SALT ANTİ HEPATİT B VİRUS CORE ANTİKORU POZİTİF KAN DONÖRLERİNDE HEPATİT B VİRUS DNA TESPİTİ

Transkript

1 T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ TIBBİ MİKROBİOLOJİ ANABİLİMDALI SALT ANTİ HEPATİT B VİRUS CORE ANTİKORU POZİTİF KAN DONÖRLERİNDE HEPATİT B VİRUS DNA TESPİTİ Dr. Tekin TAŞ UZMANLIK TEZİ DANIŞMAN Doç. Dr. Selçuk KAYA Bu tez Süleyman Demirel Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından 1487-TU-07 Proje numarası ile desteklenmiştir ISPARTA

2 İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER... i KISALTMALAR...iii ŞEKİLLER ve TABLOLAR DİZİNİ... iv ÖNSÖZ... v 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Tarihçe Sınıflandırma Hepatit B Virusu Hepatit B Virusu nun Genom Yapısı Viral Yaşam Siklusu Replikasyon Viral Proteinler Kılıf (Yüzey) Proteinleri Kor Proteinleri P Proteini X Proteini HBV Genotipleri İmmun Kaçış Mekanizmaları HBV Mutasyonları Yüzey (Kılıf) Mutasyonları Prekor/Kor Bölgesi Mutasyonları Polimeraz Geni Mutasyonları X Geni Mutasyonları Hepatit B İnfeksiyonu Epidemiyolojisi Bulaşma Yolları Perkütan Bulaşma Cinsel Temasla Bulaşma Perinatal Bulaşma Horizontal (Yatay) Bulaşma Dünyada HBV İnfeksiyonu Prevalansı i

3 Türkiye de HBV İnfeksiyonu Prevalansı Hepatit B İnfeksiyonu Patogenezi Akut Hepatit B de Klinik Bulgular ve Tanı Kronik Hepatit B de Klinik Bulgular ve Tanı Ocult Hepatit B İnfeksiyonu Ocult Hepatit B İnfeksiyonu ve HBV İnfeksiyonunun Bulaşması HBV İnfeksiyonunun Serolojik Tanısı HBV İnfeksiyonlarının Moleküler Tanısı Hibridizasyon Yöntemleri Nükleik Asit Amplifikasyon Yöntemleri PCR Uygulamasındaki Temel Aşamalar HBV-DNA Testinin Amaca Uygun Kullanımı Tedavi Kronik Hepatit B de İnterferon Tedavisi Akut Hepatit B de İnterferon Tedavisi İnterferon Dışı Tedaviler Korunma MATERYAL VE METOD BULGULAR TARTIŞMA ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR ii

4 KISALTMALAR Ab ABD Ag ALT AST Anti-HBs Anti-HBc Anti-HBe cccdna CDC DNA DR EIA GRE ELISA HBsAg HBcAg HBeAg HBV HCC Ig G Ig M IFN ORF OD PBMC PCR RNA SD : Antikor : Amerika Birleşik Devletleri : Antijen : Alanin aminotransferaz : Aspartat aminotransferaz : Hepatit B yüzey antijenine karşı oluşan antikor : Hepatit B core antijenine karşı oluşan antikor : Hepatit B e antijenine karşı oluşan antikor : Covalently-closed-circularDNA : Center for Disease Control : Deoksiribonükleik asit : Direct Repeats : Enzyme Immunoassay : Glucocorticoid Responsive Element : Enzyme linked immunosorbent assay : Hepatit B surface (yüzey) antijeni : Hepatit B core antijeni : Hepatit B e antijeni : Hepatit B virusu : Hepatocelluler carsinoma : İmmünglobülin G : İmmünglobülin M : Interferon : Open reading frame : Optik dansite : Periferal blood mononüklear ceels : Polymerase chain reaction : Ribonükleik asit : Standart deviasyon iii

5 ŞEKİLLER ve TABLOLAR DİZİNİ Şekil 1: HBV partikül yapısı... 6 Şekil 2: HBV partiküllerinin elektron mikroskobundaki görünümü... 6 Şekil 3: Genom yapısı... 9 Şekil 4: Hepatit B virusunun replikasyonu Şekil 5: HBV infeksiyonunda olası patogenezin süreçleri Şekil 6: Akut HBV infeksiyonunun seyri Şekil 7: Kronik HBV infeksiyonunun seyri Şekil 8: Viral Hepatit B de serolojik-moleküler tanı Tablo 1: HBV genotip ve subtiplerinin coğrafi dağılımı Tablo 2: HBV İnfeksiyonun bulaşma yolları ve risk grupları Tablo 3: HBV-DNA, HBeAg ve Anti-HBe serolojik profilinin yorumu Tablo 4: HBV infeksiyonu olan hastalarda tipik serolojik profil Tablo 5: HBV infeksiyonlarının serolojik tanısında karşılaşılan olağan dışı profiller Tablo 6: HBsAg negatif donörlerde Anti-HBs, Anti-HBc, Anti-HBe, HBeAg durmları ve HBV DNA pozitiflikleri Tablo 7: Serolojik profillerine göre HBV DNA oranları Tablo 8: HBV DNA pozitif olanlarda HBeAg ve Anti-HBe oranları Tablo 9: HBV DNA pozitif serumların serolojik profilleri ve viral yük miktarı Tablo 10: Viral yük miktarına göre HBV DNA pozitiflik oranları iv

6 ÖNSÖZ Uzmanlık eğitimi süresince bana yakın ilgi ve desteklerini esirgemeyen, yol gösteren değerli hocalarım; anabilim dalı başkanımız sayın Doç. Dr. Buket CİCİOĞLU ARIDOĞAN a tez çalışmalarımın büyük bir titizlikle yürütülmesini sağlayan çok değerli danışman hocam Doç. Dr. Selçuk KAYA ya, Doç. Dr. Mustafa DEMİRCİ ye, Doç. Dr. Ali Kudret ADİLOĞLU na ve Yrd. Doç. Dr. Emel SESLİ ÇETİN e teşekkürlerimi sunarım. Birlikte çalıştığımız Dr. Süleyman ÖNAL, Dr. Hasan KESBİÇ, Dr. Nurettin GÖNÜLATEŞ, Dr. Mehmet Salih ARIKAN, Dr. İlker PAKBAŞ, Dr. Hayati GÜNEŞ, Dr. Tülay TETİK, Dr. Ayşe AYNALİ, Dr. Osman KILINÇ ve Dr. Ayşe Gül ÖZSEVEN e asistanlık eğitimim sırasında bana sağladıkları katkı ve desteklerinden dolayı teşekkür ederim. Laboratuar çalışanlarından Cengiz KAYAER, Hakan DOĞANGÖNÜL ve Bediha OĞUZ başta olmak üzere tüm biyolog ve teknisyen arkadaşlara yardımlarından dolayı teşekkür ederim. v

7 1. GİRİŞ HBV dünya genelinde mortalite ve morbidite nedeni olan önemli bir halk sağlığı sorunudur. Dünyada 350 milyondan fazla HBV taşıyıcısı olduğu tahmin edilmektedir. Türkiyede %6,8 oranında HBs Ag pozitifliği bildirilmektedir. Bu oran kronik KC hastalarında %55-60 düzeyindedir (1). HBV Hepadnaviridae ailesinin Orthohepadnavirus cinsinde yer alan hepatotropik, zarflı ve kısmen çift sarmallı bir DNA virusudur nükleotidden oluşan genomik bir yapısı vardır ve bilinen tüm hayvan virusları içerisinde en küçük olanıdır (2). Serum hepatiti, uzun kuluçka süreli hepatit, MS-2 hepatiti ve viral hepatit B diye isimlendirilen enfeksiyon hastalığının etkenidir. Sadece insanları infekte eder. Doğadaki kaynağı, bu virusla infekte kişilerdir (3, 4). Bütün dünyada yaygın olarak görülen HBV ye bağlı akut hepatitin ortalama % 5 inin kronikleştiği ve bunların önemli bir bölümünün siroza dönüştüğü; sirozlu olguların ise hepatosellüler karsinom gelişme riskinin oldukça yüksek olduğu bilinmektedir (5). HBsAg nin serumdan kaybolup anti-hbs gelişinceye kadar geçen süreye pencere dönemi denir. Bu dönemde anti-hbcigm in varlığı akut infeksiyonu gösteren en önemli markerdir. Anti-HBcIgM in sebat etmesi hastalığın kronikleşeceğine işaret eder. Kronik HBV infeksiyonunda anti-hbcigm düşük titrede bulunur (6, 7, 8, 9). Serumda HBsAg nin varlığı akut ya da kronik HBV infeksiyonunu gösterir. Akut HBV infeksiyonunun varlığında HBsAg pozitifliğinin süresi değişkendir, 6 aydan fazla devam etmesi kronikleşmenin göstergesidir. Serumda HBV-DNA pozitifliği HBsAg pozitifliğinden önce saptanır (3, 10, 11). HBV-DNA viral replikasyonun en sensitif göstergesidir. HBsAg varlığında PCR ile serumda HBV-DNA tespiti viremi düzeyini ortaya koyan en iyi markerdir ve serum transaminaz düzeyleri ile koreledir (6, 8, 9). Spontan veya tedavi ile HBsAg si kaybolan bazı hastalarda serum ve/veya karaciğerde hassas PCR teknikleri ile düşük düzeyde HBV-DNA varlığı gösterilmiştir (12). Böylece saptanamayan HBsAg ile birlikte kronik HBV infeksiyonunu tanımlayan bu durum okült: sessiz veya latent HBV infeksiyonu olarak adlandırılmaktadır. Okült 1

8 HBV infeksiyonluların bir kısmında anti-hbc ve/veya anti-hbs pozitifdir. Hastaların önemli bir kısmında her ikisi de negatifdir (13). Rutin olarak yapılan HBsAg taramaları ile bulaşma riski düşük olmasına rağmen, hala transfüzyon ile HBV infeksiyonu bulaşma riski mevcuttur. Okült HBV infeksiyonunun buna katkısı vardır. Organ nakilleri sırasında, vericideki okült HBV infeksiyonu, alıcıya HBV infeksiyonunu bulaştırabilir (14). HBsAg nin negatif olması çok düşük HBsAg konsantrasyonlarından kaynaklanabileceği gibi HBsAg nin majör antijenik determinantlarındaki mutasyonlardan da kaynaklanabilir (15). Serolojik tanı testleri günümüzde yüksek duyarlılığa sahip olduğu halde transfüzyon yoluyla bulaşan hepatitler hala büyük risk taşımaktadır (16). İzole anti-hbc pozitif kişiler post-transfüzon hepatitine yol açabilmektedirler (17). Kan bankaları donör kabulünde asemptomatik gönüllülerde HBsAg testi uygulamaktadır. Asemptomatik gönüllülerden HBsAg negatif tesbit edilenler sağlıklı donör olarak kabul edilmektedir. Ancak HBsAg negatif olan bir kişi virusla karşılaşmış olabilir. HBsAg negatif anti-hbc pozitif olan kan ve organ donörlerinin HBV infeksiyonunu bulaştırabileceği bildirilmektedir (18). Bu yüzden HBV infeksiyonunun herhangi bir serolojik göstergesinin saptanamadığı ya da yalnız anti-hbc pozitifliğinin bulunduğu kişilerin incelenmesi önemlidir (19). Kan bankalarında anti-hbc araştırılması rutin olmadığından gizli hepatitli veya pencere periyodundaki bazı vakalar tespit edilemeyebilir. Bu durum transfüzyon yoluyla hepatit bulaştırılmasına yol açabilir. Bu çalışmada amacımız kan bankasına başvuran HBsAg negatif/anti-hbc pozitif donörlerden salt anti-hbc pozitif olanlarda ve farklı hepatit serolojisine sahip olanlarda viral yük ve HBV bulaştırma riskini araştırmaktır. 2

9 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Tarihçe Viral hepatit ilk defa milattan önce 5. yüzyılda tanımlanmıştır (4). Sarılıktan ilk söz eden Babil Talmudları ve Hipokrat olmasına rağmen Çinliler tarafından bulaşıcı sarılığa ait ilk veriler birkaç bin yıl önce olmuştur (1). Kan ve kan ürünleri ile bulaşan hepatit şekli ilk kez Lurman tarafından 1883 yılında tanımlanmış, Bremen'de çiçek aşısı yapılan 1289 tersane işçinin 191'inde aşı uygulamasından sonra, bir kaç hafta ile 8 ay arasındaki süre içinde sarılık ortaya çıktığı görülmüş olup aşılanmamış kişilerin ise sağlıklı olduğu gözlemlenmiştir (4). Gönüllü mahkûmlar üzerinde u yıllarda yapılan çalışmalar, infeksiyöz hepatiti ve serum hepatiti etkenlerinin günümüzde herkes tarafından bilinen bazı özellikleri hakkında önemli bilgiler sağlamıştır yılında A.B.D.'de bulaşıcı hepatit infeksiyöz hepatit olarak isimlendirilirken, İngiltere Sağlık Bakanlığı aynı yıl bir duyuru ile kan, plazma ve serum naklinden sonra gelişen sarılıkları homolog serum sarılığı olarak isimlendirilmiş, Mc Callum 1947 yılında, infeksiyöz hepatit için hepatit A, serum hepatiti için ise hepatit B terimlerini kullanmıştır (20). Krugman ve ark. (21), 1950'li yılların sonu ile ı yılların ilk yarısında, yaptığı çalışmalar sonucunda; epidemiyolojik, klinik ve immünolojik olarak birbirinden tamamen farklı iki ayrı hepatit virüsünün varlığım doğrulamışlardır. iki virusla farklı zamanlarda infekte M.S. isimli çocuktan sarılığın başlamasından hemen önce alınan serum örnekleri MS-1 ve MS-2 olarak adlandırılmıştır. Bunların (MS-1 ve MS-2) başka çocuklara oral ve intramusküler yoldan verilmesi neticesinde inkübasyon süreleri farklı olan iki tip etkenin varlığının anlaşılmasından sonra MS-1'in hepatit A (kısa kuluçka süreli hepatit, infeksiyöz hepatit) MS-2'nin ise hepatit B (uzun kuluçka süreli hepatit, serum hepatiti) virüsü olduğu anlaşılmıştır. HBV nin tarihçesinde 1965 yılı dönüm noktasıdır. Serum proteinlerinde kalıtımsal polimorfizmi araştıran Blumberg ve arkadaşları Avustralyalı bir yerlinin serumunda, çok sayıda kan transfüzyonu yapılmış bir hastanın serumu ile ağar jelde presipitasyon veren bir antijen bulunduğunu göstermişler ve günümüzde hepatit B yüzey antijeni HBsAg olarak bilinen bu proteine Avustralya antijeni-au antijeni 3

10 adını vermişlerdir. Dane ve arkadaşları 1970'de HBV'nun kısmen saflaştırılmış preparasyonlarının elektron mikroskobik incelemelerinde üç değişik partiküle rastlamışlardır. Bunlardan infektif özelliğe sahip, 42 nm çapında olanlara Dane partikülü adı verilmiştir (20). Krugman 1971 yılında ısı ile inaktive edilen hepatit B yüzey antijeni pozitif serumların immünojenik olduğunu ve aşı olarak kullanılabileceğini göstermiştir de Magnius ve Espmark virusun e antijeni ni tanımlamışlardır (22). Kaplan ve ark yılında virusun kor bölgesinde DNA ya bağımlı DNA polimeraz varlığını saptamışlardır (23). Robinson ve ark. ise HBV genomunun çeşitli özelliklerini deneysel olarak göstermişlerdir. Aynı yıllarda immun elektron mikroskobu ile virusun çeşitli antijenlerinin hepatositlerdeki yerleşim özellikleri belirlenmiş; HBsAg nin hepatosit stoplazmasında HBcAg nin ise nükleusta depolandığı tesbit edilmiştir (24). Hepatit B virusunun doku kültüründe üretilemediğinden ve hayvan deneylerinin belirli maymun türleri ile sınırlı olduğundan bu virusun yapısını ve replikasyon mekanizmasını saptamak oldukça zaman almıştır li yıllarda bazı hayvanlarda HBV benzeri virusların neden olduğu İnfeksiyonların gösterilmesi ve moleküler biyoloji deki ilerlemeler sayesinde virusun epidemiyolojisi, yapısı, infeksiyonun seyri anlaşılırmıştır (25) Sınıflandırma Hepadnaviridae ailesinde bulunan virusların, konak farklılığı, viryon ince yapısı, polipeptit büyüklüğü, gen sayısı, genom nükleotid sekans homolojisi ve antijenik çapraz reaksiyonlar dikkate alındığında memeli hayvan viruslarının bulunduğu Orthohepadnavirus (HBV, WHV, GSHV) ve kanatlı hayvan viruslarının bulunduğu Avihepadnavirus (DHBV) olmak üzere iki cins altında sınıflandırılması önerilmektedir (26, 27, 28) Hepatit B Virusu HBV, Hepadnaviridae ailesinin orthohepadnavirus cinsinde yer alan hepatotropik, zarflı ve kısmen çift sarmallı DNA virüsüdür nükleotidden oluşan genomik yapısı ile bilinen tüm hayvan DNA virusları içinde en küçük olanıdır. 4

11 Hepadnaviridae ailesinin üyeleri içinde insanlarda infeksiyona neden olan tek tür HBV dur. İnfekte hücrelerde birden fazla sayıda partikül tipi oluşumuna neden olmasıyla diğer hayvan viruslarından farklı bir yere sahip olan HBV'nun, kısmen saflaştırılmış preparasyonları elektron mikroskobunda incelendiğinde, büyüklük, yapı ve miktar gibi değişik özellikleri bakımından birbirinden farklı üç tip partiküle rastlanır (2, 26, 27, 28). a- Yaklaşık 42 nm. (42-47 nm.) çapında, infektif özellikte, tam bir viryon yapısında, küresel şekilli, Dane partikülleri; Bir adet sirküler, kısmi çift sarmallı DNA, DNA polimeraz ve Rnase H aktiviteli enzim, İkozahedral yapıda, tek bir fosfoproteinin (HBcAg) kopyalarından oluşan kapsid, Virusun kodladığı üç adet protein (HBsAg) ve hücreden kazanılan, lipitlerden meydana gelen zarf bulunur. b- Yaklaşık 22 nm. (16-25 nm.) çapında, içinde nükleik asit bulunmayan, noninfektif, küresel partiküller; c- Özellikle replikasyonun olduğu kişilerin serumunda bulunan, 22 nm. çapında, nm uzunluğunda nükleik asit ihtiva etmeyen, non-infektif; tübüler partiküller. Non infektif küresel partiküller sadece yüzey antijeninden (HBsAg) oluşmuştur. Her üç formda infekte konak serumunda yüksek miktarda ( mg/ml) tespit edilebilen ve HBsAg olarak isimlendirilen ortak yüzey antijenine sahip olup, immünojeniktir. Anti-HBs antikorları ile reaksiyon verirler. Non-infektif formlar daha fazla miktarda üretilir ve kanda dolaşan HBsAg'nin büyük kısmını 22 nm'lik küresel partiküller oluşturur. Dane partiküllerinin sayısı lo 4 - lo 9 /ml arasında iken, non-infektif küresel partiküllerin miktarı ml veya daha fazladır. Küçük yuvarlak HBsAg partikülleri sezyum klorürde 1.18 g/ml lik bir yoğunluğa sahiptir (2, 27,28, 29). 5

12 Şekil 1: HBV partikül yapısı Şekil 2: HBV partiküllerinin elektron mikroskobundaki görünümü HBV zarflı bir virus olmasına rağmen diğer zarflı viruslara göre çevre koşullarına daha dirençlidir. Eter, asit (ph 2,4) de en az 6 saat ve ısı (98 o C de 1 dakika, 60 o C de 10 saat) da immunojenite ve antijenik özellik kaybolmadığı halde infektivite kaybolmaktadır. Eğer virus yoğunluğu çok fazla ise bu işlemler sonucu inaktivasyon 6

13 tam olmamaktadır. HBsAg, %2,5 sodyum hipoklorit varlığında 3 dakikada antijenik özelliğini ve infektivitesini kaybetmektedir. Serumda infektivite doğrudan kaynatmakla 2 dakikada, 121 o C de 0,5 atm basınç altında 20 dakikada, 160 o C de 10 saatte kaybolmaktadır. Son çalışmalar HBV nun sodyum hipoklorit (500mg serbest Cl/ml) ile 10 dakikada, %0,1 2 aköz gluteraldehit, %70 izopopil alkol, %80 etil alkolde 2 dakikada inaktive olduğunu göstermiştir. HBV, o C de saklandığında en az altı ay, -20 o C de 15 yıl infektif özelliğini korur. İnfektif plazmadan elde edilen fibrinojen, protrombin, gama globulin ve plazma proteinlerinde çeşitli miktarlarda HBsAg bulunur ve HBsAg içeren kan ve kan ürünlerinin ultraviyole ışınlarına tabi tutulması infektiviteyi etkilemez (2, 27, 30) Hepatit B Virusu nun Genom Yapısı Hepatit B virusu kısmen çift sarmallı, sirküler bir DNA molekülüne sahiptir. DNA'nın mol. ağırlığı 2,3x10 6 dalton, G+C oranı yaklaşık % 49'dur. HBV DNA nükleotid taşıyan uzun (L veya negatif) ve nükleotid içeren kısa (S veya pozitif) zincir olmak üzere iki sarmaldan meydana gelmiştir. Bu zincirler ortak baz çiftlerine sahip olup, sirküler bir yapı halinde bulunmasına rağmen her birinin 3' ve 5' uçları birleşik olmadığından aslında lineer moleküllerdir. Pozitif zincirin 5' ucu sabit olup 3' ucunun uzunluğu senteze bağlı olarak farklılık gösterir. İki sarmal arasında değişik uzunlukta tek sarmallı bir bölge vardır. Negatif zincirin 5' ucunda, sentez sırasında primer olarak görev yapan terminal bir protein bulunurken pozitif zincirin 5' ucunda aynı işlevi yerine getiren bir RNA oligomeri yer alır. Negatif sarmalın 3' ucu ise 9-10 nükleotidlik artık uç (terminal redundancy) ile sonlanır. Bu alan viral replikasyon sırasında pozitif DNA sarmalının sentezindeki template switching işleminde DNA polimerazın da etkisi ile kısa zincirin tamamlanmasında ve sonuçta süper kıvrımlı, tamamen çift sarmallı, çember şeklindeki DNA molekülünün oluşumunda rol oynar (4, 26, 31, 32 ). Her iki zincirin 5' uçlarında bulunan koheziv bölgelerinin birbirlerine tutunmaları ile Viral DNA'nın yapısal bütünlüğü sağlanır. Bu bölgeler nükleotidlik yinelenen dizinlerden meydana gelmiş sabit bölgeler olup DR (direct repeats) olarak adlandırılırlar. HBV'nda iki adet DR vardır. Uzun zincirin 5'ucu

14 nükleotidde DR1 içinde, kısa olanın 5'ucu ise nükleotidde DR2 içinde yer alır. DR2 uzun zincirin 3'ucuna yakın bir yerde bulunur (27, 28). HBV'nda genetik bilginin tamamı uzun sarmal üzerinde kodlanmış olup bu sarmal S, C, X ve P kısaltmaları ile gösterilen dört farklı protein kodlayan nükleik asit dizisine (open reading frame: ORF) sahiptir. ORF'lerin transkripsiyonu promoter (prom=başlatıcı) ve enhancer (enh= güçlendirici) olarak adlandırılan düzenleyici dizinler tarafından kontrol edilmektedir. HBV genomunda fonksiyonel olarak tanımlanmış en az 4 promoter (pre-sl prom, S prom, X prom ve pre-c prom) ve 2 enhancer (Enh l ve Enh 2) bölgesi vardır. Ayrıca S geni içinde varolan ve Enh l ile bağlantılı olarak glukokortikoid varlığında gen ekspresyonunu yaklaşık 5 kat kadar arttıran bir elemanın (GRE: glucocoticoid responsive element) varlığı da gösterilmiştir (31, 33). HBV-DNA'daki genler, bazı bölgelerde içiçe girmiş, birbirleriyle çakışmış durumdadırlar. Genomun en uzun geni olan P geni; X ve C genleri ile kısmen, S geni ile tamamen çakışmış halde bulunmakta ve uzun sarmal 1,5 defa okunmaktadır. Bu özelliği nedeniyle HBV, bilinen hayvan virusları içinde en küçük genomik yapıya sahip olmasına rağmen kendini kodlama kapasitesi en fazla olan virusdur (4, 28). Genom içerisinde proteinleri kodlayan genler şunlardır (34). 1. S geni: Büyük, orta ve küçük yüzey proteinlerini kodlamaktadır. 2. C geni: İki ayrı protein (kapsid proteinleri) sentezletir. Bunlardan biri çekirdek proteini (HBcAg) diğeri ise prec ürünü taşıyan infektivite proteini (HBeAg) dir. 3. P geni: DNA polimeraz, revers transkriptaz ve Ribonükleaz H aktivitesine sahip viral polimeraz enzimini kodlamaktadır. 4. X geni: X proteinini kodlamaktadır. Başlangıç kodonları farklı olduğundan S geni üzerinde pre-sl, pre-s2 ve S olmak üzere üç, C geni üzerinde ise pre-c ve C olmak üzere iki bölge bulunmakta; dolayısıyla farklı başlangıç kodonlarından sentezlenen proteinler de farklı olmaktadır. Bu nedenle 4 adet ORF'e sahip olmasına rağmen HBV tarafından yedi değişik polipeptid üretilmektedir (31, 35, 36). 8

15 Şekil 3: Genom yapısı Viral Yaşam Siklusu HBV nun plazma yarı ömrü 24 saat olup her gün vücuttaki virusların %50 si yeniden oluşmaktadır. Günlük virus üretimi 1011 virion olan HBV nun replikasyonu başlıca hepatositlerde gerçekleşmektedir. Safra kanalı epitel hücreleri, pankreasın bazı endokrin ve ekzokrin hücreleri, böbrek ve lenfoid doku da replikasyon yeri olabilmektedir. Fakat hepatosit dışı replikasyon yerlerinin viral patogenezde rolü olmadığı düşünülmektedir. Lenfositlerdeki replikasyon virus perzistansı için ikinci bir rezervuar olabilmektedir (36) Replikasyon DNA replikasyonu bir RNA kalıbı aralıcılığı ile reverstranskripsiyonla olur. Viral replikasyon stoplazmada gerçekleşir ve (-) iplikçik RNA aracından, (+) iplikçik ise (-) iplikçikten sentezlenir (1, 37). HBV replikasyonu virusun hücre yüzeyine tutunması ve hücre içine girmesi ile başlamaktadır. HBV'nun konak hücreye bağlanmasında rol oynadığı düşünülen fibronektin, apolipoprotein H, transferrin reseptörü, polimerize insan serum albümini, 9

16 pre-s2 glikan, HBV bağlayan faktör gibi birçok reseptör adayı tanımlanmaktadır (38, 39, 40, 41, 42, 43). Son yıllarda, her ne kadar, S proteinine özgü bazı reseptörlerin (endonexin II, siyaloglikoprotein gibi) varlığı gösterilmiş olsa da, HBV'nun hepatositlere tutunmasında L ve M proteinlerinin de önemli olduğu saptanmıştır, in vitro olarak pre-sl ve pre-s2 bölgelerinde hepatosite spesifik tutunma yerleri saptanmıştır (27, 28). Pre-Sl ürünü olan L protein, karaciğer plasma membranına ve mononükleer hücrelere bağlanabilir. Mononükleer hücrelerde saptanmaktadır fakat HBV'nun bu hücrelerde aktif olarak replike olduğuna dair bir kanıt yoktur. L ve M proteinleri hepatositlere direkt olarak tutunabilir (28). Hepadnavirusların replikasyonu için 3 önemli özellik vardır (44): 1- DNA sarmallarının sentezi sırasında negatif iplikçiliğin sentezi pozitif iplikçiliğin sentezinden önce tamamlanmalıdır. 2- Viral polimeraz aynı zamanda, revers trankriptaz olarak fonksiyon görür. 3- Negatif iplikçiliğin sentezinde 5' ucuna kovalent olarak bağlı terminal protein öncül olarak kullanılırken pozitif iplikçiliğin öncülü viral genomik RNA'dan türeyen bir oligoribonükleotiddir. HBV muhtemelen reseptöre bağımlı endositoz yoluyla hücre içine girmekte, viral DNA ile nükleokapsid viryondan ayrılmakta ve işlenmeden konak hücre çekirdeğine taşınmaktadır. Kısmen çift sarmallı, her iki ucu serbest halde bulunan DNA'nın kısa sarmalının eksik olan bölümü endojen DNA polimeraz tarafından tamamlanır. Bu sırada uzun sarmalın 5' ve 3' uçları arasındaki açıklık onarılmış ve tümüyle çift sarmallı, süper kıvrımlı, uçları kapalı, sirküler yapıda bir HBV-DNA (cccdna) meydana gelir. Replikasyonun normal seyri sırasında HBV-DNA'nın konak genomuna integrasyonu görülmez. HBV ile infekte bazı kişilerin serumunda nadir olarak HBcAg'nin varlığı gösterilmiş olsa da bu antijen viral replikasyon sırasında konak hücre çekirdeğinde genellikle tespit edilebilmektedir. Bu nedenle HBcAg'nin nukleusa girmesinin cccdna'nın ortaya çıkmasından önce olduğu sanılmaktadır (27, 38, 44). Kalıp olarak cccdna'dan konak hücre RNA polimerazının (RNA polymerase II) yardımı ve viral düzenleyicilerin (4 adet promoter; 2 adet enhancer) etkisiyle viral RNA'lar sentezlenir. HBV-RNA'ların hepsinin 3' uçlan aynı nükleotidde (1934. nükleotid)'dir. Bunlar C genine ait ORF'den gelen sinyalin özelliğine göre mrna veya 10

17 genom görevi yaparlar. HBV'nda fonksiyonu bilinen 4 mrna transkripti tanımlanmıştır. Bunlar: kb mrna: En uzun parçadır. Genom replikasynonu için kalıp görevi görmekte, prec/c (precore/core) ve polimeraz (pol) proteinlerinin sentezini sağlar kb mrna: Pre-S1, pre-s2 ve S proteinlerinin sentezini sağlar kb mrna: Pre-S2 ve S proteinlerinin sentezini sağlar kb mrna: X proteinlerini sentezler. Translasyon sırasında oluşan pregenom, kor partikülü içine yerleşir. Konak hücre sitoplazmasında devam eden replikasyon boyunca 3,5 kb'lık RNA (+RNA)'dan (-) DNA sarmalı sentezlenir (44). Negatif iplikçiğin sentez işlemi; DRl'in 3' ucundaki terminal proteinin bulunduğu yerden başlar. Sentez ilerledikçe RNA, RNase H etkisiyle tahrip edilir. Kısa zincirin (+ iplikçik) sentezinde kalıp olarak uzun sarmal (- iplikçik) kullanılır. Sentez DR2'nin 3' ucundan başlar ve uzun zincirin 5' ucundaki terminal protein geçilinceye kadar devam eder. Genomun sirkülasyonu (-) iplikçiğin 3' ucundaki 9-10 nükleotidlik terminal artık sayesinde olur. Kısmen çift sarmallı sirküler yapıdaki kor kısmının kılıf proteinleri tarafından çevrelenmesi ve aynı zamanda polimerazın da tükenmesi nedeniyle kısa zincirin sentezi tamamlanamaz ve bu sarmal eksik kalır (27, 31, 38). HBs proteinleri, endoplazmik retikulumda öncelikle transmembran proteinleri olarak sentezlenir. Oligomerizasyon, molekül içi ve moleküller arası disülfid köprülerinin oluşmasıyla olgunlaşır, tomurcuklanma sırasında membran lipidleri ile birlikte kor partiküllerini çevreleyip hücre dışına çıkarlar. HBV replikasyonu sırasında stoplazmada yeni sentezlenen viral DNA ların bir kısmı çekirdeğe taşınarak orada sürekli olarak cccdna havuzu oluşturulmasını sağlar. Pe-Sl'in hücre içinde birikmesinin HBsAg sekresyonunu inhibe ettiği gözlenmiştir. HBsAg ise cccdna formasyonunu inhibe ettiğinden bunun HBV replikasyonunda negatif feedback mekanizması olduğu kabul edilir (26, 27, 28, 36, 45). 11

18 Şekil 4: Hepatit B virusunun replikasyonu Viral Proteinler Viral proteinler dörde ayrılırlar. Bunlar; kılıf (yüzey) proteinleri, kor proteinleri, P proteini ve X proteinidir Kılıf (Yüzey) Proteinleri HBV-S geni tarafından kodlanan kılıf (yüzey) proteinleri (HBs), hem Dane partiküllerinin yüzeyinde hem de infekte hastaların karaciğer ve serumlarında saptanabilen 22 nm çapındaki küresel ve tübüler (eksik viral) partiküllerin yapısında bulunmaktadır. Yüzey proteinleri değişik molekül ağırlıklarında ( dalton arasında), glikolize ve nonglikolize altı farklı polipeptidin değişik oranlarda biraraya gelmesi ile oluşmaktadır. Tek bir gen tarafından kodlanan bu proteinlerdeki farklılıklar sentezin aynı gen üzerindeki farklı başlangıç kodonlarından başlamasıyla oluşmaktadır. (26, 35). 12

19 Büyük Yüzey Proteini (L protein: LHBs): Okuma işlemi gen üzerindeki ilk kodondan başlarsa pre-sl + pre-s2 +S bölgelerinin tümü okunacağından kılıfın büyük proteini (L protein: LHBs) sentezlenir. Bu protein 39 kda molekül ağırlığında 389 aminoasitten (bazen 400 aminoaside kadar uzayabilir) oluşmuş bir polipeptiddir. LHBs en çok Dane partiküllerinin yüzeyinde bulunur. Tübüler partiküllerin kılıfında orta miktarda L proteinine rastlanırken küçük küresel partiküllerde çok az miktarda rastlanır (27, 38). Viryonun konak hücreye bağlanmasında L proteininin rolü olduğu düşününülmektedir. LHBs'nin aminoasitleri arasındaki bölgenin hepatositlere tutunma özelliğine sahip olduğu tespitedilmiş ve bu bölgeye karşı oluşturulan antikorların bağlanmayı engellediği gösterilmiştir. Dane partiküllerinin oluşumu, biraraya gelmesi (assembly) ve konak hücreden salınması için M proteininin varlığı şart olmamakla birlikte S ve L proteinlerinin mutlaka sentezlenmiş olması gerekmektedir (39, 40). Asemptomatik HBsAg taşıyıcılarında düşük düzeyde fakat devamlı üretilen LHBs'in hepatositlerde lezyon oluşumuna ve HCC gelişimine neden olabileceği düşünülmektedir. Hepatosit içinde pre-sl ürünlerinin birikmesiyle endoplazmik retikulumda dilatasyona oluşmakta, hücreler balonlaşmakta, hidropik ve eozinofilik özellik kazanarak buzlu cam (ground glass) görünümü almaktadır. Sonuç olarak koagulasyon nekrozu ile hücreler ölmektedir (27). LHBs, B ve T hücreleri için önemli antijenik bölgeler içerir ve viral infeksiyondan korunmada önemli bir role sahiptir (46). Orta Yüzey Proteini (M protein: MHBS): Okuma işlemi S geni üzerindeki ikinci kodondan başlarsa pre-s2+s bölgelerinin ürünü olan orta protein (M protein: MHBS) sentezlenir. Bu protein 33 kda molekül ağırlığında 281 aminoasitten oluşmuş bir polipeptid (p33s) olup, çoğunlukla bir veya iki bölgesinden glikolize edilmiş haldedir (44). MHBs'nin miktarı viryon ve tübüler partiküllerde en az, küresel partiküllerde ise LHBs'den biraz daha fazladır. Replikasyonun olmadığı durumlarda HBsAg içinde bulunmaz. Bu nedenle pre-s2 antijeninin varlığı viral replikasyonun bir göstergesi olarak kabul edilir (38). 13

20 L ve M proteinleri infeksiyonun erken döneminde ortaya çıkmakta olup bunlara karşı oluşan antikorların gösterilmesi iyileşmenin habercisi olarak kabul edilmektedir (47). Küçük Yüzey Proteini (SHBs): Okuma işlemi sadece S bölgesini içerir ise kılıfın küçük proteini (S protein: SHBs) sentezlenir. Bu protein 24 kda molekül ağırlığında 226 aminoasitten oluşmuş bir peptiddir. HBsAg'nin büyük kısmını oluşturan SHBs kılıfın majör proteini olarak bilinir ve B lenfositleri için epitopik bölgeye sahiptir (28, 38). HBsAg, S proteininden başka değişik oranlarda diğer kılıf proteinlerini (L ve M) de içermektedir. Kanda dolaşan S geni ürünlerinin yaklaşık %5-15'i M, % 1-2'si L ve geri kalan kısmı S proteinidir. Bu üç protein, çeşitli HBV partikül tipleri arasında eşit miktarda dağılmamaktadır. Her üç partikül tipinde de predominant olarak S proteinleri bulunurken; subviral 22 nm'lik partiküllerde değişebilen miktarlarda M polipeptidleri ve çok az miktarda da L zincirleri bulunur. Küçük partiküllerde bazen LHBs'e hiç rastlanmayabilir ama Dane partiküllerinde L proteini herzaman vardır. Dane partikülleri içerdikleri L proteinleri sayesinde hepatositlere kolaylıkla bağlanabilmektedir. Dane partiküllerinde L:M:S oranı yaklaşık 1:1:4 şeklindedir. Otantik infeksiyonda L/S oranı biraz daha fazla olabilir. Farklı izolatlarda küçük bazı değişiklikler olsa da viryon ve tübüler partiküllerde S>L>M, küçük partiküllerde ise S>M>L düzeni çoğunlukla korunur (26, 27). SHBs'yi oluşturan aminoasitlerin belli bölgelerdeki diziliş farklılıklarına göre HBsAg üzerinde en az 5 antijenik determinant (a, d/y ve w/r) bulunmaktadır. Bütün subtiplerde ortak olarak bulunan gruba özgül a determinantı, aminoasitler arasındaki hidrofilik bir bölgedir. Konvalesan serumdaki antikor bağlayan aktivitenin %80'i bu bölgede olup a determinantına karşı oluşan antikorlar HBV'nun hepatositlere bağlanmasını önler ve tüm subtiplere karşı etkili bir bağışıklık sağlar. Viryonun dış yüzünde bulunan a determinantı, aşı veya doğal infeksiyon sonrası oluşan anti- HBs'lerin büyük kısmını bağlama özelliğine sahiptir (47). S determinantına karşı gelişen humoral immun cevabın HBV'ndan korunmada etkili olması ve tüm HBsAg preperasyonlarında a determinantının bulunması, farklı veya benzer subtiplerle oluşan reinfeksiyonlardan korunmanın a determinantına karşı gelişen cevap ile olduğunu göstermektedir (48). 14

21 HBsAg subtipleri arasında biyolojik farklılıklar yoktur. Yeryüzündeki dağılımları benzer değildir. Bu nedenlerle epidemiyolojik çalışmalarda, HBsAg subtiplerinin saptanması, infeksiyon kaynağının tespiti ve HBV'nun bireyler veya toplumlar arasındaki yayılımının izlenmesinde önemli ipuçları verir (49, 50) Kor Proteinleri HBV genomu C geninde bir ÖRF bulunur fakat gen üzerinde okuma işleminin başladığı iki farklı kodon (nükleotid 1816 ve nükleotid 1903) vardır. Bu nedenle C geni, pre-c ve C olmak üzere iki bölgeye ayrılır ve antijenik özellikleri farklı iki değişik protein (HBeAg ve HBcAg) sentezleyebilir (26, 28). Her iki bölgeye ait stop kodon aynı nükleotidde (2452. nükleotid) bulunur. Dolayısıyla protein sentezi sırasında okuma işlemi hangi başlangıç kodonundan başlarsa başlasın aynı ortak noktada sonlanır. Pre-C'den başlayan okuma işleminde her iki bölge de okunarak 212 aminoasitden (29 aa+183aa) oluşan, molekül ağırlığ 25 kda olan bir polipeptid (p25c) sentezlenir. İşlenmemiş haldeki bu proteinin aminoasit sekansı; N terminal ucundaki 29 aminoasitlik ek parça dışında, HBcAg sekansı ile tamamen benzerdir. Bu ek sekans, sentez sırasında giderek uzamaya başlayan pre-c polipeptidini (p25c) endoplazmik retikuluma yönlendirir. Burada bir peptidaz tarafından C terminal bölgesindeki 34 aminoasitlik bölüm kesintiye uğrar ve işlenmiş protein haline gelerek golgi cisimciği üzerinden HBeAg olarak sekrete edilir veya nukleusa yönlendirilir (35, 47, 51). Sonuç olarak pre-c sekansı, aynı gen (pre-c/c) tarafından sentezlenen polipeptidlerin stoplazmada mı kalacağı yoksa endoplazmik retikuluma mı gideceğinin belirlenmesinde, karboksi uçtaki DNA bağlayan kısmın konak hücre tarafından uzaklaştırılmasında, hücre membranlarında protein birikmesi ve sentezlenen proteinlerin kaderini belirleyen bir yapıdır (28). HBeAg ile HBcAg ortak determinantlar içerir. Kanda dolaşan HBeAg spesifik olarak serum albümini, immünglobulin ve α-antitripsine bağlanabildiğinden yapısındaki HBcAg ile ilgili determinantlar maskelenir ve özgül olarak anti-hbe'ye bağlanabilir ancak anti-hbc ile reaksiyona girmez. Ayrıca HBcAg'nin antikor bağlama özelliği bu antijenin yapısını oluşturan proteinin bütünlüğü ve konformasyonuna bağlıdır. HBcAg, viral DNA'ya sıkıca bağlı bir molekül olduğundan anti-hbc ile reaksiyona girebilmesi için kor partiküllerinin parçalanması ve serbest polipeptid zincirlerinin açığa çıkması 15

22 gerekmektedir. HBV ile infekte hasta serumlarında solubl bir antijen olarak tanımlanan HBeAg'nin fonksiyonu tam olarak bilinmemektedir. İnvitro araştırmalar sonucunda HBeAg'nin viral replikasyon için gerekli olmadığı ispatlanmıştır (28, 35, 44). C geninin ikinci bölgesi tarafından sentezlenen polipeptidin (p23c) ön kısmı 29 aminoasitlik ek sekans olmadığı için endoplazmik retikuluma gidemez ve konak hücre sitoplazmasmda kalır. Pre-C olmadan p23c'nin ekspresyonu, hücre içinde kora benzer partiküllerin birikimine neden olur. Hücre sitoplazmasmda değişikliğe uğrayan p23c, HBcAg olarak bilinen yapı haline gelir ve karboksiterminal ucundaki 34 aminoasitlik kısım sayesinde viral DNA'ya sıkıca bağlanır. HBcAg sıklıkla intranükleer yerleşimlidir. Fakat hastalığon aktif döneminde ve aşırı viral replikasyon durumunda sitoplazmada da yaygın olarak saptanabilir (27, 28, 29). HBeAg ekstrasellüler ortama (serum) sekrete edildiği halde dolaşımda serbest halde HBcAg'ne rastlanmaz. Kanda sadece Dane partiküllerinin içinde bulunur. Serum defalarca dondurulup, çözülür veya lipid eriticiler ile muamele edilir ise viryonlar parçalanır ve HBcAg serbestleşir (29, 38). Doğal infeksiyonun seyri sırasında HBcAg nin çok kısa bir süre de olsa, serumda serbest halde bulunduğu düşünülmüş, Chermello ve ark (52), bu durumu kanıtlamışlardır. Ancak HBcAg ile anti-hbc süratle birleşip, kompleks oluşturduğu için serolojik tanıda HBcAg'nin tespitetmeye çalışmak uygun değildir. HBcAg partikülleri ve viryon korlarında protein kinaz ve proteaz aktivitesi bulunmaktadır. Kor polipeptidleri içinde sadece p23c'nin bu özelliğe sahiptir. Protein kinaz, polipeptidin serin ve treonin artıklarını fosforilize ederek HBeAg oluşumunda rol oynamaktadır (26, 28). HBeAg ve HBcAg oldukça immunojendir. HBcAg'nin immunojenitesi HBsAg'den daha fazladır ve T hücre-bağımsız antijen özelliği gösterir. HBV ile infekte hastaların tamamına yakınında HBeAg ve HBcAg'ne karşı hem hücresel hem de humoral cevap gelişir. Farklı çalışmalar her iki antijenin de T ve B hücrelerini tanıyan epitoplara sahip olduğunu göstermiştir (28, 35, 44). Üzerinde birçok immünodominant epitop tanımlanan HBV nükleokapsid proteini, kronik hepatit B'de konak immün cevabında başlıca hedeftir. (53, 54, 55). 16

23 HBcAg'ne özgül T hücreleri; HBsAg humoral cevabını başlatabilir veya bu yanıta fonksiyonel olarak yardım edebilir. Bu şekilde genetik kaynaklı S epitop cevapsızlığının giderilmesine yardım eder. Bunlardan dolayı S antijen aşılarına HBcAg eklenmesinin insanlardaki etkinliği arttırabileceği ve S antijenine cevapsızlığın olduğu bireylerde antikor cevabı oluşturabileceği düşünülmektedir (56, 57). HBcAg'ne karşı oluşan antikorlar koruyucu değildir. Erken beliren ve uzun süre kalıcı olan anti-hbc antikorları, HBV infeksiyonu geçiren sağlıklı bireylerde ve persistan HBV infeksiyonlu hasta serumlarında bulunur. Anti-HBc IgM akut dönemde; HBsAg'nin kaybolup anti-hbs'nin henüz belirmediği dönemde (pencere dönemi) pozitifleşir. Ancak bu antikorun tek başına akut infeksiyon göstergesi olarak düşünülmesi yanlış olur. Çünkü bazı HbsAg taşıyıcıları ve çoğu kronik hepatitli hastada düşük titrelerde de olsa bu antilorlar vardır. Dolayısıyla anti-hbc IgM'nin pozitifliğinden çok negatif bulunması daha anlamlıdır (35, 38, 57) P Proteini P geni, HBV genomunun yaklaşık 3/4'ünü kaplayan en uzun gendir. 92 kda molekül ağırlığında P proteinini sentezler (26, 35, 58). P proteini; revers transkriptaz, endonükleaz (RNase H) ile DNA ve RNA'ya bağımlı polimeraz aktivitesine sahiptir. Bu proteinin farklı işlevere sahip 4 bölgesi vardır (28, 58). a) Terminal protein; negatif DNA sarmalının sentezlenmesinde RNA pregenomunun revers transkripsiyonu için primer olarak hizmet verir. b) Spacer bölge; bu bölgenin enzim aktivitesi üzerine direkt etkisi yoktur, çıkarılması durumunda aktivite kaybı olmaz. c) DNA polimeraz / revers transkriptaz aktivitesi olan bölge d) RNase H bölgesi; RNA pregenomunun sindirilip yok edilmesinde endonükleaz görevi üstlenir. P proteininin immunojen özelliği vardır. Hasta serumunda bulunan anti-dna polimeraz antikorları, sentetik peptid antijenleri ile gösterilebilmektedir (38). 17

24 X Proteini X geni, HBV genomundaki en küçük gen bölgesidir. X geni iki protein sentezler. Bu gen tarafından sentezlenen HBxAg, 154 aminoasitten meydana gelmiş, 16 kda molekül ağırlığında, küçük, bazik bir proteindir (27, 36, 59). X proteini; inferferon enhancer elementlerince kontrol edilen transkripsiyonu, HIV tip I ve SV 40 virüsünü aktive eder (26, 28). Ayrıca X proteini tümör supressör gen ürününün (p 53) işlevini bozar. Bu durum HBV ile ilişkili hepatokarsinogenez sürecinin ilk aşamasında, X proteininin etkili olduğunu düşündürmekte ve HBxAg'nin hepatosellüler karsinom gelişiminde rol oynayabileceğini akla getirmektedir. HBxAg'nin HBV transkripsiyonunu da aktive ettiği gösterilmiştir. Ancak bu proteinin gen ekspresyonu veya HBV replikasyonu için mutlaka gerekli değildir. X sekansına karşı oluşan antikorlar, HCC ve HBV ile infekte karaciğer dokularındaki X proteininin saptanmasında kullanılmış ve HBxAg, yüzey ve kor antijenlerinden çok daha az olarak tespit edilebilmiştir. X sekansına ait sentetik peptidler, hasta serumlarında anti-hbx antikorlarının tespitinde kullanılmış ve bu markerın HCC'un erken tanısında faydalı olabileceği düşünülmüştür (60, 61) HBV Genotipleri Moleküler düzeyde yapılan çalışmalar sonucunda; HBV genomları arasında farklılıklar olduğu görülmüş ve birbirlerine benzerlik oranı %92 ve daha fazla olan HBV suşları aynı grupta toplanarak 6 farklı genotip (A-F) tespitedilmiştir. Yakın zamanda Fransa ve ABD de diğer genotiplerden tüm genom düzeyinde %11,7 ile %15,3 farklılık gösteren yeni bit genotip bulunmuş ve genotip G olarak adlandırılmıştır. Bu genotipler ile HBsAg subtipleri arasındaki ilişkiyi saptamak için genom sekansları ile S geni sekansları karşılaştırılmış; S geni düzeyinde genotip farklılık sınırı %4 olarak saptanmıştır ve genotip-subtip dağılımı yapılmıştır (27, 62). HBV taşıyıcılık oranları dünyanın değişik bölgelerinde önemli farklılıklar gösterir. Bu, genetik dağılım farklılığı ile paraleldir. HBV prevalansının düşük olduğu Kuzeybatı Avrupa ve A.B.D.'deki persistan taşıyıcılarda genotip A baskındır. Amazon bölgesi ve Peru gibi yüksek HBV prevalansına sahip ülkelerde ise genotip F'nin sık olduğu görülmüştür. HBV bulaşında vertikal geçişin ilk sırada olduğu Doğu Asya 18

25 ülkelerinde genotip B ve C'nin prevalansı yüksektir. Bu durum kısmen, vertikal geçişten sorumlu olan HBeAg pozitif (replikatif) dönemin daha uzun olmasıyla açıklanır. Vertikal geçiş yoluyla infekte olan çocuklarda kronikleşme oranı yaklaşık %80'dir. Bu nedenle hepatit B'nin endemik olduğu bölgelerde, yüksek taşıyıcılık oranının en önemli sebebi vertikal geçiş olduğu kabul edilir. Akdeniz ve Sahra altı Afrika ülkelerinde genotip A ve D baskın olup buralarda horizontal geçiş daha önemlidir (49, 50). Tablo 1: HBV genotip ve subtiplerinin coğrafi dağılımı Genotip Subtip En sık görüldüğü coğrafi bölge A adw2 Kuzeybatı Avrupa, Afrika ayw1 B adw2 Endonezya, Çin, Vietnam ayw1 C adw2 Doğu Asya, Japonya, Kore, Çin, Polinezya adr ayr D ayw2 Akdeniz Bölgesi, Hindistan ayw3 E ayw4 Batı Afrika F adw4 Orta ve Güney Amerika, Polinezya adw G adw2 ABD, Avrupa İmmun Kaçış Mekanizmaları Konağa ve virusa ait bazı özellikler HBV'nun immun sistem tarafından tanınmasını engelleyebilmektedir. HBV, reverse transcriptase enzimine sahip olduğundan intrasellüler olduğu dönemde kendi DNA'sını konak hücre genomuna integre etmekte ve bağışık yanıtın ortaya çıkması sırasında görünmez hale gelmektedir. Prekor/kor geninde mutasyonlar meydana getirerek immün yanıt için anahtar hedeflerden biri olan HBeAg ekspresyonunda kayba yol açarak saklanabilmektedir (63, 64). HBV, başta karaciğer olmak üzere birçok dokuda bulunabilir. Pankreas ve böbreklerde karaciğerden farklı olarak mikrovasküler bariyer sistemi vardır. Mikrovasküler bariyerler bu dokulardaki HBsAg eksprese eden hücrelere HBsAg spesifik sitotoksik T hücrelerin girişini ve saldırısını engelleyebilir. Virüsün bu organlarda bulunması immun kaynaklı doku hasarına yol açmaz. Fakat pankreas ve 19

26 böbrekler potansiyel bir rezervuar haline gelir. Karaciğer HBV ile tekrar tekrar infekte olur, viral temizlenme azalır. Bu durum viral persistansı kolaylaştırır (64). Akut HBV infeksiyonunda, kılıf proteinlerine karşı oluşan antikorlar serbest halde bulunan viruslara bağlanarak bir kompleks oluştururlar ve kan dolaşımı virustan temizlenir. Bu aşamada, HBsAg ekspresyonunda bir kayıp olur veya yüzey proteinlerini kodlayan genlerde mutasyon oluşur ise anti-hbs varlığına rağmen infeksiyon devam eder (65, 66). Viral genomun kopyalanması sırasında bir hata oluşursa bu durum farklı aminoasitlerin oluşması ve farklı proteinlerin sentezlenmesi ile sonuçlanır. Hayati önemi olmayan proteinleri sentezleten kod değişikliklerinde, virüs yaşamını sürdürmeye devam eder. Fakat virusun immün epitopları mutasyona uğramıştır ve bu mutasyonlar immün kaçış mutasyonları olarak adlandırılır, immün kaçışta birbirinden farklı en az üç mekanizma vardır (67, 68). 1. MHC ile bağlanmayı sağlayan bölgedeki peptid epitoplarını oluşturan aminoasitlerdeki mutasyonel değişiklikler antijen sunumunu etkileyebilir. 2. TCR temas residülerinde veya bu bölgenin konformasyonundaki mutasyonlar sonucu TCR'ün MHC-peptid kompleksine afinitesi kaybolur. T hücreleri kendine sunulan antijenleri tanıyamaz ve T hücre aktivasyonu önlenir. 3. Proteinin peptid bağlarında değişiklikler (APL; altered peptid ligands) meydana gelebilir. Bu durumda antijen aynı MHC molekülüne bağlanır ve antijene özgü aynı TCR ile ilişkiye girer. Etkili bir T hücre aktivasyonu için MHC- peptid kompleksi ve TCR etkileşimi yanında birçok ligand/reseptör molekül ilişkisini de gerektirir. Bu moleküller hem APC ve T hücre adezyonuna hem de T hücrelerinde kostimülasyonuna katkıda bulunur. Normalde MHC-peptid kompleksi ile TCR arasındaki ilişkiler T hücre aktivasyonuna neden olduğu halde APL ile kurulan ilişkiler T hücre cevapsızlığına yol açar. Class I ve class II sınırlı T hücreleri için tanımlanmış olan bu duruma antagonizm adı verilmektedir. (69, 70, 71). Viral genomun translasyonuna ihtiyaç göstermeyen viral proteinleri (erken veya erken-acil) sunma yeteneği olmayan HLA molekülünü eksprese eden bir hasta, infeksiyonun ilk basamağına karşı cevap oluşturamaz. Bu durumda immün kaçış ve infeksiyonun kronikleşmesi kolaylaşır (72, 73). 20

27 Neonatal HBV infeksiyonunda viral proteinler konak tarafından self proteinler olarak algılanır ve HBV antijeni için spesifik T hücre gelişimi, kronik infeksiyon ve HBV immun toleransına neden olacak klonal delesyon ile sonuçlanır. Dolayısıyla vertikal geçişli HBV, immun eliminasyondan kaçar. Fakat bu tolerans bebeğin HBsAg ile aşılamasını takiben kırılabilir (74, 75) HBV Mutasyonları HBV, kısmen çift sarmallı bir DNA virusu olup yaşam siklusu sırasında pregenomik RNA'dan revers transkripsiyonla DNA'ya dönüşür. Hızlı replikasyon yeteneğine sahip bir virus olmasına rağmen revers transkriptaz enziminin ilk okuma yeteneğindeki zayıflık nedeni ile bu aşamada nükleotid yerleşiminde yanlışlıklar olmakta ve sonuçta genom yapısında moleküler düzeyde küçük mutasyonlar oluşmaktadır. Bundan dolayı HBV diğer DNA viruslarından 10 kat fazla mutasyona sahiptir (32). Klinik seyir, tedavi ve korunma bakımından önemli sorunlar oluşturan HBV mutasyonları (76); a) Virusun replikasyonunu artırabilir. b) Virusun antijenik yapısını değiştirerek bağışık yanıttan kaçmasına neden olabilir. c) Virusun hücreye girişini ve integrasyonunu kolaylaştırabilir. d) Antiviral ilaçlara direnç gelişimine neden olabilir. Genom üzerindeki herhangi bir yerde (S, pre C/C, X, P, promotor ve enhancer) ortaya çıkabilen bu mutasyonlar; a) Tek bir taban bazınının değişimi (nokta mutasyonu) b) Bir veya daha fazla sayıda nükleotidin silinmesi c) Aynı sekansın düz veya ters biçimde tekrar edilmesi d) Nükleotid sekanslarının yeniden düzenlenmesi gibi farklı genetik mekanizmalarla oluşabilir (47, 77). 21

28 Aktif bağışık cevap varlığına rağmen virusta meydana gelen genetik değişiklikler mutant suşun hayatiyetini devam ettirmesine imkan sağlamakta; bu durum tanıda karışıklıklara, aşı çalışmalarında ise başarısızlıklara yol açmaktadır (1) Yüzey (Kılıf) Mutasyonları HBV kılıf varyantları ile ilgili olarak tanımlanan ilk önemli mutasyon; allellerdeki subtip determinant çiftlerinde (d/y veya w/r) tespitedilmiştir. Bu immünolojik farklılık olarak 519. nükleotid ve 633. nükleotideki değişiklikten kaynaklanmaktadır. Sentez sırasında 519. nükleotideki değişime bağlı olarak HBsAg'nin 122. aminoasidinde bulunan lizinin arginin ile yer değiştirmesi durumunda d determinantı y determinantına dönüşmektedir nükleotidin sorumlu olduğu 160. aminoasitteki lizinin yerine arginin konması w determinantının r ye dönmesine sebep olmaktadır. HBsAg subtiplerinde (adw, adr, ayw, ayr gibi) a determinantı ortak olmak şartıyla en az iki farklı determinant daha bulunursa da nadiren bu determinantlardan biri kaybolabilmektedir (49, 50). HBsAg nin tüm subtiplerinde a determinantı ortak olduğundan ve bu bölgeye karşı oluşan antikorlar HBV'nun hepatositlere bağlanmasını engellediğinden, aşı, veya doğal infeksiyonun geçirilmesi ile herhangi bir subtipe karşı gelişen humoral bağışıklık tüm serotiplere karşı koruyuculuk sağlar. Ancak a determinantındaki değişiklik durumunda klasik HBsAg subtiplerine karşı oluşan antikorlar koruyucu değildir (27, 47). Yüzey mutasyonlarının klinik açıdan önemli sonuçları vardır. Bunlar; 1.Aşılanmış kişilerde HBV infeksiyonunun oluşabilmesi: Aşı ile ilişkili ilk kaçak mutanta 1988 yılında İtalya'da rastlanmıştır. HBeAg pozitif anneden doğan bir bebeğe pasif ve aktif immünizasyon uygulandıktan sonra yeterli düzeyde anti-hbs'ye sahip olduğu halde bir süre sonra HBsAg ve HBeAg pozitif hale geldiği ve kronik hepatit geliştiği saptanmıştır (78). Aynı aşının uygulandığı bazı kişilerde anti-hbs varlığına rağmen geçici HBs antijenemisi görülmüş ve bir çocukta da HBeAg pozitifliği ile hastalık ortaya çıkmıştır (79). Sekans analizleri sonucunda anneye ait a determinantının 145. pozisyonunda glisin bulununurken çocuğunkinde arginin bulunmuştur. Normalde 587. nükleotidde bulunan taban bazı guanin (G)'dir fakat 22

29 mutant suşlarda guanin, adenin (A) ile yer değiştirmekte, sonuçta GGA (glisin) yerine AGA (arginin) sentezlenmektedir. Bu durumda klasik HBsAg subtipleri ile hazırlanan aşıların koruyuculuğu yeterli olmamaktadır (80). Daha sonra yapılan değişik çalışmalarda HBeAg pozitif anneden doğan ve doğumda immunproflaksi uygulanan çocuklardan elde edilen serumların incelenmesi sonucunda a determinantının değişik pozisyonlarında kombine mutasyonlara rastlanmış bu mutasyonları bazı olgularda 145. aminoasitteki glisin arginin değişimi ile birlikte görüldüğü bildirilmiştir (81). 2.HB immunglobulini ile karaciğer transplant alıcılarında HBV infeksiyonu reaktivasyonu: Korunma amacıyla monoklonal anti-a veya poliklonal anti-hbs verilen karaciğer transplantlı bazı hastalarda bir süre sonra HBV DNA pozitifleşmiştir. Bu olgularda 145. aminoasitte glisin arginin mutasyonu ve S proteininin diğer pozisyonlarında(137., 142., 144., 146.) da mutasyonel değişiklikler olduğu görülmüştür. S proteininin 145. aminoasit dışında kalan mutasyonları normal antijenik yapıya sahip olup karaciğer transplantasyonu yapılan hastalarda bu mutantların reinfeksiyona yol açtığını ve ciddi sorunlar yarattığını ortaya koymuştur (47, 66, 82). Kılıf geni ile ilgili mutasyonlar, bir sekansın silinmesi, yer değiştirmesi veya yeniden düzenlenmesi şeklinde pre-sl ve pre-s2 bölgelerinde de daha az sıklıkta ortaya çıkabilmektedir. Anti-HBs ve HBsAg'nin birlikte pozitif olduğu kronik hepatitli bir hastada pre-s2 bölgesinin aminoasitleri arasında 14 aminoasitlik kısmın silindiği ve a determinantının ilk kıvrımında üç, ikinci kıvrımında ise bir aminoasidin yer değiştirdiği bir mutant tanımlanmıştır (27). İleri çalışmalar, özellikle kronik ve fulminant hepatitli olgularda pre-s gen mutasyonlu defektif HBV varyantlarına, daha sık rastlandığını ortaya koymuştur (66, 82, 83). Pre-S2 defektif mutantları karaciğer yetmezliğinde rol oynayabilmekte ve sıklıkla fulminant hepatit ile ilişkilidir (84). S promoter regülatör CCAAT motifinde meydana gelen mutasyon viral retansiyondan sorumludur (85). HBV yüzey geni mutasyonları çok çeşitli olup infeksiyöz ve patojendir. HBsAg'nin a determinantındaki mutasyonların immünproflaksi uygulanan taşıyıcılarda ortaya çıktığı düşünülmüştür. Aşılama güçlü bir humoral yanıt oluşturmasına rağmen sitotoksik T hücre cevabı oluşturmaz. HBV ile doğal infeksiyon sonucunda humoral bağışıklık ve sitotoksik T hücre cevabı oluşmaktadır. Bu tip 23

30 mutantların aşı ile indüklendiği ileri sürülmüş ve bunlara aşı ile indüklenen kaçak mutantlar adı verilmiştir. Fakat a determinant mutantlarına aşısız taşıyıcılarda da rastlanmıştır (86). 3. HBsAg tespitinde kullanılan ELİSA testlerinin saptayamayacağı antijenik yapıların varlığı ve atipik serolojik profiller: S bölgesinde ortaya çıkan mutasyonlar serolojik tepkimeleri de etkilemekte, tek başına HBV DNA pozitifliği, tek başına HBsAg pozitifliği, anti-hbs ve HBsAg'nin birlikte pozitifliği gibi alışılmışın dışında serolojik profillerin görülmesine sebep olmaktadır (77). Sonuç olarak yüzey geni mutasyonları aşının ve HBIG nin korumasından kaçabilen HBsAg negatif HBV infeksiyonlarına neden olabilen ve fulminan seyirle ilişkisi olabilen virusları meydana getirebilir (87) Prekor/Kor Bölgesi Mutasyonları HBV nin ilk tespit edilen ve üzerinde durulan mutasyonları bu bölgede oluşan mutasyonlardır. Viral replikasyon kaybı olmaksızın anti-hbe serokonversiyonu gösteren bazı hastalardan izole edilen HBV DNA'ların incelenmesi ile prekor/kor geni üzerindeki mutasyonların varlığı ortaya konmuştur. Prekor bölgesinde görülen en önemli mutasyon HBeAg'nin üretilememesi ile karakterize olan stop kodon oluşumudur. Normalde prekor bölgesinde stop kodon bulunmaz ve prekor bölgesinin başlangıç kodonundan başlayan sentez işlemi kor bölgesinin başlama kodonu ile devam eder. Eğer prekor bölgesinin nükleotidindeki guaninin (G) yerine adenin (A) gelirse triptofan kodonu da denilen kodon 28 (TGG), stop kodon (TAG) haline gelir ve HBeAg'nin prokürsör proteini (p250) oluşamaz. Söz konusu nokta mutasyonu kor bölgesinin başlama kodonundan önce meydana geldiğinden ve HBeAg ile HBcAg farklı mrna moleküllerinden sentezlendiğinden HBeAg üretilemez ancak HBcAg'nin sentezi devam eder (88, 89, 90). HBV replikasyonu için HBeAg translasyonu gerekli değildir. Prekor alanında oluşan mutasyonlar viral replikasyonu etkilemez aksine replikasyon yeteneğine sahip HBeAg negatif mutantların ortaya çıkmasına neden olur. HBeAg'nin fonksiyonu konağın HBV'na karşı gelişen cevabını kontrol etmektir. HBeAg sentezleyemeyen mutant suş konağın sitotoksik cevabından kaçarak hayatını sürdürür. Üstünde HBeAg 24

31 bulunan hepatositler anti-hbe'nin de etkinliği ile bir sûre sonra lizise uğrar ve sonuçta HBeAg negatif mutant suş dominant hale gelir (77). Infekte hepatositlerin temizlenmesi membran üstünde bulunan antijenlere karşı gelişen humoral cevap ile veya viral proteinlerden birindeki peptidlere karşı ortaya çıkan CTL cevabı ile olur. Akut hepatit B'li olgularda prekor stop kodon mutantlarının görülmesinde iki faktör rol oynar. Bunlardan ilki bulaş sırasındaki HBeAg pozitif/hbe- Ag negatif virüs oranı ikincisi ise bu varyantların ortaya çıkışını engelleyen CTL fonksiyonundaki bozukluktur (47). Prekor mutantlarının varlığı asemptomatik HBV taşıyıcılarında, kronik viral hepatit B'li olgularda, ciddi karaciğer hastalığı olanlarda ve fulminant hepatitli hastalarda gösterilmiştir (59). Kronik hepatit B'nin seyri sırasında ortaya çıkan HBeAg negatif vireminin hepatosellüler hasarı arttırdığı, prekor/kor mutantlarının fulminant hepatit ile hızlı progresyon gösteren kronik hepatit oluşumunda rol oynayabileceği sanılmaktadır. (91, 92). Prekor promoter bölgesindeki değişiklikler HBeAg sentezini ve viral replikasyon seviyelerini etkilemektedir. Prekor promoter mutasyonlarında pregenomik RNA sentezi etkilemeyip HBeAg ekspresyonunu azalmaktadır. Viral replikasyonda ise orta düzeyde bir azalma olmaktadır. Prekor ORF'de ise doğal yoldan oluşmuş ve pozisyon 28'de bir terminasyon kodonu taşıyan mutantın nükleokapsid partiküllerindeki pregenomik mrna'nın enkapsidasyonunu artmaktadır (93). Kor promoter/enhancer II alanındaki (nt ) nokta mutasyonları kısa delesyonlar veya insersiyonlar sonucunda pre-mrna transkripsiyonunda azalma, C- mrna'da artış meydana gelmektedir. HBeAg sentezi iptal olurken kor ve pol proteinlerinin üretimi artmakta ve sonuçta viral partiküller daha fazla oluşmaktadır. Bu bölgede en sık tanımlanan nokta mutasyonları AT'den zengin ilk bölgeyi (nt ) etkileyen A-T 1762 ve G-A 1764 mutasyonlarıdır (94, 95, 96). HBeAg negatif mutantlar ile infekte kişilerde alışılmadık serolojik profiller ile karşılaşılır. HBeAg'nin kaybolmasıyla HBV DNA'da belirgin bir azalma olmaktadır. HBV DNA testleri kullanılmadan önce HBeAg, vireminin göstergesi olarak kabul edilmiş ancak HBeAg negatif mutantların varlığını gösterilince, HBeAg ve anti-hbe'nin vireminin çok güvenilir parametreleri olmadığı anlaşılmıştır. Bu nedenle klinik 25

32 uygulamalarda anti-hbe antikorlarının gösterilmesi HBV replikasyonu ve karaciğer hastalığı olmadığı anlamına gelmediği unutulmamalıdır. Viral replikasyonunun direkt göstergesi HBV DNA'dır (53, 77). Anti-HBe pozitif kronik aktif hepatitli hastalardaki prekor mutantlar, HBeAg pozitif hastalarda da saptanmıştır (97, 98). Prekor HBe negatif mutantların, normal karaciğer fonksiyonlarına sahip anti-hbe seropozitif kronik taşıyıcılarda da sık olduğu gösterilmiştir (99, 100, 101, 102). Kor bölgesi ile ilgili mutasyonlar sıklıkla T helper ve B hücre epitoplarında ortaya çıkar. Ancak CD8+CTL epitopunda da mutasyonlar tanımlanmıştır. Kor bölgesinin T helper epitopu içinde yer alan aminoasit 12 pozisyonundaki treonin'in serin ile yer değiştirmesi, HBV'nun CD4+T hücre cevabından kaçmasını sağlamaktadır (27, 53, 103, 104). Kor promoter mutasyonları, prekor mutasyonları ile birlikte veya bunlar olmadan da ortaya çıkabilir. HBV DNA üzerindeki kor promoter, X geninin 3' terminalinde yer alır ve 3,5 kb'lık mrna'nın (pregenom-kor/polimeraz mrna) transkripsiyonunu kontrol eder. Bu mrna pregenom gibi davranarak kor proteini ve DNA polimeraz-revers transkriptaz'ın sentezinde rol oynar. Kor promoter aynı zamanda HBeAg prokürsörünü kodlayan ve biraz daha uzun olan 3,5 kb'lık mrna (prekor mrna)'nın transkripsiyonunu da kontrol eder (44). Bu nedenle kor promoter'da ortaya çıkan mutasyonlar hem RNA (pregenom-kor/polimeraz mrna veya prekor mrna) hem de bunların gen ürünlerinin ekspresyonunu etkiler. Spesifik mutasyonlarda sadece bir tip mrna'nın transkripsiyonu etkileneceğinden tek başına HBeAg'nin üretimi durur veya kor proteinleri ile DNA polimerazın üretimi bloke olur. HBV kor promoter'undaki iki komşu mutasyonun (nükleotid 1768'de C yerine T ve nükleotid 1770'de T yerine A geçmesi) pregenomik RNA transkripsiyonunda küçük artış (yaklaşık 2-3 kat) ve bu transkripsiyondan bağımsız olarak viral enkapsidasyonda büyük artışla (on katdan daha fazla) sonuçlanmaktadır. Oluşan mutant ise fulminant hepatit ile yakından ilişkilidir (105) Polimeraz Geni Mutasyonları Polimeraz geni HBV nin en büyük geni olup diğer üç genlede overlap lar yapmaktadır. Bu nedenle gen üzerindeki değişiklik genellikle diğer genlerde de değişikliğe neden olmaktadır. Bunun için doğal olarak polimeraz mutasyonlarına çok az 26

33 rastlanır. Bugün için polimeraz geni mutasyonları dendiğinde akla nükleozid analogları na karşı direnç sağlayan mutasyonlar gelmektedir (106). HBV replikasyonunu inhibe etmek için gansiklovir, lamivudine ve famsiklovir gibi pek çok antiviral ilaç kullanılmaktadır. Bu ajanlar HBV replikasyonunu baskılasalarda uzun süreli kullanımlarından sonra ilaca dirençli HBV suşları oluşmaktadır. Şimdiye kadar ilaca bağlı en iyi tanımlanmış HBV mutantları lamivudine (LAM)'e dirençli olanlardır ve bunlar HIV suşları ile aynı mutasyona sahiptirler (53, 107) X Geni Mutasyonları X gen bölgesi virüsün replikasyonu ve ekspresyonu için çok önemlidir. X proteini HBV genlerini transaktive etmekte ve kor promoter, enhancer II, DR1 ile DR2 bu bölgede yer almaktadır. Dolayısıyla burada oluşan mutasyonlar bu yapıları da etkilemektedir (108): a- X-ORF'de meydana gelen nokta mutasyonlar ve delesyonlar daha az viral gen ekspresyonu ve replikasyonuna sahip bir fenotip oluşturur. Sonuçta HBV'na ilişkin serolojik göstergelerin çoğu veya tümü negatif bulunur. b- X bölgesindeki mutasyonlar, DR sekanslarının biri veya her ikisinde delesyona yolaçabilir. c- X-ORF'nin 3' delesyonları kor promoter'ı elimine eder. Ancak bu durumda kor polipeptidi, X promoter ve virus enhancer'in üst kısımlarında yapılmaya devam edebilir. d- Normalde pre-c sekansındaki delesyonlar viral replikasyonu etkilemez. Fakat X bölgesindeki delesyon, pre-c bölgesi girişine kadar uzanır ise viral polimerazın pregenomik bağlanma alanları ve pregenomik paketlenme sinyalini etkileyebilir. e- X bölgesinin orta kısmından yukarıya doğru uzanan delesyonlar polimeraz ORF'nin 3' ucunu da içine alır ve polimerazın kısmi delesyonu atenüasyona katkıda bulunur (60). X geninde meydana gelen değişik mutasyonların fonksiyonel önemi tam bilinmemekle birlikte bu tip varyantların infektiviteleri zayıf, replikasyon seviyeleri 27

34 düşüktür. Kronik HBV infeksiyonlu, HCC'lu, fulminant hepatitli ve sirozun son döneminde bulunan hastalarda X geni üzerindeki 130. ve 131. kodonlarda nokta mutasyonları bildirilmiştir (61) nükleotidleri arasındaki 8 nükleotidlik delesyonunun DNA ekspresyon ve replikasyonunu baskıladığı ve sonuçta HBsAg'nin negatif hale geldiği bildirilmiştir (108). HBx mutantları, beklenen serolojik profilden sapmalar gösteren hastalar, anti- HBc negatif-yüksek düzeyde viremik hepatitliler, renal diyalize giren kişiler ve çok kan transfüzyonu yapılan hastalarda da gösterilmiştir (42, 109). Serolojik olarak sessiz nonb-nonc hepatitli olgulardan bu tip mutantların sorumlu olabileceği tahmin edilmektedir (110) Hepatit B İnfeksiyonu Epidemiyolojisi Bütün dünyada yaygın olarak görülen HBV ye bağlı akut hepatitin ortalama % 5 inin kronikleştiği ve bunların önemli bir bölümünün siroza dönüştüğü; sirozlu olguların ise hepatosellüler karsinom gelişme riskinin oldukça yüksek olduğu bilinmektedir (5) Bulaşma Yolları HBV'nun 4 ana bulaşma şekli vardır: İnfekte kan ya da vücut salgıları ile parenteral temas (perkütan), cinsel temas, infekte anneden yeni doğana bulaşma (perinatal vertikal), infekte kişilerle cinsellik içermeyen yakın temas (horizontal). HBV'nun bulaşmasında mevsim ve yaş faktörlerinin rolü yoktur. HBV fekal oral yolla bulaşmadığından infeksiyonun yayılmasında su ve gıdalar önemli değildir. Oral yolla bulaşma ancak infekte kanın hasarlanmış oral mukozaya temasıyla gerçekleşebilir. Göz ve bütünlüğü bozulmuş deri de virusun geçişinde önemli rol oynar (6) Perkütan Bulaşma Virusun perkütan inokülasyonu, kan ve kan ürünlerinin transfüzyonu, hemodiyaliz, endoskopi, yapay solunum cihazı gibi tıbbi aletlerin kullanımı, akupunktur uygulaması, aynı enjektörün farklı bireylerde kullanımı ve dövme yaptırmayla 28

35 olmaktadır. Ayrıca infekte kan bulaşmış havlu, jilet, tıraş makinesi, diş fırçası, banyo malzemeleri gibi günlük eşyaların ortak kullanımı da perkütan bulaşmaya neden olabilir (6) Cinsel Temasla Bulaşma Homoseksüeller arası cinsel temas, HBV için en riskli seksüel bulaşma yoludur. Rektal mukoza mikrotravmalarına bağlı olarak infekte kan veya infekte semen teması riski arttırmaktadır. Genital sekresyonlar kandan daha az konsantrasyonlarda virüs içermelerine karşın bu sekresyonlar heteroseksüel temas sırasında bulaşmaya neden olmaktadırlar (111) Perinatal Bulaşma Taşıyıcı annenin perinatal dönemde infeksiyonu bebeğine geçirme ihtimali %40-50'dir (6). HBeAg pozitif bir annede bu oran daha yüksektir (27). Annenin HBV taşıyıcı olması durumunda hamileliğinin üçüncü trimesterinde veya doğumdan sonraki ilk iki ay içinde akut hepatit B infeksiyonu geçirmesi de perinatal bulaşmaya neden olabilir. Anneden çocuğa bulaşma, doğum esnasında veya doğumdan sonra oluşabilen deri ve mukoza sıyrıklarının infekte maternal sıvılarla teması, vaginal kanaldan geçiş sırasında anne kanının yutulması, sezaryen sırasında anne kanıyla temas veya plasenta hasarı sonucu maternal dolaşımın fötal dolaşıma karışmasıyla olur. İntrauterin bulaşma oranı ise nadirdir (%5-10) (112) Horizontal (Yatay) Bulaşma Parenteral, cinsel veya perinatal temasla bulaşmanın olmadığı durumlarda oluşan bulaşmaya horizontal bulaşma denir. HBV'nun hepatositlerden başka periferik kandaki mononükleer hücrelerde de replike olabilmesi nedeniyle, çok küçük miktarlardaki infekte kanın, yakın temastaki bireylerin hasarlı derileriyle temasının horizontal bulaşmaya yol açabileceği düşünülmektedir (113). Tükürük gibi vücut sıvılarının defektli deriyle teması da bulaşmaya sebep olabilir. Horizontal yol özellikle ev içi bulaşmada önemlidir. HBV'nun zeka özürlü çocuk bakımevleri, anaokulu, kreş, yatılı okul, kışla, yurt, hapishane gibi yerlerde de 29

36 kolay yayıldığı görülmüştür. Kalabalık yaşam şartları, kötü hijyen ve düşük sosyoekonomik düzey HBV'nun bulaşma oranını arttırmaktadır (6). Tablo 2: HBV İnfeksiyonun bulaşma yolları ve risk grupları Perkütan (parenteral) bulaşma Çoğul transfüzyon yapılan hastalar Hemodiyaliz hastaları Damar içi uyuşturucu bağımlıları Dövme (tatuaj) yaptıranlar Sağlık personeli Cerrahlar Diş hekimleri Hemşireler Hastabakıcıları Laboratuvar teknisyenleri Ilk yardım çalışanları Cincel temasla bulaşma Erkek eşcinseller HBV taşıyanların cincel partnerleri Fahişeler Çok partnerli heteroseksüeller Perinatal bulaşma HBV taşıyıcısı annenin bebekleri Horizontal bulaşma Kalabalık topluluklar halinde kötü hijyen ve düşük sosyoekonomik durumda yaşayanlar Mental özürlüler 30

37 Dünyada HBV İnfeksiyonu Prevalansı HBV infeksiyonunun dünyadaki dağılımı coğrafi bölgelere göre farklılıklar göstermektedir. Bundan dolayı dünya, düşük, orta ve yüksek endemisite bölgelerine ayrılmıştır (111). Düşük endemisite olan bölgelerde HBV taşıyıcılık prevalansı %2'den azdır. Erişkinler açısından infeksiyonla karşılaşma oranı da %20 dir. Cinsel temas en önemli bulaşma nedenidir. HBV ile çoğunlukla erişkin dönemde karşılaşılır. Perinatal ya da erken çocukluk dönemlerindeki bulaşma da önemli ölçüde HBV taşıyıcılığına neden olur. Kuzey Amerika, Kuzey ve Batı Avrupa, Avustralya, Yeni Zelanda gibi gelişmiş ülkelerde HBV düşük endemisite göstermektedir. Bu ülkelerde genel popülasyonda hepatit B insidansı düşük iken eşcinseller, çok partnerli heteroseksüeller, damar içi uyuşturucu bağımlıları gibi risk gruplarında ve Eskimolar, Yeni Zelanda Maorileri, Avustralya yerlileri, ABD zencileri gibi bazı etnik gruplarda infeksiyon endemiktir (6). Orta endemisite profili Güney ve Doğu Avrupa, Güney ve Orta Amerika, Orta Asya ile Türkiye'nin de içinde yeraldığı Ortadoğu da görülmektedir. Bu grupta toplumdaki HBsAg pozitifliği %2-10 arasındadır ve erişkinlerin %20-60'ında anti-hbs pozitifliği bulunmaktadır, infeksiyon çoğunlukla çocukluk, ergenlik veya genç erişkinlik dönemlerinde alınmaktadır. Başlıca bulaşma yolu horizontal olmakla birlikte diğer bulaşma yollan da infeksiyonun yayılmasında rol oynarlar (114). Yüksek endemisite Afrika ve Asya gibi bölgelerde HBV infeksiyonunun epidemiyolojik paterni oldukça farklıdır. Toplumun %10'dan fazlası HBV ile kronik olarak infektedir ve erişkinlerin %70'den fazlasında anti-hbs pozitifdir. Bu bölgelerin insanları yaşamlarının yaşları arasında %50'nin üzerine çıkan oranlarda anti-hbs pozitifliği edinirler (6). Yüksek endemisite bölgelerinde perinatal veya horizontal bulaşma ana bulaşma yoludur. Asya'da perinatal bulaşma daha önemli iken Afrika'da ise bulaşma bir yaşından büyük çocuklarda aile içi horizontal yolladır (111) Türkiye de HBV İnfeksiyonu Prevalansı Türkiye'deki HBsAg seroprevalansı, bölgeden bölgeye değişmek üzere ELISA yöntemi ile %3,9 12,5 olarak belirlenmiştir. Özellikle Diyarbakır'dan olmak üzere Güneydoğu Anadolu bölgesinde genellikle %10'un üzerindedir (27). Bu sonuçlara göre 31

38 Türkiye orta derecede endemik bir bölgedir ve 4 milyon civarında taşıyıcı bulunmaktadır (115). Kızılay Kan Merkezi 1998 yılında donörde %1,4 oranında HBsAg pozitifliği belirlemiştir. Sağlık Bakanlığı verilerine göre 1998 yılında Türkiye genelinde çalışılan kanda ise %1,0 oranında HBsAg pozitifliği saptanmıştır (115). Ülkemiz çocuklarında %2,0 12,1 oranlarında HBsAg pozitifliği saptanmıştır (115) yaş arasındaki 495 çocukta yapılan bir çalışmada HBsAg seroprevalansı %4,9 olarak belirlenmiştir (116). Bu grupta yapılan çalışmalar içinde en yüksek olgu sayısının bulunduğu araştırma (1190 olgu %7,1 HBsAg seropozitifliği, %21,9 anti-hbs seropozitifliği) Pasha ve ark. tarafından yapılmıştır (115). Anti-HBs'nin tarandığı çalışmalardan elde edilen verilere göre anti-hbs pozitifliği oranı %20,6 52,3 arasında değişmektedir (115). Böylece Türkiye'de HBV infeksiyonu seroprevalansının (HBsAg pozitifliği+anti-hbs pozitifliği) %25-60 arasında olduğu söylenebilir ki bu oranlar gelişmiş ülkelere göre oldukça yüksektir. HBV infeksiyonu seroprevalansının en çok araştırıldığı olgular içerisinde risk grupları, özellikle sağlık personeli ilk sırayı almaktadır. Bu grupta ortalama %8 (3,5 16,4) HBsAg pozitifliği ve %40 (17,9 52,9) anti-hbs pozitifliği bulunmuştur (115) Hepatit B İnfeksiyonu Patogenezi HBV infeksiyonu çok değişken bir spektruma sahiptir. Virusun akut, fulminan veya kronikleşerek siroza ve hepatosellüler karsinomaya gidebilen formda hepatit tabloları yapabildiği gibi persistan viremiye rağmen aminotransferazların ve karaciğer histolojisinin normal olduğu sağlam taşıyıcılık diyebileceğimiz bir tablo olarakda kalabilir (117). HBV ne karşı konağın immun cevabı ortaya çıkan klinik patolojinin ve virustan kurtulmanın temel nedenidir. HBV nun hepatositlere nasıl girdiği tam anlaşılmamıştır. Virusun pre-s2 domeni ile polimerize insan serum albümini ne ve pre- S1 domeni ile bir transmembran enzimine veya IgA reseptörüne veya IL-6 reseptörüne yada asialoglikoprotein reseptörüne bağlanarak hücreye girdiği düşünülmektedir. Ayrıca virusun pre-s1 aracılığı ile karaciğer hücresi membranın da türe spesifik bir protein olan anneksinv aracılığıyla membrana bağlandığı ve anti-anneksinv antikorlarının 32

39 HBsAg nin intakt hepatositlere bağlanmasını inhibe ettiği gösterilmiştir (117). Konak hücrelerine virusun girmesin engellemek için serbest HBV partiküllerinin nötralizasyonu önemlidir. Zarf antijenlerine karşı oluşan antikorlar akut infeksiyonun ortadan kalkmasından sonra kalıcı hale gelirler. B hücrelerinden antikor üretimi CD4 + T hücrelerinin yardımıyla üretilen sitokin aracılı bir süreçtir (72, 118, 119). HBV direkt sitopatik etki göstermez. Hepatosit nekrozu, sellüler ve humoral immun cevaplar sonucu gelişir. Akut olgularda, CD4 + T hücre proliferasyonu, IL-2, INF-γ, TNF-α yapımı ile karakterize Th1 tipinde güçlü bir T hücre yanıtı vardır. Nükleokapsid antijenleri viral klirens için immun tepkinin hedef molekülleridir (117). CD4 + hücreler antiviral immun yanıtı başlatan hücrelerdir. Bu hücrelerden salınan sitokinlerin hem virusun oluşturacağı hastalık tipini hemde viral infeksiyonun sonucunu belirlemede oldukça önemli oldukları düşünülmektedir. HBcAg, HBeAg den daha immunojendir ve HBeAg den farklı olarak HBcAg direkt virus spesifik B hücrelerini uyararak anti-hbc antikorlarını oluşturabilir. Yüksek titrede anti-hbc yanıtı erken dönemde ortaya çıkıp uzun sürede yavaş yavaş azalır. Buna karşın anti-hbe serokonversiyonu geç oluşup HBeAg kaybolmasından yıllar sonra kalır. HBeAg neonatal infeksiyondaki toleranstan sorumlu olduğu gibi yetişkinde immun yanıtı modüle etmektedir. Böylece HBeAg sekresyonu virus eliminasyonu veya konak hasarına yol açmadan infeksiyonun uzun süre devamına yol açar. Asemptomatik HBV taşıyıcılarında Th2 profili gözlenir. HBcAg/HBeAg-spesifik Th1/Th2 hücrelerin dengesi karaciğer hasarını ve viral klirensi regüle etmede önemli görünmektedir (117). Erken (preklinik) dönemde düşük titrede anti-hbs antikorlarının sentezlendiği gösterilmiştir. Bu antikorlar HBsAg ile kompleks yapmış durumda bulunurlar. Nitekim prodromal dönemde ateş yükselmesi, döküntü ve artrit ile seyredebilen ekstra hepatik sendromun bu immun komplekslerle oluştuğu bildirilmiştir. Genellikle ticari kitlerle gösterebilir düzeyde ortaya çıkışları HBsAg nin kaybolmasını (spesifik CTL etkisinin kalkmasını) gerektiren bir pencere dönemi izler. İyileşme olduğu halde HBsAg nadiren pozitif kalabilir. Bunun, S geninin konak hepatosit genomuna entegrasyonundan ileri geldiği düşünülür (117). Bu durumda anti-hbs antikorlar HBV klirensinden sonra bile tespit edilmeyebilir (48). 33

40 Viral klirenste sitotoksik T lenfositleri (CTL) kritik rol oynar. HBV infeksiyonunun nasıl sonlanacağı CTL yanıtı ile belirlenir. Akut HBV infeksiyonunda CD8 + T hücre proliferasyonu ve aktivasyonu artmıştır. HBsAg, etkin bir CTL yanıtını indükler; kronik infeksiyonda bu yanıt sınırda kalır. Kronik infeksiyonda nükleokapsid antijenlere spesifik T hücre yanıtının viral klirensten sorumlu olduğu sanılmaktadır. Anti-viral (non-sitolitik) immun mekanizmalar, akut gidişli HBV infeksiyonu süresince desrüktif (sitolitik) mekanizmalardan daha önce ve daha etkin biçimde rol alır. Böylece viral DNA nın en az %90 nı bu yolla elimine edilir. Ancak non-sitolitik yolun virusun kalmasınada yol açabileceği düşünülmektedir (117). Akut HBV infeksiyonundan iyileşmede sellüler ve humoral immun yanıtlar önem taşır. T hücre yanıtları infekte hücreleri temizler, humoral yanıtlar ise dolaşımdaki viryonları bloke eder ve infeksiyona karşı korunmayı sağlar. HBV persistansı infeksiyonun alındığı yaşa yüksek düzeyde bağımlı görünmektedir. Bebeklik ve erken çocukluk çağında alınan infeksiyon çoğunlukla persiste ettiği halde erişkin yaş infeksiyonunun %95 kadarı kendiliğinden iyileşmektedir. HBV nun viral klirensten kurtulmasında kabul gören yollar bilinmektedir (117); 1) Virusun T hücreleri tarafından tanınmaktan kurtulması; zayıf peptid sunumu, antijenik değişim, virusun immun sistemden korunmuş yerlerde saklanması, 2) Konak immun yanıtın baskılanması; Th1 sitokin fonksiyonunun azalması, virus spesifik T hücrelerinin tolerize olması veya tükenmesi, 3) Bazı class II allelerinin HBV persistansı ile ilişkili olabileceği düşünülmüş. Örneğin; HLA DR2 ve DR7 nin persistan HBV ile ilişkili olduğu, DR6 nın ise persistandan koruduğu, 4) Konakta opsonik indeksin düşmesine yol açan mannoz bağlayan lektin kodonlarındaki mutasyon, 5) CTL antijen sunumdaki yetersizlik, 6) Yetişkinde T hücrelerinin spesifik antijene yoğun biçimde maruz kalmaları ile T hücre apoptozisinin olması. 34

41 Sonuç olarak immun yanıtın şiddeti ve kalitesi HBV infeksiyonunda doğal seyri belirleyen en önemli faktörlerdir. İmmun yanıt, infeksiyonun sonlandırılması için gerekli olmakla birlikte HBV nun elimine edilemediği durumlarda viral replikasyon ile immun yanıt arasındaki ilişki karaciğer hasarına neden olmaktadır. Kronik hepatosit hasarına eşlik eden inflamasyon ve rejenerasyon DNA hasarına neden olarak HCC gelişimi ile sonlanabilmektedir. Viral DNA nın konak DNA sına entegrasyonu da konak genleri üzerine etki ederek kanser gelişimine katkıda bulunabilmektedir (120). Şekil 5: HBV infeksiyonunda olası patogenezin süreçleri 2.6. Akut Hepatit B de Klinik Bulgular ve Tanı Akut hepatit B infeksiyonunun inkübasyon dönemi 4-28 hafta olarak belirlenmiş, fakat çoğu vaka da bu aralık gündür. Hepatitin ortaya çıkması serumda HBsAg nin saptanmasından ortalama 4 hafta (1-7 hafta) sonradır (6, 34). Viral hepatitler asemptomatik infeksiyondan fulminan hastalığa kadar değişen farklı klinik seyir göstermektedir. Hastalık çocuklarda ve gençlerde yetişkinlere göre daha hafif ve asemptomatik olarak seyretmektedir. HBV infeksiyonunun 4 yaşın altındaki çocuklarda % 90, 30 yaşın üzerindeki yetişkinlerde ise 2/3 oranında asemptomatik olarak geçirilmektedir (7). Akut hepatitin başlangıç semptomları nonspesifiktir. Semptomatik akut hepatit B, hafif ve anikterik veya daha ciddi ve ikterle birlikte olabilir. HBV li erişkinlerin % 5-20 sinde belirgin akut hepatit belirtileri ortaya 35

42 çıkmaktadır (6, 34). Sklerada ikter, serum bilirubin düzeyi % 2,5 3 mg üstünde olunca görülür. Tipik semptomları, halsizlik ve yorgunluk, iştahsızlık, bulantı, kusma ve sağ üst kadranda hafif künt bir ağrıdır. Preikterik dönemdeki bu semptomlar genellikle 3-10 gün sürer. Sarılığın başlaması ve koyu idrar çıkması ile ikterik dönem başlar. İkterik vakalarda semptomlar ilerleyebilir, değişmeden kalabilir veya hızlıca düzelebilir. Sarılığın başlamasıyla hastalar genellikle kendilerini daha iyi hissederler. Hastaların bir kısmında birkaç gün süren hafif kaşıntı oluşur, nadiren kaşıntı uzayabilir, idrar koyu, dışkı açık veya çamur rengindedir Sarılığın süresi genellikle 1-3 haftadır ve 4 haftayı nadiren aşar (6). Akut hepatit B li hastaların % sinde belirgin karaciğer hastalığı semptomlarının başlamasından birkaç gün veya hafta önce eritematöz makülopapüler raş, ürtiker, artralji, nadiren artrit ve bazen de ateş ile kendini gösteren serum hastalığına benzer sendrom olarak isimlendirilen bir tablo vardır. Preikterik dönemdeki bu belirtiler hepatit B yönünde teşhis koydurucudur. Bu durum HBV una bağlı olarak gelişen immün kompleks ile ilişkilidir. Bu semptomlar genellikle 2-10 gün sürüp sarılığın ortaya çıkmasıyla kalıcı değişiklik bırakmadan hızla ortadan kaybolurlar, nadir olarak haftalar veya aylarca sürebilir. Akut hepatit B li çocuklarda bu sendrom ile ilşkili bir hastalık papüler akrodermatit (Gianotti hastalığı) olarak tanımlanmıştır (6, 121). HBV infeksiyonu nadir olarak karaciğer fonksiyon anormalliği olmadan ortaya çıkar ve sadece virus için spesifik serolojik tetkiklerle teşhis edilebilir. Fizik muayenede sağ üst kadranda hassasiyet, hepatomegali, sklera, mukoza ve deride ikter mevcuttur. Hastaların % inde splenomegali olabilir. Servikal lenfadenopati olabilir. Geçici jinekomasti olabilir fakat nadirdir. Çocuklar genellikle 2 haftada, erişkinler ise 4-6 haftada iyileşir (6). Akut hepatit B de laboratuvar testleri normal gözlenir veya orta derecede azalmış hematokrit veya hemoglobin e rastlanır. Lokosit sayısı normal, granulositopeni ve relatif lenfositoz olabilir. Geçici steatore erken hastalık döneminde olabilir (6). Total serum bilirubini genellikle gün yüksek kalır. Akut viral hepatitin esas göstergesi serum transaminaz aktivitesindeki hızlı yükseliştir. Transaminazların yükselmesi semptomlar başlamadan önce başlar ve genellikle semptomların birinci haftasında pik 36

43 yapar. Serum pik düzeyi genellikle 1000 Ü/ml nin üzerindedir ve alanin aminotransferaz (ALT), genelde aspartat aminotransferaz (AST) dan daha fazla yüksektir (6, 34). Pik seviyeleri karaciger hastalığı ile doğru orantılıdır, fakat prognostik faktör değildir. Serum alkalen fosfataz seviyesi normal veya hafif yükselmiştir. Serum albumin ve globulin konsantrasyonu genelde normaldir (6) Kronik Hepatit B de Klinik Bulgular ve Tanı Sağlıklı yetişkinlerde akut infeksiyondan sonra kronikleşme riski % 5 civarındadır (122). Altı aydan uzun süre serumda HBsAg tespit edilmesi taşıyıcılığı ifade eder. Serum transaminaz değerleri normal olan ve karaciğer hastalığının diğer belirtileri olmayan HBsAg pozitif kişiler sağlıklı taşıyıcı olarak isimlendirilmektedir (9, 123). Kronik HBsAg taşıyıcılarının % 1-2 sinin her yıl HBsAg negatif olacakları tahmin edilmektedir. HBeAg kaybolduğunda HBV replikasyonu sona erer ve kronik HBsAg taşıyıcıları infeksiyonun nonreplikatif dönemine geçerler. HBeAg-AntiHBe serokonversiyonunun yıllık % 2,7 25 oranlarında gerçekleştiği bildirilmektedir (9). Genellikle taşıyıcılarda Anti-HBc pozitiftir. HBeAg nin pozitif, Anti-HBe nin negatif olması viral replikasyonun olduğunu; HBeAg nin negatif Anti-HBe nin pozitif olması replikasyonun sona erdiğini gösterir. Ancak bazı durumlarda Anti-HBe pozitif olmasına rağmen HBV-DNA nın pozitif olması mutant bir HBV infeksiyonunu gösterir (123). Bu durum kronik hepatitlerde prognozun ve tedavinin belirlenmesi bakımından oldukça önemlidir. Anti-HBe pozitif olgularda % 20, HBeAg pozitif olgularda % 80 oranında HBV-DNA nın gösterilmesi, HBsAg pozitif vakalarda viral replikasyonun varlığını göstermesi bakımından özellikle kronik hepatitlerde PCR ile HBV-DNA bakılmasını zorunlu hale getirmiştir (124). Tablo 3: HBV-DNA, HBeAg ve Anti-HBe serolojik profilinin yorumu HBV DNA HBeAg Anti-HBe Yorum Replikasyon mevcut Replikasyon mevcut, Muhtemel mutant HBV Replikasyon mevcut, Muhtemel mutant HBV Replikasyon sona ermiş 37

44 HBeAg pozitif olan annelerde HBV'nun bebeklere geçiş riski % kadardır ve HBV infeksiyonuna yakalanan yenidoğanların % ında kronik HBsAg taşıyıcılığı ve daha sonrada kronik karaciğer hastalığı gelişmektedir (125, 126). Hastalığın kronikleşmesi karaciğerde viral replikasyonun devam etmesine ve hastanın immünolojik durumuna bağlıdır. Virusun atılamaması muhtemelen HBV antijenini tanıyan spesifik T hücre yetersizliğine bağlıdır. Konağın immün cevabı zayıf ise, karaciğer hasarı oluşmaksızın normal karaciğer fonksiyonu ile birlikte virus çoğalmaya devam eder ve bu hastalar sağlıklı taşıyıcı olarak isimlendirilir. Hücresel immün cevabı biraz daha iyi olan hastalarda hepatosellüler nekroz devam eder, fakat hücresel cevap virusu temizlemek için yetersiz olduğundan hastalık kronik hepatitle sonuçlanır. Kronik hepatit sıklıkla sessiz bir hastalıktır. Hastaların çoğu akut bir hastalık dönemi geçirdiğinin farkına varmazlar. Teşhis genellikle donör olarak kan verirken veya rutin kan taraması sırasında HBsAg pozitif bulunduğu ve serum transaminazlarında orta derecede yükseklik tespit edildiği zaman konabilir. Semptomlar karaciğer hasarının ciddiyeti ile korele değildir. Kronik hepatit B de en önemli genel semptom yorgunluktur. Diğer semptomlar bulantı, üst karın ağrısı, kas ve eklem ağrıları şeklindedir. Klinik bulgular sarılık, nadiren örümcek nevüs, büyük veya küçük karaciğer ve splenomegalidir. Ascit ve özefagus varis kanamaları geç ortaya çıkan portal hipertansiyon belirtileridir. ALT, AST ve gamaglobulin orta derecede yükselmektedir. Serum bilirubin ve albumini ciddi hastalık dışında normaldir. Serum transaminazları karaciğerdeki hastalığın ciddiyetini tam olarak yansıtmaz ancak yaklaşık bir fikir vermesi açısından hafif şiddetde < 100 IU, orta şiddetde IU, ağır şiddetde > 400 IU olarak kullanılmaktadır (127). Kronikleşme daha çok yenidoğan, homoseksüel, AİDS li, lösemi ve kanser, böbrek yetmezliği ve immünsüpressif tedavi alanlar gibi immün sistemi yetersiz olan hastalarda görülür (8). HBsAg taşıyıcılığı ile kronik hepatit arasındaki ayırım, karaciğerdeki kronik nekroinflamatuar hastalığın histolojik olarak ortaya konması ile mümkündür. HBsAg pozitif, serum transaminazları yüksek olan kronik hepatitli bir hastada immünohistokimyasal yöntemlerle HBsAg ve HBcAg nin gösterilmesi kesin teşhis koydurucudur (123). 38

45 2.8. Ocult Hepatit B İnfeksiyonu Akut kendini sınırlayan veya kronik infeksiyonda ya da başarılı anti HBV tedavisi sonrası HBsAg nin kaybolmasından sonra bazı hastalarda düşük düzeylerde HBV DNA serum veya karaciğer dokusunda kalabilir. Bu klinik durum ocult, sessiz veya latent HBV infeksiyonu olarak tanımlanır. Serum HBV DNA düzeyi 10 4 copya/ml den düşüktür ve bu düzey HBsAg pozitif kişilerden anlamlı olarak düşüktür (148, 149). Ocult hepatit B li kişilerde HBsAg negatif bulunurken, HBeAg nadiren tesbit edilebilir düzeylerdedir. Anti-HBs ve anti-hbc değişik oranlarda pozitiftir. % 20 vakada ise geçirilmiş HBV infeksiyonuna ait tüm markerlar negatiftir (13). Ocult hepatit B infeksiyonu; kan transfüzyonu, hemodiyaliz ve organ transplantasyonu sırasında geçişte risk oluşturur. Kriptojenik karaciğer hastalığı, kronik hepatit B nin akut ekserbasyonu veya fulminan hepatite neden olabilir. Hepatoselüler karsinom gelişimiyle ilişkilidir. Kronik hepatit C de hastalık progresyonunu ve tedaviye yanıtı etkiler. Ocult HBV infeksiyonu için çeşitli hipotezler ortaya atılmıştır I- HBV DNA da mutasyon II- Kişinin kromozomlarına HBV DNA nın integrasyonu III- Periferal kan monomüklear hücrelerin HBV ile infeksiyonu IV- HBV içeren immün kompleks formasyonu V- Kişinin immün cevabının değişmesi VI- HBV nin diğer viruslarla karışması Ocult hepatit B, anti-hbc pozitif kişilerde yüksek sıklıkla görülmektedir (19). Ocult hepatit B li kişilerde intrahepatik HBV DNA tesbiti, serum HBV DNA tespitinden sıktır (148, 149). Bu durum karaciğerin HBV replikasyonunda santral olarak yer almasıyla açıklanabilir. Buna karşın ocult HBV infeksiyonunda serumda HBV DNA tesbit edilebilirken, intrahepatik olarak tesbit edilemeyebilir. Bu durum ise ya ocult hepatit B nin geçiş fazıdır ya da HBV replikasyonu bilinmeyen bir lokalizasyonda devam etmektedir (150). 39

46 Ocult Hepatit B İnfeksiyonu ve HBV İnfeksiyonunun Bulaşması HBsAg negatif kişilerden kan transfüzyonuyla HBV nun geçiş riski bilinmektedir. Ocult hepatit B infeksiyonu olan annelerden çocuklara vertikal geçiş; insan ve woodchuk modellerinde gösterilmiştir (151, 152). Organ transplantasyonunda HBV bulaşması ve ocult hepatit B den de nova infeksiyonun yeri vardır. Ocult hepatit B infeksiyonlu kişilerdeki PBMCS nin HBV replikasyonunu sürdürmesindeki yeteneği bu hastalarda recurrent HBV infeksiyon gelişmesinde rezervuar rol oynadığını düşündürmektedir (148). Ocult hepatit B li karaciğer donörlerinden HBV infeksiyon kazanma riski %25-94 arasındadır (153, 154, 155). Ocult hepatit B prevalansı hemodiyaliz hastalarında %14-19 arasındadır (156, 157). HBV infeksiyonunu ocult HBV li böbrek donörlerinden kazanma riski, karaciğer donörlerinden kazanmaya göre daha azdır (158). Kemik iliği transplantasyonu sonrası HBV kazanma riski düşüktür, ama yinede bazen latent enfeksiyonun reaktivasyonu ve fulminant hepatite yol açabilir (159) HBV İnfeksiyonunun Serolojik Tanısı Akut viral hepatit B yi klinik olarak diğer hepatitlerden ayırmak güçtür ve tanısı spesifik serolojik testlerle konulmalıdır. HBsAg/Anti-HBs sistemi: HBV ile temastan 1-12 hafta sonra veya semptomların başlangıcından 2-8 hafta önce inkübasyon peryodu boyunca HBsAg serumda saptanır ve 3 ay sonra kaybolur (6, 7, 8). HBsAg nin belirmesinden ortalama dört hafta sonra klinik hepatit tablosu oluşmaktadır. Belirtilerle birlikte serumda HBeAg, DNA polimeraz ve HBV DNA saptanabilmektedir (128). HBsAg nin 3 aydan daha uzun süre sebat etmesi kronik hepatit B infeksiyonu gelişeceğini işaret etmektedir. Yetişkinlerin % 95 inde HBsAg kaybolur, % 5 inde Kronik HBsAg taşıyıcılığı oluşur. Kronik HBsAg taşıyıcılığı, infekte olan yenidoğanlarda % 90, bebeklerde % 50 ve çocuklarda % 20 oranlarında gerçekleşmektedir (7, 9, 127). Anti-HBs, HBsAg kaybolduktan sonra ve genellikle hastalığın başlangıcından 3 ay sonra ortaya çıkar, iyileşmeyi ve immüniteyi gösterir (akut dönemde anti-hbs oluşmakta fakat antijen fazlalığı nedeniyle rutin testler ile bu dönemde tespit 40

47 edilememektedir). Anti-HBs çoğu kişilerde hayat boyu kalıcıdır. Anti-HBs ile birlikte Anti-HBcIgG pozitifliği doğal immüniteyi, sadece Anti-HBs pozitifliği aşılama ile oluşan koruyuculuğu gösterir. İmmunkompleks formasyonu ile birlikte artrit ve raş gelişen hastaların % sinde klinik hepatit bulguları başlamadan önce ve antijenemi esnasında anti-hbs ortaya çıktığı gösterilmiştir. Ayrıca HBsAg taşıyıcılarının % ında düşük titrede anti-hbs olabilir. Bu durumun mekanizması muhtemelen farklı subtiplerle aynı zamanda infeksiyon olmasına bağlanmaktadır (6, 7, 8, 9, 34, 128). HBcAg/Anti-HBc sistemi: HBcAg nin serumda saptanması oldukça güçtür. Bu nedenle kor bölgesiyle ilgili pratik önemi olan tek gösterge Anti-HBc antikorlarıdır. Anti-HBcIgM ve IgG semptomların başlamasıyla ortaya çıkar, IgM birkaç ay pozitif kalır ve hastalığın başlangıcından 4-8 ay sonra serumda tespit edilemez. HBsAg nin serumdan kaybolup anti-hbs oluşuncaya kadar geçen pencere döneminde Anti- HBcIgM in varlığı akut infeksiyonu gösteren en önemli markerdir. Anti-HBcIgM in sebat etmesi hastalığın kronikleşeceğinin işaretidir. Anti-HBcIgM kronik HBV infeksiyonunda düşük titrede bulunur. Anti-HBcIgM in 7-8S formunun kronik HBV infeksiyonunda, 19S formunun ise akut infeksiyonda dominant olduğu bidirilmektedir (6, 7, 8, 9, 129). HBV ne maruz kalanlarda Anti-HBcIgG yıllarca veya hayat boyu pozitif kalabilir. HBsAg taşıyıcılarında Anti-HBcIgG yüksek titrede bulunur. Anti-HBs olmadan yüksek titrede anti-hbcigg olması viral infeksiyonun devam ettiğini gösterir. Anti-HBs ile birlikte Anti-HBcIgG nin düşük titrelerde bulunması hepatit B infeksiyonunun çok eskiden geçirildiğini gösterir (8, 9, ). HBeAg/Anti-HBe sistemi: HBeAg viral replikasyonun devam ettiğini ve infektiviteyi gösterir, HBsAg den kısa bir süre sonra pozitifleşir HBsAg den daha önce kaybolur. 10 haftadan daha uzun süre devam etmesi infeksiyonun kronikleşeceğinin belirtisidir. Anti-HBe düşük infektivitenin ve hastalığın tamamen iyileşeceğinin güçlü bir göstergesidir. Anti-HBe genellikle akut infeksiyondan yıllar sonra kaybolur. HBV- DNA viral replikasyonun en sensitif göstergesidir. HBsAg varlığında PCR ile serumda HBV-DNA tespiti viremi düzeyini ortaya koyan en iyi markerdir ve serum transaminaz düzeyleri ile koreledir (6, 8, 9, 130). 41

48 Pre-S/Antipre-S sistemi: Son yıllarda yapılan ön çalışmalar pre-s1 ve pre-s2 antijenlerinin varlığının, HBeAg ye oranla replikasyonun daha kesin göstergeleri olarak değerlendirilmesine yol açmaktadır. Bu antijenler, HBsAg ile birlikte ortaya çıkmata ve iyileşme ile sonlanan olgularda, çok daha erken yerlerini antipre-s antikorlarına bırakmaktadalar. Bu durumda, henüz HBsAg pozitif olgularda saptanan pre-s/antipre-s serokonversiyonu, kronikleşmenin olmayacağının erken bir göstergesi olarak kabul edilmektedir. İstanbulda yapılan bir çalışmada da, akut hepatiti B geçiren ve iyileşme ile sonlanan 34 olguda pre-s antijenlerinin HBsAg den çok daha erken kaybolduğu saptanmıştır (131). Tablo 4: HBV infeksiyonu olan hastalarda tipik serolojik profil Serolojik Akut Geçirilmiş Kronik İnaktif Ocult test Aşı HBV HBV HBV taşıyıcı HBV Anti-HBs /+ Anti-HBc /+ Anti-HBe /+ HBsAg HBeAg /+ HBV DNA Tablo 5: HBV infeksiyonlarının serolojik tanısında karşılaşılan olağan dışı profiller Tek başına HBsAg pozitifliği HBV varyantının varlığı Anti-HBc antikorlarının oluşmamasına neden olan immun defektin varlığı Tek başına Anti-HBc pozitifliği Yalancı pozitiflik Pencere dönemi Hümoral yanıtta bozukluk Anti-HBc antikorlarının anneden bebeğe pasif olarak aktarılması Tek başına anti-hbs pozitifliği Aşılama Hiperimmunglobulin Kan ve kan ürünlerinin tranfüzyonu HBsAg ve anti-hbs birlikte pozitifliği Hemodiyaliz hastalarında Asemptomatik damar içi uyuşturucu kullananlarda Anti-HBs pozitifliğinin yerini HBsAg pozitifliğine bırakması HBV-DNA nın hücrelerde saklı kalması ve uygun ortam bulduğunda tekrar ortaya çıkması (38). 42

49 Şekil 6: Akut HBV infeksiyonunun seyri Şekil 7: Kronik HBV infeksiyonunun seyri 43