YÜKSEK LĐSANS TEZĐ HEPATĐT C VĐRÜSÜNÜN TÜRKĐYE'DE DAĞILIMI VE NS5B, E1 VE 5'UTR BÖLGELERĐNE GÖRE FĐLOGENETĐK ANALĐZ ĐLE GENOTĐPLERĐNĐN BELĐRLENMESĐ

Transkript

1 ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ BĐYOTEKNOLOJĐ ENSTĐTÜSÜ YÜKSEK LĐSANS TEZĐ HEPATĐT C VĐRÜSÜNÜN TÜRKĐYE'DE DAĞILIMI VE NS5B, E1 VE 5'UTR BÖLGELERĐNE GÖRE FĐLOGENETĐK ANALĐZ ĐLE GENOTĐPLERĐNĐN BELĐRLENMESĐ Saliha Gökçe KABAKCI Danışman Öğretim Üyesi Prof. Dr. A.Mithat BOZDAYI ANKARA 2011 i

2

3 Son 1,5 yıl içinde kaybettiğim, çok sevdiğim dedelerim Muhsin AKSU ve Mustafa KABAKCI ya ii

4 ÖZET Hepatit C Virüsünün Türkiye de Dağılımı ve NS5B, E1 VE 5'UTR Bölgelerine Göre Filogenetik Analiz ile Genotiplerinin Belirlenmesi Hepatit C virüs (HCV) enfeksiyonu hem dünyada hem de Türkiye de en önemli karaciğer hastalıklarından biridir. HCV enfeksiyonunun süresi ve tedaviye verilen yanıt HCV genotipleri ile yakından ilişkilidir. Bu virüsün 6 genotipi arasından kötü prognozla ilişkili tip 1b Türkiye de en baskın genotiptir. Bu çalışmada Türkiye de HCV genotip ve subtiplerinin dağılımının belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu çalışmaya Şubat 2007 Eylül 2010 tarihleri arasında Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Gastroenteroloji bilim Dalı Polikliniği ne başvuran HCV enfeksiyonu varlığı kanıtlanmış 500 hasta (274 kadın, 226 erkek; yaş ortalaması: 57,2 ± 11,1) dahil edilmiştir. Hastaların kantitatif HCV-RNA düzeyleri kopya/ml arasında değişmektedir. Genotiplendirmede High Pure RNA Izolation Kit ile izole edilen HCV-RNA lardan elde edilen RNA lardan cdna elde edilmiş ve bölgeye özgü primerler (NS5B bölgesi için, E1 bölgesi için ve 5 UTR bölgesi için) kullanılarak RT-PZR ile edilen ürünler silika kullanılarak saflaştırılmış BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ile dizi analizi (ABI Prism 310 Genetic Analyzer) yapılmıştır. Bu çalışmada 500 hastanın HCV-RNA sına ait NS5B bölgesine göre 450 hastada (%90) genotip 1b, 36 hastada (%7,2) genotip 1a, 3 hastada genotip 2a, 1 hastada ise genotip 4 saptanmıştır. E1 bölgesine göre; 468 hastada (%93,6) genotip 1b, 27 hastada (%5,4) genotip 1a, 1 hastada genotip 2a, 2 hastada genotip 4 ve 2 hastada da genotip 3a saptanmıştır. 5'UTR bölgesine göre; 450 hastanın (%90) genotipi 1b, 43 hastanın (%8,6) genotipi 1a, 3 hastanın genotipi 2a, 2 hastanın genotipi 4a ve 2 hastanın genotipi 3a olarak belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Hepatit C Virüsü, HCV genotipleri, HCV-RNA iii

5 ABSTRACT Molecular Epidemiology and Genotype Distribution of Hepatitis C Virus of Turkey as Reflected by Phylogenetic Analysis of the NS5B Region, E1 Region and 5 UTR Region Hepatitis C Virus (HCV) infection is one of the most important liver diseases in Turkey and worldwide. The duration of hepatitis C virus infection and the response to the standard therapy is strongly related to the HCV genotypes. Among the at least six well identified genotype of HCV, genotype 1b is the most prevalent one in Turkey, which is associated with poorer prognosis. The aim of this study was to investigate the distribution of HCV genotypes in Turkey. A total of 500 HCV-RNA positive patients (274 female, 226 male; mean age: 57,2 ± 11,1) who were admitted to Hepatology laboratory, department of Gastroenterology Ankara University Medical School between February 2007 September 2010, were included in the study. Quantitative HCV-RNA levels of the patients were between copy/ml. HCV-RNAs were isolated using High Pure RNA Izolation Kit and cdna was obtained from HCV-RNAs using reverse transcription and genotyping was done by sequencing with suitable primers (for NS5B region, for E1 region and for 5 UTR region). The RT-PCR products were purified with silica and sequenced by BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit in ABI Prism 310 Genetic Analyzer. The phylogenetic analysis of NS5B region revealed that 450 (90%) of the patients were genotyped as 1b, 36 (72%) as genotype 1a, 3 as genotype 2a as genotype 4. The phylogenetic analysis based on the E1 region sequences showed that 468 (93,6%) of the patients were genotyped as 1b, 27 (5,4%) as genotype 1a, one as genotype 2a, 2 as genotype 4 and 2 as genotype 3a. While the same analysis with 5'UTR region revealed that 450 (90%) of the patients were genotyped as 1b, 43 (8,6%) of the patients were genotypes as 1a, 3 of the patients were genotypes as 2a, 2 as genotype 4 and 2 as genotyped 3a. Key Words: Hepatitis C virus, HCV genotypes, HCV-RNA iv

6 ĐÇĐNDEKĐLER Sayfa No: ÖNSÖZ... ii ÖZET... iii ABSTRACT... iv ĐÇĐNDEKĐLER... v ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ... vii ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ... viii SĐMGELER DĐZĐNĐ... ix 1. GĐRĐŞ Hepatit C Virüsü HCV Virion Yapısı HCV Genom Organizasyonu HCV Viral Proteinler Yapısal Proteinler Yapısal Olmayan Proteinler HCV Genotiplerinin Coğrafik Dağılımı Genetik Heterojenite ve Sınıflandırma Sistemleri HCV Hayat Döngüsü Hücreye Giriş Protein Translasyonu ve Proteinlerin Đşlenmesi RNA Replikasyonu Paketlenme ve Hücreden Çıkış HCV Çalışmalarında Kullanılan Model Sistemler HCV Genotiplemesi Đçin Metodlar Moleküler Genotipleme Serolojik Genotipleme HCV Bulaş Yolları HCV Tanı ve Tedavi KAYNAK ÖZETLERĐ Türkiye de Yapılan HCV Genotipleme Çalışmaları MATERYAL ve YÖNTEM Materyaller Hasta Grupları v

7 3.1.2 HCV RNA Đzolasyonu cdna Elde Edilmesi Polimeraz Zincir Reaksiyonları PZR Ürünlerinin Görüntülenmesi PZR Ürünlerinin Temizlenmesi Örneklerin Nanodropta Ölçülmesi Sekans PZR Sekans PZR Temizleme Cihazlar Yöntemler HCV RNA Đzolasyonu cdna Elde Edilmesi Polimeraz Zincir Reaksiyonları Agaroz Jel Elektroforezi PZR Ürünü Temizleme Nanodropta Örneklerin Okutulması Sekans PZR Sekans PZR Temizleme Sodyum Asetat (NaOAc) hazırlanması Örneklerin Cihaza Yüklenmesi Sekansı Belirlenen örneklerin filogenetik ağacının oluşturulması ve genotiplerinin belirlenmesi ARAŞTIRMA BULGULARI NS5B,E1 ve 5'UTR Bölgelerine ait jel görüntüleri Sekans PZR ürünlerinin dizi analiz sonuçları HCV genotiplerinin veri tabanları ile belirlenen genotipleri Filogenetik ağaç çizilmesi TARTIŞMA ve SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMĐŞ vi

8 ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ Sayfa No: Şekil 1.1. HCV virion yapısı... 2 Şekil 1.2. HCV nin genom organizasyonu... 3 Şekil 1.3. Dünyada HCV genotiplerinin dağılımı... 8 Şekil 1.4. Hepatit C Virüsünün yaşam döngüsü... 9 Şekil 1.5. Subgenomik HCV replikonlarının yapısı Şekil tur PZR sonunda NS5B, E1 ve 5 UTR bölgelerine ait primerler ile yapılmış DNA ların jel görüntüsü Şekil 4.2. NS5B bölgesine ait örneklerin FinchTV kullanılarak elde edilen DNA dizi analizi Şekil 4.3. E1 bölgesine ait örneklerin FinchTV kullanılarak elde edilen DNA dizi analizi Şekil UTR bölgesine ait örneklerin FinchTV kullanılarak elde edilen DNA dizi analizi Şekil 4.5. Örneklerin genotiplerinin Pubmed de belirlenmesi Şekil 4.6. Örneklerin genotiplerinin da belirlenmesi Şekil 4.7. Örneklerin genotiplerinin adresinden belirlenmesi Şekil 4.8. NS5B bölgesine ait örneklerin MEGA 3.1 kullanılarak karşılaştırılması Şekil numaralı hastalara ait NS5B, E1 ve 5'UTR bölgelerine ait filogenetik ağaçlar Şekil numaralı hastalara ait NS5B, E1 ve 5'UTR bölgelerine ait filogenetik ağaçlar Şekil numaralı hastalara ait NS5B, E1 ve 5'UTR bölgelerine ait filogenetik ağaçlar Şekil numaralı hastalara ait NS5B, E1 ve 5'UTR bölgelerine ait filogenetik ağaçlar Şekil numaralı hastalara ait NS5B, E1 ve 5'UTR bölgelerine ait filogenetik ağaçlar vii

9 ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ Sayfa No: Çizelge 1.1. HCV proteinlerinin büyüklükleri... 4 Çizelge 2.1. Türkiye de yapılan HCV genotipleme çalışmaları Çizelge hastaya ait hasta numaraları, cinsiyetleri, yaşları ve NS5B, E1 ve 5'UTR bölgesine göre belirlenen genotipleri Çizelge 4.2. Simmonds ve ark, 2005 ten alınan HCV genotipleme referans dizileri viii

10 SĐMGELER DĐZĐNĐ ATP : Adenozintrifosfat cdna : Komplementer DNA CLDN-1 : Claudin-1 DNA : Deoksi ribonükleik asit eif2 : Eukaryotic Initiation Factor 2 eif3 : Eukaryotic Initiation Factor 3 EIA : Enzim immün test EL : Extracellular loop ER : Endoplazmik retikulum GFP : Raportör gen GTP : Guanozin trifosfat HBV : Hepatit B virüsü HCV : Hepatit C virüsü HCVpp : Retroviral pseudoparticle HIV : Human Immunodeficiency virus ISDR : Đnterferon duyarlı protein kda : Kilo dalton LD : Lipid damlacığı LDL : Low density lipoprotein NS : Yapısal olmayan RdRp : RNA bağımlı RNA polimeraz RNA : Ribonükleik asit PEG-IFN : Peg interferon RT-PZR : Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu PZR : Polimeraz zincir reaksiyonu SS-RNA : Single stranded RNA Trna : Taşıyıcı RNA UTR : Translasyona uğramayan bölge UV : Ultra Viole VLDL : Very low density lipoprotein ix

11 1. GĐRĐŞ 1.1. Hepatit C Virüsü Hepatit C virüsü (HCV) ile dünyada tahmini olarak milyon insan infektedir ya da bu dünya nüfusunun % 2 ya da 3 ü olarak belirtilebilir (Perz vd 2006). Kronik HCV enfeksiyonu karaciğer sirozu ve hepatoselüler karsinom riskini artırır (Cooreman vd 1996). HCV nin en yaygın bulaş şekli kan yolu ile gerçekleşir. HCV ile infekte hastaların tedavisinde peg-interferon ve ribavirin kullanılmaktadır. Fakat bu tedavinin kalıcı yanıtı % 50 oranındadır. HCV enfeksiyonuna etkili koruyucu bir aşı yoktur. HCV 1989 yılında moleküler klonlama ile keşfedilmiştir. Choo ve arkadaşları infekte olan hayvanlardan serum toplamışlar, total nükleik asit izolasyonu, cdna olarak kopyalanması ve hepatit A veya hepatit B ile infekte olmayan şempanzenin plazmasından elde edilen nükleik asit içine klonlanması yöntemleri izlenmiştir. Klonlamada faktör XIII konsantresi kullanılmıştır (Choo vd 1989). HCV kılıf ile çevrili, -10 kb uzunluğunda, tek artı zincirli RNA virüsüdür. Flaviviridae ailesine dahil Hepacivirüs genusuna aittir. Dünyada farklı HCV izolatlarının nükleotid sekansları korunmuş yapı gösterir (Choo vd 1991). Sınıflandırmanın temeli genomik farklılıklar olup HCV genomuna ait farklı bölgelerine göre sınıflandırılır. HCV nin yüksek genetik çeşitliliğinin temeli yüksek replikatif aktivitenin yanında RNA bağımlı RNA polimerazın (RdRp) proof-reading aktivitesinin eksikliğidir. Bunun sonucunda genotipler ve subtipler ortaya çıkmıştır. Bilinen 6 genotip olmasına rağmen henüz az bilinen genotip 7, 8, 9, 10 ve 11 de vardır. Genotipler arasında % arasında, subtipler arasında ise % arasında farklılık görülmektedir. 1

12 1.2. HCV Virion Yapısı HCV tam olarak görüntülenememiş olduğundan yapısı tam olarak bilinmemektedir. Filtreleme ve elektron mikroskopi çalışmalarına göre, HCV parçacıkları nm çapındadır (Wakita vd 2005). Kor proteini ve E1 ve E2 kılıf glikoproteinleri bir virionun ana protein komponentleridir. Genomik RNA nın dışı birçok kor proteininin oluşturduğu nükleokapsit ve bunun dışında E1 ve E2 proteinlerinin bağlandığı konak hücrenin çift-katmanlı lipit tabakası ile kaplıdır (Moradpour vd 2007). HCV infekte ettiği konakçıda değişik formlarda dolaşır. LDL, VLDL, veya immünoglobülinlere bağlı olabildiği gibi serbest formda da bulunabilir (Andre vd 2005). Kılıf glikoproteini (E1) Zar yağ tabakası SS RNA Genomu (~9.6 Kb) Kılıf glikoproteini (E2) Kor proteini Şekil 1.1. HCV virion yapısı, Sharma, 2009 dan değiştirilmiştir HCV Genom Organizasyonu HCV genomu tek zincirli, artı iplikli RNA molekülünden oluşur. 9,400 ribonükleotidden oluşur ve poli A kuyruğu ve 3 sonlandırma bölgesi içerir. 341 bazlık 5 UTR bölgesi, 3,011 aminoasitlik uzun bir açık okuma bölgesi ve 27 bazlık 3 UTR den oluşan genomik yapıya sahiptir. Kodlanmayan bölgeler, poliprotein translasyonu ve genomik 2

13 replikasyon için yüksek derecede korunmuş RNA yapısında bölgelerdir. 5 UTR bölgesi internal ribosomal entry site (IRES) içerir. Bu bölge sayesinde 40S lik ribozomal alt üniteye bağlanır ve poliprotein translasyonunda rol oynar. Açık okuma bölgesi her genotipte bazı farklılıklar gösterir. Örneğin bu bölge genotip 1 de 9,400 ribonükleotidden oluşurken, genotip 2 de 9,099 nükleotidden oluşur ve genotip 3 te ise 9,063 nükleotidden oluşur (Bukh vd 1995). Şekil 1.2 de HCV genom organizasyonu gösterilmiştir. Hepatit C virüs RNA 9600 nt baz Prekürsör poliprotein Yapısal proteinler Yapısal olmayan proteinler nükleokapsid Kılıf glikoproteinleri Proteazlar RNA helikaz Transmembran proteini kofaktörler Đnterferon direnç proteini RNA polimeraz Şekil 1.2. HCV nin genom organizasyonu 1.4. HCV Viral Proteinler HCV genomu bir adet açık okuma çerçevesi içerir. Bu açık okuma çerçevesinden yaklaşık 3000 amino asit uzunluğunda çoklu protein sentezi olur. Daha sonra viral ve hücresel proteazlar tarafından çoklu protein işlenmesi olur. Ortaya en az 9 adet işlevsel yapısal ve yapısal olmayan viral proteinler ortaya çıkar: Kor, kılıf proteinleri E1 ve E2 (yapısal proteinler); p7, NS2-3, NS3-4A, NS4B, NS5A, NS5B (yapısal olmayan 3

14 proteinler). Bunların dışında ribozomal çerçeve kayması sonucu oluşan ARFP/F proteini de vardır. Çizelge 1.1. HCV proteinlerinin büyüklükleri (Hepatology 2009 dan uyarlanmıştır) Yapısal Proteinler Kor Proteini: Kor proteinin dizisi 342. nükleotidde AUG kodonu ile başlar, bu kodon HCV poliproteininin translasyonu için başlama kodonudur. Translasyon sırasında poliprotein endoplazmik retikuluma transfer olurken, sinyal peptidazlar tarafından sinyal dizinin kesilmesiyle ilk ve olgun olmayan 191 amino asitlik bir kor proteini oluşur. Daha sonra sinyal peptid peptidazlar tarafından olgun olmayan kor proteinin C-ucundan kesimleme yapılır ve 21-kDa ağırlığında, amino asit boyunda olgun kor proteini oluşur (McLauchlan vd 2002). Kor proteini viral nükleokapsiti meydana getirir. Ayrıca, viral RNA nın bağlanmasında ve RNA translasyonun düzenlenmesinde görev alır (Ait-Goughoulte vd 2006, Santolini vd 1994). 4

15 Kılıf Glikoproteinleri: Kor bölgesinin kodlanmasından sonra HCV RNA genomu 2 kılıf glikoproteini daha kodlar; E1 (192 aa.) ve E2 (363aa.). E1 proteini kda, E2 proteini ise kda ağırlığındadır (Beeck vd 2001). HCV glikoproteinlerinin olgunlaşması ve katlanması kompleks bir süreçtir. ER şaperonlarında disülfit bağı oluşumu ve glikozillenme olur. E1 ve E2 nin C-ucundaki transmembran bölgeler heterodimerizasyonu sağlar. E1 ve E2 160 ve 334 aminoasitlik geniş hidrofilik ektodomain ile birlikte tip 1 transmembran proteinleridir ve bu proteinlerin 30 aminoasitlik kısmı da kısa transmembran bölgesidir. E2, HCV genomunun en değişken bölgesini oluşturur (Weiner vd 1991) ve bu değişkenlikler etkin nötralize edici antikorlar için büyük sorun yaratır. E2 proteini, virüsün reseptörlere bağlanması için gerekli olan bölgeyi bulundurur. E1 ve E2 nin C- ucundaki transmembran domainler heterodimerizasyonu sağlar. E1 ve E2 nin üç boyutlu yapısının keşfi reseptör bağlanma ve füzyon işlemlerinin aydınlatılması için önemlidir. p7: Küçük olan p7 proteini (63 aa.) E2 ve NS2 bölgeleri arasına yerleşmiştir. Translasyon sırasında hücresel sinyal peptidazlar ile E2-p7 ve p7-ns2 oluşur. Fonksiyonel p7 membran proteini endoplazmik retikulumda lokalizedir ve iyon kanalı görevi görür (Haqshenas vd 2007, Pavlovic vd 2003). Bu viroporin rolüyle viral parçacık olgunlaşması ve salınımı için görev yapabilir Yapısal Olmayan Proteinler NS2: 217 aminoasitlik yapısal olmayan bir proteindir. NS3 proteinin N-terminal ucu ile NS-3 sistein proteaz meydana getirirler, NS2 ve NS3 arasında poliprotein prekürsörüdür (Grakoui vd 1993, Santolini vd 1995). Katalitik aktivitesi NS2 C ucunun yarısında ve NS3 N-ucunun üçte birinde bulunur. His 143, Glu 163 ve Cys 184 amino asitleri proteolitik aktivite için gereklidir (Moradpour vd 2007) NS3: 631 aminoasitlik NS3 proteini çok fonksiyonlu bir proteindir. N-ucunun üçte biri (189 aa) serin proteaz olarak, C-ucunun üçte ikisi (442 aa) ATPaz/RNA helikaz olarak görev yapar. NS4A, NS3 serin proteaza kofaktörlük yapar (Moradpour vd 2007), viral 5

16 RNA genomunun replikasyon sırasında bağlanmasını sağlar ve katlanmasını önler (Jin vd 1995, Kim vd 1995). NS4A: Yapısal olmayan 4A proteini 54 aminoasitlik polipeptiddir NS3 serin proteazın kofaktörüdür (Faila vd 1994). 4A proteininin N-terminal ucu; NS3-4A kompleksinin membrana bağlılığından sorumludur. NS4A; endoplazmik retikulum membranına yerleşmiş diğer HCV proteinleri ile de ilişkilidir. NS4A proteini sadece endoplazmik retikulumda değil mitokondride de bulunmaktadır (Selimovic vd 2008). Esas görevi replikasyonda olmasına rağmen patogenezde de rol oynar. Yapılan bir çalışmada Huh7 hücre hattında, mitokondride NS4A ekspresyonun tamirinde görev aldığı gösterilmiştir (Nomura-Takigawa vd 2006). Burada HCV replikasyonu sırasında küçük polipeptid rolü oynar. NS4B: NS4B proteini 217 aminoasit içerir. Endoplazmik retikulum membranına lokalize olmuştur. NS4B nin N-terminal bölgesi amfipatik karakter gösterir proteinin endoplazmik retikuluma taşınmasını sağlar. Bu bölge HCV replikasyonu için en önemli bölgedir (Elazar vd 2004, Gretton vd 2005). Ayrıca nükleotid bağlanma bölgesi ( aminoasit) tanımlanmıştır (Einav vd 2004). NS4B proteininin görevi henüz tam olarak bilinmemesine rağmen, HCV replikasyon kompleksi için gerekli olan membranımsı ağ lain oluşumunda görev alır (Egger vd 2002). NS5A: NS5A proteini 458 aminoasit içeren, membranda bir çok fonksiyona sahip olan bir fosfoproteindir. Farklı hücresel protein kinazlar tarafından fosforillenir fakat NS5A nin replikasyondaki rolü tam olarak anlaşılamamıştır. NS5A proteinin önemli bir özelliği 40 aminoasitten oluşan IFNα (ISDR) bölgesinin IFNα tedavisine cevapta rol oynamasıdır (Enomoto vd 1995, Enomoto vd 1996). ISDR (Interferon sensitivity determining region) bölgesindeki mutasyonlar IFNα ile yapılan tedavilerde pozitif ilişki gösterir. ISDR interferon duyarlılığını belirleyen bölgedir. NS5B: HCV replikasyonu, art iplikli RNA ya komplementer eksi-zincirli RNA yapılmasıyla başlar. Daha sonra eksi-zincirli RNA lardan artı-zincirli RNA lar oluşur. Bu işlemi NS5B RdRp yapar. Bu enzim çok fazla çalışılmaktadır ve ana hedeflerden biridir. NS5B diğer RdRp ler gibi sağ el yapısındadır. Klasik parmaklar, aya ve başparmak subdomainleri bulunur. Parmaklar ve başparmak subdomainleri birbiriyle etkileşim içindedir ve çok iyi korunmuş aktif bölgesi vardır. NS5B nin oligomrizasyonu 6

17 RNA sentezi için önemlidir (Ago vd 1999, Lesburg vd 1999, Bressanelli vd 2002). NS5B nin C-ucundaki 21 amino asitlik kısımla membrana bağlıdır. Bu kısım in vitroda gereksizken in vivoda gereklidir (Moradpour vd. 2004). ARFP/F proteinleri: Genotip 1a da -2/+1 ribozomal çerçeve kayması sonucunda 160 amino asit boyunda F proteinler üretilir (Branch vd 2005). F proteini in vitro ve in vivo HCV replikasyonu için gerekli değildir. Yeni bir çalışmaya göre, bu proteinde bir veya daha fazla sayıda korunmuş ve önemli RNA elementleri vardır (McMullan vd 2007). Ancak, F proteininin HCV hayat döngüsünde ne gibi bir rol aldığı henüz bilinmemektedir. In vitro yapılan çalışmalarda ARFP nin kısa süre sitoplazmada kalabildiği ve endoplazmik retikulum ile ilişkilendirildiği gösterilmiştir (Xu vd 2003) HCV Genotiplerinin Coğrafik Dağılımı HCV genotiplerinin coğrafik dağılımının bilinmesi, epidemiyolojik çalışmalar ve risk grupları açısından önem taşımaktadır. Genotip 1: Kuzey ve Güney Amerika, Avustralya. Amerika da ki HCV hastalarının %70 i genotip 1 dir. Yaygın olan genotip 1a dır. Genotip 1b en çok Avrupa ve Asya da özellikle de Japonya da yaygın olarak görülür. Türkiye de de en çok görülen subtip 1b dir. Yapılan çalışmalar genotip 1 in genotip 2 ve 3 e göre tedavilerde daha dirençli olduğunu göstermiştir. Genotip 2: Japonya da ve Çin de yaygın olarak görülmektedir. Japonya da, Tayvan ve Çin de 1b ve 2a genotipleri de görülmektedir. Genotip 2b, genotip 2 nin en yaygın görülen subtipidir ve Amerika ve kuzey Avrupa da görülürken genotip 2c, batı ve güney Avrupa da, Pakistan da ve Hindistan da görülür. Genotip 3: Đskoçya ve Birleşik Krallık ın bazı bölgelerinde, Avrupa ve çok az da olsa Amerika da görülür. Genotip 3a, Avustralya ve güney Asya da oldukça yaygındır. Genotip 4: En yaygın olarak Orta Doğu ve Afrika da görülür. Genotip 4a Mısır da yaygın olarak görülürken genotip 4c ise Afrika da yaygındır. Genotip 5: Sadece Güney Afrika da görülmektedir. 7

18 Genotip 6: Asya ve Hong Kong da görülmektedir. Genotip 6a, Hong Kong, Makao ve Vietnam da görülür. Genotip 7: Çok az bilinen 7a ve 7b genotipleri Tayland da görülür. Genotip 8, 9, 10 ve11: Çok az bilinen 8a, 8b ve 9a genotipleri Vietnam da, yine çok az bilinen 10a ve 11a genotipleri Endonezya da görülmektedir (PKID s online, 2003) Şekil 1.3. Dünyada HCV genotiplerinin dağılımı 8

19 1.6. Genetik Heterojenite ve Sınıflandırma Sistemleri Choo ve arkadaşlarının HCV genomunu tanımlamalarından sonra (Choo vd 1991) dünyanın farklı bölgelerinden çeşitli izolatlar tespit edilmiş ve dizi analizleri yapılmıştır (Chen vd 1992, Enomoto vd 1990, Li vd 1991). Dizi analizleri tanımlandığında viral genomlar arasında % 33 ün üzerinde farklılıklar saptanmıştır (Okamoto vd 1992). Dizi analizleri ile farklılıklar yüksek korunmuşluk gösteren 5 UTR ve kor bölgeleri ve hiper variable kılıf bölgeleri (E) ne göre yapılmıştır (Kato vd 1990, Okamoto vd 1994, 1991, Takamizawa vd 1991) HCV Hayat Döngüsü nükleokapsid E1 ve E2 proteini taşıyan viral kılıf HCV NĐN HAYAT DÖNGÜSÜ 1.Adsorpsiyon 2.Endositoz 8.Virion çıkışı Plazma membranı endozom 4.Kılıftan ayrılma 3.Füzyon Klatrin çeperli boşluk 5.Translasyon ve RNA replikasyonu G lü er Nükleus 6.Paketlenme Sitoplazma 7.Virion olgunlaşması Şekil 1.4. Hepatit C Virüsünün yaşam döngüsü 9

20 Hücreye Giriş Virüs yaşam döngüsünde ilk basamak konak hücreye tutunmaktır. Hücreye tutunmak ve hücreye girebilmek için bazı reseptörlere ihtiyaç duyar. HCV 25 kd (kilo dalton) büyüklüğünde ki CD81 (Pileri vd 1998) reseptörünün, glikoprotein olan E2 proteinine güçlü bir şekilde bağlanmasıyla hücreye HCV girişini başlatır (Pileri vd 1998). CD81 reseptörü 25 kd büyüklüğündedir. Bu bağlanmanın ardından HCV hücreye düşük yoğunluklu lipoprotein LDL reseptörleri ile hücreye alınabilir. Anti-CD81 antikorlarının CD81 e bağlanmasıyla HCV nin Huh-7 hücre hatlarında ve primer insan hepatositlerinde hücreye girişi rapor edilmiştir (Bartosch vd 2003a, Cormier vd 2004, McKeating vd 2004). Bazı çalışmalarda; CD81 in yalnız başına HCV nin hücreye girişinde etkili olmadığı, bunun scavenger receptor B type I (SR-BI) kofaktörüne ihtiyaç duyduğu gösterilmiştir (Bartosch vd 2003b, Hsu vd 2003, Scarselli vd 2002, Kapadia vd 2007). Hücreye girişi, CD81 ve SR-BI reseptörleri E2 proteinine bağlanarak başlatırlar. Viral girişin ilk basamağı adsorbsiyon, HCV E2 zarf glikoproteini ve konak hücrenin yüzeyinde ki glikozaminoglikan heparan sülfatın etkileşimi ile gerçekleşir (Germi vd 2002, Barth vd 2003). Daha sonra LDL reseptörü bağlanır (Agnello vd 1999). Claudin-1 (CLDN-1) önemli bir HCV giriş koreseptörü olarak bulunmuştur. Dört tane transmembrana ve iki tane extracellular loop (EL) a sahiptir. Bunlardan EL1 içinde bulunan I32-E48 amino asitler dizisinin alanin mutasyon analizi sonucunda viral giriş için önemli olduğu bulunmuştur. CLDN-1 ile HCV arasında direkt bir etkileşim olmaz ancak virüsün hepatosite ilk bağlanması aşamasından sonra kılıf glikoproteinlerinde meydana gelen konformasyonel değişiklikler olabilir. HCV nin hücreye girişindeki son aşama klatrin aracılı endositoz yoluyla olur (Blanchard vd 2006). Endozomla içeriye giren virüs, endozom içindeki ph oranının düşmesiyle (ortamın asitlenmesiyle) kılıf proteinlerinde meydana gelen konformasyonel değişiklik ve füzyon sonucuyla sitoplazmaya ulaşır (Koutsoudakis vd 2006, Tscherne vd 2006). Sitoplazmaya giren kılıfsız kapsit bilinmeyen bir mekanizmayla açılır ve viral RNA sitoplazmaya salınmış olur. Bu mekanizma düşük ph ta gerçekleşmesine rağmen füzyon basamağında ki füzyon peptidleri henüz tanımlanamamıştır. 10

21 Protein Translasyonu ve Proteinlerin Đşlenmesi Viral kılıf ve endozomik membranın füzyonu sonucunda genomik RNA sitoplazmadadır. Viral genomik RNA translasyona uğramayan bölge (NTR) içerir. 5 NTR; I-IV olmak üzere toplam 4 domainden oluşur. Domain II, III ve IV internal ribosome entry site (IRES) bölgesini oluşturur (Fukushi vd 1994, Honda vd 1999). HCV IRES 40S ribozomal alt ünite ile kompleks oluşturur ve ökaryotik bağlanma faktörleri 2 ve 3 (eif2 ve eif3), GTP ve trna bağlanmasıyla 48S lik bir kompleks oluşur (Spahn vd 2001, Otto vd 2002). 40S te meydana gelen konformasyonel değişiklik 60S in bağlanıp 80S kompleksi oluşturması için kritik bir aşamadır. 80S kurulduktan sonra translasyon başlar (Otto vd 2004) HCV açık okuma çerçevesinin translasyonu sonucunda poliprotein oluşur. Bu poliprotein translasyon sırasında ve sonrasında hücresel ve viral proteazlar tarafından olgun yapısal ve yapısal olmayan proteinlere çevrilir. Yapısal proteinler ve p7, ER sinyal peptidaz tarafından işlenirken, yapısal olmayan proteinler NS2-3 ve NS3-4A proteazlar tarafından işlenir RNA replikasyonu HCV RNA nın replikasyonu henüz çok az bilinmektedir. Viral RNA replikasyonu için anahtar rol oynayan enzim NS5B bir RNA bağımlı RNA polimeraz (RdRp) dır (Behrens vd 1996). Bunun yanı sıra bazı hücresel ve viral faktörler de replikasyonda rol oynar. RdRp, özellikle eksi iplikli HCV RNA dan artı iplikli genomik HCV RNA sentezinde görevlidir. NS3 helikaz enziminin eksi iplikli RNA nın sentezinde yardımcı olduğu kabul edilir (Jin vd 1995, Kim vd 1995). Replikasyon ve posttranskripsiyonel işlemler, yapısal olmayan proteinlerden ve perinükleer membrana yakın bulunan konakçı hücre proteinlerinden oluşan membranımsı ağda gerçekleşir. 11

22 Paketlenme ve Hücreden Çıkış Virionun paketlenmesi ve kurulması için lipit damlacığı (LD) gereklidir. Yeni bir çalışmaya göre; LD, kor proteinleri tarafından aktin hücre iskeleti kullanılarak ER membranına taşınır. LD, ER membranında replikasyon kompleksiyle etkileşir. Henüz bilinmeyen bir mekanizmayla yeni virion kurulur. Yeni virion ER içine doğru tomurcuklanır ve salınım yolunu takip ederek hücreden dışarı çıkar HCV Çalışmalarında Kullanılan Model Sistemler Uzun bir süre HCV araştırmaları küçük hayvan modellerinin eksikliği nedeniyle ve etkili bir hücre kültürü sisteminin eksikliği nedeniyle sınırlıydı. HCV nin tanımlanmasından tam 10 sene sonra Lohmann V ve ark. (1999) Con1 izolatından (genotip 1b) subgenomik; sadece yapısal olmayan genleri içeren genom seçici bir genle (neo) ve EMCV IRES ile rekombine ederek replikon sistemi kurmuşlardır. Bu sistem sayesinde HCV replikasyonu ve translasyonu çalışmaları, antiviral ilaç etkinlik testleri yapılabilinmiştir. Ölçülebilir HCV replikasyonu için adaptif mutasyonlar ve seçilmiş hücre hatları gerekliydi. Ancak infeksiyöz HCV parçacıkları üretilemediğinden HCV nin hücreye giriş aşamaları çalışılamıyordu. Daha sonraları HCV enfeksiyonunun ilk aşamalarının çalışılması için retroviral pseudoparticle kullanılmıştır (HCVpp). Bu sistem, retrovirüs kapsit proteinleri, enkapsidasyon sinyali ve raportör gen (GFP) içeren genom, ve HCV glikoproteinlerinden oluşmaktaydı (Bartosch vd 2003b). Buna ek olarak, bazı çalışmalarda çözünür E2 proteini kullanılmış ve bu sayede CD81 in HCV için bir reseptör olduğu bulunmuştur (Pileri vd 1998) 12

23 Şekil 1.5. Subgenomik HCV replikonlarının yapısı (Lohmann vd 1999). Huh-7 ile yapılan transfeksiyon için kullanılan in vitro transkriptlerin genetik yapısı gösterilmiştir. A) Kronik enfeksiyona sahip hastanın karaciğer dokusuna ait tüm transkript B) Yapısal olan genleri ve p7 genini kodlayan sekans bölgesini bulundurmayan subgenomik replikon C) Kor, E1, E2, p7 ve NS2 genlerini bulundurmayan subgenomik replikon HCV çalışmalarında asıl gelişme 2003 yılında Kato ve ark. geliştirdiği JFH-1 izolatından (genotip 2a) Huh-7 hücre hattında enfeksiyöz virüs üretilmesiyle olmuştur. Đlk olarak HCV nin tam hayat döngüsü çalışılınabilir hale gelmiştir. Sistem adaptif mutasyonlara ihtiyaç duymuyordu ancak infeksiyon düşüktü yılında Lindenbach ve ark. J6 genomunun C-NS2 bölgesi, JFH-1 genomunun NS3-5B, 5 -NCR ve 3 -NCR bölgesi birleştirilerek kimerik bir virüs üretmişlerdir. Bu virüs Huh-7.5 hücre hattında yüksek oranda infeksiyon göstermektedir (Lindenbach vd 2005). 13

24 1.9. HCV Genotiplemesi Đçin Metodlar Moleküler Genotipleme Coğrafik farklılıklardan dolayı, hastalığın seyri ve tedavide izlenecek yolun belirlenebilmesi için uygulanan klinik testler önemlidir. HCV genotiplendirmesi için referans standart ve sonuç açısından en kesin metod hastadan elde edilen HCV genomuna spesifik PZR amplifikasyonu ürünlerinin dizi analizi yöntemi ile belirlenmesi ve filogenetik ağaç ile sınıflandırılmasıdır. HCV genotipleme de NS5, kor, E1 ve 5 UTR bölgelerinin analizi yapılır. Dizi analizi çok pratik bir metod olmamasına rağmen en kesin sonuç elde edilebilir yöntemdir. Güvenilir diğer yöntemler ise; HCV RNA nın amplifikasyonu clinical specimens den, ya o genotipe spesifik primerler ile reamplifikasyonu ya da yine o genotipe spesifik problar ile hibridizasyonu yapılır (Li vd 1994, Okamoto vd 1992, Qu vd 1994, Widell vd 1994) ya da PZR ürünlerinin restriksiyon endonükleazlar ile kesilip genotip-spesifik bölgelere ayrılması ile belirlenebilir (McOmish vd 1993). Genotipe spesifik primerler ile HCV genotiplendirme ilk olarak Okamoto ve arkadaşları tarafından (Okamoto vd 1992) kor bölgesine ait primerler ile yapılmıştır. Bu metodda hassasiyet ve spesivite düşüktür (Xavier vd 1998) çünkü sadece 1a, 1b, 1c, 2a, 2b ve 3a subtipleri belirlenebilmektedir. Uygun modifikasyonlar yapılırsa metod daha spesifik olarak kullanılabilir (Okamoto vd 1996, Widell vd 1994). HCV genotiplendirmesinde kullanılabilinecek bazı DNA hibridizasyon yöntemleri geliştirilmiştir. InnoLipa ya ait HCV genotipleme kiti ters dotblot hibridizasyon prensibine dayalı olan line prob assay dir. Bu kit 5 UTR amplifikasyon ürünlerini genotipe spesifik problar ile belirlemektedir. (Stuyver vd 1993). InnoLipa nın bu versiyonun hassasiyeti düşük olmasına rağmen yeni versiyonunda HCV nin 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 3c, 4a 4h, 5a ve 6a subtiplerini belirleyebilmektedir (Maertens vd 1997). Genotiplendirme için başka bir metod; restriksiyon enzimleri ile restriksiyon fragmentlerini boylarına göre ayırt edilebilmesidir (RFLP). Bu metodda PZR ile amplifiye edilmiş olan DNA lar restriksiyon endonüklezlar ile farklı boylarda fragmentlere ayrılır, bu fragmentler her genotipe özgü bölgeleri ifade eder (Xavieer vd 1998). Bu yöntemle HCV genotipleme NS5 ve 5 UTR bölgeleri için uygulanabilir 14

25 (Bukh vd 1992, Chan vd 1992, Nakao vd 1991). Bu yöntemin en büyük dezavantajı tüm HCV genotiplerini saptayamamasıdır. Genotiplemede kullanılan yöntemlerin karşılaştırılmasında, yöntemler arası anlamlı bir korelasyon bulunmuştur. Bununla beraber, 5'UTR bölgesinin genotiplemede yetersiz kaldığı durumlar söz konusu olabilmektedir. Ülkemizde görülmemekle beraber bazı genotip 6 dizinleri 5'UTR dizileri bakımından genotip 1a ve 1b ile çok benzerlik göstermektedir. Bizim ülkemizi daha fazla ilgilendiren konu, sıklıkla 5'UTR dizilerinden 1a ve 1b ayrımını yapmada kullanılan 243. nükleotidin bu ayrımda zaman zaman yetersiz kalması durumudur. Benzer sorunlar 2a, 2b ve 2c ayrımında da yaşanabilmektedir. Genelde tüm genomu temsil ettiği varsayılarak yapılan küçük bir bölgedeki nükleotid dizilimleri rekombinasyon olaylarının saptanmasında yetersiz kalırlar. Genotiplemede en detaylı ve doğru sonuç kor, E1 ya da NS5B bölgesinin PZR ile çoğaltılıp dizi analizinin yapılması ile elde edilebilir Serolojik Genotipleme Serolojik yöntemlerin diğer yöntemlere göre bazı avantajları vardır, bunlar daha az kontaminasyon riski ve daha basit uygulanabilir olmasıdır. Son 9-10 yıldır özellikle 2 serolojik yöntemle genotiplendirme yapılmaktadır. Đlk olarak; RIBA SIA, NS4 bölgesinden 5 farklı serotip-spesifik peptid sekansına ve kor bölgesinin 2 farklı serotipspesifik peptid sekansına göre 1, 2 ve 3 olarak genotiplendirmesi için kullanılır (Dixit vd 1995). Đkinci serolojik genotipleme yöntemi ise; Murex HCV ile NS4 bölgesinde genotip-spesifik antikorlar kullanılarak genotip 1, 2, 3, 4, 5 ve 6 belirlenebilmektedir. HCV nin serolojik tiplendirilmesinde, ya göreceli olarak korunmuş kor bölgesinden köken almış sentetik peptidlere karşı geliştirilmiş antikorlar ya da daha değişken olan NS4 bölgesinden köken almış tipe özgü sentetik peptidlere karşı geliştirilmiş antikorlar kullanmaktadır. PZR a dayalı yöntemler nispeten daha duyarlı olmakla birlikte her iki yöntemin de olumlu ve eksik yanları vardır. 15

26 1.10. HCV Bulaş Yolları HCV bulaş yolları aşağıda belirtilmiştir. 1) Kan ve kan ürünleri 2) ĐV uyuşturucu ilaç 3) Nasokomial bulaşma 4) Perinatal bulaşma: Anti HCV pozitif anneden çocuğa bulaşma HCV RNA pozitif anneden çocuğa bulaşma HCV RNA + HIV pozitifliği 5) Cinsel yolla bulaşma: HCV nin cinsel yolla bulaşması olasıdır. Fakat HBV ve HIV den daha azdır. 6) Đntrafamilial bulaşma 7) Organ nakli 8) Kulak veya vücut piercingleri traş bıçakları HCV Tanı ve Tedavi HCV nin tanısında kullanılan virolojik testler anti-hcv antikor testleri, HCV RNA viral yükünün ölçümü ve genotipleme testleridir. HCV antikorunun aranmasında bugüne kadar 3 kuşak enzim immün test (EIA) kullanılmıştır. Günümüzde kullanılmakta olan 3. kuşak EIA testleri 2. kuşak EIA testinde kullanılan kor ve NS3 antijenlerinin yeniden düzenlenerek bunlara bir de NS5 bölgesine ait bir antijenin eklenmesiyle oluşturulmuştur. Bu testin duyarlılığı 2. kuşak testine göre daha yüksek olup daha kısa sürede serokonversiyonu saptama olanağı sağlamaktadır. Buna ek olarak rekombinant immünoblot testler (RIBA) pozitif EIA sonuçlarını desteklemek amacıyla kullanılır. EIA ucuz ve kullanımı kolay bir testtir ancak akut ve kronik enfeksiyonları ayırt etmez, sadece hastanın HCV ile karşılaştığını gösterir. HCV nin saptanmasında veya HCV RNA nın kantitatif ölçümünde, sinyal amplifikasyonu (bdna) ve hedefin çoğaltılması olmak üzere moleküler biyoloji temelli iki tip teknik kullanılmaktadır. Ticarileştirilmiş bdna testi, ELISA yöntemine benzer 16

27 hibridizasyon temeline dayanır ve HCV RNA nın kantitatif ölçümüne olanak verir. Günümüzde yaygın olarak kullanılan hedefin çoğaltılması temelli yöntemlerde genomik hedef genelde 5'-UTR dir. Bu yönteme dayalı ticarileştirilmiş testler iyi standardize edilmiştir ve düşük düzeydeki HCV kopyalarının saptanmasına olanak verir. HCV RNA nın çoğaltılmasına yönelik tüm testler RNA nın cdna ya transkripsiyonu, bunu takiben çoğaltma aşaması ve çoğaltılan ürünlerin kolorimetri ile saptanması aşamalarını gerçekleştirir. Çoğaltılan ürünlerin saptanması aşaması klasik PZR ı gerçek zamanlı PZR temelli testlerden ayıran aşamadır. HCV RNA nın saptanması ve kantifikasyonu için geliştirilmiş ve ticarileştirilmiş son testler real-time RT-PZR teknolojisine dayanır. Klasik RT-PZR dan farklı olarak amplifikasyon her bir PZR siklusunda enzimatik reaksiyonla saptanır. Klasik RT-PZR a göre daha düşük miktarlar da saptanabilir. Ticarileştirilmiş bu teknolojiler örneklerden RNA nın izole edilmesi ve amplifikasyonu sürecini birleştiren otomatize platformlar sağlamıştır. Bu testlerle tüm genotipler saptanabilir. Testlerin en büyük avantajı nispeten yüksek duyarlılıktır. Ancak tüm PZR temelli testler gibi, düşük viral yükü olan örneklerde (serum veya plazma) çoğaltamama ve kontaminasyona bağlı yanlış pozitif reaksiyonların oluşması gibi riskleri vardır. Bu nedenle internal kontroller kullanılmalıdır. Kronik HCV tedavisinde Đnterferon en temel tedavidir. Đnterferon direk antiviral mekanizması olan ve bağışıklık sistemini virüse karşı kuvvetlendiren bir glikoproteindir. Bununla beraber, 48 hafta boyunca haftada 3 kez, 3 milyon ünite, yalnızca interferonla yapılan tedavi, %10-19 oranında düşük devam eden virolojik yanıt üretmektedir. Sentetik guanozin analoğu olan ribavirin, RNA ve DNA virüslerine karşı direkt bir etkiye sahiptir ve viral bağımlı RNA polimerazı inhibe ettiği düşünülmektedir. Tek başına verilen ribavirinin HCV üzerinde bir etkisi yoktur. Bununla beraber, ribavirin ile standart interferonun birlikte kullanımı virolojik yanıtı artırmaktadır. Son zamanlarda kullanılan, interferonun pegylated formülasyonu ile birlikte kullanılan ribavirin yanıt oranını artırmaktadır. Hem monoterapiye hem de kombinasyona virolojik yanıt geliştiren hastalarda aynı zamanda histolojik düzelme ortaya çıkmaktadır. HCV enfeksiyonu tedavisinde kullanılan peg interferon alfa (PEG-IFN alfa) ve ribavirin kombinasyonunun tedaviye kalıcı yanıtı yaklaşık olarak %60 dır. Bu tedavinin başarısı HCV genotipi ve tedavi öncesi viral yüke bağlıdır. Çok sayıda çalışma HCV viral yükü ve karaciğer hastalığının ilerleyişi arasında bir bağlantı olduğunu göstermiştir. Tedaviye 17

28 kalıcı yanıt tip 1 ve 4 için %52 olup, tip 2 ve 3 için %85 e çıkmaktadır (Hadziyannis vd 2004). Ayrıca tedavi sırasında HCV RNA nın saptanması ve viral yük miktarının tayininin yapılması tedavinin yeterli olup olmadığının belirlenmesinde gereklidir. Tedavi, ilaç dozu ve süresi genotipe bağlı olarak planlanabilir. Bazı değişkenler tedaviye verilen kalıcı yanıtla ilişkili bulunmuştur. Genotip 1 haricinde ki HCV genotipi, düşük serum HCV RNA seviyeleri ve bazalde fibrozis veya sirozun olmaması durumlarında tedaviye verilen yanıt artmaktadır. 18

29 2. KAYNAK ÖZETLERĐ 2.1. Türkiye de Yapılan HCV Genotipleme Çalışmaları Türkiye de yılları arasında, çeşitli bölge ve şehirlerde yapılan HCV genotipleme çalışmalarına göre belirlenen genotipler tabloda gösterilmiştir. Bu çizelge 2.1 e göre genotip 1b en çok görülen genotiptir, bunu takiben genotip 1a görülmektedir. RFLP yöntemi kullanılarak yapılan çalışmalarda; Abacıoğlu ve ark. 89 hastada yaptıkları araştırmada %19.1 tip 1a, %75.3 tip 1b, %3.4 tip 2 ve %2.2 tip 4 saptamışlardır (Abacıoğlu vd 1995). Sayan ve ark. 10 hastalık bir çalışma sonucunda hastaların tümünün genotipi 1b olarak belirlemişlerdir (Sayan vd 2001). Bozdayı ve ark. nın 36 hastada yaptıkları çalışmada %17 tip 1a, %78 tip 1b, %3 tip 2a genotipleri saptanmıştır (Bozdayı vd 2000). Gürsoy ve ark. nın 67 olguda yaptıkları çalışma sonucunda %4.47 tip 1a, %52.2 tip 1b, %7.46 tip 2b, %2.98 tip 3 ve %11.9 tip 4 genotiplerini saptamışlardır (Gürsoy vd 2001). Bozdayı G. ve ark. 36 hastada yaptıkları çalışmada %22 tip 1a ve %78 tip 1b bulmuşlardır (Bozdayı G. vd 2002). Aslan ve ark. nın 39 hastalık yaptıkları çalışmada 4 hastanın genotipi 1a olarak belirlenirken 35 hastanın genotipi tip 1b olarak belirlenmiştir (Aslan vd 2004). Tipe özgü PZR ile genotip belirleme çalışmalarında; Yarkın ve ark. nın 87 hasta ile yaptıkları çalışma sonucunda hastaların %100 ü tip 1b olarak belirlenmiştir (Yarkın vd 1997). Kendal ve ark. 28 hastada yaptıkları çalışma sonucu %100 tip 1b genotipi belirlemişlerdir. Uzunalimoğlu ve ark. nın 39 hasta ile yaptıkları çalışmada hastaların %5 i tip 1a, %87 si tip 1b ve %8 i tip 2b olarak belirlenmiştir (Uzunalimoğlu vd 1995). Selçuk ve ark. 130 hastada yaptıkları çalışma sonucunda %25 tip 1a, %68 tip 1b ve %7 tip 4 genotipleri saptamışlardır (Selçuk vd 2006). Akhan ve ark. 59 olgu içeren bir çalışmada 1 olguda tip 1a, 57 olguda tip 1b ve 1 olguda ise tip 1c saptamışlardır (Akhan vd 2008). LIPA yöntemi ile yapılan çalışmalara göre; Altındiş ve ark. nın 53 hastalık yaptıkları çalışma sonucunda hastaların %6 sı tip 1a, %92 si tip 1b ve %2 si tip 2 olarak saptanmıştır (Altındiş vd 2006). Altındiş ve ark. nın yaptıkları başka bir çalışmada LIPA ve dizi analizi yöntemlerini kullanmışlardır. Bu çalışmanın sonuçları 30 kişilik hasta grubunun %3.3 ü tip 1a, %93.3 ü tip 1b ve %3.3 ü tip 3a olarak belirlenmiştir (Altındiş vd 2007). Hizel ve 19

30 ark. nın 56 hastada yaptıkları çalışma sonucunda hastaların 9 u tip 1a, 30 u tip 1b ve 15 i ise tip 4 olarak saptanmıştır (Hizel vd 1998). Filogenetik analiz ve dizi analizi ile yapılan çalışmalara göre; Zeytinoğlu ve ark. nın 8 hastalık yaptıkları çalışma sonucunda %37.5 tip 1a, %37.5 tip 1b, %12.5 tip 3a ve %12.5 tip 4a saptanmıştır (Zeytinoğlu vd 2002). Şanlıdağ ve ark. nın 100 hastalık yaptıkları çalışma sonucunda hastaların %2 si tip 1a, %90 ı tip 1b, %2 si tip 2a ve %5 i tip 4a olarak saptanmıştır (Şanlıdağ vd 2009). Çil ve ark. 22 hasta ile yaptıkları çalışmada 5 hastada tip 1a, 16 hastada tip 1b ve 1 hastada ise tip 3a genotipi belirlemişlerdir (Çil vd 2007). Bozdayı ve ark. 365 hasta ile yaptıkları çalışma sonucunda 43 hastada tip 1a, 306 hastada tip 1b, 10 hastada tip 2, 3 hastada tip 3 ve 3 hastada da tip 4 saptamışlardır (Bozdayı vd 2004). Ural ve ark. nın 80 hastalık yaptıkları çalışmada hastaların %100 ü tip 1b olarak belirlenmiştir (Ural vd 2007). Yıldırım ve ark. 37 hastalık çalışmalarında %11 tip 1a, %76 tip 1b, %5 tip 2a ve %8 i ise tip 4a olarak saptamışlardır (Yıldırım vd 2006). Türkiye de yapılan çalışmalarda HCV genotipleri içinde genotip 1b % arasında olup birinci sıklıkla görülmektedir. Đkinci sıklıkla gösterilen genotip ise % oranındaki genotip 1a dır. Daha az sıklıkla genotip 2a, 3a, 4, 4c bildirilmiştir. Tüm bu çalışmalar, Türkiye de genotip 1 HCV li olguların % sinde saptandığı gösterilmiştir. 20

31 Çizelge 2.1. Türkiye de yapılan HCV genotipleme çalışmaları Çalışma Grubu Bölge Yıl HCV RNA Saptanması Hasta Profili Hasta Sayısı Genotipleme 1a 1b Abacıoğlu ve ark. Ege 1995 nested RT-PCR Hemodiyaliz Hastaları 89 RFLP %19.1 %75.3 %3.4 %2.2 Sayan ve ark. Ege 2001 nested RT-PCR + Amplicor, Roche Kronik HCV enfeksiyonu 10 LIPA + RFLP 10 (%100) Zeytinoğlu ve ark. Ege 2002 Amplicor, Roche Nosokomial HCV enfeksiyonu 8 Filogenetik Ağaç (NS5B) 3 (%37.5) 3 (%37.5) 1 (12.5) 1(%12.5) Altındiş ve ark. Ege 2006 nested RT-PCR Askerler ve kan bağışçıları 53 LIPA 3 (%6) 49 (%92) 1 (%2) Altındiş ve ark. Ege 2007 Rotorgene Artus + Kronik HCV enfeksiyonu, hemodiyaliz LIPA + Dizi Analizi 30 nested RT-PCR hastaları, kan bağışçıları, hastane çalışanları (NS5 ve 5'UTR) 1 (%3.3) 28 (%93.3) 1 (%3.3) Altuğlu ve ark. Ege 2007 nested RT-PCR Kronik HCV enfeksiyonu 345 RFLP + Dizi Analizi 34 (%10) 301 (%87) 3 (%0.9) 5 (%1.4) 2 (%0.6) Tekin ve ark. Ege 2008 Amplicor, Roche HCV-related decompensated cirrhotics 20 NA 20 (%100) Şanlıdağ ve ark. Ege 2009 Real-time PCR Kronik HCV enfeksiyonu 100 Filogenetik Analiz 2 (%2) 90 (%90) 2 (%2) 4a/5 (%5) Akız ve ark. Akdeniz 1996 nested RT-PCR Hepatoselüler Karsinom 22 nested RT-PCR (Kor bölgesi) 22 (%100) Yarkın ve ark. Akdeniz 1997 Nested RT-PCR Kronik HCV enfeksiyonu 87 Tipe Özgü PZR 87 (%100) Kendal ve ark. Güneydoğu 1999 nested RT-PCR Kronik HCV enfeksiyonu 28 Tipe Özgü PZR 28 (100%) Çil ve ark. Güneydoğu 2007 nested RT-PCR Kronik HCV enfeksiyonu 22 Dizi analizi Uzunalimoğlu ve ark. Đç Anadolu 1995 Nested RT-PCR Kronik HCV enfeksiyonu 39 Tipe Özgü PZR %5 %87 %8 Hizel ve ark. Đç Anadolu 1998 nested RT-PCR Hemodiyaliz Hastaları 56 LIPA 9 (%16) 30 (%)54 15 (%27) Bozdayı AM ve ark. Đç Anadolu 2000 nested RT-PCR Kronik HCV enfeksiyonu 36 RFLP 6 (%17) 28 (%78) 1 (%3) Gürsoy ve ark. Đç Anadolu 2001 AcuGen RT- Amplisensor (Biotronics Hemodiyaliz Hastaları 67 RFLP 3 (%4.47) 35 (%52.2) 5 (%7.5) 2(%2.98) 8(%11.9) Tech.) Bozdayı G ve ark. Đç Anadolu 2002 nested RT-PCR Hemodiyaliz Hastaları 36 RFLP 8 (%22) %78 Aslan ve ark. Đç Anadolu 2004 nested RT-PCR NS5A bölgesi için Kronik HCV enfeksiyonu 39 RFLP 4 35 Bozdayı AM ve ark. Đç Anadolu 2004 nested RT-PCR Kronik HCV enfeksiyonu 365 Dizi analizi 43 (%11) 306 (%84) 10 (%3) 3(%1) 3(%1) Selçuk ve ark. Đç Anadolu 2006 nested RT-PCR Son aşama Böbrek hastaları 130 Genotiplere özgü prob hibridizasyon 32 (%25) 89 (%68) 9(%7) Ural ve ark. Đç Anadolu 2007 nested RT-PCR Kronik HCV enfeksiyonu 80 Dizi analizi 80 (%100) Türkoğlu ve ark. Marmara 1996 nested RT-PCR Kronik HCV enfeksiyonu 79 NA %9 %47 %5 Turhan ve ark. Marmara 2005 nested RT-PCR Kronik HCV enfeksiyonu 50 RFLP 15 (%30) 31 (%62) 4 (%8) Coşkun ve ark. Marmara 2005 nested RT-PCR Hemodiyaliz ve böbrek transplantasyonu olan hastalar 14 RFLP 3 11 Yenice ve ark. Marmara 2006 PZR Kronik HCV enfeksiyonu 74 NA 9 63 Yıldırım ve ark. Marmara 2006 nested RT-PCR Hemodiyaliz Hastaları 37 Dizi analizi 4 (%11) 28 (%76) 2 (%5) 3 (%8) Çakaloğlu ve ark. Marmara 2008 Cobas Amplicor, Roche Kronik HCV enfeksiyonu 30 LIPA 3 (10%) 27 (%90) Akhan ve ark. Marmara 2008 Cobas Amplicor, Roche Hemodiyaliz Hastaları 59 NS5B bölgesine özgü primerler ile PZR 1 57 Şentürk ve ark. Marmara 2008 Amplicor, Roche Kronik Hepatit B/C Koenfeksiyonu 36 NA 36 (%100) Sayan ve ark. Marmara 2009 Real -time PCR, Flourion Kronik HCV enfeksiyonu? Dizi analizi 21

32 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyaller Hasta Grupları Bu tez çalışmasına Şubat 2007 Eylül 2010 tarihleri arasında Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Gastroenteroloji Anabilim Dalı Polikliniği ne başvuran HCV enfeksiyonu varlığı kanıtlanmış 500 hasta dahil edilmiştir. 500 hastadan 274 i kadın, 226 u erkek hastadır. Hastaların yaş ortalamaları 57 dir. Hasta serumları Roche COBAS Ampliprep / COBAS Taqman HCV Test ile yapılan deney sonucu hastaların HCV viral yükleri belirlenmiştir. HCV viral yükü 10 3 ve üzeri olan hastalar çalışmaya dahil edilmiştir. Hasta serumları çalışmaya alınana kadar -20 C de saklanmıştır HCV RNA Đzolasyonu Viral yükü belirlenen hasta serumları High Pure Viral RNA Isolation kit kullanılarak serumdan HCV RNA elde edilmiştir. Primerler NS5B, E1 ve 5'UTR bölgelerinin amplifikasyonu için kullanılan primerler aşağıda verilmiştir. DM 106 5' GGN GCY GAG TAY CTG GTC ATG GC 3' NS5B B1 5' TAT GAY ACC CGY TGC TTT GAC 3 ' NS5B B2 5' GAG GAG CAA GAT GTT ATC AGC TC 3' NS5B B3 5 'GAA TAC CTG GTC ATA GCC TCC 3' DM 110 5' GTR GGN GAC CAR TTC ATC ATC A 3' DM 111 5' GCA ACA GGG AAY YTD CCY GGT TGC TC 3' DM 108 5' TTC ATC ATC ATR TCC CAN GCC AT 3' DM 109 5' AAY YTD CCC GGT TGC TCT TTY TCT AT 3' HCV 11 5' ATA CTC GAG GTC CAC GGT CTA CGA GAC CT 3' HCV 12 5' CAC TCT CGA GCA CCC TAT CAG GCA GT 3' HCV 13 5' CTG TGA GGA ACT ACT GTC TT 3' HCV 14 5' TTC ACG CAG AAA GCG TCT AG 3' 22

33 cdna Elde Edilmesi cdna elde dilmesinde kullanılan malzemeler aşağıda verilmiştir. * Ters Transkriptaz, AMV set ( dntp (datp, dctp, dgtp, dttp) (2mM) * datp 10 µl * dctp 10 µl * dgtp 10 µl * dttp 10 µl * dh 2 O 460 µl *Geri primerler (DM 106, DM 110, HCV 11) * RNA * dh 2 O Polimeraz Zincir Reaksiyonları NS5B, E1 ve 5'UTR bölgelerinin amplifikasyonu için gerekli malzemeleri aşağıda verilmiştir. NS5B PZR (Nested PZR) * Fermentase Taq Polymerase set * dntp (2mM) * Primerler: 1. Tur için; NS5B B1 NS5B B2, 2. Tur için; NS5B B1 NS5B B3 * cdna * dh 2 O E1 PZR (Nested PZR) * Fermentase Taq Polymerase set * dntp (2mM) * Primerler: 1. Tur için; DM 110 DM 111, 2. Tur için; DM 108 DM 109 * cdna * dh 2 O 5 UTR PZR (Nested PZR) * Fermentase Taq Polymerase set * dntp (2mM) * Primerler: 1. Tur için; HCV 11 HCV 13, 2. Tur için; HCV 12 HCV 14 23

34 * cdna * dh 2 O PZR Ürünlerinin Görüntülenmesi Görüntüleme için gerekli malzemeler aşağıda verilmiştir. * Tris-asetik asit-edta Tamponu (TAE) (10X) 0,2 M Tris base, 0,09 M Glasiyal asetik asit, 0,05 M EDTA * Agar PZR Ürünlerinin Temizlenmesi 1. ve 2. Tur PZR ürünlerinin temizlenmesi için gerekli malzemeler aşağıda verilmiştir. * Silika (35 g. GSCN, 0,10 g, Tris, 1g, Silika, 60 µl HCl, 100ml dh 2 O) * % 70 Ethanol * dh 2 O Örneklerin Nanodropta Ölçülmesi Örneklerin sekans PZR da kullanılacak miktarlarını belirlemek amacıyla nanodropta ölçüm yapılır Sekans PZR * BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit * Geri primerler (NS5B B3, DM 108, HCV 14) * dh 2 O Sekans PZR Temizleme Sekans PZR ürünlerinin temizlenmesi ve cihaza yüklenmesi amacıyla NaOAc ve Formamid ile temizleme yapılmıştır. * % 95 Ethanol * dh 2 O * NaOAc * Formamid * Vorteks 24

35 Cihazlar HCV genotiplendirmesi için yapılan deneylerde kullanılan cihazlar aşağıda verilmiştir. * Roche COBAS Ampliprep * UV görüntüleme cihazı * Thermal Cycler PZR Cihazı * Soğutmalı Santrifüj * Nanodrop 1000 Spektrofotometre * ABI 310 Genetic Analyser * Hassas Terazi * Laminar Flow * Đnkübatör 3.2. Yöntemler HCV RNA Đzolasyonu Laminar Flow da High Pure Viral RNA Izolation kit kullanılarak yapılmıştır. Santrifüj işlemleri +4 C de yapılmıştır. Deney aşamaları aşağıda ki gibidir. 1. Ependorf tüpüne hasta başı 400 µl Binding buffer üzerine 4 µl poly A eklenir µl hasta serumu eklenir 3. 5 dk. oda sıcaklığında bekletilir 4. Karışım filtreli tüplere aktarılır rpm de 1 dk santrifüj edilir 6. Supernatant atılır µl inhibitor removal buffer eklenir rpm de 1 dk santrifüj edilir 9. Supernatant atılır µl wash buffer eklenir (x2) 11. Supernatant atılır µl dh 2 O eklenir 13. Santrifüj edilir ve son ürün ependorf tüplerine alınır C de saklanır 25

36 cdna Elde Edilmesi Her örnek için; 5 µl dh 2 O 4 µl buffer 4 µl dntp (2mM) 1 µl reverse primer 0.2 µl AMV 5 µl RNA 42 C de 90 dk Thermal Cycler PZR Cihazında bekletilir Polimeraz Zincir Reaksiyonları NS5B, E1 ve 5'UTR bölgelerinin amplifikasyonunda kullanılan yöntemler aşağıda verilmiştir. PZR (NS5B) 1. Tur / 2. Tur Her örnek için; 29,6 µl dh 2 O 5 µl Buffer 5 µl dntp (2mM) 3 µl MgCl 2 1 µl NS5B B1 (25 pmol) / 1 µl NS5B B1 (25 pmol) 1 µl NS5B B3 (25 pmol) / 1 µl NS5B B3 (25 pmol) 0,4 µl Taq DNA polimeraz 5 µl DNA PZR protokolü; 95 C 5 dk 95 C 30 sn 56 C 30 sn 30 döngü 72 C 1 dk 72 C 10 dk 26

37 PZR (E1) 1. Tur / 2. Tur Her örnek için; 29,6 µl dh 2 O 5 µl Buffer 5 µl dntp (2mM) 3 µl MgCl 2 1 µl DM 110 (25 pmol) / 1 µl DM 111 (25 pmol) 1 µl DM 108 (25 pmol) / 1 µl DM 109 (25 pmol) 0,4 µl Taq DNA polimeraz 5 µl DNA PZR protokolü; 94 C 5 dk 94 C 30 sn 55 C 30 sn 30 döngü 72 C 1 dk 72 C 10 dk PZR (5 UTR) 1. Tur / 2. Tur Her örnek için; 30.5 µl dh 2 O / 32.5 µl dh 2 O 5 µl Buffer 5 µl dntp (2mM) 3 µl MgCl 2 2 µl HCV 11 (10 pmol) / 1 µl HCV 13 (10 pmol) 2 µl HCV 12 (10 pmol) / 1 µl HCV 14 (10 pmol) 0,4 µl Taq DNA polimeraz 5 µl DNA PZR protokolü; 95 C 5 dk 95 C 1 dk 55 C 1 dk 30 döngü 72 C 1 dk 72 C 7 dk 27