalışmada 100 bp lık Ladder kullanılmıştır (1: LA 1579, 2: M3, 3: NCEBR3) Şekil 4.6. Çalışmada kullanılan SSR333, SSR45, SSR638 ve SSR306 markörleri kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonun görünümü. SSR333 primeri NCEBR3 ve M3 ile 201 bp lik bant ve LA1579 ile 223 bp lik bant oluşturmuştur. SSR306 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 255 bp lik bant verirken LA1579 ile 273 bp lik bant oluşturmuştur. SSR45 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 140 bp lik band verirken LA1579 ile 149 bp lik bant oluşturmuştur. SSR 638 markörü M3 mutantı ile 157 bp lik bant veriken LA1579 ile 161 bp lik bant oluşturmuştur. Çalışmada 50bp lık Ladder ve negatif kontrol olarak distile steril su kullanılmıştır. (1: NCEBR3, 2: M3, 3: LA 1579) vi

11 TABLOLAR LĐSTESĐ Sayfa Tablo 1.1. Dünya Sebze Üretiminde Önemli Ülkeler ve Dünya Üretimindeki Payları 2 Tablo 1.2. Dünya domates üretimi yapan ülkeler ve üretim miktarları 4 Tablo 3.1. Bakteriyel kanser ve solgunluk (Clavibacter michiganensis subsp. micgiganensis) hastalığına karsı Amerikan Ulusal Germplasm Sisteminde ( taranarak laboratuarımıza getirilen tohumlar.. Tablo 3.2. NCEBR3, M3 ve LA 1579 bitkileri arasındaki polimorfizmi ortaya koymak için çalışmada kullanılan SSR markörleri. Tablo 4.1. Çalışmada kullanılan NCEBR3, M3 ve LA 1579 domates hatlarının Cmm2 ile yapılan patojenisite test sonuçları vii

12 1 1. GĐRĐŞ Asya ile Avrupa kıtalarının birleştiği yerde ve Akdeniz ile Karadeniz arasında yer alan Türkiye asırlar boyunca birçok uygarlıklara ev sahipliği yapmış; çok önemli bir tarım, ticaret ve ulaşım merkezi olmuştur. Türkiye coğrafi yapısından gelen bu avantajlar sayesinde topraklarında güzel bir iklim çeşitliliği bulunan bir ülkedir ve bu çeşitlilik bitkisel üretimine de yansımaktadır. Anadolu da hemen hemen tüm ılıman iklim bahçe ürünleri ile subtropik ürünlerin önemli kısmı ekonomik bir şekilde üretilmektedir. Ürün çeşitliliği ve ekonomik avantajları sayesinde, yağlı tohumlar ve bazı tropik meyveler hariç tutulduğunda, Türkiye temel bitkisel ürünlerde kendisine yeten bir ülke konumunda olup; birçok üründe de üretim fazlasına sahiptir (Abak, 2006). Bahçe bitkileri yetiştiriciliğinde dünyada önemli bir konuma sahip olan Türkiye; birçok bitki türü açısından gen merkezi konumunda olması nedeniyle büyük bir tür ve çeşit zenginliğine sahiptir (Şeniz ve ark., 2005). Bitkisel çeşitlilik içerisinde sebzeler özellikle dengeli beslenmede insanlar için alınması gerekli olan besin öğeleri olarak oldukça büyük önem taşırlar (Balkaya, 1999). Dünya nüfusunun yaklaşık % i az gelişmiş ülkelerde ve bölgelerde yaşamakta ve bu insanlar genellikle gıda olarak bitkilerle yaşamlarını sürdürmektedirler. Bugün dünyada hem kültüre alınmış hem de doğadan toplanarak değerlendirilen sebzeler içerdikleri protein, karbonhidrat, yağ, lif, vitamin, antioksidan ve mineral maddeler bakımından insan beslenmesinde önemli bir etkiye sahiptirler. Sebze olarak değerlendirilen bitkilerin toprak üstü ve toprak altı kısımları değişik şekillerde çiğ veya pişmiş olarak kullanılmaktadır (Eşiyok, 2005). Dünya içersinde küçük dünya olarak tanımlanan Türkiye, iklim özellikleri ve tabiat örtüsü bakımından bu tanımlamayı gerçekten hak eden bir konumdadır. Çünkü ülkemizde mevcut bulunan hemen hemen bütün iklim özelliklerinin bir arada görülmesi mümkündür. Dolayısıyla her mevsimde birçok sebzenin yetiştirilme kullanılma imkanı ülkemiz koşullarında mevcuttur (Şeniz, 1993). Ülkemizde 1 milyon ha alan üzerinde yaklaşık 25.7 milyon ton kadar sebze üretilmektedir ve bunun 9.8 milyon tonunu domates oluşturmaktadır (Tablo 1.1) (Anonim, 2011a). Ülkemizde toplam domates

13 2 üretiminin yarısına yakınını sofralık domates, diğer yarısını da sanayi tipi domates oluşturmaktadır (Alan ve ark., 1992). Tablo Dünya Sebze Üretiminde Önemli Ülkeler ve Dünya Üretimindeki Payları (FAO, 2008). Ekiliş Alanı Ekilişte pay Üretimde pay Ülkeler Üretim (ton) (ha) (%) (%) Çin , ,7 Hindistan , ,5 ABD , ,3 Türkiye , ,8 Rusya Fed , ,8 Mısır , ,8 Đran , ,8 Đtalya , ,5 Đspanya , ,4 Diğerleri , ,4 Toplam Anavatanı Güney Amerika nın orta ve güney kısımları olduğu bilinen domates (Lycopersicum esculentum L.) dünyada tarımı en fazla yapılan sebzelerden biridir. Kültür domatesi Amerika dan Avrupa ya, oradan da Afrika ya geçmiştir. Bugün kültürü yapılmış olan domateslerin L. hirsitum, L. peruvianum ve L. pimpinellifolium dan faydalanılarak geliştirildiği, ana materyalin ise L. peruvianum olduğu bilinmektedir (Vural ve ark., 2000). Domatesin Orta Amerika ve Güney Meksika da çok sayıda tür ve çeşidi bulunmaktadır. Amerika kıtasında, ekvatorun 30 o kuzey enlem ve 30 o güney enlem sınırları arasında kalan bölgeler domatesin anavatanı kapsamı içerisinde kalmakta ve Güney Amerika nın batı kıyılarının domatesin anavatanının merkezi olduğu bildirilmektedir (Günay, 2005). Peru da Maya uygarlığı zamanında adı xtomatl veya tomatl olarak geçen domates, orijini olan Peru, Bolivya ve Ekvator dan 16. yüzyılda Đspanyollar tarafından Avrupa ya getirilerek yetiştirilmeye başlanmıştır (Küçüker, 1994). Avrupa da uzun süre zehirlidir diye çekinilen domates daha sonra kültür bitkisi olarak kabul görmüştür (Ekinci, 1972).

14 3 Anadolu ya 150 yıl önce getirilmiş olup günümüzde yaygın olarak yetiştirilmekte ve sevilerek tüketilmektedir (Yazgan ve Fidan, 1996). Oldukça kuvvetli kök sistemine sahip olan domates, dallanmış kazık kökler ve buradan çıkmış sekonder kökler şeklinde gelişir. Yapraklar bileşik şekilde ve tüylerle kaplıdır. Kendine döllenen bir bitki olup, toprak isteği yönünden çok seçici değildir. Besin maddelerince zengin her toprakta başarı ile yetiştirilir (Vural ve ark., 2000). Domates, bugün beslenme programlarında önemli yeri olan bir sebzedir. Domatesin 100 gr ında 0.55 mg vitamin B6, 1700 IU vitamin A ve 0,10 mg vitamin B1 ile 21 mg C vitamini bulunmaktadır. Bu değerler bir yetişkinin günde 4-5 domates yemesi halinde günlük vitamin gereksinimini karşılayabileceği gerçeğini ortaya koymaktadır (Sevgican, 1999). Kalori değerinin düşük olması taze domatesi iyi bir rejim besini haline getirmiştir. Domatesin beyin hücrelerinin yaşlanmasını yavaşlattığı, bağışıklık sistemini güçlendirdiği, kireçlenmeyi önlediği, saçları ve cildi güzelleştirdiği, kalp hastalıkları ve kansere karşı koruyucu etkisinin olduğu yapılan çalışmalarla ortaya konmuştur (Sevgican, 1999). Domates, dünyada en çok üretilen, tüketilen ve ticarete konu olan tarım ürünlerinin basında gelmesi, insan beslenmesinde vazgeçilmez ürünlerden olması ve gıda sanayinde dondurulmuş, konserve, salça, ketçap, tursu gibi çok çeşitli kullanım alanlarına sahip olması nedeniyle önemli sebzelerin basında gelmektedir. Domates dünyada birçok ülkede yetiştirilmekle birlikte, Türkiye uygun iklim koşulları nedeniyle üretiminde önemli ülkelerden biridir (Anonim 2011b). Domates, Doğu Anadolu nun iklimsel olarak uygun olmayan kısımları hariç, Türkiye nin hemen hemen her yerinde, sera ve açık tarla koşullarında yetiştirilmektedir. Meyve şekli (yuvarlak, basık, konik, armut şeklinde vs.) ve bitki görünüşü (cüce veya uzun) bakımından farklılık gösteren çeşitli varyetelerinin kültürü yapılmaktadır (Davis, 1978). Ülkemizde hem sofralık hem de sanayiye yönelik domates üretimi yapılmaktadır. Ülkemizin her bölgesinde üretilmekle birlikte, sofralık domates Adana, Mersin, Antakya, Antalya, Đzmir, Çanakkale, Konya ve Tokat ta yoğun olarak üretilirken,

15 4 turfanda üretim genellikle örtü altında Akdeniz kıyısında Mersin ve Antalya illerinde yapılmaktadır. Sanayi için domates üretimi Marmara ve Ege bölgelerinde Balıkesir, Bursa, Manisa ve Çanakkale illerinde yapılmaktadır (Bayrak ve Kaya, 2009). Ülkemizin yaş meyve sebze ihracatında ilk sırada yer alan domates, yurt dışına hem taze sofralık, hem de işlenmiş halde ihraç edilmektedir. Akdeniz Đhracatçılar Birliği nin 2009 raporuna göre 2007 yılında taze domates ihracatı yapan ülkeler arasında Türkiye ton ile Meksika, Đspanya, Hollanda ve Ürdün den sonra 5. sırada yer almıştır. Ülkemiz domates salçası ve kurutulmuş domates ihracatında lider ülkeler arasındadır (Bayrak ve Kaya, 2009). Türkiye kendi başına her türlü tarımsal üretimi gerçekleştiren, kendisi için yeterli tarımsal ürünleri üreten ve ürettiği tarımsal ürünlerden yurt dışına ihracat edebilen Dünyanın sayılı tarım ülkelerinden biridir (DPT, 2009). Ülkemiz Dünya domates üretiminde ton üretim ile en çok domates üretimi yapan ülkeler olan Çin ve A.B.D den sonra içerisinde 3. sırada yer almaktadır (Tablo 1.2) (FAO, 2008). Đçerisinde bulunduğumuz Tokat bölgesi ise yıllara göre değişmekle birlikte bin tonluk domates üretimi ile Türkiye'nin domates üretiminin %6 sını karşılamaktadır (Anonymous, 2009). Tablo Dünya domates üretimi yapan ülkeler ve üretim miktarları (FAO, 2008). Ülke Üretim (ton) Çin USA Türkiye Hindistan Đtalya Đran Mısır Brezilya Đspanya Meksika

16 5 Tokat ili Türkiye de domates tarımı yapılan illerden en önemlilerden birini oluşturmaktadır yılında Türkiye domates üretiminde yaklaşık %7 lik, Dünya domates üretiminde yaklaşık %0.5 lik sahip olan ilimizde ha alanda yaklaşık 510 bin ton üretim gerçekleştirilmiştir (Anonim, 2007). Özellikle 1994 yılından itibaren başlatılan çalışmalarda dış Pazar isteklerine uygun çeşitlerin üreticilere kazandırılmış olması günümüzde Tokat ilinde gerçekleştirilen üretimi elde edilen verim miktarını sonucunda Dünya ve Türkiye ortalamasının üzerine çıkarmıştır. Ilık ve sıcak iklim meyvesi olan domates, sıcaklık değerleri açısından minimum 16 ºC, maksimum 35 ºC de normal gelişimini sürdürebilir. Tokat ın sahip olduğu sıcaklık ve yağış değerleri domates tarımına oldukça müsaittir. Tokat ın uygun doğal koşulları hemen her ilçede bu sebzenin üretimine olanak sağlamış olsa da pazarla sorununun çözüldüğü, sulanabilen ovalık alanlarda yoğun bir üretim gerçekleştirilmektedir (Yürüdür ve Akkurt, 2008) yılında ha olan domates üretim alanlarının yaklaşık %97 si ve üretiminin yaklaşık %99 u Merkez, Erbaa, Niksar, Pazar, Turhal ilçeleri tarafından karşılanmıştır. Türkiye de domates üretiminin % 1,5-2,0 si yurt dışına ihraç edilmekte, geri kalan bölüm ise yurt içinde kullanılmaktadır. Yurtiçi kullanımında taze tüketim oranı % civarında bulunmaktadır. Üretimin yaklaşık 1/4 lük bölümü ise işleme sanayinde salça, konserve, doğranmış domates gibi çeşitli ürünlere işlenmektedir (Anonim, 2011c). Gerek örtü altı gerekse tarla koşullarında domates üretiminde ekonomik kayıplara neden olan faktörlerin başında bitki hastalıkları gelmektedir. Domateste fungal ve viral hastalık etmenlerinin yanı sıra pek çok bakteriyel etmende önemli ürün kayıplarına neden olmaktadır (Karaca ve Saygılı, 1982). Domateste hastalık oluşturan bakteriler Pseudomonas, Xanthomonas, Clavibacter, Erwinia, Agrobacterium ve Ralstonia cinsleri içerisinde yer almaktadır (Üstün, 2008). Bu bakteriyel hastalıklardan biride Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al. in (Cmm) neden olduğu bakteriyel solgunluk hastalığıdır. Bakteriyel solgunluk hastalığı tohum kaynaklı olması nedeniyle savaşımı güç hastalıklardandır (Erkan, 1988). Etmen domates dışında fasulye, bezelye, mısırda da ürün kayıplarına neden olmaktadır. Patojen 1910 yılında A.B.D de ilk rapor edilişinden bu yana tüm Dünya ya yayılmış, tarla ve seradaki

17 6 domateslerde ciddi kayıplara neden olmuştur (Hayward ve Waterson, 1964). Çalışmanın yürütüldüğü Tokat bölgesinde bakteriyel hastalık etmeni Cmm domates üretimi yapılan alanlarda bulunmuş ve domates üretimi yapılan alanların %8 nin bu etmen ile bulaşık olduğu ortaya konmuştur. Bakteriyel Kanser Hastalığı domatesin tohum kaynaklı en önemli hastalıklarındandır. Cmm tarafından oluşturulan, hastalık tablosunda ilk göze çarpan, iletim dokularının bakterilerce işgal edilmesi sonucu oluşan, ilk görünür belirti diyebileceğimiz solgunluktur. Solgunluk gelişmiş bitkilerde yavaş ve dereceli olarak ilerler. Sistemik olarak enfekte olmuş bitkilerde ilk belirti yaşlı yapraklarda görülür. Bu yapraklar solar ve aşağı doğru sarkıp asılı kalır. Bu hastalıkta, bitkinin bir tarafı solduğu halde diğer tarafı sağlıklı görülebilir. Bazı durumlarda aynı yaprak sapına bağlı olan yaprakçıkların bir kısmı solgun gözükürken diğer yaprakçıkların turgorunu koruduğu ve sağlıklı görüldüğü durumlara da rastlanabilir. Etmen meyve de ise ortası kahverengi ve çevresi beyaz bir hale ile çevrili kuş gözü lekeleri olarak bilinen simptomlar gösterir (Özaktan ve Bora, 1991). Bakteriyel etmen köpek üzümü gibi Solanaceae familyası üyelerinde de yaşayabilir. Nem, etmenin bitkiyi hastalandırabilmesi için önemli bir etkendir (Fatmi ve Schaad, 1988). Etmenin farklı yerlerde yaşamını sürdürebilme özelliğinden dolayı mücadelesinde zorluklar yaşanmaktadır. Sertifikalı tohum ve fide kullanımı bakteriyel solgunluk hastalığının mücadelesi için önemlidir. Ancak bu etmenle epifitik olarak bulaşık olan tohumların sertifika alabilme olasılığı bulunmaktadır. Bu şekildeki tohumlar ve yine bu tohumlardan elde edilen fidelerin kullanımı ile hastalık yayılabilmektedir (Chang ve ark., 1992). Ancak uygulanabilirliği kabul edilmiş olan tohum uygulamaları da Cmm e karşı her zaman etkili olmayabilir (Thyr ve ark., 1973). Aynı zamanda kültürel önlemlerin tek balına yetersiz oluşu çiftçileri yoğun olarak kimyasalların kullanımına yöneltmektedir. Bitki hastalıkları ile mücadelede yoğun biçimde kullanılan kimyasalların insan sağlığı ve doğa üzerine olan olumsuz etkilerinin üzerine tüketicilerdeki bilinçlenme ve çevre kirliliğine karşı duyarlılığın artması üreticileri daha az kimyasal kullanmaya

18 7 yönlendirmiştir. Özellikle bakteriyel patojenlerin kimyasallara karşı dayanıklılık oluşturmaları, bunlara karşın bakteriyel solgunluk hastalığına karşı yeterli ve etkili bir mücadele yönteminin olmayışı dayanıklı çeşit kullanımını da kapsayan alternatif yöntemlerin çalışılmasını öncelikli konular haline getirmiştir. Bu projenin amaçları; bakteriyel kanser hastalığına karşı ümitvar olarak bulunan NCEBR3 domates mutantlarının M3 populasyonundaki patojenisite testlerini gerçekleştirmek, orijinal NCEBR3 domates bitkileri, M3 domates mutant bitkileri ile yabani domates bitkisi Solanum pimpinellifolium (LA 1579) bitkileri arasındaki polimorfizmi SSR markörleri ile belirlemek, M3 mutant bitkileri ile yabani S. pimpinellifolium (LA 1579) bitkilerini melezleyerek F 1 popülasyonunu oluşturmaktır. Bu çalışma ile NCEBR3 orijinal ve bunların M3 mutantları ile yakın akrabaları olan S. pimpinellifolium (LA 1579) bitkileri arasındaki genetik kalıtım ortaya konmaya çalışılacaktır.

19 8 2. LĐTERATÜR ÖZETLERĐ 2.1. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al., Hakkında Genel Bilgiler Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis; Prokaryota alemi, Firmicutes bölümü, Thallobacteria sınıfı, Microbacteriaceae familyası, Clavibacter cinsi içerinde yer almakta (Agrios, 2005) ve dünya çapında domates üretimini kısıtlayan en önemli bakteriyel etmenlerden biri olarak bilinmektedir (Saygılı ve ark., 2006). Etmen bakteri, Erwin F. Smith tarafından ilk olarak Bacterium michiganense daha sonra Aplanobacter michiganense olarak isimlendirilmiştir. Đlerleyen zamanlarda Pseudomonas michiganensis, Phytomonas michiganensis ve Mycobacterium michiganensis olarakta isimlendirilmiş, ancak terminolojik isimlendirmenin kabul edilmesiyle yaklaşık 50 yıl Corynebacterium michiganense olarak adlandırılmıştır lerde patojenin hücre duvarı yapısı ile ilgili yeni bilgilere dayanılarak Clavibacter sınıfı içerisinde yeniden sınıflandırma yapılmış ve Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al. olarak isimlendirilmiştir (Gleason ve ark., 1993). Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, domates (Solanum lycopersicum Mill.), biber (Capsicum annum L.), patlıcan (Solanum melongena) ve Lycopericium hirsutum, Lycopericium pimpinellifolium gibi bazı Solanaceae familyasına ait türlerde hastalık oluştursa da, domates ekonomik anlamda önemli olduğu tek kültür bitkisidir (Çetinkaya-Yıldız ve Aysan, 2008). Hastalık belirtileri, etmenin bitkiye giriş yoluna göre farklılık göstermektedir. Enfeksiyon tohumdan gelişirse veya yaralar yoluyla patojen direkt iletim demetlerine giriş yapmışsa sistemik enfeksiyondan söz edilir. Sistemik enfeksiyonlar bitkilerde solgunlukla başlar (Şekil 2.1). Tek taraflı solgunluk, renk değişimi ve yanıklık (Şekil 2.2) tipik hastalık belirtileridir. Sistemik enfeksiyonlar fide döneminde meydana gelmişse genç fideler hızla solar, çöker ve ölür. Đlerleyen dönemde ise hasta bitkilerin gövdeleri boyuna kesildiğinde iletim demetlerinde başta sarımsı renklenme daha sonra

20 9 kızılımsı kahverengiye dönen renk değişimi (Şekil 2.3) gözlenir. Solmuş bitkilerin iletim demeti tıkandığından ileri dönemde yapraklara besin ve su taşınması gerçekleşmez bunun sonucunda da yanıklıklar hatta kavrulmuş gibi görünümler ortaya çıkar (Çetinkaya-Yıldız ve Aysan, 2008). Eğer patojen hidatodlar gibi doğal açıklıklar veya tüylerin kırılmasıyla açılan yaralardan bitkiye girdiğinde ise, lokalize olmuş enfeksiyondan söz edilir. Yaprakçıkların kenar nekrozları genellikle lokalize olmuş enfeksiyonların ilk simptomlarıdır (Şekil 2.4). Lokalize olmuş bir enfeksiyon zamanla, iletim demetlerine ilerleyerek uygun koşullar altında sistemik bir enfeksiyonu başlatabilir. Hastalıktan dolayı meydana gelen kayıplar esas olarak bitkilerin solması ve çökmesi ile oluşmakta, domates meyveleri üzerinde KUŞ GÖZÜ lekesi olarak bilinen 3-6 mm çaplı, ortası kahverengi ve çevresi beyaz bir hale ile çevrili yüzeysel simptomlar şeklinde kendini gösteren lekeler de meyvenin pazar değerini düşürmektedir (Çetinkaya-Yıldız ve Aysan, 2008). Şekil Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu sistemik enfeksiyon sonucu oluşan solgunluk görünümü.

21 10 Şekil Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu yaprak yanıklığı Şekil 2.3. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu iletim demetlerinde ki renklenme belirtileri

22 11 Etmen gövde, meyve ve iletim demetlerinde renk değişikliği, gövdede çatlama şeklindeki KANSER lere, bitkinin öz kısmında boşluklar oluşumuna ve sonunda bitkinin ölümüne neden olmaktadır (Özaktan ve Bora, 1991). Yapraktaki belirti genelde yaprakların kenar kısımlarında gözlenir. Hastalığın bu dönemine Yanıklık Dönemi adı verilir. Şekil 2.4. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu lokalize enfeksiyon sonucu oluşan lokal yaprak yanıklıkları Domateste ekonomik zarar meydana getiren bu bakteriyel etmenin inokulum kaynakları, bulaşık toprak, yabancı otlar, hastalıklı bitkiler, hastalıklı bitki artıkları ve özellikle bulaşık tohumlardır (Çetinkaya Yıldız ve Aysan, 2008). Bu hastalıkla mücadelede; hastalıksız tohum kullanımı, fiziksel ve kimyasal tohum uygulamaları (Fatmi ve ark., 1991), koruyucu bakır uygulamaları (Özaktan, 1991), toprak solarizasyonu (Tokgönül, 1998), biyolojik mücadele (Tokgönül ve Çınar, 1999), bitki aktivatörleri (Çetinkaya Yıldız ve Aysan, 2005) ve çinko gübrelemesi (Çakmak ve Aysan, 2009) önerilmektedir. Ancak istenilen düzeyde hastalık önlenememektedir. Mücadelede en etkin ve çevreci yöntem olanak varsa dayanıklı çeşit kullanılmalıdır.

23 C. m. subsp. michiganensis (Smith) Davis et al., in Epidemiyolojisi Đle Đlgili Yapılan Çalışmalar Bakteriyel etmen Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ilk kez 1909 yılında Amerika Birleşik Devletlerinin Michigan eyaletinde domates üretim alanlarında saptandığından beri dünyanın domates yetiştirilen bütün bölgelerinde rapor edilmiştir (Gleason ve ark.,1993). Cmm domates bitkisinde hem kalite hemde kantite de azalmaya neden olmaktadır. Sherf ve Macnab (1986) bakteriyel solgunluk hastalığını domatesin en korkulan ve yıkıcı hastalıklarından biri olarak tanımlamakta ve 1960 yılında Kuzey Carolina, Kenya ve Ontario da %60-80 nin üzerinde ürün kayıpları ile sonuçlanan epidemiler oluşturduğunu bildirmektedirler. Chang (1992a) fidelerin tarlaya şaşırtılması esnasında enfektelenen domates bitkilerinde %31-83 oranında enfeksiyon oluştuğunda, ortalama meyve ağırlığında 13 g, toplam ürün miktarında ise %46 oranında azalma olduğunu bildirmiştir. Etmen Amerika Birleşik Devletlerinin Midwest (1930 lu ve 1980 li yıllar), Ontario (1960 lı ve 1980 li yıllar) ve Kuzey Carolina (1960 lı yıllar) eyaletlerinde çeşitli yıllarda meydana getirdiği epidemilerde üretici bazında %80 nin üzerinde, bölgesel olarak ise %5-10 oranında ürün kaybına neden olmuştur (Gleason et al., 1993). Ricker ve Riedel (1993) yaptıkları çalışmada, fideler tarlaya şaşırtılmadan önce etmen tarafından enfektelendiğinde çevre şartlarına bağlı olarak ürün miktarının %63-93 oranında azaldığını bildirmişlerdir. Ülkemizde ise bakteriyel solgunluk hastalığının varlığı Tokgönül (1998) ün bildirdiğine göre ilk olarak Đç Anadolu bölgesinde (Bremer ve Özkan, 1950) saptandıktan sonra, Güney Doğu Anadolu (Bremer ve ark.,1952), Marmara (Karahan, 1965) ve Ege bölgesinde (Karaca ve Saygılı, 1977) tespit edilmiştir. Daha sonra yapılan çalışmalarda etmen Doğu Akdeniz (Çınar, 1980), Çukurova bölgesi (Öktem, 1985) Batı Akdeniz (Basim ve ark., 2004) ve Doğu Anadolu (Sahin ve ark., 2002) bölgelerinde domates üretim alanlarında belirlenmiştir.

24 13 Hastalığın Ankara ilinde %0.5 ile %23 arasında bir yaygınlık gösterdiği tespit edilmiştir, ancak bazı ilçelerde %100 bulaşık tarlalara da rastlanmıştır. Yapılan çalışmalarda patojenin kurumuş domates gövdesinde 5 ay, kurumuş yaprakta (saplı) ise 4 ay süre ile yaşadığı tespit edilmiştir ( (Öktem, 1985). Orta Anadolu Bölgesi nde 14 ilde (Afyon, Ankara, Bolu, Burdur, Çankırı, Eskişehir, Isparta, Kayseri, Kırşehir, Konya, Nevşehir, Niğde, Yozgat ve Zonguldak) domates ekim alanlarında 354 örnekleme noktasında domates bakteriyel hastalıkları surveyi yapılmıştır. Surveyler sonucunda Afyon dışındaki 13 ildeki 97 tarlada Domates Bakteriyel Kanser Hastalığına rastlanmıştır. Hastalık sırayla Isparta (% 5,25),Yozgat (% 4,67), Ankara (% 3,71), Çankırı (%1,8) ve Niğde (%1,4) illerinde oldukça yüksek oranda görülmüş, diğer illerde ise % 0,07 0,71 arasında değişen oranlarda saptanmıştır (Öktem ve Benlioğlu, 1993). Kahveci ve Gürcan (2003) yaptıkları çalışmada Antalya (Alanya, Elmalı, Kaş, Korkuteli, Kumluca, Manavgat, Merkez ve Serik ilçeleri) ilinde incelenen sera ve tarla domateslerinde solgunluk gösteren bitkilerden izole edilen 72 adet bakteri izolatını yaptıkları testler sonucunda Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis olarak tanılamışlardır. Şahin ve ark., (2002) yapmış oldukları bir çalışmada Doğu Anadolu Bölgesinde Oltu, Đspir ve Yusufeli ilçelerinde Target çeşidi ticari domates üretimi yapılan 6 farklı üretim alanında hastalık yaygınlığının %100 olduğunu bildirmişlerdir. Yapılan biyokimyasal testler ve yağ asit metil ester analizleri sonucunda elde ettikleri izolatları Clavibacter michiganensis susp. michiganensis olarak tanılamıştır. Basım ve ark., (2004) Isparta ya bağlı Keçiborlu, Çandır ve Şeyhler ilçeleri ile Antalya ya bağlı Serik, Aksu, Kumluca, Demre ve Kınık ilçelerinde örtü altı domates yetiştiriciliği yapılan alanların %26 ve %65 arasında değişen oranlarda Cmm ile bulaşık olduklarını saptamışlardır.

25 14 Yıldız (2007) ın Çukurova bölgesinde yaptığı arazi sürveyleri sonucu hasta domates bitkilerinden yapılan izolasyonlarda domates bitkilerinin yoğun bir biçimde Cmm etmeni ile bulaşık olduğunu tespit etmiştir. Çalışmada Adana, Mersin, Antalya, Bursa, Artvin ve Đzmir illerinde domates üretim alanlarında sürveyler yapılmıştır. Sürvey yapılan üretim alanlarında simptomolojik olarak yapılan gözlemler sonucunda bakteriyel kanser hastalığının görüldüğü yıllarda %15-25 arasında değişen oranlarda yaygınlık gösterdiği belirlenmiştir. Özellikle bir önceki üretim sezonunda hastalık saptanmış ve yaygınlık oranının %70-80 lere ulaştığı tespit edilmiştir C. m. subsp. michiganensis (Smith) Davis et. al., in Bulaşma Yolları Bakteriyel solgunluk etmeni Cmm toprakta, bitki artıklarında, yabancı otlarda, sera konstrüksiyon malzemeleri, çeşitli tarımsal aletler (fide saksısı, oluk, budama makası vb), üzerinde ve tohumlarda yaşamını sürdürebilmektedir (Blancard, 1988). Tokgönül (1998) ün bildirdiğine göre Grogan ve Kendrik in 1953 de, Thyr ın ise 1969 da yaptığı çalışmalarda Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ile bulaşık domates tohumlarının hastalığın en önemli inokulum kaynağı olduğu ve etmenin tohumda taşınma oranının %0.25 ile %100 arasında değiştiği bildirilmiştir. Ayrıca Tokgönül (1998) ün bildirdiğine göre, Öktem (1985) Türkiye de domates üretiminin periyodik artışına paralel olarak tohumluk probleminin ortaya çıktığını ve çok sayıda çeşidin ülkeye girişi ile domates bakteriyel hastalıklarında artış görüldüğünü bildirmiştir. Chang (1992) fidelerin tarlaya şaşırtılması esnasında enfektelenen domates bitkilerinde %31-83 oranında enfeksiyon oluştuğunda, ortalama meyve ağırlığında 13 g, toplam ürün miktarında ise %46 oranında azalma olduğunu bildirmiştir. Ricker ve Riedel (1993) yaptıkları çalışmada, fideler tarlaya şaşırtılmadan önce etmen tarafından enfektelendiğinde çevre şartlarına bağlı olarak ürün miktarının %63-93 oranında azalma görüldüğünü saptamışlardır. Nedumaran ve Vidhyasekaran (1982) Hindistan ın farklı bölgelerinden elde ettikleri domates tohumları ile yaptıkları çalışmada Cmm ile doğal bulaşıklılığın ciddi bir tehlike oluşturduğunu saptamışlar ve bununla ilgili geniş çalışmaların acil olarak başlaması

26 15 gerektiğini bildirmişlerdir. Ayrıca enfekteli domates tohumlarından etmenin elde edilmesi ve tanılanması için çeşitli yöntemleri araştırmışlardır. Etmenin tohumdan fideye taşınmasının epidemi oluşumundaki öneminin belirlenmesi için yapılan bir çalışmada ise tohumdan fideye %0.01 oranında taşınan Cmm in tarlada önemli bir epideminin başlangıcı olabileceği belirlenmiştir (Chang ve ark., 1991). Özaktan (1991) ın bildirdiğine göre Byran (1930) etmenin iletim sistemi yardımı ile tohumları sistemik olarak enfekte ettiğini ve embiryoda bulunduğunu belirlemiştir. Ayrıca çalışmada doğal enfekteli tohumlarda bakterinin tohuma geçiş oranının %1-5, yapay enfekteli tohumlarda ise %21-40 oranında olduğu belirlenmiştir. Patino-Mendez (1964) yaptığı çalışmada Cmm in tohumları tohum kabuğu veya tohum zarından geçerek enfekte ettiğini, tohum zarının en içte bulunan hücrelerine doğru hareket ettiğini, ancak embriyoya giremediğini saptamıştır. Walker (1969) ise etmenin enfekteli meyve etinin ekstraksiyon işlemi sırasında tohumları yüzeysel olarak bulaştırabildiğini ve tohum kabuğundan kotiledon yapraklara daha sonra ise iletim sistemine yayıldığını belirtmiştir. Cmm in sebep olduğu Domates Bakteriyel Solgunluğunun primer inokulum kaynağının tohum olduğu bilinmektedir (Tsiantos, 1987). Bu etmenin embriyoda bulunduğu ve vasküler sistem yardımıyla tohumları sistemik olarak infekte ettiği (Bryan, 1930) ve etmenin tohumları tohum kabuğu ya da tohum zarından geçerek infekte ettiği, tohum zarının en içteki hücrelerine doğru hareket ettiği fakat embriyoya girmediği saptanmıştır (Pantino-Mendez, 1964). Etmenin infekteli meyve etinin ekstraksiyon işlemi sırasında tohumları yüzeysel olarak bulaştırabildiği ve tohum kabuğundan kotiledonu, daha sonra da vasküler sistemi işgal ettiği bilinmektedir (Özaktan ve Bora, 1991). Birçok araştırıcı ise Cmm in bir diğer inokulum kaynağının toprak olduğunu ve bu etmenin toprakta belirli koşullarda canlılığını sürdürebildiğini belirtmişlerdir (Grogan and Kendrick, 1953).

27 16 Cmm in topraktaki yaşam süresinin belirlenmesi için yapılan bir çalışmada inokulasyondan 8 ay sonra hava ile kurutulmuş topraktan etmen geri izole edilemezken, 2 o C deki nemli toprakta ay süre ile canlı ve virülent kalabildiği saptanmıştır (Strider, 1967). Ayrıca Ciccarone ve Carili (1948) de yaptıkları çalışmada Đtalya da etmenin toprakta dört yıl süreyle yaşayabildiğini belirlemişlerdir. Grogan and Kendrick (1953), etmenin tarladaki kalıntısının önemli olmadığını belirtmiştir, Dick (1981) ise kışı toprakta geçiren bakterinin meyve üzerinde lekelenmelere sebep olduğunu saptamalarına rağmen; Ciccarone ve Carili (1948) Đtalya da bu etmenin toprakta 4 yıl süreyle canlı kalabildiğini belirtmiştir. Bulaşık kalıntılarda da bu etmen bir yıldan uzun süre canlılığını sürdürebilmektedir (Farley and Miller, 1973). Basu (1966) nun yaptığı bir çalışmada ise; 20 º C de domates yaprakları inkube edilmiş ve etmenin 36 hafta süreyle canlı kalabildiği saptanmıştır. Gleason ve ark. (1991) toprak yüzeyinde kalan bulaşık bitki artıklarında etmenin en az 24 ay boyunca canlı kalabildiğini fakat toprağa gömülen bulaşık bitki artıklarında sadece 7 ay boyunca canlılığını sürdürdüğünü belirlemişlerdir. Ayrıca araştırıcılar kışı bulaşık bitki artıklarında geçiren epifitik Cmm populasyonunun primer inokulum kaynağı olarak rol oynayabileceğini bildirmektedirler. Chang ve ark., (1992) patojenin toprak yüzeyinde kalan bulaşık bitki artıklarında, toprağa gömülen bulaşık bitki artıklarına göre daha uzun süreyle canlılığını koruyabildiğini belirlemişlerdir. Gitaitis ve ark., (1989) domates bakteriyel solgunluk hastalığının esas inokulum kaynaklarının topraktaki artıklar, yabancı otlar, bulaşmış odunsu parçalar, enfekteli bitkiler ve enfekteli tohumlar olduğunu bildirmişlerdir. Etmenin latent peryodunun uzun olması, hasta ve sağlıklı fide ayrımının yapılmasını güçleştirmektedir. Bu yüzden araştırıcılar hızlı tanıda yarı seçici besi yeri kullanımını önermekte ayrıca akşamsafası (Mirabilis jalapa) bitkisinde etmen tarafından oluşturulan aşırı duyarlılık reaksiyonunun hızlı tanıda güvenilir bir kriter olabileceğini bildirmektedirler. Trevors ve Finnen (1990) ise organik maddeler içeren kumlu, killi yapıdaki steril olmayan toprağa 12 patojenik Cmm izolatı inokule etmişlerdir. 30 gün boyunca yaptıkları izolasyonlarda başlangıçta etmeni %90 seviyelerinde geri izole ederken 30.

28 17 günde bu oran %10 un altına düşmüştür. Araştırıcılar patojenin bazı izolatlarının toprakta canlılığını devam ettirebildiğini bir kısmının ise zayıf canlılık gösterdiğini saptamışlardır. Patojenin düşük yoğunlukta elde edilmesinin, etmenin izolasyonundaki zorluklardan kaynaklanabileceğini bildirmişlerdir. Cmm in seconder bulaşma kaynağının ise; budama, koltuk alma gibi kültürel işlemlerin yanı sıra yağmur, su ve pestisit damlacıklarının olduğu belirtilmektedir (Sasaki, 1987). Fatmi ve Schaad (2002) farklı coğrafik bölgeler de Cmm in bulaşık bitki artıklarında canlılığının belirlenmesi üzerine araştırmalar yapmışlardır. Çalışmalarını Amerika Birleşik Devletlerinin California ve Ohio eyaletlerinde Fas ın ise Melk Zhar ve Ait Melloul bölgelerinde sürdürmüşlerdir. Araştırıcılar patojenin toprak yüzeyine bırakılan domates gövdelerinde Ohio ve California da 314 gün boyunca, Melk Zhar ve Ait Melloul da sırası ile 194 ve 132 gün boyunca canlılığını devam ettirdiğini saptamışlardır. Toprağa gömülen gövdelerde ise etmenin Ohio da 314 gün, California da 240 gün, Ait Melloul ve Melk Zhar da 60 gün boyunca yaşamını sürdürdüğünü belirlemişlerdir. Araştırıcılar elde ettikleri bu bilgiler ışında Cmm in bitki artıklarındaki yaşam süresinin hem coğrafik bölgeye göre, hem de bitki artıklarının toprak yüzeyinde veya toprak içerisinde gömülü olmasına bağlı olarak değiştiğini bildirmişlerdir C. m. subsp. michiganensis (Smith) Davis et. al., Đle Mücadele Primer enfeksiyonların önlenmesinde tohum bulaşıklığının giderilmesi öncelikli bir konudur. Tohumla taşınan bakteriyel etmenlerin mücadelesinde tohum uygulamaları olarak; 1. Genel olarak üretim materyaline (tohum, fide, fidan vb) uygulanan antagonistlerin (Bacillus subtilis (Quantum 4000TM), Penicillium oxalicum, Chaetomium spp., Pseudomonas cepacia, Streptomyces griseoviridis (Mycostop), Gliocladium virens, Agrobacterium radiobacter ve Trichoderma spp.) yer aldığı, biyolojik mücadele yöntemi,

29 18 2. Tohum partilerinde patojenlerin enfeksiyonları nedeni ile rengi, şekli ve görünümü değişmiş, zarar görmüş tohumların mekanik olarak ayrılması esasına dayanan, mekanik mücadele yöntemi, 3. Tohumlara zarar vermeden, sıcaklıkla (sıcak su uygulaması, sıcak hava uygulaması, havalı buhar uygulaması ve radyasyon uygulaması) patojenlerin ortadan kaldırılması prensibi ile çalışan fiziksel mücadele yöntemi, 4. Streptomisin sülfat, Streptomisin, Kasugamisin, Na hipoklorit (NaOCl), Bronopol, Captafol, Mancozeb, TCMTB, Thiram, Hidroklorik asit (HCI), Sodyum hidroksit (NaOH) ve Sodyum fosfat (Na3PO4) gibi kimyasalların kullanıldığı kimyasal mücadele yöntemi uygulanmaktadır (Karsavuran ve ark., 2005). Tohum uygulamaları, tohum ve toprak kökenli mikroorganizmaların zararını önlemek veya azaltmak için düşünülmüş yöntemlerdir (Karsavuran ve ark., 2005). Sodyum hipoklorit, hidroklorik asit, bakır asetat, sıcak su uygulamaları Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis e karşı etkili bulunan fiziksel ve kimyasal tohum uygulamalarıdır (Özaktan, 1991). Hastalık ile mücadelede yoğun biçimde kullanılan kimyasalların insan ve çevre sağlığı üzerine olan olumsuz etkilerinin ortaya çıkması, düşük dozlarda ve çevreye dost kimyasal kullanımının hızla artmasına neden olmuştur. Bunun yanında bakteriyel solgunluk hastalığına karşı yeterli ve etkili bir mücadele yönteminin olmayışı insanları yeni mücadele yöntemlerinin arayışına sürüklemiştir. Bu patojeni elimine etmek için kullanılan birçok mücadele yöntemi vardır. Bu mücadele yöntemlerine ilişkin literatür özetleri aşağıda verilmiştir. Đnfekteli tohumda bulunan bakteriyi yok etmek için önerilen mücadele yöntemleri içinde kuru sıcaklık ve sıcak su uygulamaları ile ilgili literatür bilgilerini özetlemek gerekirse; Fatmi ve Schaad (1988), 0.6 M HCl de 5 saat, % 0.5 asitli bakır asetatta 20 dakika, 52 º C sıcak suda 20 dakika veya 56 º C sıcak suda 30 dakika tohum uygulaması kullanarak patojenin tohumdan eradikasyonunu sağlamışlardır. Uygulanan blotter testlerinde, 56 0 C de sıcak su uygulaması hariç, bütün tohum uygulamaları çimlenmeyi

30 19 olumsuz etkilemiş, ancak tohumlar steril toprağa ekildiğinde ise sadece HCl ve 52 º C de ki sıcak su uygulaması çimlenmeyi önemli ölçüde düşürmüştür. Ark (1944), infekteli bitkilerden elde edilen domates tohumlarını 24 saat süreyle ºC de kuru sıcaklığa bırakmak suretiyle tohumda bulunan bakterinin kontrol edilebileceğini ve bu sıcaklık derecelerinin tohum çimlenmesi için de toksik olamayacağını kanıtlamıştır. Özaktan ve Bora nın, (1991), yaptığı bir çalışmada Cmm ile bulaşık tohumlara, ekimden önce sıcak su uygulaması yapılmıştır ve buna göre en etkili sıcaklık uygulamasının; º C olduğu saptanmıştır. En etkili kuru sıcaklık uygulaması ise bulaşık tohumların 75 C de 16 saat bekletilmesinden elde edilmiştir. Yapılan başka bir araştırmada ise 53 C sıcak su uygulamasının (Orth, 1937), 56 C de 30 dakika süreyle sıcak su uygulamasının, Goode and Sasser (1980) ise; C de 25 dakika süreyle sıcak su uygulamasının infekteli domates tohumunda bulunan Cmm yi başarılı şekil elimine ettiğini saptamışlardır. Domates tohumlarının % 0-6 lık HCl ile dakika süreyle ekstrasyonundan sonra 66 C de 3 saat kurutulmasının sistemik infekteli domates tohumlarındaki Cmm nin elimine edilebileceği saptanmıştır (Thyr et al., 1973). Blood (1937), yeni ekstrakte edilmiş tohumların % 0,8 lik asetik asit içinde 24 saat süre bekletilmesi sonucunda Cmm nin elimine edildiğini belirtmiştir. Shoemarker and Echandi (1976) ise, tohumların % 1,05 lik sodium hypocholorit içinde 40 dakika, % 5 lik HCl de ise, 5 saat süreyle tutulması sonucunda hastalığın önemli ölçüde engellendiğini saptanmıştır. Dhanvantari (1989), tohumlar 0,6 M HCl, % 0,6 sodium hypocholorit içinde 15 dakika süreyle bekletilmesi sonucunda etmenin önemli ölçüde engellendiğini saptamıştır. Hastalıklı domates tohumları % 0,5 lik ethyl mercury phosphate solüsyonu içinde 5 dakika süreyle tutulması sonucunda, in vivo testlerde % arasında hastalıktan arı tohum elde edildiği ve fitotoksisite görülmediği saptanmıştır. Özaktan ve Bora nın (1991), Metoksietil civaklorür ün değişik dozlarıyla yaptığı tohum ilaçlamasında, domates tohumlarında Cmm e etkisinin en yüksek olduğu dozun, ppm olduğu saptanırken, Streptomycin uygulamasında ise bu dozun, ppm olduğu in vitro

31 20 testlerde saptanmıştır. Karahan (1969) ve Çınar (1980) ın yaptığı çalışmada % 15 Hg içeriğine sahip olan phenyl mercury acetate preparatının Cmm ye karşı etkinli olduğunu saptamışlardır. Tohumların % 0,1 lik civa klorid süspansiyonuna daldırmanın etmeni elimine etmekte başarılı olduğu belirtilmiştir (Mathai, 1984). Bogatsevska et al. (1989) ise; infekteli tohumların 52 º C sıcaklıkta 25 dakika % 0,25 lik phenyl mercury acetate süspansiyonuna daldırılması sonucunda tohum kaynaklı olan bu hastalığın önemli ölçüde azaltıldığını ve sıcaklık olmaksızın yapılan tohum uygulamasının daha az etkili olduğunu bildirmiştir. Yapılan başka bir çalışmada ise streptomycin in, etkili bir tohum ilacı olduğu in vivo ve in vitro testlerle saptanmıştır (Waksman, 1949). Köhler (1950) ise; hastalıkla bulaşık tohumların % 0,01 lik streptomycin süspansiyonunda 20 dakika süreyle bekletilmesinin, kontrolde % 60 oranında hastalık gözlenmesine karşın, uygulama görmüş tohumlardan gelişen bitkilerde bakteriyel kansere rastlanmadığını saptamıştır. Yapılan diğer bir çalışmada ise Cmm ile yapay infekteli domates tohumlarının 24 saat süreyle antibiyotik süspansiyonuna bırakılması sonucunda kontroldeki hastalık şiddetinin % 84,6 olduğu saptanırken, Penicilin dışında Streptomycin, Bacitracin ve Polymycin B gibi antibiyotiklerin bakteriyel solgunluğu etkili biçimde kontrol ettiği saptanmıştır. Streptomycin in 4 saat içinde tohum gömleğini geçtiği ve Cmm için etkili bir tohum ilacı olduğu belirtilmiştir. Tohumda bulunan patojenin elimine edilmesinde kullanılan bir diğer mücadele yöntemi ise; meyve etli tohumların fermentasyona tabi tutulmasıdır. Bu alanda yapılan çalışmalarda (Blood, 1937), meyve etli tohumların saat süreyle yapılan fermentasyonunda tohumdaki inokulumun kontrol edilebildiği; bunun nedeninin ise fermente olan meyve eti içinde laktik ve asetik asitlerin varlığı ve infekteli tohumların bu asitlerle ıslatılması sonucunda bu etmenin gelişiminin engellemesi sonucuna varılmıştır. Krüger ise (1959) ; fermente olmuş meyve etinin Cmm ye karşı engelleme aktivitesinin yüksek olduğunu ve fermentasyon sırasında üretilen antibiyotiklerin tohum gömleğinden embriyoya geçme yeteneğini kanıtlamıştır. Mathai (1984) ise; 30 C de 2-3 gün süreyle yapılan fermentasyonun bakteriyi engelleme konusunda başarılı olduğunu saptamıştır. Özaktan ve Bora (1991) ise, katkı yapılmaksızın sadece meyve etli tohumlar, toprak katkısı ve çürük meyve kullanılarak yaptıkları fermentasyon işlemi sonucunda oluşan mikroorganizmaların fermente olmuş meyve suyu örneklerinden izole

32 21 edilmiş ve bu bakterileri antagonistik yetenekleri açısından değerlendirmiştir. Sonuç olarak; her üç uygulamada da hastalığın önlenmesine karşın toprak katkılı fermentasyonun patojeni daha iyi elimine ettiği saptanmıştır. Bu hastalığı elimine etmekte kullanılan bir diğer yöntem de tohum uygulamalarının, kimyasal mücadele ile desteklenmesidir. Krüger (1960), domates fidelerinin Cmm ile infeksiyonundan önce köklerin albamycin, albamycin + terramycin ile uygulama görmesinin hastalık şiddetinde önemli bir azalmaya neden olduğunu saptamıştır. Strider (1969), fungisid uygulaması ve nemli hava koşullarında hastalığın yayılım hızının arttığını ve bakteriyel etmenin kullanılan fungisidlerde canlı kalabildiğini belirtmiştir. Bunun dışında standart fungisid programına (Maneb + Zineb) tribazik bakır sülfat ın veya streptomycin katılmasının meyve ve yaprak simptomlarını azalttığı sonucuna varılmıştır. Congleton and Huisingh (1970), gövde inokulasyonundan önce 14 saat süreyle kökleri 10 µg/ml Vancomycin veya Ristocetin içine daldırılarak uygulama gören ve bulaşık toprağa dikilen bitkilerdeki hastalık şiddetinde % oranında azalma olduğu belirtilmiştir. Farley and Miller (1973) ise, etmenin budama ile yayıldığını belirterek, budama öncesi ve sonrasında 4,5 g/l tetracycline püskürtmekle sera koşullarında hastalığın kontrol edildiğini, aynı şekilde tarlada da etkili sonuç verdiğini belirtmişlerdir. Pilavcı ve Ulukuş (1987), fide köklerine yaptıkları 3 saatlik antibiyotik uygulaması sonucunda; 5,0 g/l dozundaki troleandomycin in etkililiğinin % 29,36 olduğunu, 1,0 g/l dozundaki streptomycin uygulamasının ise % oranında etkinlik sağladığını saptamışlardır. Etmenin tohumda taşınma oranı % 0, olmasına karşın (Agarwal and Sinclair, 1997) bazı alanlarda bulaşık topraklardan kaynaklanan infeksiyonlar da önem taşımaktadır. Strider (1967), organizmanın toprakta 18 ay süreyle canlı kalabileceğini ve toprağa yapılacak olan methyl bromide uygulamasıyla bakterinin elimine edilebileceğini

33 22 saptamıştır. Upstone (1971) ve Docea and Marinescu (1977), Metham-sodium gibi bir fumigant uygulamasının bulaşık toprağı dezenfekte etmede etkili olduğunu belirtmişlerdir. Schuster and Wagner (1972) ve Pena (1982), şaşırtma yastıklarına uygulanan formalin, topraktaki patojenin elimine edilmesinde etkili olduğunu bildirmişlerdir. Bu çalışmaların dışında bakteriyel solgunluk ve kanser hastalığını önlemede diğer bir mücadele yöntemi ise, bazı zararsız kimyasalların bitki eksratlarının ve eterik yağların kullanımına yönelik çalışmalardır. Bu alanda yapılan literatür bilgilerini özetlemek gerekirse; Soylu et all., (2003), %50 (WP) Acibenzolar-S- methyl (ASM) etkili maddesini distile edilmiş su içinde çözdürülerek fidelere içirme yöntemiyle uygulamıştır. Bu uygulama sonucunda oluşan Superoxide dismutase ve Glutathione S17 transferase enzimlerinin patojen bakteri populasyonunda % 68,2, hastalık şiddetinde ise % 75 oranında azalmaya neden olduğunu saptanmıştır. Basım et all (2005), polen ve propolis ekstraktı kullanımının, patojen bakteriye etkisini araştırmıştır. Polen ve propolis ektraktının farklı konsantrasyonları besin ortamına karıştırılmış ve 48 saatlik inkubasyondan sonra oluşan engelleme zonları ölçülmüştür. Araştırıcı, bu konsantrasyonlar içinde 1/5 oranında yapılan polen ekstraktı uygulamasında en yüksek engelleme zonunun uygulamada 10 mm olduğunu, propolis ekstaktının ise en yüksek engelleme zonunu yine 1/5 oranında yapılan uygulamada 11 mm olarak ölçüldüğü belirtilmiştir. Slusarski (2004), Peracetic acid + Hydrogen peroxide, Alkyldimethylbenzylammonium chloride + glutaraldehyde, Alkyldimethylbenzylammonium + biguanidine türevi ve greyfurt ekstraktını kaya yününde yetiştirilen domates bitkisine damla sulama yöntemiyle uygulamıştır. Bunun sonucunda, dezenfektanlar hastalık şiddetinde önemli ölçüde düşüşe neden olurken, pazarlanabilir üründe % 2-15 oranında artış sağlandığı saptanmıştır; greyfurt ekstraktının ise dezenfektanlar gibi Cmm e karşı etkili olmasına sağlamasına rağmen meyve veriminde ise önemli ölçüde düşüşe neden olduğu belirtmiştir. Türküsay ve Tosun (2005), bitki aktivatörü olarak kullanılan HuwaSan TR -50 (Hidrojen Peroksit 580 g/l ve kolloid gümüş 0.36 g/l) isimli preparatın Cmm e karşı in vivo ve in vitro etkileri değerlendirmiştir. In vivo test sonuçlarına göre;

34 23 HuwaSan TR -50 nin Cmm nin koloni gelişimini % 61 oranında engellediği saptanmıştır. Yapılan in vivo testlerde ise yapay olarak infekteli tohumlara uygulanan bu preparatın ise Cmm e karşı % 75 lik bir etki sağladığı saptanmıştır. Araştırıcılar, kimyasal preparat olan Champ Formula (Bakır hidroksit, 361,1 g/l) ile HuwaSan TR - 50 yi birlikte uyguladıklarında ise bu etkinin % 81,7 oranında olduğunu saptamışlardır. Dimitra et all (2002), mercanköşk, kekik, yer fesleğeni, lavanta, adaçayı, yabani fesleğen, kuşburnu ve geyik otu gibi çeşitli bitkilerden elde edilen eterik yağları in vitro koşullarda değerlendirmiştir. Araştırıcı, eterik yağları King B besi ortamına farklı konsantrasyonlarda ( µg/ml) karıştırmış, Cmm i ise petri kabına yayma şeklinde vermiş ve petride oluşan koloni sayılarına göre değerlendirme yapmıştır. En etkili sonucun kekik ve gazel otundan alındığını belirtmiştir. Kekik bitkisinde 100 µg/ml uygulama dozunda Cmm in koloni sayısında % 100 oranında düşüş sağlandığı, gazel otunda ise 150 µg/ml dozda patojen bakterinin sayısının koloni sayısı % 100 oranında düştüğü belirtmiştir. Bu hastalığı önlemedeki diğer bir mücadele yöntemi ise özellikle son yıllarda oldukça önemli sonuçların alındığı canlı organizmalar ile (biyolojik mücadele) hastalığın elimine edilmesi yöntemidir. Özaktan ve Bora (1991); fermantasyon sırasında domates meyve etinin fermantasyon sıvısından, fermantasyon sırasında izole ettikleri bir antagonistik bakteri ile uygulama gören Cmm ile % 100 bulaşık tohumlardan yapılan reizolasyonlarda ve ELĐSA testi ile yapılan kontrollerde, %6 gibi çok düşük bir patojen bakteri populasyonu saptamışlar, tarla denemesinde ise; bu bakteri ile uygulama gören domates fidelerinde solgunluk çıkışının % 75 oranında engellendiğini belirtmişlerdir. El- Abyad et all (1992) ; invitro testlerde Streptomyces pulcher ve S. citrefluorescens in etkisini araştırmıştır. Bu antagonist bakterilerin farklı dozdaki filtrat konsantrasyonları Cmm ile petride karşı karşıya getirilmiş ve patojen bakterinin oluşturduğu koloni sayıları saptanmıştır. Kontrolde koloni sayısı 200 olarak hesaplanırken, her iki antagonist bakteri içinde % 80 filtrat konsantrasyonunda koloni sayısı 0 olarak hesaplanmıştır. Ayrıca Streptomyces pulcher in tohum kaplama, tohum daldırma ve toprak inokulasyon yöntemleri ile inokulum kaynağıyla bulaşık etmene uygulanması sonucunda toprak inokulasyonu ve tohum daldırma uygulamalarında

35 24 hastalık şiddeti % 100 oranında engellenirken tohum çimlenmesinin ise % oranında olduğu saptanmıştır. Tohum daldırma uygulamasında ise hastalık şiddetinin % 57,1 oranında, tohum çimlenmesinin ise % 96 oranında olduğu sonucuna varılmıştır. Boudyach et al (2001), domates bitkisinin rizosfer ve rizoplane inden izole ettikleri 178 bakteriyel strainden özellikle 3 ünün tohum uygulamasını takiben fide uygulaması şeklinde sisteme sokulması durumunda, Cmm infeksiyonunu başarıyla engellediğini ve etkili antagonist bakterilerinin genelde flourosent Pseudomonas lar olduğunu belirtmiştir. Bacillus subtilis (Quadra 136), Trichoderma harzianum (Root Shield), rizozom, kompost sıvısı, Rhodosporidium diobovatum (533) ve B.subtilis (Quadra 137) domates bitkilerine pulverize edilerek uygulandığında, sera kosullarında, domates bitkilerinde Cmm den kaynaklanan bakteriyel solgunluk ve kanseri, inokule edilmiş kontrol bitkileriyle karşılaştırıldığında başarıyla engellemiştir (Utkhede and Koch, 2004). Slusarski, 2004 nin 4 farklı antagonist bakterinin Cmm e etkisini testlediği bir çalışmada, bakteriler kaya yününe damla sulama sistemiyle verilmiş ve bunun sonucunda hastalık şiddetinde düşüş, pazarlanabilir ürün miktarında ise % 7-17 oranında artışın elde edildiği belirlenmiştir. Umesha (2001), antagonistik P. flourescens ile tohum uygulamasının laboratuvar koşullarında tohum kalitesini ve çıkışını başarıyla engellediğini saptamıştır C. m. subsp. michiganensis (Smith) Davis et. al., ın Moleküler Yöntemler Kullanılarak Tanısı Đle Đlgili Çalışmalar Çaplık ve Basım (2009) yapmış oldukları bir çalışmada domates bakteriyel solgunluk ve kanser hastalık etmeni Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) ile domates ve biber bakteriyel yaprak lekesi hastalık etmeni Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (Xav) nin tanısı ve tespiti için hassas ve seçici bir Taqman Real-Time PCR yöntemi geliştirilmişlerdir. Cmm ye ait pat-1 gen dizisi ve Xav ye ait hrp gen dizisini kullanarak geliştirmiş oldukları yeni bir primer ve TaqMan prob setinin hassasiyeti, Real-Time PCR yöntemiyle farklı Cmm ve Xav strainlerine, farklı cins ve türe ait bitki patojeni bakterilere ve domates ile biber genomik DNA sına karşı test etmişlerdir.. 73 bp ve 69 bp lik PCR ürünleri sırasıyla tüm Cmm ve Xav strainlerinin genomlarından çoğaltılabilirken, Cmm ve Xav dışındaki diğer bakteri strainlerinden ve domates ile

36 25 biber total genomik DNA sından çoğaltılamamıştır. Bu çalışmada geliştirilen TaqMan Real-Time PCR yönteminin Cmm ve Xav nin tespitindeki hassasiyeti, Cmm ve Xav nin saf genomik DNA ları florumetrik spektrofotometre kullanılarak picogram (pg) düzeyinde belirlenmiştir. Đçsel dizi kontrolünün sağlanması için TaqMan probu kullanılarak geliştirilen bu Real- Time PCR yöntemi Cmm ve Xav nin tanısı ve tespitinde seçici, hassas ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Bu yöntemin, Cmm ve Xav strainlerinin direkt hücreden hızlı ve hassas bir şekilde tanısında, domates ve biber tohumlarından ve hastalıklı bitki dokularından tespitinde yaygın olarak kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Patojenik olan izolatların PCR testi ile saptanması amacı ile Santos ve ark., (1997) tarafından CM3-5 CCT CGT GAG TGC CGG GAA CGT ATC 3 ve CM4-5 CCA CGG TGG TTG ATG CTC GCG AGA T 3 primer çifti, Louws ve ark., (1999) tarafından ise CMM-5 (GCGAATAAGCCCATATCAA) ve CMM-6 (CGTCAGGAGGTTCGCTAATA) primer çifti geliştirilmiştir. Ömer (2002) Bio- PCR testi ile hastalık simptomu görülmeden bile patojenin tespit edilebileceğini bildirmiştir. Bitkinin erken gelişme devrelerinde özellikle bitki simptom göstermediğinde ve ürün tohum üretimine yönelik olduğunda patojenin tespit edilmesi için BIO-PCR yöntemini önermiştir. Hadas ve ark., (2005) ise de 1 bulaşık tohumun Bio-PCR tekniği ile saptanabileceğini bildirmişlerdir. Benzer şekilde Burokiene (2006) domates fidelerinde Cmm in neden olduğu enfeksiyonun erken dönemde tanılanabilmesi için Bio-PCR ın kullanım olanaklarını araştırmıştır. Araştırıcı CMM-5 ve CMM-6 primerlerini kullandığı Bio-PCR çalışması sonucunda bu tekniğin seçiciliğinin yüksek, hızlı ve güvenilir olduğunu, sağlıklı domates bitkilerine patojenin yayılmasını erken dönemde önlemede kullanılabileceğini bildirmiştir. Jahr ve ark., (1999) yaptıkları çalışmada Cmm in patojenik özelliklerinin yaklaşık 1500 nükleotid den oluşan pat-1 geni üzerinde toplandığını belirlemişlerdir. Pa-t1 genine sahip olan Cmm izolatları virülent, sahip olmayanlar ise avirülent olarak ayrılmıştır. Tanı çalışmalarında virülent Cmm izolatlarını ayırt etmek için PCR testinde kullanılan primer dizilerinin pat-1 geni üzerinde bulunan baz dilimlerine göre dizayn edildiğini bildirmişlerdir. Garterman ve ark., 2003 yılında yaptıkları çalışmada pcm1 ve pcm2

37 26 plazmidine sahip olan Cmm izolatlarının virülenslik gösterebildiklerini diğerlerinin ise virülent izolatlar olmadığını ortaya koymuşlardır. pcm1 de selülazı kodlayan cela geni, pcm2 üzerinde ise serin proteazı kodlayan pat-1 geni yer almaktadır. Bach ve ark., (2003) ise fitopatojenik C. michiganensis alt türlerinin farklılıklarının ve niteliklerinin belirlenmesi için TaqMan-PCR protokolü oluşturmuşlardır. Geylani (2005), çeşitli firmalardan temin edilen 75 tohum örneğini ISTA (International Seed Testing Association) prosedürlerine göre testlemiş ve elde ettiği izolatları biyokimyasal testler, PCR testi ve Immunofloresan boyama testi ile Cmm olarak saptamıştır. Özdemir (2005) Cmm ve Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria için sırası ile pat-1 genlerinden elde edilen 614 bp lik CMM5 ve CMM6 primer çifti ile hrp genlerinden elde edilen 840 bp lik RST2 ve RST3 primer çiftlerini kullanarak multiplex-pcr kullanımı olanaklarını araştırmıştır. Bu çalışma ile tek bir PCR tüpünde Cmm ile Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria nın sırası ile CMM5 ve CMM6 ile RST2 ve RST3 primerlerinin en iyi 0.2:0.4 µm primer konsantrasyonlarında çoğalabilecekleri ve en iyi bağlanma sıcaklığının da 58.5 ile 59.5 oc olduğu belirlenmiştir. Ayrıca araştırıcı multiplex-pcr kullanılarak zamandan, iş gücünden ve reaksiyon maliyetlerinden tasarruf edilebileceğini bildirmektedir. Rep-, Eric- ve Box-PCR kullanılarak C. michiganensis in beş alt türü olan C. m. subsp. michiganensis, C. m. subsp. nebraskensis, C. m. subsp. tesellarius, C. m. subsp. sepedonicus ve C. m. subsp. insidiosum un genetik farklılıkları ortaya konmuştur. Ayrıca Rep-PCR kullanılarak, DNA polymorfizmine göre C. m. subsp. michiganensis in en az dört tipi (A, B, C ve D) olduğu saptanmıştır (Louws ve ark., 1998). Dreier ve ark. (1995) C. michiganensis in alt türlerinin plasmid üzerinde yer alan ve endonüklez enzimini kodlayan cela ya spesifik olarak geliştirilen DNA probları kullanılarak ayırt edilebileceğini ortaya koymuşlardır. Ayrıca Cmm e özgü olan ve

38 27 virülensliği kodlayan pat1 genine spesifik primer kullanılarak PCR testi ile hastalık oluşturma yeteneğine sahip izolatların saptanabileceğini belirtmişlerdir. Günümüzdeki ıslah programları ağırlıklı olarak dayanıklı çeşit geliştirmeye yönelik olmaktadır. Çünkü yetiştiricilikte önemli ekonomik kayıplara yol açan hastalıklarla en etkin mücadele yöntemi dayanıklı çeşitlerdir C. m. subsp. michiganensis (Smith) Davis et. al., e Karşı Yapılmış Olan Dayanıklılık Mekanizmaları Đle Đlgili Çalışmalar Domates üretimini dünya çapında sınırlayan en önemli bakteriyel etmenlerden olan Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in kimyasal mücadelesinde bakırlı preparatların yeterli ve etkili olamaması, bu tarımsal ilaçlara karşı bir süre sonra dayanıklılık probleminin ortaya çıkabilmesi, kullanılan kimyasalların insan ve çevre sağlığına karşı olumsuz etkileri ve çevre kirliliği sorunu araştırıcıları alternatif mücadele yöntemlerine yönlendirmiştir. Yapılan son çalışmalar en ekonomik, çevreci ve sürdürebilir olmasından dolayı bakteriyel solgunluk etmenine karşı dayanıklı çeşit kullanımı üzerine yoğunlaşmıştır. Dayanıklı çeşitlerin geliştirilmesi uzun ıslah çalışmaları sonucu ortaya çıkmaktadır. Çünkü dayanıklılık kaynakları domatesin yabani türlerinde bulunmaktadır ve bir çeşide eklenen pek çok dayanıklılık genleri, ıslah çalışmalarında beraberinde istenmeyen özellikleri de getirmektedir (Scott, 2005). Son yıllarda biyoteknoloji alanındaki hızlı gelişmeler, bitki ıslahında kullanımını rutin hale getirmiştir. Klasik ıslah çalışmalarında kullanılan morfolojik işaretleyiciler genotipleri birbirinden ayırmaya yardımcı olmakla birlikte fenotipik özelliklerdir ve çevre koşullarından etkilenebilmektedir. Bu karakterlerden herhangi birinin resesif (çekinik) olması durumunda homozigot dominant ve heterozigot bireyler tespit edilememektedir. Bundan dolayı özellikle hastalıklara dayanıklılık ıslahında moleküler işaretleyicilerin kullanımı ile klasik bitki ıslahında büyük bir gelişme sağlanmıştır. Dayanıklı genlerle bağlantılı moleküler işaretleyicilerin kullanılmasında ana avantaj, hassas ya da dayanıklı genotiplerin seçilebilmesidir. Genç bitki yapraklarından DNA

39 28 hızla çıkarılır ve bulunan dayanıklı genler analiz edilir, yalnızca dayanıklı genotipler seçilerek melezlenir ve sonraki generasyonlarda yeni dayanıklı çeşitler elde edilir. Böylelikle seleksiyon için zaman ve yer azaltılarak bir günde yüzlerce bitki aynı anda seçilebilir (Barone et al., 2005). Dünya genelinde diğer birçok bitki patojenine karşı olduğu gibi Cmm e karşı da dayanıklı çeşitlerin geliştirilmesi ve dayanıklılık mekanizmaları konusunda çalışmalar yapılmıştır. Elazığ, Mardin ve Diyarbakır illerinde yürütülmüş olan bir dayanıklılık çalışmasında 15 çeşitten Süper - 1 ve Red top çeşitlerinin hastalığa karşı oldukça duyarlı olduğu, buna karşı Süpermarmande, P378 RT17, Süper -14, SC 2121, Es -24, Cal-Ace, ve YF -134 çeşitlerinin hastalığa daha az duyarlı olduğu belirtilmiştir. Ancak, hastalığa tam bağışık bir çeşit saptanamamıştır (Ulukuş, 1982). Çınar (1980) Çukurova bölgesinde yaptığı çalışmada 23 adet domates çeşidini Cmm e karşı dayanıklılık açısından incelemiş ve 3 domates çeşidini az duyarlı olarak saptamıştır. Cmm e karşı dayanıklılığı kontrol eden genler hakkında farklı bilgiler vardır. Hastalığın kalıtımına bakıldığında Clavibacter e dayanıklılıkk birden fazla gen tarafından kontrol edilmekte ve Cmm geni Clavibacter e dayanıklılığı ifade etmektedir. Yani Cmm e dayanıklılık kantitatif özellikte olup türlere göre farklılık göstermektedir. Bu hastalığın dayanıklılık kaynağı olarak, domatesin yabani türleri olan S.pimpinellifolium, S. hirsutum ve S. peruvianum tanımlanmaktadır (Sandbrink ve ark., 1995). Bu bakteriyel etmene dayanıklı S. peruvianum kaynaklı LA2157 aksesyonu ve S. hirsutum kaynaklı LA407 aksesyonları geliştirilerek, bunlarda hastalığa dayanıklılıkla ilişkili çalışmalar yapılmıştır (Van Heusden ve ark.,1999) Coaker (2004) tarafından yapılan bir çalışmada Lycopersicum hirsutum un LA407 hattı Cmm e karşı kısmi bir dayanıklılığa sahip olduğu yapılan patojenisite testleri

40 29 sonucunda bulunmuştur. Bu hattın genetik olarak özellikleri incelendiğinde ise kantitatif özellikte bir dayanıklılığa sahip olduğu belirlenmiştir. Francis ve ark., (2001), yaptıkları çalışmada da kullanılan LA407 dayanıklı olarak bulunmuş ve diğer bir dayanıklılık kaynağı olan Solanum peruvianum orjinli LA 2157 en iyi dayanıklılık kaynağı olarak tespit edilmiştir. Ayrıca LA2157 ile yapılan genetik analizlerde dayanıklılık genleriyle ilgili ilk çalışmalarda 5 QTL (Sandbrink ve ark.,1995) ve sonraki çalışmalarda 3 QTL (Van Heusden ve ark.,1999) belirlenerek, en etkili QTL in 7. kromozomda olduğu belirtilmiştir. 7 nolu kromozomda S. peruvianum kaynaklı dayanıklılıkla ilişkili SCAR moleküler işaretleyicisi de belirlenerek, ıslahta kullanılacağı belirtilmiştir. LA407 materyali ile yapılan genetik çalışmada da Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis izolatlarına dayanıklılıkla ilgili 2. ve 5. kromozomlarda bulunan 2 QTL belirlenerek, her iki QTL ile ilişkili RGA işaretleyicileri belirlenmiştir. Özellikle S. peruvianum ile kültür domatesi arasında yapılan melezleme çalışmalarında embriyo veya ovül kurtarma çalışmalarının gerekliliği, bu kaynağın ıslahta kullanımını sınırlamaktadır. Solanum hirsutum kaynaklı LA407 dayanıklı aksesyonla S. esculentum hatları arasındaki melezmelerden oluşturulan iki F2 populasyonunda yapılan genetik analizlerde dayanıklılıkla ilişkili 2 QTL (2. ve 5 kromozomlarda) ve dayanıklılık genleriyle ilişkili RGA moleküler işaretleyicisi belirlenmiştir (Kabelka ve ark., 2002). S. Hirsutum kaynaklı bu iki QTL in haritalaması çalışmalarında epistatik etkide dayanıklılığı kontrol ettiği ortaya konmuştur (Coaker ve Francis, 2004). Rai and Strobel (1969), Lycopersicon esculentum PI Thyr (1968) L. hirsutum Bulgaria 12, Utah 737, L. esculentum P. I çeşitlerinin Cmm e karşı dayanıklı olduklarını saptamışlardır. Thry (1969) en yüksek dayanıklılık seviyesinin Lycopersicum pimpinellifolium ve L. hirsitum da bulunduğunu belirtmişlerdir. Ancak bu kaynaklar dayanıklılığın sadece kısmi bir seviyesine sahiptir.

41 30 Linthout ve Purimahua (1989) Cmm e dayanıklılık için L. peruvianum un 57 genotipini taramışlardır. Sadece 5 çeşidin hastalığa karşı daha az duyarlı olduğunu tespit etmişlerdir. Dayanıklı bulduğu çeşitlerden olan LA2157 ve hassas çeşit olan LA2172 hattını melezleyerek dayanıklılığın kalıtımını araştırmışlardır. Dayanıklılığın kalitatif bir özellikte olduğunu yani tek bir gen tarafından kontrol edildiği sonucuna varmışlardır. Dayanıklılığın genetik özelliklerinin saptanması yanında hastalığa karşı bitkinin savunma sistemini artırması konusunda da çalışmalar yapılmaktadır. Bitkilerde dayanıklılığın teşvik edilmesi için biyotik uyarıcılar (bakteri, fungus, virus ve nematodlar) ya da abiyotik uyarıcılar (salisilik asit, glisin, jasmonik asit, etilen ve bazı herbisitler) oldukça geniş bir patojen dizisine karşı pek çok kültür bitkisinde kullanılmıştır (Ozeretskovskaya, 1995). Baysal ve Soylu (2003) tarafından yapılan bir çalışmada bitki aktivatörü kullanılarak domates bitkisinde peroxidase, glutathione peroxidase, chitinase, superoxide dismutasu ve glutathione S-transferase enzimlerinin miktarlarını artırarak Cmm e karşı dayanıklılığı teşvik ettiği ayrıca uygulamalar sonucu bitkilerde hastalık şiddetini %76, bakteriyel gelişmeyi ise %68 oranında azalttığı belirlenmiştir. Türküsay ve Tosun (2005), bitki aktivatörü olarak bilinen hidrojen peroksit in in vivo ve in vitro etkilerini değerlendirmişlerdir. Bitki aktivatörü yardımıyla domatesin Cmm e karşı dayanıklılığının artırılması ve uyarılan bitki savunma mekanizması enzimlerinde meydana gelen değişikliklerin saptanması amacıyla yapılan bu çalışmada hidrojen peroksit in laboratuar koşullarında petrilere, tohumlar üzerine ve fidelere uygulamaları gerçekleştirilmiştir. Bu denemede in vitro testlerde, bitki aktivatörü tarafından Cmm nin koloni gelişimini %61.3 oranında engellemiştir. Tohumlara yapay olarak Cmm inokulasyonundan sonra uygulanan hidrojen peroksit muamelesi %73.5 lik bir etki sağlamıştır. Domates fidelerinde Cmm nin engellenmesi amacıyla uygulanan aktivatörün etkisi incelendiğinde ise patojenin etkisinin %70 lik bir oranda azaldığı tespit edilmiştir.

42 31 Yapılan uygulamalar sonucunda Cmm ile enfekte edilmiş olan bitkilerde savunma tepkisinin bir göstergesi olarak peroksidaz enziminin spesifik aktivitesinde kontrol grubuna oranla önemli artış saptanmıştır. Bu çalışma sonucunda bitkide peroksidaz enziminin arttığı görülmüştür. Savunma mekanizmasının işleyişinde erktin olarak yer alan peroksidaz enziminin bitkilerde çoklu savunma sisteminin önemli bir bölümünü oluşturmaktadır ve bitkilerin çoğunda kloroplastlarda sentezlenmektedir (Türküsay ve Tosun, 2005).

43 32 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. MATERYAL Çalışmada Kullanılan Fitopatojen Bakteriler Bakteriyel etmen Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in en virülent ırkı olan Cmm2 Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü Öğretim Üyesi Prof. Dr. Hüseyin Basım tarafından çalışmalarımızda kullanılmak üzere hediye edilmiştir Çalışmada Kullanılan Test Bitkileri Çalışmada kullanılacak domates NCEBR1-6 hatları Prof. Dr. Randy GARDNER (Horticultural Science, North Carolina University, USA) tarafından bizlere hediye edilmiştir. Diğer yabani domates tohumları ve kültür domates tohumu NC84173 University of California Tomato Genetics Resource merkezinden ( temin edilmiştir. Diğer M3 (NCEBR3 mutantı) tohumları ise Cmm ye karşı hassas olan kültür domates hattı NCEBR3 tohumları önceki çalışmada %0.5 EMS solüsyonu kullanılarak mutasyona uğratılmış bu tohumların geliştirilmesi sonucunda M1 bitkileri elde edilmiştir. M1 bitkilerinden elde edilen tohumların tekrar viollere ekilip Cmm2 patojeni ile patojenisite testine tabi tutulması sonucunda dayanıklı olan M2 bitkileri seçilmiştir. Bu M2 bitkilerinin tohumlarının tekrardan geliştirilmesi sonucunda elde edilen bitkiler Cmm2 izolatıyla patojenisite testi yapılmış ve sonuçta dayanıklılığı ümitvar olan M3 bitkileri seçilmiştir. Tüm orijinal domates tohumları, yabani domates tohumları ve mutant domates tohumları biyoteknoloji serasında kontrollü olarak kendilenmeye bırakılmakta ve bu hatlardaki tohumların devamı sağlanmaktadır. Hasat edilen tohumlar +4 C buzdolabında kullanılıncaya kadar saklanmaktadır.

44 33 Tablo 3.1. Bakteriyel kanser ve solgunluk (Clavibacter michiganensis subsp. micgiganensis) hastalığına karsı Amerikan Ulusal Germplasm Sisteminde ( taranarak laboratuarımıza getirilen tohumlar. Tohumun Adı (Accesion No) Orijini Latince Đsmi NCEBR1 Amerika L. esculentum NCEBR2 Amerika L. esculentum NCEBR3 Amerika L. esculentum NCEBR4 Amerika L. esculentum NCEBR5 Amerika L. esculentum NCEBR6 Amerika L. esculentum Kullanılan Çözeltilerin ve Besi yerlerinin Hazırlanışı 1. Glucose yeast carbonate agar (GYCA): 5 g. glucose, 5g. yeast extrate, 40g. calsium carbonate sırasıyla tartılarak içerisine 1 L. distile su (dsh 2 O) eklenmiştir. Karışımın ph sı 7.2 ye ayarlanmıştır. Sonrasında karışıma 15 g. agar ilave edilmiştir. Erlen mayerlerin ağzı alüminyum folya ile iyice kapatıldıktan sonra karışım karıştırıcıda belli bir süre karıştırılmıştır. Besi yeri 121 ºC de 1 atm basınçta 20 dk. otoklav edilmiştir. Otoklavdan çıkan besi yerleri soğuduktan sonra steril kabinde 90mm lik steril plastik petrilere dökülerek donmasına izin verilmiştir. 2. Nutrient Agar (NA): 28 g. nutrient agar tartılarak içerisine 1 L distile su ilave edilmiştir. Erlenmayer in ağzı alüminyum folya ile iyice kapatıldıktan sora ortam karıştırıcıda belli bir süre karıştırılmıştır. Besi yeri 121 ºC de 1 atm basınçta 20 dk. otoklav edilmiştir. Otoklavdan çıkan besi yerleri 45 ºC ye kadar soğuduktan sonra steril kabinde 90 mm lik steril plastik petrilere dökülerek katılaşmaya bırakılmıştır. 3. Nutrient Broth (NB): 13 g. nutrient broth tartılarak üzerine 1 L distile su ilave edildikten sonra sıvı besi yeri 121 ºC de 1 atm basınçta 15 dk. otoklav edilmiştir. 4. %30 luk Gliserol: 70 ml distile su içerisine 30 ml gliserol eklendikten sonra otoklavda 121 ºC de 1 atm basınçta 15 dk. otoklav edilmiştir.

45 34 5. %3 lük KOH Çözeltisi: 3 g. KOH 100 ml distile su içerisinde çözülerek hazırlanmıştır. 6. %70 lik Etil Alkol: 70 ml etil alkol üzerine 30 ml distile su eklenerek hazırlanmıştır. 7. 5X TBE Buffer: 54,0 g l -1 Tris-Base ph: 8.0, 27.5 g l -1 Boric Asid, 20 ml l M EDTA ph: X Loading Dye: %0.25 Bromophenol blue, % 0.25 Xylene Cyanol, %15 Ficoll (Type 400 Pharmacia) 9.TE Buffer: 10mM Trisma-HCl ve 1mM EDTA 100 ml distile su içerisinde karıştırıcıda karıştırılarak çözülmüştür. Karışımın ph sı sodyum hidroksit kullanılarak 8 e ayarlandıktan sonra 121 ºC de 1 atm basınçta 20dk. otoklav edilmiştir M KAC (Potasyum Asetat) Çözeltisi: 49, 075 g. 5 M KAC 100ml distile su içerisinde karıştırıcıda karıştırılarak çözülmüştür. Hazırlanan çözelti 121 ºC de 1 atm basınçta 20dk. otoklav edilmiştir M NaAc (Sodium Asetat) Çözeltisi: 40, 824 g. 3 M NaAc 100ml distile su içerinde karıştırıcıda karıştırılarak çözülmüştür. Hazırlanan çözelti 121 ºC de 1 atm basınçta 20dk. otoklav edilmiştir M TE (Trisma-HCl) Çözeltisi: 15,76 g. 1 M Trisma-HCl ve 100 ml su ile hazırlanan karışımın ph sı sodyum hidroksit kullanılarak 8 ayarlanmış ve çözelti 121 ºC de 1 atm basınçta 20dk. otoklav edilmiştir M EDTA Çözeltisi: 18,612g. 0.5 M EDTA ve 100 ml distile su ile hazırlanan çözeltinin ph sı sodyum hidroksit kullanılarak 8 e ayarlanmış ve çözelti 121 ºC de 1 atm basınçta 20dk. otoklav edilmiştir.

46 M NaCl (Sodyum Klorür) Çözeltisi: 29,22 g. 5 M NaCl 1000 ml distile su içerisinde çözülmüş ve hazırlanan çözelti 121 ºC de 1 atm basınçta 20dk. otoklav edilmiştir M KOH (Potasyum Hidroksit) Çözeltisi: 56,109 g. KOH 1000ml su içerisinde çözüldükten sonra 121 ºC de 1 atm basınçta 20dk. otoklav edilmiştir. 16. %20 SDS Çözeltisi: Sodiumdodecylsulphate 200 g l YÖNTEM Bitkilerin Yetiştirilmesi Çalışmalarda kullanılan kültür domates hattı NCEBR3, yabani domates hattı LA1579 ve mutatant domates hattı M3 bitkilerinin tohumları viyollere ekilmiştir. Viyollerde çimlenen ve 2-3 gerçek yapraklı döneme ulaşan domates fideleri içerisinde buhar ile sterilize edilmiş torf bulunan 7 numaralı saksılara şaşırtılmıştır. Saksılardaki bitkiler Ziraat Fakültesi Biyoteknoloji laboratuarı serasında 16 saat (h) gündüz, 8 h gece ışıklanmaya sahip, %50 nispi nem içeren, 25±2 C derecede tutulan kontrollü ortama yerleştirilmiştir. Bitkilerin sağlıklı gelişebilmesi için topraktan ve yapraktan besin maddeleri takviyesi yapılmıştır.

47 36 Şekil 3.1. NCEBR3, M3 ve LA1579 hattına ait domates fidelerinin 7 no lu saksılara aktarıldıktan sonra Biyoteknoloji serasında gelişmeleri Bakteriyel Hastalık Etmeni Cmm2 nin GYCA Besi Ortamında Geliştirilmesi Besi ortamı steril plastik petrilere dökülüp donması sağlandıktan sonra stok halinde bulunan Cmm2 izolatından öze ile alınarak steril kabinde GYCA besi ortamına 3 lü çizimi yapılmıştır. Petri kapları ekim yapıldıktan sonra etrafı streç film ile sarılıp patojenin gelişebilmesi için en uygun sıcaklık olan 28 ºC de ki etüvde 3 günlük süre ile bekletilerek bakterilerin gelişimi sağlanmıştır.

48 37 Şekil 3.2. Bakteriyel etmen Cmm2 nin GYCA besi ortamındaki gelişimi Patojenisite Testi Patojenisite testleri hastalık etmeni Cmm2 ye karşı dayanıklı ve hassas domates bitkilerini ortaya koyabilmek için yapılmıştır. Bu amaçla steril şartlarda GYCA besi ortamında geliştirilen CMM2 izolatları steril kürdan yardımıyla 8-10 yapraklı dönemdeki inokule grubu domates fidelerinin gövdelerine batırılarak inokule edilmiştir (Şekil ) (Yıldız, 2007). Daha sonra sera şartlarında inokule grubu bitkilerdeki hastalık etmeninin gelişimi 28 gün boyunca gözlemlenmiştir (Şekil ).

49 38 Şekil 3.3. Steril şartlarda besi ortamında geliştirilen Cmm2 bakteri izolatlarının steril kürdan yardımıyla domates fidelerinin gövdelerine batırılarak inokulasyonun gerçekleştirilmesi. Şekil 3.4. Đnokule grubu bitkilerdeki bakteriyel etmenin gelişimi

50 Melez Bitkilerin Oluşturulması Hastalık etmeni Cmm2 ile patojenisite testlerinde kullanılan bitkilerin hastalık gelişimlerine bakılarak dayanıklı ve hassas bitkiler belirlenmiştir. Dayanıklı ve hassas domates bitkileri çiçeklenme dönemine geldiğinde birbirleriyle melezlenerek F1 hibrit melez bitkileri oluşturulmuştur. Melezleme işleminde hassas ebeveyn olan LA1579 un tamamen açılmış çiçeklerden petri içerisine polen tozları alınmıştır. Petri kabı içerisindeki polenler hafifçe ezilip toz haline getirilerek kullanıma hazır hale getirilmiştir. Dayanıklı ebeveyn olan M3 bitkisinin tam açılmamış olan çiçeklerinin bir pens yardımı ile önce taç ve çanak yaprakları açılmıştır. Daha sonra polen ana hücreleri dişicik borusuna zarar vermeden, dişicik borusu yalnız kalacak şekilde uzaklaştırılmıştır. Yalnız bırakılan dişicik borusuna hazırlanmış olan LA1579 polenleri değdirilerek tozlanma işlemi gerçekleştirilmiştir. Melezleme yapılan çiçek yabancı tozlanmayı engellemek için parşömen kağıdından yapılan ışığı ve havayı geçiren kese kağıtlara konularak kapatılmıştır. Melezleme işleminin başarılı olabilmesi için bu işlem bir gün aralıklarla 3 defa tekrarlanmış ve bir bitkide en fazla üç tane çiçeğe melezleme yapılmıştır. Şekil 3.5. Polen ana hücrelerinin dişicik borusuna zarar vermeyecek şekilde pens yardımıyla uzaklaştırılması

51 40 Şekil 3.6. Yalnız bırakılan dişicik borusuna hassas ebeveynin polenlerinin değdirilmesi Şekil 3.7. Melez meyvelerin gelişimi.

52 Bitkilerden DNA Đzolasyonu Bakteri inokule edilmiş ve kontrol bitkilerinden ilk 7 gün, 14., 21., ve 28. Günlerde genç yapraklardan ependorf tüp içerisine yaprak örnekleri alınmış ve her tüp ayrı ayrı etiketlenmiştir. Hücresel organellerin açığa çıkması ve hücre duvarının parçalanması için, fiziksel olarak dondurup-çözme işlemi ve kimyasal maddeler uygulanmıştır. Bu işlem için yaprak örnekleri sıvı azot içerisinde dondurularak sıcak ekstraksiyon buffer içerisinde öğütülerek yapılmıştır. Hücre membranı ise CTAB ya da SDS gibi deterjanların kullanılmasıyla parçalanmıştır. DNA yı nükleazlardan ayırmak için EDTA gibi deterjanlar kullanılmıştır. DNA-protein kompleksinin çözülmesi ve proteinlerin uzaklaştırılması buffer karışımına kloroform ve/ veya fenol karışımı eklenerek yapılmıştır. Bitki DNA izolasyonunda asağıda belirtilen protokol farklı DNA izolasyonu metotlarının modifiye edilmesi sonucu oluşturulmuştur. 1) 1,5 cm boyunda bir yaprak ependorf tüpte önce 50 µl buffer içinde ögütülür ve daha sonra üzerine 450 µl buffer ilave edilir. 100 ml Buffer: 65 ml dh2o 10 ml 1 M Tris ph: 7,5 14 ml 5 M NaCl 10 ml 0,5 M EDTA ph: 8,0 ==> 65 o C de ısıtılarak, 1 gr CTAB 1 ml 14 M Beta MerkaptoEtanol (BME) eklenir. 2) Bir ünite Proteinase K eklendikten sonra (1 ünite 5 µl konsantrasyon) vorteksde karıştırılır. 3) 50 µl % 20 SDS (veya 80 µl %10 SDS) eklenerek 65oC deki su banyosunda 1 saat tutulur ve ara sıra alt üst ederek karıştırılır.

53 42 4) Su banyosundan çıkarılan tüplere 2 / 3 hacim (400 µl) kloroform : isoamil alkol (24:1) eklenir dakika alt üst edilerek karıştırılır. 5) rpm de 15 dakika santrifüj edilir. 6) Süpernatant 2 / 3 hacim yani 400 µl 2-propanol içeren yeni bir tüpe alınır. Alt üst edilerek DNA gözle görülür hale getirilir. 7) 15 dakika rpm de santrifüj edilir. 8) Sıvı dökülür. Pelet kuruduktan sonra 400 µl 1 x TE eklenir. 9) DNA 60 oc deki su banyosunda 3 saat eritilir. 10) 10 mg / ml RNase çözeltisinden 1 µl eklenir ve su banyosunda 1 saat bekletilir. 11) 400 µl kloroform:isoamil alkol (24:1) eklenir. Tüpler 10 dakika alt üst edilerek karıştırılır. 12) 15 dakika g de santrifüj edilir. 13) Süpernatant 100 µl 1.2M NaCl (veya 26 µl 5 M NaCl ) içeren yeni bir tüpe alınır. Hafifçe karıştırılır. 14) 800 µl % 96 soğuk etil alkol ilave edilir. Alt üst edilip karıştırılarak DNA çökeltilir. 15) g de 20 dakika santrifüj edilir ve sıvıyı dökülür. 16) Pelet 900 µl % 70 soğuk etil alkol ile dikkatlice yıkanır. Ters çevrilmiş halde 2 saat kurutulur. 17) Kuruyan pelet 100 µl 1 x TE de çözülür. Toplam 20 µg civarında DNA elde edilebilir. Elde edilen bu DNA lar kullanılıncaya kadar 100 µl TE buffer içerisinde C de saklanmıştır PCR Analizleri Moleküler belirteçlerin teknik açıdan kullanımı kolay, ucuz ve bilgilendiricidir. Temelde, iki farklı DNA belirteç tekniği mevcuttur. Birincisi DNA hibridizasyonuna dayalı RFLP (restriction fragment length polymorphism), diğeri ise PCR (polymerase chain reaction) ye dayalı SSR (simple sequence repeats), RAPD (random amplified polymorphic DNA), AFLP (amplified fragment length polymorphism) ve SRAP

54 43 (sequence related amplified polymorphism) teknikleridir (Gülşen ve Mutlu, 2005). PCR basit ve hızlı bir metottur, yalnızca küçük bir ham ekstrakt DNA ister ve prosedür otomasyona bağlıdır. PCR (polimerase chain reaction) olarak tanımlanan yöntem; genetik materyaller (DNA ve RNA) üzerinde seçilmiş bir veya birden fazla bölgenin in vitro şartlar altında oligonükleotit primer ve Taq polimeraz enzim kullanılarak bir otomatik termocycle sistem (PCR cihazı) yardımıyla amplifiye edilmesidir (Şahin ve ark., 2000). PCR üç farklı basamaktan oluşan reaksiyonlar zinciridir. PCR reaksiyonları; DNA çift zincirinin birbirinden ayrıldığı denatürasyon basamağı, Primerlerin tek zincirliği DNA ya yapıştığı bağlanma (annealing) basamağı, Taq polimerase enziminin nükleotidleri zincire eklediği uzaman (extantion) basamağından oluşmaktadır. PCR, DNA polimeraz enziminin kullanılmasıyla suni şartlarda DNA üretilmesini ifade etmektedir. Bu üretim için 6-25 nükleotid uzunluğunda başlatıcı DNA lar (primerler) gerekir. Reaksiyon ortamının ph sını ve tuz konsantrasyonunu optimum hale getiren tampon çözelti, polimeraz enzimin ihtiyaç duyduğu MgSO 4 ve DNA üretiminde kullanılmak üzere A, T, G, C nükleotidlerinin her birinden konulur. Polimeraz enzimi bu başlatıcı DNA nın bir kalıp DNA üzerine bağlanmasından sonra, onu bir uçtan uzatmaya baslar ve kalıp DNA nın aynısını üretir. DNA üretim işlemi birbirini izleyen bir seri çok spesifik sıcaklık devrelerinden yapılmaktadır. Reaksiyonda önce 95 0 C civarında bir sıcaklık kullanımıyla kalıp (hedef) DNA nın çift sarmal yapısı açılarak hedef DNA nın denatürasyonu sağlanıp DNA tek iplik haline getirilmektedir. Yapışma safhasında C arasında bir sıcaklıkta primerlerin kalıp DNA ya bağlanması sağlanmaktadır. Son olarak da 72 0 C de polimerizasyon yani DNA üretimi yapılmaktadır. Bu üç devre duruma bağlı olarak defalarca (normalde döngü) tekrarlanarak milyonlarca hedef DNA elde edilmektedir. (Sambrook ve ark., 1989).

55 44 PCR ilk kez 1985 te Saiki ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. Thermus aquaticus bakterisinden yüksek sıcaklıklara dayanıklı Taq DNA polimerase enziminin izole edilmesi ve bu enzimin DNA amplifikasyonunda kullanılması PCR ın uygulanabilirliğini artırmıştır (Dönmez, 2004). Bugün birçok obligat fungal ve bakteriyel mikroorganizmaların ve kültür ortamında çoğaltılamayan patojenlerin oluşturduğu hastalıkların teşhisi PCR ile kolayca yapılabilmektedir. PCR, tohum sağlığının belirlenmesinde, çeşitli türlerin tanısında ve türler arsındaki genetik akrabalığın belirlenmesinde kullanılmaktadır (Arı, 1999). Patojen-konukçu arasındaki uyumlu interaksiyonu kodlayan bazı genler (patojenite, virulenslik, avirulenslik, toksin, enzim ve hormon üretimini kodlayan) vardır. Farklı patojenlerde bu tür genlerin baz dizilişleri, genlerin kromozom üzerindeki dağılımları ve tekrarlanma sıklıkları hakkında elde edilen genetik bilgiler patojenin kimliğini açıklamaktadır. O nedenle yukarıda bahsedilen genlerden bir veya birkaçı için spesifik olarak sentezlenen oligonükleotit primerler yardımı ile farklı patojenlerden izole edilen genetik materyaller PCR ile kolayca amplifiye edilmektedir. Daha sonra elde edilen PCR ürünlerinin agorose jel üzerinde elektroforez edilmesiyle patojene spesifik bant veya bant profilleri belirlenerek hastalığa neden olan etmenin tanısı ve aynı zamanda da hastalığın teşhisi yapılmaktadır (Şahin ve ark., 2000). PCR a dayalı işaretleyicilerin kullanımı, kullanıcı için kolay, ucuz, hızlı, ve daha az yoğunlukta işgücü gerektirmesinden dolayı hızla artmıştır. Bu çalışmada SSR markörleri kullanılmıştır. Bundan sonraki bölümlerde bu markörlerin kullanımı ile ilgili çalışmalar yer almaktadır Agarose Jel Elektroforezi Polimeraz zincir reaksiyonu sonucunda elde edilen ürünleri görüntülemek için, UV ışığı altında floresan etki gösteren ethidium bromide (EtBr) boyasının kullanımı ile DNA nın jel üzerindeki yerini belirlemek mümkündür. Bu analizin temeli DNA molekülünün elektriksel jel üzerinde parça büyüklüklerine göre sıralanmasına dayanır. Dolayısıyla jel elktroforezinde kullanılan nişasta, poliakrilamid, agaroz-akrilamid veya agaroz

56 45 destekleyici maddeler mekaniksel etkiyi engellemeyi ve moleküllerin büyüklüklerine göre ayrılmasını sağlar. Üzerlerine 4 µl loading dye ilave edilen PCR ürünleri, DNA %1.5 luk agarose jel üzerindeki kuyucuklara pipetle yüklenmiştir. Đlk kuyucuğa 50 kilobaz (kb) lık PCR marker dan devamındaki kuyucuklara da PCR ürünleri, DNA lardan 15 µl yükleme yapılmıştır. Elektroforez jel düzeneği 100 Volt (V) a ayarlanarak DNA koşma işlemi başlatılmıştır. Agaroz jel elektroforezinde ethidium bromidin DNA bağları arasına bağlanarak nm dalga boyunda ışığı absorbe etmesi sonucu floresan etki göstermesi ile DNA jelde görünür hale gelmiştir. Yapılan 2,5-3 saat koşma işlemi sonunda elektrik bağlantısı kesilip jel tankı, tepsi içerisinden çıkarılmış ultraviyole ışın veren cihaza konulmuş ve böylece jel içerisindeki DNA bantları görüntülenerek fotoğrafı çekilmiştir. Đzole edilen DNA genomik DNA ise keskin bir bant ve yukarı doğru biraz yayılan bir görüntü vermiştir. Elektroforez sonucu büyüklüklerine göre ayrılan DNA lar bantlar oluşturmuş ve bu bantların büyüklükleri Vilber Lourmat jel dokümantasyon sisteminin sahip olduğu Bio- Capt programı kullanılarak polimorfizmleri belirlenmiştir.

57 46 A B C Şekil 3.8. PCR amplifikasyonu sonunda elde edilen PCR ürünlerinin loading dye boyası eklendikten sonra (A) %1.5 luk agarose jele yüklenmesi (B) ve yükleme sonrası jeldeki görünümü (C).

58 47 Şekil 3.9. PCR ürünlerinin 100 V luk akıma bağlı %1.5 luk agarose jelde saat süreli koşturulması Şekil Koşma işleminden sonra agarose jel içerisindeki DNA bantlarının Bio Capt programı kullanılarak görüntülenmesi.

59 Moleküler Markörler Dayanıklı ve hassas domates fenotiplerinde genetik polimorfizmi belirlemek için toplam 11 adet moleküler markör belirlenmiştir. Moleküler markörlerin 11 adedini de SSR (Simple Sequence Repeats) markörü (Tablo 3.2) oluşmaktadır. Çalışmada belirtilen tüm markörlerin olgonükleotid dizilemeleri ĐONTEK (Đstanbul) firmasından temin edilmiştir. Tablo 3.2. NCEBR3, M3 ve LA 1579 bitkileri arasındaki polimorfizmi ortaya koymak için çalışmada kullanılan SSR markörleri Kromozom Marker Annealing Nükleotid dizisi Đsmi sıcaklığı 2 SSR356 Forward 5''-ACCATCGAGGCTGCATAAAG-3' Reverse 5'-AACCATCCACTGCCTCAATC-3' 55 C 4 SSR638 4 TOM184 4 TOM210 5 SSR13 6 SSR47 7 SSR45 Forward 5 TGTTGGTTGGAGAAACTCCC-3 Reverse 5 -AGGCATTTAAACCAATAGGTAGC-3 Forward 5 -CAACCCCTCTCCTATTCT-3 Reverse 5 - CTGCTTTGTCGAGTTTGAA-3 Forward 5 -CGTTGGATTACTGAGAGGTTTA-3 Reverse 5 - ACAAAAATTCACCCACATCG-3 Forward 5 -GGGTCACATACACTCATACTAAGGA-3 Reverse 5 -CAAATCGCGACATGTGTAAGA -3 Forward 5 -TCCTCAAGAAATGAAGCTCTGA-3 Reverse 5 -CCTTGGAGATAACAACCACAA-3 Forward 5 -TGTATCCTGGTGGACCAATG -3 Reverse 5 -TCCAAGTATCAGGCACACCA C 60 C 45 C 45 C 50 C 50 C 50 C

60 49 Tablo 3.2. Devam ediyor 8 SSR38 9 SSR70 Forward 5 -GTTTCTATAGCTGAAACTCAACCTG -3 Reverse 5 -GGGTTCATCAAATCTACCATCA-3 Forward 5 -TTTAGGGTGTCTGTGGGTCC-3 Reverse 5 -GGAGTGCGCAGAGGATAGAG-3 50 C 50 C 9 SSR333 Forward 5 -GTTCCCGCTTGAGAAACAAC 3 Reverse 5 -CCAATGCTGGGACAGAAGAT-3 50 C SSR markörleri PCR amplifikasyonu sonucunda ebeveynler arasındaki polimorfizmi kolayca ortaya koyması, enzimlerle ayrıca kesmeye ihtiyaç duyulmaması nedeniyle hızlı ve güvenilir sonuçlar vermektedir. SSR markörlerinin maliyeti ekstra kesme işlemine ihtiyaç duyulmadığı için daha düşüktür. Çalışmamızda yukarıda saydığımız kolaylıklardan dolayı SSR markörleri öncelikle tercih edilmiştir. 4. BULGULAR 4.1. Patojeniste test sonuçları Çalışmada kullandığımız NCEBR3, M3 ve LA 1579 domates hatları bakteriyel kanser hastalık etmeni Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in en virulent izolatı olan Cmm2 ile inokule edildikten sonra hastalık etmeninin bitkideki gelişimi 0., 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7., 14., 21., ve 28. günlerde incelenmiştir. Bitkilerdeki hastalık gelişimi dikkate alınarak dayanıklı, hassas ve en hassas hatlar ortaya konmuştur (Tablo 4.1).

61 50 Tablo 4.1. Çalışmada kullanılan NCEBR3, M3 ve LA 1579 domates hatlarının Cmm2 ile yapılan patojenisite test sonuçları. Domates Hatları M3 NCEBR3 LA 1579 Dayanıklı Hassas En Hassas X X X Patojenisite testlerinde test edilen NCEBR3 domates bitkileri inokulasyondan 14 gün sonra tamamen ölmüşlerdir (Şekil 4.1). Çalışmada test edilen M3 mutant bitkileri dayanıklılık göstermişler ve inokulasyondan 28 gün sonra hayatta kalarak meyve vermişlerdir (Şekil 4.2). Patojeniste testleri sonucunda LA 1579 bitkilerinde hastalık gelişimi gözlemlenmesine rağmen bitkilerin tamamen ölmediği görülmüştür (Şekil 4.3). Bu sonuçlara göre kültür domatesi NCEBR3 en hassas, yabani domates LA 1579 hassas, ve mutant M3 bitkilerinin dayanıklı olduğu bulunmuştur. Đnokule Kontrol Şekil 4.1. NCEBR3 bitkisinin patojenisite testinden 28 gün sonraki durumu ve kontrol bitkisiyle karşılaştırılması

62 51 Đnokule Kontrol Şekil 4.2. M3 bitkisinin patojenisite testinden 28 gün sonraki durumu ve kontrol bitkisiyle karşılaştırılması 14. gün 28. gün Şekil 4.3. LA 1579 bitkisinin patojenisite testinden 14 ve 28 gün sonraki durumu

63 Moleküler Analiz Sonuçları Çalışmada kullandığımız NCEBR3, M3 ve LA 1579 domates hatlarının DNA ları materyal ve metotta belirtildiği gibi çıkartılmıştır. Çalışmada belirlediğimiz SSR markörlerinden SSR38, SSR70, SSR349, SSR13, SSR47, SSR333, SSR45, SSR638, SSR356, TOM210 ve TOM184 markörleri NCEBR3, M3 ve LA 1579 bitkilerinin DNA ları ile aralarındaki polimorfizmi ortaya koyabilmek için polymeraz zincir reaksiyonunda (Polymerase Chain Reaction :PCR) spesifik bandlar amplifike edilmiştir Moleküler olarak çoğaltılan bu bantları ortaya koyabilmek için PCR ürünleri %1.5 luk agarose jelde koşturularak analiz edilmişlerdir. Çalışmada kullanılan SSR70, SSR47, SSR333, SSR356, SSR45 ve TOM210 markörleri NCEBR3 ve M3 ile aynı bantı oluştururken yabani domates LA1579 ile farklı polimorfik bantlar oluşturmuştur (Şekil 4.4; 4.5 ve 4.6). Test edilen 11 adet SSR markörden 8 adetinin kullanılan domates bitkileri arasında polimorfik bulunması çalışmada seçilen domateslerin arasında %73 oranında bir polimorfizimin olduğunu ortaya çıkarmaktadır.

64 53 Şekil 4.4. Çalışmada SSR38, SSR70 ve SSR349 markörleri kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonun görünümü. SSR70 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 119 bp lik band verirken LA1579 ile 103 bp lik bant oluşturmuştur. SSR349 ve SSR38 markörleri test edilen DNA lar arasında bir ploymorfizm oluşmamıştır. Çalışmada Ladder olarak 50 bp lik moleküler size markör ve Negatif kontrol olarakta distile steril su kullanılmıştır. (1: M3, 2: LA 1579, 3: NCEBR3).

65 54 Şekil 4.5. Çalışmada SSR47, TOM184, SSR13, TOM210 ve SSR70 markörleri kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonun görünümü. SSR47 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 189 bp lik band verirken LA1579 ile 193 bp lik bant oluşturmuştur. TOM210 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 216 bp lik band verirken LA1579 ile 204 bp lik bant oluşturmuştur. SSR70 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 119 bp lik band verirken LA1579 ile 103 bp lik bant oluşturmuştur. TOM184 primeri NCEBR3 ve M3 DNA larıyla amplifikasyon oluşturmamıştır. SSR13 markörü test edilen DNA lar arasında bir polymorfizm vermemiştir. Çalışmada 100 bp lık Ladder kullanılmıştır (1: LA 1579, 2: M3, 3: NCEBR3).

66 55 Şekil 4.6. Çalışmada SSR333, SSR45, SSR638 ve SSR356 markörleri kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonun görünümü. SSR333 primeri NCEBR3 ve M3 ile 201 bp lik bant ve LA1579 ile 223 bp lik bant oluşturmuştur. SSR356 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 255 bp lik bant verirken LA1579 ile 273 bp lik bant oluşturmuştur. SSR45 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 140 bp lik band verirken LA1579 ile 149 bp lik bant oluşturmuştur. SSR 638 markörü M3 mutantı ile 157 bp lik bant veriken LA1579 ile 161 bp lik bant oluşturmuştur. Çalışmada 50bp lık Ladder ve negatif kontrol olarak distile steril su kullanılmıştır. (1: NCEBR3, 2: M3, 3: LA 1579).

67 56 5. TARTIŞMA VE SONUÇ Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu domates bakteriyel kanser ve solgunluk hastalığı ülkemiz dahil domates yetiştiriciliği yapan pek çok ülkenin önemli sorunlarından biridir (Saygılı ve ark., 2006). Bitki bakteri hastalıklarıyla mücadelede ilk adım hastalıksız üretim materyali kullanmaktır. Dünyada aktif olan tohum ticaretiyle hastalık etmeni temiz üretim alanlarına bulaşabilmektedir. Patojen bakteri, üretim alanına bir kez bulaştıktan sonra kültürel işlemler esnasında açılan yaralardan tüm üretim alanına dağılabilmektedir. Özellikle örtü altında bitkiler ıslakken yapılan kültürel işlemler bu patojeni kolayca yayabilmektedir. Üretim sezonu sonunda patojen bakteri toprakta, bitki artıklarında, civardaki konukçu veya konukçu olmayan bitkilerde hatta sera konstriksüyon materyalinde yaşamaya devam etmektedir (Gleason ve ark., 1993). Üreticilerimizin aynı tarlada veya serada her yıl aynı ürünü yetiştirme tercihlerinden dolayı da inokulum bir sonraki üretim sezonuna populasyonunu artırarak yayılmaya devam etmektedir. Böylece patojen bakteri, bir kez bir alana giriş yaptıktan sonra iklim koşulları da patojenin gelişimini desteklerse her yıl hastalık ortaya çıkabilmektedir. Bu şekilde her yıl artış gösteren bakteri inokulumuyla mücadele etmek son derece zordur. Ülkemizde şu an bu hastalık etmeninin bulaşmadığı yöre hemen hemen yok gibidir (Çetinkaya-Yıldız, 2007). Bu hastalık sadece tarla veya serada değil aynı zamanda fide üretim yerlerinin de önemli bir sorunudur. Domates tohumlarının pek çok yerinde (tohum kabuğu, endosperm ve embriyo) yaşamını sürdürebilen Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis tohumun çimlenmesi esnasında populasyonunu arttırır ve iletim demetlerine ulaşarak bitkide solgunluk belirtileri oluşturur (Çetinkaya-Yıldız ve Aysan, 2008). Đnokulum sağlıklı fidelere hava yoluyla veya sulama suyu sıçratmasıyla bulaşarak fidelikte çok sayıda fidenin imha edilmesine neden olabilir. Hastalıklı tohumdan gelişen fideler uygun iklim koşulunu bulamazlarsa belirti göstermeksizin epifitik olarak fidelerde yaşamaya devam ederler. Bu fideler pazarlanıp üretim alanına dikildiğinde uygun iklim koşulları oluştuğunda hastalık ortaya çıkabilir.

68 57 Bu hastalığın epidemiyolojisinden de anlaşıldığı gibi bu hastalığın ilk inokulum kaynağının tohum kabuğu ya da embriyo olması nedeniyle mücadele olarak tohumdaki patojeni elemin etmeye yönelik çalışmalar yapılmaktadır (Özaktan ve Bora, 1991). Ancak tohum uygulamaları da hastalığı önleme de yeterli olmamaktadır. Bu hastalığın bitkiye verdiği zararı önlemek için kimyasallar kullanılmış olsa bile bitkide oluşturacağı zarar tamamen önlenemez. Aynı zamanda kimyasal kullanımı ürün maliyetini artırmakta ve de çevreye ve diğer canlılara zarar verebilmektedir. Dünyanın birçok yerinde birçok bitki patojenine karşı olduğu gibi Cmm e karşı da dayanıklı çeşitler hakkında çalışmalar yapılmaktadır. Ancak bu hastalığa karşı tam dayanıklı bir domates çeşidi saptanamamıştır. Yapılan çalışmalarda Cmm e dayanıklılığın kaynağı daha çok yabani domates çeşitlerinde bulunmuştur. Thyr ve Berry (1989) en yüksek dayanıklılık seviyesinin Lycopersicum pimpinellifolium ve L. hirsitum da bulunduğunu belirtmişlerdir. Ancak bu türlerde hastalığa karşı tam dayanıklılık göstermemektedir. Tarımsal verimin artırılmasında önemli olan etkenlerden birisi hastalıklara karşı dayanıklı bitkilerin kullanılmasıdır. Bu amaçla yapılacak olan çalışmalarda değişik ıslah yöntemleriyle genetik yapıları farklı yeni genotiplerin elde edilmesi amaçlanmıştır (Ünver, 1989). Yeni çeşitlerin elde edilmesi amacıyla yapılacak ıslah çalışmalarında ya doğada bulunan ya da yapay olarak ortaya çıkarılacak genetik varyasyonlardan yararlanılmaktadır. Son çeyrek yüzyılda uygulamay konulan ve ıslahçıların uygulamaya uygulamay başladıkları mutasyon ıslahı doğrudan veya melezleme ıslahının tamamlayıcısı olarak büyük bir önem kazanmıştır (Akbay, 1988). Mutasyon ıslahında temel ilke bitkilerin genetik yapılarına farklı yöntemlerle değişik mutagenlerin farklı dozlarda uygulanarak olumlu veya olumsuz genetik varyasyonların ortaya çıkarılmasıdır. Böylece elde edilen yeni çeşitlerin ekonomik amaçla üretime alınması ya da mutantların melezleme ıslahında ebeveyn olarak kullanılması ıslahçının ulaşmak istediği sonuçtur (Ünver, 1989). Bu amaçla yapılan çalışmaların bir bölümünde, çalışmada kullanılan kültür domates hattı NCEBR3, mutant domates hattı M3 ve yabani domates hattı LA1579 bitkilerinin

69 58 Cmm nin en virulent ırkı olan Cmm2 ye karşı reaksiyonlarına bakılarak dayanıklı ve hassas domates hattını ortaya koyabilmek için patojenisite testleri yapılmıştır. 28 günlük test sonucunda; Cmm2 ye karşı M3 mutant domates hattının dayanıklı, NCEBR3 kültür domates hattının en hassas ve LA1579 yabani domates hattının orta derecede hassas olduğu tespit edilmiştir. Dayanıklı ve hassas domates hatlarının belirlenmesiyle M3 mutant domates hattındaki dayanıklılığın kalıtsal olup olmadığını ortaya koyabilmek için bu bitkiler orta derecede hassas olan ve kültür domatesleriyle farklı genetik yapıya sahip olan yabani domates hattı LA1579 bitkileri ile melezlenmiştir. Projenin diğer bölümünde çalışmada kullanılan kültür domates hattı NCEBR3, mutant domates hattı M3 ve yabani domates hattı LA1579 bitkilerindeki polimorfizmi ortaya koymak için bu bitkilerin orta boy yapraklarından örnek alınmış ve DNA ekstraksiyonu sonucunda genomik DNA ları elde edilmiştir. 15 adet SSR markörü kullanılarak PCR yöntemiyle polimorfik bantlar elde edilmeye çalışılmıştır. Çalışma sonucunda kullanılan 15 adet SSR marköründen. tanesinin polimorfizmi ortaya koyan spesifik bantlar ürettiği görülmüştür.

70 59 6. KAYNAKLAR Abak, K., Türkiye Sebzeciliği Ve Geleceği. VI. Sebze Tarımı Sempozyumu, Kahramanmaraş Sütçü Đmam Üniversitesi, Bahçe Bitkileri Bölümü, Eylül, 1-5s. Kahramanmaraş. Agarwal, V.K., Sinclair, J.B., 1997, Principles of seed pathology, 2.ed. Boca Raton: CRC, p. Agrios, G. N., Plant Pathology. Fifth Edition. Elvesier Academic Press. London, UK. 530 p. Akbay, G., Farklı EMS dozlarının uygulandığı Tokak 157/37 (Hordeum vulgare L.) iki sıralı arpa çeşidi Tohumlarının Farklı Ortam ve Farklı Sürelerde Bekletilmesini M1 bitkilerinin Bazı Özellikleri Üzerine Etkileri. Ankara Ünv. Ziraat Fak. Yayınları Bilimsel Araştırmalar ve Đncelemeler No: 1, 573s. Alan, M. N., Kovancı, Đ., Yoltaş, Y., Çolakoğlu, H., Domatesin Kaldırmış Olduğu Bitki Besin Elementleri, Bunların Taşınması Ve Potasyumun Verime Olan Etkileri Üzeinde Araştırmalar. Türkiye I. Ulusal Bahçe Bitkileri Kongresi, Cilt: 2, Anonim, Anonim, Domates üretimi ve sorunları, Tokat Tarım Đl Müdürlüğü, Anonim, 2011a. Anonim, 2011b. Anonim 2011c.

71 60 Anonymous, Data Sheets on Quarantine Organisms, EPPO publication series Vol:12, No:1, 1-6p. Arı, Ş., DNA nın Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile Çoğaltılması. Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler. Đstanbul Üniv., Biyoteknoloji ve Genetik Mühendisliği Araştırma ve Uygulama Merkezi (BĐYOGEM). Yayın No: 52, 85-91s. Ark, P.A., Studies on Bacterial Canker of Tomato. Phytopathology, 33 (4): Bach, H. J., Jessen, I., Schloter, M. and Munch J. C., A Taqman- PCR protocol for guantification and differention of the phytopathogenic Clavibacter michiganensis subspecies. Journal of Microbiological Methods, 52: Balkaya, A., Karadeniz Bölgesindeki Taze Fasulye (Phaseolus vulgaris L.) Gen Kaynaklarının Teksel Seleksiyon Yöntemi ile Seçimi Üzerinde Araştırmalar. Ondokuz Mayıs Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, Doktora Tezi, 199s, Samsun. Barone, A., Molecular Marker Asisted Selection for resistance to Pathogens in Tomato, Mas in Plants, Sension 1. Basım, E., Basım, H., Dickstein, E. R., ve Jones, J. B., Bacterial Canker Caused by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis on Greenhouse-Grown Tomato in The Western Mediterranean Region of Turkey. Plant Disease, 88:1048. Basım, E., Basım, H., Özcan. M., Antibacterial Activities of Turkish Polen and Propolsis Extracts Against Plant Bacterial Pathogens. Journal of Food Engineering 77 (2006)

72 61 Basu, P.A., Condition forsymtomatological Differantiation of Bacterial Cancer, Spot and Speck on Tomato Seedlings. Can. J. Plant Sci., 46: Bayrak, S. S., Kaya, M. L., Dünya taze domates ve işlenmiş domates ürünleri piyasası önemli ülkelerdeki son durum. AĐB Araştırma Serisi, 59:1-27. Bayraktar, K., Sebze Yetiştirme Cilt:2. Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi, Yayın No:169, 475s. Đzmir. Baysal, Ö., Soylu, E. M., and Soylu, S., Induction of defence-related enzymes and resistance by the plant activator acibenzolar-s-methyl in tomato seedlings against bacterial canker caused by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Plant Pathology. No:52, s. Blancard, D., Domates Hastalıkları: Gözlem, Teşhis, Mücadele. HASAD Yayıncılık, Đstanbul, 215s. Blood, H.L., A Possible Acid Seed Soak for the Control Of Bacterial Canker of the Tomato. Science, 86: Bogatsevska, N., M. Vitanov and P. Boneva, Disinfecting Tomato Seeds Against Bacterial Pathogens. Rasteniev dni Nauki, 26 (4): Boudyach, E. H., Fatmi, M., Akhayat, O., Benizri, E., Ait Ben Aoumar, A, 2001, Selection of Antagonistic Bacteria Of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis and Evaluation of Their Efficiency Against Bacterial Canker of Tomato, Biocontrol Science and Technology, 11: Burokıene, D., Early detecion of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in tomato seedlings. Agronomy Research, 4: Bryan, M. K., Studies on Bacterial Canker of Tomato. J. AGR., 41:

73 62 Chang, R. J., Ries, S. M., and Pataky, J. K., Dissemination of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis by practices used to produce tomato transplants. Phytopathology, 81: Chang, R. J., Ries, S. M., and Pataky, J. K., Reduction in yield of processing tomatoes and ıncidence of bacterial canker. Plant Diseases, 76: Ciccarone, A. and A. Carilli, Osservasion di Campo su Cornebacterium michiganense ( Smith) Jensen e considerazioni su unposibble caso di sua supravvivenza nel terreno. Bolletino della Stazione di Patologia Vegetale, 6: Coaker, Gitta L., Proteomic Analysis of Resistance Mediated by Rcm 2.0 and Rcm 5.1, Two Loci Controlling Resistance to Bacterial Canker of Tomato. Molecular Plant-Microbe Interactions 17(9). Coaker, G. L and Francis, D. M., Mapping, genetic effects, and epistatic interaction of two bacterial canker resistance QTLs from Lycopersicon hirsutum Theor Appl Genet (2004) 108: Congleton, W.F; D.Huisingh, Chemical Control of Bacterial Canber of Tomato with Ristocetin and Vancomycin. Phytopathology, 60 (4): 582 (Abstr). Çakmak, Ö. ve Y. Aysan, Farklı düzeylerde çinko uygulanan domates bitkilerinde bakteriyel solgunluk hastalığı üzerine bitki gelişimini artıran kök bakterilerinin etkisinin araştırılması. Türkiye III. Bitki Koruma Kongresi, Temmuz 2009, Van. s 333. Çaplık, D., ve Basım, H., Taqman Real-Time PCR ile Domates Bakteriyel Kanser ve Solgunluk Hastalık Etmeni Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ile Domates ve Biber Bakteriyel Yaprak Lekesi Hastalık Etmeni Xanthomonas

74 63 axonopodis pv.vesicatoria nın Tanısı ve Real-Time-Bio PCR ile Tohumdan ve Hastalıklı Bitki Dokularından Tespiti. Türkiye III. Bitki Koruma Kongresi, Temmuz 2009, Van Çetinkaya-Yıldız, R. ve Aysan, Y., Bakteriyel Solgunluk Hastalığı etmeni (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) ile bulaşık domates fidelerinde bitki aktivatörlerinin etkinliğinin belirlenmesi. Türkiye II. Tohumculuk Kongresi, 9-11 Kasım 2005, Adana, s.359. Çetinkaya-Yıldız, R., Domates Bakteriyel Solgunluk Hastalığı Etmeni Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis Et. Al. nin Tanılanması ve Bitki Büyüme Düzenleyici Rizobakteriler ile Biyolojik Mücadele Olanaklarının Araştırılması. Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, Bitki Koruma Anabilim Dalı, Doktora Tezi, Adana, 173s. Çetinkaya-Yıldız, R. ve Aysan, Y., Domates Bakteriyel Solgunluk Hastalığı, Tomato Bacterial Wilt Disease, Stem Canker, Bird s Eye Spot, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. (H. SAYGILI, F. ŞAHĐN, 54 Y. AYSAN editörler). Bitki Bakteri Hastalıkları, Meta Basım Matbaacılık, Bornova-Đzmir, s Çınar, Ö., Bakteriyel Domates Solğunluğu Hastalığın (Corynebacterium michiganensee.f.s Jens.) nın Tanımı, Savaş Yöntemleri ve Etmene Karşı Dayanıklı Çeşitler Üzerine Araştırmalar. Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Yayınları, No: 31, 36 s. Davis, P.H., Flora of Turkey and the East Aegean Islands. Vol:6 p:444 Edinburgh Univ. Press. Edinburgh. Dayteg, C., Tuvesson, S., Merker, A., Jahoor, A. and Kolodinska, B. A., Automation of DNA marker analysis for molecular breeding in crops: practical experience of a plant breeding company, Plant Breeding, 126,

75 64 Dhanvantari, B. N., 1989, Effect of Seed Extraction Methods and Seed Treatments on Control of Tomato Bacterial Cancer. Can. J. Plant Pathology., 11: Dick, J.A., 1981, Epidemiology of Bacterial Cancer Tomato : Resistant of Common Cultivars and Biocantrol of Seed- borne Inoculum. M. Sc. Thesis. Üniversity of Guelph, 61 pp. Dimitra, J. D., Basin N. Z., Moschos G. P, 2002, The Effectiveness of Plant Essential Oils on the Growth of Botrytis cinerea, Fusarium sp. and Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Science Direct, Crop Protection, S: Docea, E. and B.Marinescu, 1977, Contribution to thr Control of the Bacterial Cancer of Tomato Caused by Cornebacterium michiganens (E.F.Sm) Jensen. Acta Horticulture, 58: Dönmez, M., F., Erzurum ve Erzincan Đllerinde Fasulye ( Phaseolus vulgaris L.) Bitkisinde Görülen Bakteriyel Hastalık Etmenlerinin Tanılanması ve Bu Etmenlere Karşı Çeşitli Fasulye Genotiplerinin Duyarlılıklarının Belirlenmesi (Doktora Tezi), Atatürk Üniv. Ziraat Fak., Erzurum D.P.T., Ekonomik gelişmeler, Nisan 2010, Devlet Planlama Teşkilatı, Dreier, J., Bermpohl, A., and Eichenlaub, R., Southern hybridization and PCR for specific detection of phytopathogenic Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Phytopathology, 85: Ekinci, S., Özel Sebzecilik. Ahmet Sait Matbaası, Đstanbul. El- Abyad, M.S., M. A. El-Sayed., A. R. El-Shanshoury and Sabha M. El-Sabbagh, 1992, Towards the Biological Control of Fungal and Bacterial Diseases of Tomato Using Antagonistic Streptomyces spp. Plant and Soil 149:

76 65 Erkan, S., Tohum Patolojisi. Gözdem Ofis. s 275. Eşiyok, D., Sebze Yetiştiriciliğinde Çevre Dostu Üretim Teknikleri. Bahçe Bitkileri Tarımında Çevre Dostu Üretim Teknikleri, Meta Basım Matbaacılık Hizmetleri, Editör Prof. Dr. Ayşe Gül, Đzmir, FAO, Tomato production and area. Food and agriculture organisation of the United Nations. Farley, J.D and Miller T.D., Spread and Control of in Tomato Transplants During Clipping. Plant Dis. Reptr., 57: Fatmi, M. and N. W., Schaad, Semiselective agar medium for isolotion of Clavibacter michiganensis subps. michiganensis from tomato seeds. Phytopathology 78: Fatmi, M., and Schaad N. W., Survival of Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis in infected tomato stem under field conditions in California, Ohio and Morocco. Plant Pathology, 51: Fatmi, M., Schaad, N. W., and Bolkan, H. A., Seed treatments forn eradicating Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis from naturally infected tomato seeds. Plant Disease, 75: Francis, D. M., Kabelka, E., Bell, J., Franchino, B., and St. Clair, D Resistance to bacterial canker in tomato (Lycopersicon hirsutum LA407) and its progeny derived from crosses to L. esculentum. Plant Dis. 85: Frey, J. E., Frey, B., Sauer, C. and Kellerhals, M., Efficient low-cost DNA extraction and multiplex fluorescent PCR method for marker-assisted selection in breeding, Plant Breeding, 123(6):

77 66 Gartemann, K. H., Kirchner, O., Engemann, J., Grafen, I., Eichenlaub, R. and Burger, A., Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis: first steps in understanding of virulence of a gram-positive phytopathogenic bacterium. Journal of Biotechnology, 106: Geylani, E., Saygılı, H., Aysan, Y., Çetinkaya Yıldız, R., and Şahin, F., Detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis from infected tomato seeds using conventional and molecular methods. 5th ISTA-SHC Seed Health Symposium, May 10-13,Anger, France, pp27. Gitaitis, R. D., Beaver, R. W., and Dhanvantari, B. N., Detection of Clavibacter michiganense subsp. michiganense in tomato transplants (A. W. Seattler, N. W. Schaad and D. A. Roth, Edts.). The American Phytopathological Society. Minnesota, USA Gülşen, O. ve Mutlu, N., Bitki Biliminde Genetik Markerler ve Kullanım Alanları. Ala tarım, 4 (2): Günay, A., Özel Sebze Yetiştiriciliği Cilt 4. Çağ Matbaası, 103s. Ankara. Günay, A., Sebze Yetiştiriciliği Cilt II. Meta Basımevi, 530s. Đzmir. Güneş, E., Albayrak, M., Gülçubuk, B., Türkiye de Gıda Sanayi, Türk-Gıda Đş Sendikası Yayını, Đzmir. Gleason, M. L., Braun, E. J., Carlton W. M., and Peterson, R. H., Survival and disesemination of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in tomatoes. Phytopathology, 81: Gleason, M. L., Gitaitis, R. D. and Ricker M. D., Recent progress in understanding and controlling Bacterial Canker of Tomato in Eastern North America. Plant Disease, 77:

78 67 Goode, M.J and M.Sasser, Prevention the Key to Controlling Bacterial Spot and Bacterial Speck of Tomato. Plant Disease, 64 (9): Grogan, R.G. and J.B. Kendrick, Seed Transmission, Mode of Overwintering and Spread of Bacterial Cancer of Tomato Caused by Corynebacterium michiganense. Phytopathology, 43: 473 (Abstr). Hadas, R., Krıtzman, G., Klıetman, F., Gefen, T and Manulıs, S., Comparison of extraction procedures and determination of the detection threshold for Clavibacter michiganensis ssp. Michiganensis in tomato seeds. Plant Pathology, 54: Hospital, F., Marker-assisted Breeding. In: H. J. Newbury (ed.), Plant Molecular Breeding, Blackwell Publishing Ltd, Oxford, UK. Hyward, A. C., and J. M., Waterson, CMI descriptions of pathogenic fungi and bacteria No: 19. Jahr, H., Bahro, H., Burger, A., Ahlemeyer, J., and Eıchlaub, R., Interaction between Clavibacter michiganensis and its host plants. Environmental Microbiology, 1: Kabelka, E., Franchino, B., and Francis, D. M Two loci from Lycopersicon hirsutum LA407 confer resistance to strains of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Phytopathology 92: Kahveci, E., Gürcan, A., Antalya Đlindeki Domates Bakteriyel Hastalık Etmenlerinin Tespiti. Bitki Koruma Bülteni, Cilt 33, No 3-4, s , Temmuz- Aralık Karaca, Đ., ve Saygılı, H., Batı Anadolu nun bazı illerinde domates ve biberde görülen bakteriyel hastalıkların oranı, etmenleri ve konukçu çeşitlerinin

79 68 duyarlılığı üzerine araştırmalar. III. Türkiye Fitopatoloji Kongresi, Ekim, Adana, Karahan, O., 1965, Muhtelif sebzelerde zararlı hastalık amilleri ve mücadeleleri.tarım Bakanlığı Ankara Zirai Mücadele Enstitüsü Müdürlüğü Sayı: 42, Ankara, 52. Karsavuran, Y., Saygılı, H., Tosun, N. ve Türküsay, H., Tohumla taşınan hastalık ve zararlıların mücedalesi. (ESER, B., SAYGILI, H., GÖKÇÖL, A. ve ĐLKER, E., editörler). Tohum Bilimi ve Teknolojisi, Cilt 2, Meta Basım Matbaacılık, Bornova-Đzmir, s Köhler, H., 1950, Antibiotica und ihre Bedeutung in der Pflanzenpathologie. Nachrichtenbl. Deutsch. Pflanzenschutzd, 9: Krüger,W., 1960, The Control of Tomato Cancer (Corynebacterium michiganense E.F.Sm) Jensen ) by Means of Antibiotikcs. S. Afr. J. Agric. Sci., 2: Küçüker, O., Tıbbi Biyologlar için Botanik Ders Kitabı. Đstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Yayınları Đstanbul Lindhout, P., and Purimahua, C., Resistance against Corynebacterium michiganense found in Lycopersicon peruvianum. Pages in modern trends in tomato genetics and breeding: synopses 10th meeting eucarpia tomato working group. Louws, F. J., Bell, J., Medına-Mora, C. M., Smart, C. D., Opgenorth, D., Ishımaru, C. A., Brujın, F. J., Fulbrıgth, D. W., Rep-PCR mediated genomic fingerprinting: A rapid and effective method to identify Clavibacter michiganensis. Phytopathology, 88:862. Mathai, P., 1984, Vegetable Growing in ZAMBĐA. Zambia Seed Company Limited: pp.

80 69 Nedumaran, S., and Vidhyasekaran, P., Techiniques to detect Corynebacterium micgiganense pv. michiganense infection in tomato seed. Indian Phytopathology- Phytopathology Notes, 35: Orth, H., Untersuchunten über die Biologie und Bekampfung des Erregers der Bakterienwelke der tomaten (B. michiganense). Zentr. F. Bakt., etc., Abt. 2; 96: Ozeretskovskaya, O. L., Induced Resistance in teh Solanaceae. (R. Hammerschmidt and J. Kuc, eds.) Induced Resistance to Disease in Plants. Kluwer Academic Publishers, London, p Öktem, Y., E., Domates bakteriyel Solgunluğu (Corynebacterium michiganense) nun Ankara Đlindeki Yayılışı, Etmenin Toprak ve Bitkiden Đzolasyonu Đle Bitki Artıklarında Yaşama Süresi Üzerine Çalışmalar. Türkiye de Sertifikalı ve Kontrollü Tohumluk Üretim ve Dağıtım Sorunları Sempozyumu, 8-10 Şubat 1985, Ege Üniversitesi, Atatürk Kültür Merkezi, Đzmir. Ömer, M. A., Domates bakteriyel kanseri etmeninin (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) tanısında moleküler ve serolojik metotların kullanımı. Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Bitki Koruma Anabilim Dalı. Doktora Tezi 69 sayfa. Özaktan, H, Domates Bakteriyel Solgunluğu (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) ile Savaşım Olanakları Üzerine Araştırmalar. Ege Üniversitesi Doktora Tezi, Bornova-Đzmir, 98s. Özaktan, H., Bora, T., Domates Bakteryel Solgunluğu (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al ) ile savaşım olanakları üzerinde Araştırmalar. Doktora Tezi, sf: 99.

81 70 Özdemir, Z., Development of a Multiplex PCR Assay for concurrent detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis and Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria. Plant Pathology Journal, 4: Pantino-Mendez, G., Studies on the Pathogenicity of Corynebacterium michiganense (E.F.Sm) jensen and its transmission in tomato seed. Ph. D. Thesis. Univ. Calif., 70 pp. Pena, R.J., Bacterial Cancer of Tomato. Leafted; No: 793, 11 pp. Pilavcı, O. ve Đ.Ulukuş, Studies on possibilities of using Troleandomycin as a seedling treatment chemical against Tomato Bacterial Canver (Corynebacterium michiganense pv. michiganense Smith Jensen): II. In-vivo Effectiveness of the Antibiotic and its comparison with Streptomycin. J. Turk. Phytopathol., 16 (2): Rai, P.V. and G.A. Strobel, Relationship of degradation of toxic bacterial glycopeptides to bacterial cancer resistance in tomato. Phytopathology, 59 (8): 1045 (Abstr.). Rıcker, M. D. and Rıedel, R. M., Effect of secondary spread of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis on yield of northern processing tomatoes. Plant Diseases, 77: Sandbrink, JM., Ooijen, JWv., Purimahua, CC., Vrielink, M., Verkerk, P., Zabel, P., Lindhout, P., Localization of genes for bacterial canker resistance in Lycopersicon peruvianum using RFLPs. Theor Appl Genet 90: Santos, M, S., Cruz, L., Norskov, P., and Rasmussen, O. F., A Rapid and sensitive detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in tomato seeds by polymerase chain reaction. Seed Science and Technology, 25:

82 71 Sasaki, T., Studies on the ecology of bacterial cancer of tomato. 3. Dissemination of causal bacteria from contaminated seeds and seedlings of Plant Protection of North Japan, 38: Saygılı, H., Şahin, F. ve Aysan, Y., Fitobakteriyoloji. Meta Basım Matbaacılık, Đzmir, 530s. Scott, J. W., Perspective on Tomato Disease Resistance Breedig: Past, Present and Future. Acta Hort 695. Sevgican, A., Örtüaltı Sebzeciliği Cilt-I. Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları No: 528, Ege Üniversitesi Basımevi, 302s. Đzmir. Schuster, M.L. and L.T. Wagner, 1972, Control of bacterial cancer root knot of hydrophonic tomatoes. Plant Dis. Reptr. 60 (2): Shoemaker, P. B. and F. Echandi, 1976, Seed and plant bed treatment for bacterial canker of tomato. Plant Dis. Rep. 60: Slusarski, C., 2004, Evaluation of chemical and biological caontrol methods for their potential to reduce bacterial cancer of tomato ın a greenhouse stonewool cultivation system. International Society for Horticulture Science. (abtr.). Soylu, E.M., S. Soylu, and Ö. Baysal, 2003, Induction of resistance and antioxidant enzymes by Acibenzolar- S- methyl against bacterial cancer (Clavibacter michiganense subsp. michiganense) ın tomato. Journal of pathology (2003), 85 (3), Strider, D.L., 1967, Survival studies with the tomato bacterial cancer organism. Phytopathology, 57:

83 72 Strider, D.L., 1969, (b) Foliage blight of bacterial cancer of tomato and survival of Corynebacterium michiganense in toxicants and in an airdried condition. Plant Dis. Reptr., 53 (11): Şahin, F., Pirim, Đ., ve Çiftçi, M., Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR). II. Uygulamalı Moleküler Biyoloji Teknikleri Kursu, Mayıs 2000, Erzurum, p Şahin, F., Uslu, H., Kotan, R., ve Dönmez, F., Bacterial Canker, Caused by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, on Tomatoes in Eastern Anatolia Region of Turkey. Plant Pathology : 51, 399. Şeniz, V., Domates, Biber ve Patlıcan Yetiştiriciliği. TAV Yayınları No:26, 174s. Yalova. Şeniz, V., Genel Sebzecilik. Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi, Ders Notları No:53, Bursa. Şeniz, V., Eser, B., Daşgan, Y., Akbudak, N., Đlbi, H., Sürmeli, N., Başay, S., Sebze Üretiminde Gelişme Ve Hedefler. VI. Türkiye Ziraat Mühendisliği Teknik Kongresi 3-7 Ocak 2005, Thyr, B. D., E., Webb, C. A., Jaworski and T. J., Rateliffe, Tomato bacterial canker: control by seed treatment. Plant Dis. Rep. 57: Thry, B. D., Assaying tomato seed for Corynebacterium michiganense. Plant Dis. Reptr., 53: Tokgönül, S., Ticari Domates Tohumlarında Bakteriyel Solgunluk Etmeni (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) nin Saptanması ve Etmene Karşı Mücadele Olanakları Üzerine Araştırmalar. Ç. Ü., Fen Bilimleri Enstitüsü, Bitki Koruma Anabilim Dalı, Doktora Tezi, Adana, 93s.

84 73 Tokgönül, S. ve Çınar, Ö., Domates bakteriyel solgunluk hastalığı Etmeni (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) ile mücadelede antagonist bakterilerin kullanım olanakları. Türkiye IV. Biyolojik Mücadele Kongresi, Ocak, 1999, Adana, s Türküsay, H., Tosun, N., Hidrojen Peroksit Uygulamalarının Domates Bakteriyel Solgunluk ve Kanser Hastalığı (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et. al.) na Etkileri. Ege Üniv. Ziraat Fak. Derg. No: 42(2), 45-46s. Trevors, J. T., and Fınnen, R. J., Plant and Soil, 126: Tsiantos, J., 1987, Transmission of bacterium Corynebacterium michiganense pv michiganense by seeds. J. Phytopathology, 119: Türküsay, H., Tosun. N., 2005, hidrojen peroksit uygulamalarının Domates bakteriyel solgunluk ve kanser hastalığı (Clavibacter michiganense ssp. michiganense.(smith) Davis et al) na etkileri. Ege Üniv. Ziraat Fak. Derg., 42 (2): Ulukuş, Đ., Elazığ, Diyarbakır ve Mardin Đllerinde domates ve biberlerde bakteriyel hastalıkların surveyi, belirtileri, etmenlerin tanısı ve en önemlisine karşı korunma çareleri üzerine araştırmalar.doktora tezi. Umesha, S., 2001, Occurence of bacterial canker in tomato fields of Karnataka and effect of biological seed treatment on disease incidence., Crop Protection, Upstone, M.E., 1971, Control of bacterial diseases of tomatoes in Jersey. Proc.6th Br. Insectic, Fungic. Contf., pp.

85 74 Utkhede, R., Koch, C, 2004, Biological treatments to control bacterial canker of greenhouse tomatoes, BioControl, 49: Ünver, S., Arpa (Hordeum vulgare) da uygulanan EMS dozları, yıkama suyu sıcaklık ve süresinin M1 ve M2 bitkileri üzerine etkileri (Doktora Tezi), Ankara Üniv. Ziraat Fak., Ankara Üstün, N., Patates Kahverengi Çürüklük Hastalığı Brown Rot of Potato Domates ve Sardunya Bakteriyel Solgunluk Hastalığı Southern Bacterial Wilt of Tomato and Geranium Muz Moko Hastalığı Moko Disease of Banana Tütün Granville Solgunluğu Granville Wilt of Tobacco Ralstonia solanacearum. (H. SAYGILI, F. ŞAHĐN, Y. AYSAN editörler). Bitki Bakteri Hastalıkları, Meta Basım Matbaacılık, Bornova-Đzmir, s Van Heusden, A.W., Koornneef, M., Voorrips, R.E., Brüggemann, W. G., Pet, Vrielinkvan Ginkel, X.Chen, R., Lindhout, P., Three Qtls From Lycopersicon Peruvianum Confer A High Level Of Resistance to Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis. Vural, H., Eşiyok, D., Duman, Đ., Kültür Sebzeleri (Sebze Yetiştirme). Ege Üniv., Ziraat Fak., Bornova, Đzmir. Waksman, S.A., 1949, Streptomycin, nature and pratical applications. Baltimore: Williams and Watkins Co., 618 pp. Yazgan, A., Fidan, S., Tokat Koşullarına Uygun Kiraz Domates (Lycopersicon esculentum Mill. var. Cerasiforme) Çeşitlerinin Belirlenmesi. GAP 1. Sebze Tarımı Sempozyumu, 19-23s. Şanlıurfa. Yıldız, R. Ç., Domates Bakteriyel Solgunluk Hastalığı Etmeni (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et. al.) nin Tanılanması ve Bitki Büyüme Düzenleyicisi Rhizobacteriler ile Biyolojik Mücadele

86 75 Olanaklarının Araştırılması. Çukurova Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı Doktora Tezi, Adana. Yürüdür, E., ve Akkurt, A., Tokat ta Domates Üretimi. Gaziosmanpaşa Üniv. Sosyal Bilimler Dergisi No:8, s. Tokat.

87 76 ÖZGEÇMĐŞ KĐŞĐSEL BĐLGĐLER Adı Soyadı Doğum Tarihi ve Yeri : Demet ÇELĐK : TURHAL Medeni Hali : Bekar Yabancı Dili : Đngilizce Telefon : [email protected] EĞĐTĐM Derece Eğitim Birimi Mezuniyet Tarihi Yükek Lisans Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı Lisans Gaziosmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Anabilim Dalı 2008 Lise Pazar Çok Programlı Lisesi 2004