Laboratuvara Giriş. Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBT 109 Çiğdem YAMANER (Yrd. Doç. Dr.)

Transkript

1 Laboratuvara Giriş Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBT 109 Çiğdem YAMANER (Yrd. Doç. Dr.) 10. Hafta ( ) Derslik B301 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 1

2 LABORATUVARDA KULLANILAN MALZEMELERİN TEMİZLİĞİ ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 2

3 Çalışma sonuçlarının güvenilirliği büyük ölçüde kullanılan malzemenin temizliğine bağlıdır. Birçok kimyasal ve biyokimyasal madde miligram veya mikrogram miktarlarında kullanılır. Beherdeki, pipetteki veya cam küvetteki herhangi bir kirlilik yaplan deney veya çalışmayı önemli oranda etkiler. Birçok biyokimyasal reaksiyon ve biyokimyasal süreç metal iyonları, deterjanlar ve organik kalıntılar gibi kirleticilere duyarlıdır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 3

4 Plastik Malzeme Temizliği Laboratuvarlarda genel olarak polietilen plastik malzemeler kullanılmaktadır. İlk kez kullanılacak polietilen malzemeler önce 8 M üre çözeltisiyle temizlenir. Sonra distile su ile durulanır, 1 N KOH çözeltisi ile yıkanır, tekrar distile sudan geçirilir ve sonra metal iyon kontaminasyonu gidermek için M EDTA ile yıkanır. Sonunda distile su ile durulanır. Bu ilk kullanım öncesi yapılan temizliği takiben her kullanım sonrası % 0.5 lik deterjanla yıkayıp distile su ile durulamak yeterlidir. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 4

5 Plastik Malzeme Temizliği Laboratuvarlarda genel olarak polietilen plastik malzemeler kullanılmaktadır. İlk kez kullanılacak polietilen malzemeler önce 8 M üre çözeltisiyle temizlenir. Sonra distile su ile durulanır, 1 N KOH çözeltisi ile yıkanır, tekrar distile sudan geçirilir ve sonra metal iyon kontaminasyonu gidermek için M EDTA ile yıkanır. Sonunda distile su ile durulanır. Bu ilk kullanım öncesi yapılan temizliği takiben her kullanım sonrası % 0.5 lik deterjanla yıkayıp distile su ile durulamak yeterlidir. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 5

6 Cam Malzeme Temizliği Cam malzemelerdeki organik kalıntıların temizlenmesi için uzun yıllar bikromat temizleme solüsyonu kullanılmıştır. Fakat kromun toksik etkisi, kanserojen oluşu ve yoğun H2SO4 kullanımı nedeniyle günümüzde tavsiye edilmemektedir. İyonlarından arındırmak için yoğun nitrik asit ile yıkamak gerekir. Cam pipetlerde % 0.5 lik deterjanlı suda bekletilip daha sonra bol akan suda durulanmalıdır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 6

7 Kuartz ve Cam Küvetlerin Temizliği Kuartz veya optik parlatılmış cam malzemelerin etanolde hazırlanmış KOH veya kuvvetli bazlarla temizlenmesi aşınmaya neden olmaktadır. Bunun yerine % 0.5 lik deterjan ile temizleyip distile su ile durulamak yeterli olur. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 7

8 Plastik ve Cam Malzemelerin Kurutulması Cam malzemeler kurutma fıranlarında kurutulur. Birçok plastik malzemeyi de kurutma fırınında kurutabiliriz. Fakat selüloz nitrat santrifüj tüpleri (patlayıcı olduğu için) kurutma fırınına konmamalıdır. Eğer plastik malzemenin tipinden emin değilseniz, kurutma fırınını kullanmayınız. Cam malzemeler aseton ile de kurutulabilir. Fakat asetona bağlı kirlilik eğer deneyi etkiliyorsa kullanılmamalıdır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 8

9 STSTERİLİZASYONERİLİZASYON ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 9

10 Sterilizasyon, bir ortam veya maddenin tüm canlı mikroorganizmalardan arındırılması işlemidir. Hastane Gıda işleme Kozmetik Labaratuvar vb ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 10

11 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 11

12 Sıcaklık ile Sterilizasyon En yaygın sterilizasyon yöntemidir Sıcaklık etkisiyle hücre proteinlerinin koagule olması sonucu, mikroorganizmalar canlılıklarını yitirirler Mikroorganizmalar içerdikleri su miktarına bağlı olarak sıcaklığa duyarlılıkları farklıdır. Sporlar az su içerdiklerinden sıcaklık ile sterilizasyona daha dirençlidirler. Kuru sıcaklık ile sterilizasyon Nemli sıcaklık ile sterilizasyon ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 12

13 Kuru Sıcaklık ile Sterilizasyon Kızıl dereceye kadar ısıtma ve yakma Alevden geçirme Yüksek sıcaklıktaki fırınlarda bekletme ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 13

14 Kızıl dereceye kadar ısıtma ve yakma ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 14

15 Alevden geçirme Cam ve metal malzemelerin dış yüzleri alevden geçirilerek steril edilebilmektedir. Ayrıca steril kapların ağız kısımları, her açış ve kapatış sırasında alevden geçirilerek sterilizasyonun bozulmaması sağlanır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 15

16 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 16

17 Yüksek sıcaklıktaki fırınlarda bekletme Tüp, balon, pipet ve petri kutuları gibi cam eşyalar kuru sıcaklık ile çalışan elektrikli fırında steril edilirler Bu tür malzemeler 170 C de 1 saat 160 C de saat ısıtılarak steril edilirler Steril edilecek malzeme kuru olmalıdır Bu nedenle ıslak cam eşya önce 70 C de kurutulmalı ve daha sonra yüksek derecede steril edilmelidir ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 17

18 Pastör Fırınının Görünümü ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 18

19 Nemli Sıcaklık ile Sterilizasyon Besiyeri, kumaş elbise, önlük ve kuru sıcaklık ile bozulabilen diğer materyaller nemli sıcaklık ile steril edilir. Kuru sıcaklığa göre nemli sıcaklığın öldürücü etkisi daha fazladır ve ortam nemli olduğundan besiyerinde buharlaşma ile su kaybı olmaz ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 19

20 Basınçlı Buhar ile Sterilizasyon Bu sterilizasyonda ilke, buhara doymuş bir ortamda ve 100 C den yüksek sıcaklık ile sterilizasyondur Buharla sterilizasyonun en etkili olanı, doymuş su buharı ile çalışan otoklav denilen cihazla yapılan sterilizasyondur. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 20

21 Otoklav Otoklavlar çalışma prensibi yönünden kabaca düdüklü tencereye benzetilebilirler. Otoklavlar genellikle iç içe iki çelik kazandan yapılmıştır. İçteki kazan malzemenin suyla temas etmesini engeller. Bu kazan üzerinde buharın geçeceği delikler bulunur. Otoklavlar elektrikle çalışan rezistansları sayesinde suyu ısıtırlar. Üzerinde basınç ve ısı göstergeleri, termostat ve buhar vanası bulunur. Kapakları buhar sızdırmayacak nitelikte olup, vidaları sıkıca kapatılır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 21

22 Otoklavın Kontrolü A) Maksimal Termometre Otoklavın ulaştığı en yüksek sıcak, içine yerleştirilen bir maksimal termometre ile kontrol edilebilir. Bu termometrenin özelliği ibresi yükseldikten sonra kendi kendine düşme göstermemesidir. B) Kimyasal İndikatörler Kükürt gibi 120 C de eriyen maddeler içeren tüplerle otoklavın ısınma derecesi kontrol edilir Laboratuvarlarda kullanılan otoklav bandlarının temelide bu prensibe ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 22 dayanmaktadır.

23 Otoklavın Kontrolü C) Biyolojik İndikatörler Bacillus subtilis ve Bacillus stearothermophilus gibi sporlu bakteriler yüksek sıcaklık derecelerine dayanıklı olmaları nedeniyle otoklav kontrolünde biyolojik indikatör olarak kullanılırlar Bakteri kültüründen sürülmüş bez ya da kağıt parçası otoklavda belli süre tutulduktan sonra sporların canlı kalıp kalmadıkları, besiyerine ekilerek araştırılır. Aynı amaçla 1 g kuru toprakta kullanılabilir. Çünkü toprak çok dayanıklı sporlar içermektedir. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 23

24 Basınçsız Buharla Sterilizasyon Katı besiyerinin eritilmesi ve bazı besiyerlerinin sterilizasyonu bu yolla yapılır. 100 o C ısıda, buharla doymuş bir ortamda, basınç olmaksızın, yarım saat tutulmakla yapılan sterilizasyondur. Bu amaçla kullanılan cihaza Koch kazanı adı verilir. Eğer bu cihaz yoksa otoklavlarda bu amaçla kullanılabilir. Otoklavın kapağı kapatıldıktan sonra vidaları sıkıştırılmaz. Bu sayede kapağın kenarından fazla buhar çıkacağı için, ortam buhara doyar, fakat basınç oluşmaz. Sterilizasyon yapılması otoklavdakine benzer şekildedir. Otoklava göre daha az kullanılan bir yöntemdir C'nin üzerindeki ısıda ve basınç altında bozulacak ADÜ malzemelerin Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü sterilizasyonunda 24 kullanılır.

25 Akım Halindeki Buhar ile Yapılan Sterilizasyon Bu işleme Ultra High Temperature ( UHT) sterilizasyonu denir. Özellikle süt sterilizasyonunda kullanılır. Uzun ömürlü sterilizasyon sağlar. Süt buhar ile o C'ye kadar ısıtılmış levhalar üzerine 1-4 saniye kadar püskürtülür. Daha sonra vakum bulunan soğutucu kazanlara püskürtülür. Bu sayede ısı hızla 22 o C'ye kadar indirilir. Bu şekilde yüksek ısının ani olarak düşük ısıya dönüşmesi sonucunda, şok etkisi ile bakteriler ve sporlar ölürler. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 25

26 Kaynatma 100 o C' de kaynayan su içerisinde, 30 dakika tutmak suretiyle uygulanır. Güvenilir bir yöntem olmamakla birlikte, çok önemli olmayan işlemlerde ve vücut için uygulanmayan yöntemlerde kullanılabilektedir. Kaynayan su içerisinde ısıya dayanıklı bakteri sporları canlı kalabilmektedir. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 26

27 Tindalizasyon Benmari denilen sterilizasyon aleti içerisinde yapılır. Steril edilecek malzeme o C'de üç gün süreyle, dakika tutularak yapılır. Her tindalizasyon işleminden sonra 1 gece oda ısısında bekletilir. Bu bekleme sırasında ortamda bulunan sporlu bakteriler açılarak, vejetatif hale geçerler. İlk günkü işlemde ortamdaki sporsuz bakteriler ölürler. İkinci günkü işlemde açılan sporlu bakterilerin vejetatif şekilleri ölürler. Üçüncü günkü işlemde ise ortamda kalmış olan sporlardan oluşabilen vejetatif bakteriler ölürler. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 27

28 Benmarinin Görünümü ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 28

29 Pastörizasyon Süt, krema ve meyve suları gibi besinlerde bulunan gıda patojenlerinin öldürülmesi için gıda endüstirisinde uygulanan dezenfeksiyon yöntemidir. Yüksek sıcaklıkta kısa süre (71-72 o C de sn) veya düşük sıcaklıkta uzun süre (62-65 o C de 30 dak) tutulduktan sonra en kısa sürede sıcaklık 10 o C ye düşürülmesi ile gerçekleştirilir Bakterilerin vejetatif şekilleri ölür, sporları ölmez Bu nedenle pastörize süt buzdolabında en fazla iki gün bekletilmelidir. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 29

30 Kimyasal Maddelerle Sterilizasyon ve Dezenfeksiyon Bazı kimyasal madeler mikroorganizmalara karşı öldürücü (bakterisidal) veya üremelerini durdurucu (bakteriyostatik) etki gösterirler Dezenfeksiyon: kimyasal maddeler kullanılarak cansız eşyaların yüzeyindeki mikroorganizmaların vejetatif şekillerinin öldürülmesi işlemine dezenfeksiyon denilmektedir. Antisepsi: Dezenfektanların sulandırılarak insan veya hayvan vücuduna uygulanmasına antisepsi denilir Antiseptik: Antisepsi işleminde kullanılan maddelere antiseptik maddeler denir. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 30

31 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 31

32 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 32

33 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 33

34 Filtrasyon ile Sterilizasyon Isıya dayanıksız maddeleri steril etmek amacıyla kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem sıvı bir ortamda bulunan mikroorganizmaları çeşitli filtrelerden geçirerek tutma ve süzüntüye geçmesini engelleme esasına dayanır. Süzme işleminde kullanılan aletlere filtre ya da süzgeç adı verilir. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 34

35 Filtreler iki şekilde mikropları ortamdan uzaklaştırırlar 1-Mekanik Olarak Süzme: Filtrenin delikleri bakterilerden küçük olduğu için bakterileri tutarlar. Bakteriler filtrenin üzerinde kaldığı için, süzüntü steril hale gelir. 2-Adsorbsiyon Yoluyla Süzme: Bakteri yüzeyi ile, filtrenin elektrik yükünde farklılık nedeniyle, süzme işlemi sırasında bakteriler filtrenin deliklerine yapışarak adsorbe olurlar. Bu sayede süzüntüye geçemezler. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 35

36 Filtre Sisteminin Sterilizasyon Kontrolü Filtre ile süzülen sıvıdan alınarak besiyerlerine ekimler yapılıp üreme olup olmadığı kontrol edilir. Ayrıca süzüntü kısmı ikinci defa filtreden süzüldükten sonra, bu filtre kağıdı alınarak besiyeri üzerine konulur. Belirli süre inkübasyondan sonra üreme olmaması sterilizasyonun tam olduğunu gösterir. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 36

37 Radyasyon ile Sterilizasyon 1- Ultraviyole ışınları ile yapılan sterilizasyon 2- X ve Gama ışınları ile yapılan sterilizasyon Canlılar tarafından absorblanan radyasyon dozları rad ve Grey gibi birimlerle ifade edilirler Deneysel koşullarda saptanan dozlar en hassas bakteri için Grey en dirençliler için Greydir Radyasyona en hassas bakteriler Gram Negatif Çomaklardır. Bakteri sporları genellikle radyasyona çok dirençlidir. Bu nedenle besin endüstrisinde Clostiridium botilinum sporları büyük önem taşır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 37

38 ULTRAVİYOLE IŞINLARI İLE YAPILAN STERİLİZASYON Ultraviyole ışınları civa buharlı lambalardan elde edilirler. Bu ışınların derinlere nüfuz etme yetenekleri bulunmamaktadır. Bu yüzden yalnızca ortam havasının ve ortamdaki dış yüzeylerin sterilizasyonunda kullanılırlar. Genelde hastanelerdeki operasyon odaları ve bazı steril çalışma odaları bu yöntemle steril edilir. İnsan için zararlı etkisi olduğu için bu şekilde sterilizasyon yapılırken, odada kimsenin bulunmaması gerekir. Lamba yakılarak kapılar kapatılır ve sterilizasyon süresi bitiminde lambalar söndürülerek bu şekilde gerektiğinde steril odaya girilir. Ultraviyole ışınlarına direkt olarak çıplak gözle bakılmamalı, bakılması gereken durumlarda ise ultraviyole ışınlarını süzen filtreli gözlüklerle bakılmalıdır. Aksi taktirde göz üzerine etki ederek keratit oluşumuna yol açabilirler. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 38

39 X VE GAMA IŞINLARI İLE YAPILAN STERİLİZASYON X ve gama ışınları özel jeneratörler tarafından üretilirler. Bu ışınların derinlere ulaşma özellikleri bulunmaktadır. Genellikle paketlenmiş hazır gıdaların sterilizasyonunda kullanılırlar. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 39