T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI

Transkript

1 T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI I. VE II. ÜRÜN MISIRDA KÜF FLORASI VE AFLATOKSİN RİSK FAKTÖRLERİNİN BELİRLENMESİ YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMANMARAŞ Şubat-2008

2 T.C KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI I.VE II. ÜRÜN MISIRDA KÜF FLORASI VE AFLATOKSİN RİSK FAKTÖRLERİNİN BELİRLENMESİ Fatma KAHRAMAN YÜKSEK LİSANS TEZİ Kod No: Bu Tez 31/01/ 2008 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oy Birliği ile Kabul Edilmiştir. Yrd. Doç. Dr. Yrd. Doç. Dr. Doç. Dr. Yaşar ALPTEKİN Leyla İDİKUT Nihat TURSUN Danışman Üye Üye Yukarıdaki imzaların adı geçen öğretim üyelerine ait olduğunu onaylarım. Prof. Dr. Özden GÖRÜCÜ Enstitü Müdürü Bu çalışma KSÜ Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: 2006/3-6 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER. I ÖZET. II ABSTRACT III ÖNSÖZ.. IV ÇİZELGELER DİZİNİ V ŞEKİLLER DİZİNİ. VI SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... VII 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR En Önemli Mikotoksin Çeşitleri Mısırla İlgili Yapılan Önceki Çalışmalar Diğer Çalışmalar MATERYAL VE METOT Materyal Metot I. ve II. Ürün Mısırda Tane Yüzeyindeki Fungusların Tespiti I. ve II. Ürün Mısırda Hasat Sonrası Aflatoksin Miktarının Saptanması BULGULAR VE TARTIŞMA I. ve II. Ürün Mısırda Tane Yüzeyindeki Fungusların Tespiti I. ve II. Ürün Mısırda Hasat Sonrası Aflatoksin Miktarının Saptanması.. 5. SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR. 28 ÖZGEÇMİŞ I

4 ÖZET T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ ÖZET I.VE II. ÜRÜN MISIRDA KÜF FLORASI VE AFLATOKSİN RİSK FAKTÖRLERİNİN BELİRLENMESİ DANIŞMAN: Yrd. Doç. Dr. Yaşar ALPTEKİN Yıl: 2008 Sayfa: 33 Jüri : Yrd. Doç. Dr. Yaşar ALPTEKİN : Yrd. Doç. Dr. Leyla İDİKUT : Doç. Dr. Nihat TURSUN Bu çalışma, Kahramanmaraş merkez ve ilçelerine bağlı köylerde 2006 üretim sezonunda üretilen I. ve II. ürün mısırlarda hasat sonrası fungus cinslerinin ve aflatoksin miktarlarının saptanması amacıyla yapılmıştır. Bu çalışmada, 50 adet mısır örneğinde dane yüzeyi küf florası belirlenmiştir. Çalışma sonunda Aspergillus cinsi funguslara sıklıkla rastlanmıştır. Buna ilaveten daha az sıklıkla Penicillium ve Fusarium cinlerine rastlanmıştır. 41 tane mısır örneğinde ise hasat sonrası aflatoksin miktarlarının saptanması için HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromotografi Sistemi) ile aflatoksin analizi yapılmıştır. HPLC analizi sonucunda I. ürün mısır numunelerinin 3 tanesinin AFB 1 değeri 5 ppb den yüksek, toplam aflatoksin (AFB 1 +AFB 2 +AFG 1 +AFG 2 ) değeri ise tüm örneklerde 10 ppb den düşük bulunmuştur. II. ürün mısır numunelerinde ise AFB 1 değeri 5 ppb den düşük ve toplam aflatoksin (AFB 1 +AFB 2 +AFG 1 +AFG 2 ) değeri 10 ppb den düşük çıkmıştır. Yapmış oluğumuz çalışma sonucunda, I. ve II. ürün mısır örneklerinde aflatoksin değerleri toplam aflatoksin için kabul edilebilir maximum değerlerin altında bulunmuştur. Anahtar Kelimeler: Mısır, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Aflatoksin II

5 ABSTRACT UNIVERSITY OF KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF PLANT PROTECTION MSc THESIS ABSTRACT IDENTIFICATION OF FUNGAL FLORA AND DETERMINATION OF AFLATOKSIN RISK FACTORS IN 1 st AND 2 nd CROP CORN Supervisor: Assist. Prof. Dr. Yaşar ALPTEKİN Year: 2008 Page: 33 Jury : Assist. Prof. Dr. Yaşar ALPTEKİN : Assist. Prof. Dr. Leyla İDİKUT : Assoc. Prof. Dr. Nihat TURSUN This study was carried out in order to identify fungal genera and to determine aflatoxin levels in first and second crop corn after harvest in Kahramanmaraş and it s counties in In this study, total of 50 corn samples were tested to identify fungal genera on seed surface. As result of this study, fungi belonging to Aspergillus genus were more frequently observed. Fungi belong to Penicillium and Fusarium genera were less frequently observed then Aspergillus sp. and forty one corn samples were tested for aflatoxin content in HPLC after harvest. As a result of HPLC analysis, three of first crop corn samples had AFB 1 content over the 5ppb limit, and total aflatoxin contents of all corn samples were less than the 10 ppb limit. All second crop corn samples had less than the 5 ppb limit for AFB 1 and less than the 10 ppb limit for total aflatoxin (AFB 1 +AFB 2 +AFG 1 +AFG 2 ). In summary, aflatoxin contents of all first and second crop corn samples were less than maximum tolerable levels for total aflatoxin. Key Words: Corn, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Aflatoxin III

6 ÖNSÖZ ÖNSÖZ Mısır çok farklı kullanım alanlarına sahip çok besleyici bir besin maddesidir. Bu denli önemli olan bu üründe yanlış kurutma ve depolamadan dolayı ürün kayıpları gözlenmekte ve daha ileriki aşamalarda insan ve hayvanlara zararlı hale gelmektedir. Bu nedenle bu çalışma Kahramanmaraş merkez ve ilçelerine bağlı köylerde 2006 üretim sezonunda yetiştirilen I. ve II. ürün mısırda hasat sonrası küf florası ve aflatoksin risk faktörlerinin belirlenmesi için yapılmıştır. Yüksek lisans programı süresince yardımlarını esirgemeyen, çalışmalarım esnasında her türlü desteğini aldığım, her türlü özveriyi bana gösteren değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Yaşar Alptekin e çalışmalarımda yardımlarını esirgemeyen hocam Yrd.Doç.Dr. Ahmet Doğan Duman a, Doç.Dr. Nihat Tursun a, Doç.Dr. M. Kubilay Er e, Yrd.Doç.Dr. Leyla İdikut a ve Yüksek Gıda Mühendisi M. Reis Akkaya ya teşekkürlerimi sunuyorum. Labaratuar çalışmalarımda ve tez yazım aşamalarında bana yardımcı olan Yük. Ziraat Mühendisi Abdurrahman Adin e, Yük. Ziraat Mühendisi Ayşegül Karcı Tavukçu ya, Yük. Ziraat Mühendisi Duygu Atılgan a, Yük. Ziraat Mühendisi Ali Kemali Özuğur ve eşi Hanife Özüğur a, Ar. Gör. Zeynep Ağca ya, Ar. Gör. Ziya Dumpınar a, Çağlayan Kocakaya ya, Aysun Akyar a, Musatafa Soydan ve eşi Seda Soydan a, örneklerin toplanmasında emeklerini esirgemeyen ikiz kardeşim Hatice Kahraman ve Ziraat Mühendisi Canan Hasdemir e, Kahramanmaraş Toprak Mahsülleri Ofisi, Toros Tarım A.Ş. çalışanlarına ve Gemerek İlçe Tarım Müdürlügündeki mesai arkadaşlarıma bana olan desteklerinden dolayı teşekkür ediyorum. Son olarak, maddi ve manevi desteğini esirgemeyen aileme (Ali, Atike, Fatih Kahraman) ve Ahmet Aydın a gönülden teşekkürlerimi sunarım., Şubat 2008 KAHRAMANMARAŞ IV

7 ÇİZELGELER DİZİNİ ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 4.1. Sayfa I.Ürün Mısır Örneklerinin kaynağı, hasat tarihleri, nem oranları ve koloni oluşturan birim sayıları Çizelge 4.2. I.Ürün Mısırda Funguslar ve Koloni Sayıları (kob/g).. 18 Çizelge 4.3. II. Ürün Mısır Örneklerinin kaynağı, hasat tarihleri, nem oranları ve koloni oluşturan birim sayıları Çizelge 4.4. II.Ürün Mısırdaki Funguslar ve Koloni Sayıları (kob/g). 21 Çizelge 4.5. I.Ürün mısır örneklerinde aflatoksin B 1 (ppb) ve toplam (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ppb) Aflatoksin Miktarları 23 Çizelge 4.6. II.Ürün mısır örneklerinde aflatoksin B 1 (ppb) ve toplam (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ppb) Aflatoksin Miktarları 25 V

8 ŞEKİLLER DİZİNİ ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 1.1. Mısır Koçanı (a) ve danesi (b) Şekil 2.1. Aflatoksinlerin kimyasal yapısı.. 5 Şekil 3.1. Örneklemenin yapıldığı Kahramanmaraş Toros Tarım A.Ş. yem fabrikası silosu genel görünüşü.. 12 Şekil 3.2. Örneklemenin yapıldığı Kahramanmaraş Toros Tarım A.Ş. Yem fabrikası mısır alım ünitesi. 13 Şekil 3.3. Örneklemenin yapıldığı Kahramanmaraş Toros Tarım A.Ş. yem fabrikası mısır depolama tankları. 13 Şekil 3.4. Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi, Bitki Koruma Bölümü Laboratuarında kullanılan etüv ve otoklav. 15 Şekil 4.1. I.Ürün Mısırda Fungusların Koloni Oluşturma Sayısı. 19 Şekil 4.2. II.Ürün Mısırda Fungusların Koloni Oluşturma Sayısı Şekil 4.3. I.Ürün Mısır Örneklerinde Aflatoksin Miktarları 24 Şekil 4.4. II.Ürün Mısır Örneklerinde Aflatoksin Miktarları VI

9 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ AFB 1 : Aflatoksin B 1 AFB 2 :Aflatoksin B 2 AFG 1 : Aflatoksin G 1 AFG 2 : Aflatoksin G 2 AFM 1 : Aflatoksin M 1 AFM 2 : Aflatoksin M 2 a w : Su aktivitesi CD-ELISA : Direct Competitive-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay DON : Deoxynivalenol FTS : Fizyolojik tuzlu su GHP : Uygun hijyen gerekleri GMP : İyi üretim uygulamaları gr : Gram HACCP : Tehlike Analizi ve Kritik Kontrol Noktaları HPLC : High Performance Liquid Cromotography (Yüksek performanslı sıvı kromatografi sistemi) IAC : Immüno afinite kolonları İTK : İnce tabaka kromotografsi L : Litre ml : Mililitre µl : Mikrolitre mm : Milimetre PDA : Patates Dextroz Agar ppb : Milyardaki miktar ppm : Milyondaki miktar sn : Saniye YBSK : Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ZEN : Zearalenon VII

10 GİRİŞ 1. GİRİŞ Mısır önemi ve kullanım alanları gün geçtikçe artmakta olan endüstriyel bir tarım ürünüdür. Çok yönlü ve çok değişik kullanım alanına sahip olan mısır bitkisi bebek mamalarında, pastalık malzemelerde, yağ sanayinde, çerezlerde, cipslerde, konservelerde, ekmek üretiminde, yemeklerde insan gıdası olarak kullanılacağı gibi slaj yapımına uygunluğu ve elde edilen slajın beslenme değerinin yüksekliği gibi nedenlerle hayvan beslenmesinde de kullanılabilmektedir (Şekil 1.1). Ayrıca buğday ve arpadan sonra ikinci ürün olarak da yetiştirilebilen mısır bitkisinin daneleri hayvan yemlerinde katkı maddesi olarak da kullanılabilmektedir. Hayvansal gıda olarak bu denli önemli olduğundan mısır tarımını teşvik etmek için Tarım Bakanlığı nın Hayvancılığı Geliştirme Projesi kapsamında Yem Bitkileri Destek Projesiyle çiftçilere destek verilmektedir. Şekil 1.1. Mısır koçanı (a) ve danesi (b) (Anonim, 2007a; Anonim, 2007b). Mısır tane şekillerine göre yedi grup altında toplanır. Yaygın olarak tarımı yapılan at dişi mısır (Zea mays indentata Sturt.) ve sert mısır (Zea mays indurata Sturt.) dır. Dünyadaki mısır ticaretine bakıldığında en büyük üretici ülke A.B.D dir. Dünyada döneminde toplam 81,5 milyon ton mısır ticareti yapılmıştır (Anonim, 2008a) yılında Türkiye de 3,500,000 ton üretim ve 437,6 kg/da ortalama verim elde edilmiştir (Anonim, 2008b) yılında Kahramanmaraş ta 18,188 ha alanda üretim yapılmış, 163,411 ton ürün elde edilmiştir. Veriminde 20,715 kg/ha olduğu tespit edilmiştir (Anonim, 2008a). Örneklemenin yapıldığı 2006 yılında, Afşin de 846,679 da, Andırın da 22931,605 da, Çağlayancerit te 461,933 da, Ekinözü nde 153,266 da, Elbistan da 6157,852 da, Göksun da 452,942 da, merkezde 39454,829 da, Nurhak da 217,316 da, Pazarcık da 42191,348 da ve Türkoğlu nda 69019,045 da alanda mısır üretilmiştir yılında ise en fazla üretim Pazarcık ta 79891,227 da alanda, en az üretim ise Ekinözü nde 153,119 da alanda yapılmıştır (Anonim, 2008a). 1

11 GİRİŞ Mısır tarlada, hasat sırasında ve depolama aşamalarında istenmeyen sıcaklık ve su içeriğine bağlı olarak küflerle (funguslar) bulaşırlar. Fungal hastalık etmenleriyle bulaşan ve miktoksin oluşmuş tahıllar, yağlı tohumlar, baharatlar, kurutulmuş meyveler, hayvan yemleri ve süt ürünlerinin kullanılması ülke ekonomisi ve toplum sağlığı açısından bir risk teşkil etmektedir. Her yıl küf bulaşıklığı nedeniyle yağlı tohumlarda, pirinçte, yer fıstıklarında, mısırda ve soya fasulyesinde sırasıyla % 12, 5, 4, 3 ve 3 ürün kayıpları meydana gelmektedir (Tunail, 2000). Hastalıklardan dolayı ise mısırda verim kaybının % 7-20 arasında değiştiği bilinmektedir. Ancak 1970 yılında A.B.D nin Misisipi nehri deltasında Helminthosporium yaprak yanıklığı (Helminthosporium maydis Nisik.) epidemisi sonucunda % 80 civarında verim kaybı olmuştur. Bu olaydan sonra mısır hastalıklarının önemi artmış ve mısır hastalıkları üzerine çalışmalar dahada yoğunlaşmıştır (Kırtok, 1998). Hasat öncesi ve hasat sonrası hastalıklar mısırda önemli kayıplara neden olmaktadır. Mısır hastalıklarını genel olarak 5 grupta toplamak mümkündür. Bunlar; - Tohum ve fide hastalıkları, - Yaprak hastalıkları, - Sap çürüklükleri, - Koçan çürüklüğü, - Tarlada ve hasat sonrası funguslardan kaynaklanan mikotoksin bulaşıklığıdır (Kırtok, 1998). Tahıllar ve yağlı tohumlular gibi birçok ürün tarlada veya depolama sırasında funguslar tarafından infekte olurlar. Dane, yem ve gıdalar üzerinde gelişen küfler ikincil metabolit ürünleri olan mikotoksinleri üretirler. Bu mikotoksinler; kanserojen, teratojen, mutajen vb. özellikleri ile insan ve hayvan sağlığını ciddi şekilde tehdit ederler. Dünyadaki tarımsal ürünlerin her yıl mevsim, hasat ve depolama şartlarına bağlı olarak % 25 inin mikotoksinlerle bulaşık olduğu bilinmektedir. A.B.D de mikotoksin (aflatoksin, fuminosin ve deoxynivalenol) bulaşıklığı nedeniyle yıllık ortalama ekonomik kaybının yaklaşık olarak 900 milyon dolar olduğu saptanmıştır. Mikotoksin üreten fungus cinsleri arasında Aspergillus, Penicillium ve Fusarium en önemli cinslerdir. Bu güne kadar 400 değişik mikotoksin tanımlanmış ise de ancak bunların 8-10 tanesi gıda ve hayvan yemlerinde mikotoksikozise neden olur (Alptekin, 2007). Canlılar mikotoksinleri direkt olarak (pirimer mikotoksikosiz) kontamine olmuş gıda ve yemleri tüketerek, dolaylı olarak (sekonder mikotoksikosiz) ise kontamine yemle beslenen hayvanların yumurta, süt gibi ürünlerinin tüketilmesiyle almaktadır. Bağıl nem ve su aktivitesi (a w ), sıcaklık, ph, oksijen, karbondioksit, mikroorganizmalar, kimyasallar, baharatlar ve ışık mikotoksin oluşumunu etkilemektedir (Tunail, 2000; Şener, 2006). Mısır besin değerinin öneminden dolayı insan ve hayvan beslenmesinde büyük öneme sahiptir. Her geçen gün hastalık ve zararlılardan dolayı ürün kayıpları artmaktadır. 2

12 GİRİŞ Mısır hastalıkları içerisinde tarlada, hasat sırasında ve depoda aflatoksin bulaşıklığı büyük önem arzetmektedir. Bu çalışma yıllarında Kahramanmaraş merkez ve ilçelerinde yetiştiriciliği yapılan mısır örneklerinde fungal cinslerin belirlenmesi ve aflatoksin miktarının tespiti amacıyla yapılmıştır. 3

13 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. En Önemli Mikotoksin Çeşitleri Patulin Patulin Penicillium ve Aspergillus türleri tarafından sekonder bir metabolit olarak üretilen bir mikotoksindir (Akbulut, 2005). Patulinin bitki, hayvan hücre ve dokuları içinde yüksek toksik etkiye sahip olduğu bildirilmiştir (Stott ve Bullerman 1975, Engel ve Teuber 1984) Ergot Claviceps purpurea tarafından üretilmektedir (Peraica ve ark., 1999; King, 1979). Bu hastalığın ilk belirtileri bacaklarda ödem ve şiddetli ağrılar şeklinde gözlenmektedir (King,1979) Okratoksin A Aspergillus ve Fusarium spp. türleri tarafından üretilmektedir. Okratoksinler arasında en sık bulunan ve en toksik olanı Okratoksin-A dır. Okratoksin A nın bağışıklık baskılayıcı, kansirojenik olduğu test edilen bütün hayvanlar üzerinde gözlenmiştir (Tayfur, 1993) Zearalenon Zearelenon dünyanın her bölgesinde bulunabilen küf cinsi olan Fusarium ların bir metabolitidir. Doğrudan bir toksin olmaktan çok hormon benzeri bir yapıya sahiptir ve bir seri östrojenik hastalıklara neden olmaktadır (Topçu ve Tayfur, 1999) Fumonisin Fusarium moniliforme ve ilgili fungus türleri tarafından üretilen mikotoksinlerdir. Toksik önemi sahip olanlar B 1 ve B 2 dir (Paraica ve ark., 1999). Fumunosin B 1, Güney Afrika da Transkei, Çin ve Kuzey İtalya bölgelerindeki mısır örneklerinde daha sık ve yüksek miktarlarda bulunmuştur (Peraica ve ark., 1999) Aflatoksin Aspergillus cinsi küfler tarafından sentezlenen metabolizma toksinleri olup mikotoksinler arasında insan sağlığı yönünden en tehlikeli olan kanserojenik maddelerdir. Aflatoksinler oksitite derecelerine göre B 1, B 2, G 1,G 2 ve ayrıca aflatoksin türevi olan M de (M 1, M 2 v.b) bu gurup içerisinde yer almaktadır (Şekil 2.1). Aflatoksinler arasında en etkili grubuda B 1 oluşturmaktadır. Aflatoksinlere verilen bu harfler toksinlerin UV ışını altında verdikleri renkleri belirtir. B 1 ve B 2 mavi, G 1 ve G 2 yeşil-mavi, M 1 mavi-viyola ve M 2 viyola renkli yaymaktadır (Tunail, 2000). 4

14 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şekil 2.1. Aflatoksinlerin kimyasal yapısı (Anonim, 2006a). Aflatoksinlerin neden olduğu (özellikle AFB 1 ) akut, subakut ve kronik olarak seyreden mikotoksikosize aflatoksikosiz denir (Tunail, 2000). Aflatoksinler toksititesine göre AFB 1 >AFM 1 >AFG 1 >AFB 2 >AFG 2 >AFM 2 olarak bilinmektedir (Tunail, 2000). Aflatoksinle kontamine tarımsal ürünler kendi içinde risk taşımaları açısından sınıflandırılmıştır. Bu sıralamaya göre en önemlileri mısır, yer fıstığı, pamuk tohumu ve Antep fıstığıdır (Tunail, 2000) Mısırla İlgili Yapılan Önceki Çalışmalar Karagözlü ve Karapınar (2000), yaptıkları çalışmada aşurelik buğday, mısır, mısır unu, yulaf gevreği, yulaf ezmesi, yulaf unu ve müsliden oluşan toplam 100 örnekte okratoksin-a düzeylerine bakmışlar ve fungal yüklerini saptamışlardır. Sonuç olarak 1 adet aşurelik buğday, 2 adet mısır ve 1 adet yulaf ezmesi olmak üzere toplam 4 örnekte µg\kg düzeyleri arasında okratoksin-a varlını tespit etmişlerdir. Gürsoy ve Biçici (2003), yaptıkları çalışmada Çukurova bölgesinde yetiştirilen buğday ve mısır ürünlerinde hastalıklara neden olarak tane kalitesini bozan ve verim kayıplarına yol açan fungal türler ile onların bu ürünlerde oluşturdukları aflatoksin, deoxynivalenol (DON), T-2 toksin ve zearalenone (ZEN) gibi mikotoksinleri DC-ELISA (Direct Competitivive Enzym Linked Immuno Sorbent Assay) ve HPLC (High Performance Liquid Chromatography) teknikleri ile araştırma yapmışlardır. Sonuç olarak yaptıkları çalışmada tanımı yapılan fungusların bulunduğu mısır ve buğday örneklerinde DC-ELISA testi ile 23 örnekte aflatoksin, 25 örnekte µg\kg DON, 31 örnekte µg\kg T-2 toksin ve 37 örnekte µg\kg ZEN belirlemişlerdir. DC-ELISA tekniği uygulaması sonunda 50 ppb aflatoksin içeriğini belirledikleri mısır örneğini ayrıca HPLC uygulayarak karşılaştırma yapmışlardır. Bu uygulama sonucunda da 43 ppb aflatoksin içeriği saptamışlardır. 5

15 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Özçelik ve ark. (2003), yapmış oldukları çalışmada gıda ve yemlerde mikotoksin bulaşıklığının önlenmesi hakkında araştırma yapmışlardır. Sonuç olarak Deuteromycetes (Fungi imperfecti) sınıfına giren ve mikotoksin oluşturan küfler çoğunlukla Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Cladosporium, Alternaria, Byssochlamys ve Stachybotrys cinslerinden olduğu saptamışlardır. Mikotoksinlerin gıda ve yemlerden azaltılması ve uzaklaştırılması a-fiziksel, b-kimyasal ve c-biyolojik metodlarla yapılabildiğini bildirmişlerdir. Gürsoy (2004), yaptığı çalışmada Adana, Ceyhan, Tarsus ve Karataş yörelerinden hasat esnasında alınan 20 ticari mısır çeşidinden 73 adet ve 16 buğday çeşidinden 43 adet olmak üzere toplam 116 tane örneğinde doğal olarak oluşan fungal infeksiyonlar ve mikotoksin aramaları yapmıştır. Sonuç olarak CD-ELİSA ( Competitive ELİSA) tekniği uygulaması sonunda aflatoksin içeriği 50 ppb olan bir adet mısır örneğine ve 3.5 ppb toksin içeriğine sahip bir adet buğday örneğine ayrıca Immuno Affinity Column-High Performance Liquid Chromotography (IAC-HPLC) ile toksin analizi de yapılmış ve buğday örneğinde toksin içeriği saptanamazken mısır örneğinde 43.5 ppb gibi CD-ELİSA sonucuna yakın aflatoksin içeriği saptamıştır. Jaime-Garcia ve Cotty (2004), mısır koçanları hasat öncesi veya toprakta iken Aspergillus flavus ile bulaşır. Çalışmalarında mısır koçanlarının mısır ve pamuk için bir inokulum kaynağı teşkil edip etmediğini araştırmışlardır. Sonuç olarak önceki sezondan kalan mısır koçanlarının aynı tarladaki topraktan 190 kez ve iki yıllık koçan kalıntılarının ise topraktan 45 kez daha fazla A. flavus inokulumu taşıdığını bildirmişlerdir. Son olarak artan koçan yaşına bağlı olarak A. flavus miktarının da azaldığını belirtmişlerdir. Aşkun (2005), bu çalışmada yılları arasında Balıkesir piyasasından temin edilen toptan ve perakende onbeş buğday ve yedi yem örneği gıdalar için uygun izolasyon ortamları ve uluslar arası gıda mikolojisi toplantılarında kabul edilmiş olan standart metotlar kullanılarak incelemiştir. Türlerin tanımlanması morfolojik karakterleri ile birlikte koloni karakterlerine göre çeşitli tür tayin anahtarları kullanılarak yapmıştır. Böylece Balıkesir yöresine ait buğday ve yem ürününün küf florası ve potansiyel mikotoksin üretici türleri belirlemiştir. Alptekin ve ark. (2005), Kahramanmaraş merkez ve ilçelerine bağlı köylerde hasat edilen I.ürün mısır örneklerinde küf sayımı ve florasının tespiti amacı ile 2004 Ekim ve Kasım aylarında yapmışlardır. Toprak Mahsulleri Ofisi (TMO) Kahramanmaraş şubesinde kamyonlarla satılmak üzere getirilen mısırlardan her kamyondan olmak üzere 170 cm boy ve 2,5 cm çapında sonda aleti ile 4,5 kg alt örnek almışlar ve toplam 20 adet farklı tarladan gelen kamyonlarda mısır örneklemesi yapmışlardır. Laboratuarda 4,5 kg örnekten 500 g alt örnek alınmış ve 10-6 dilüsyonları hazırlanarak Czapeck Dox Agar (CZA) besiyerlerinde küf sayımları ve izolasyonları yapmışlardır. Mısır örneklerinde; Penicillium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, cinsi küflere sıklıkla rastlamışlardır. Numunelerden elde edilen küf sayımları 1.7x x10 9 kob(cfu)/g olarak tespit etmişlerdir. Camunak (2005), yaptığı çalışmada 2004 üretim sezonunda Kahramanmaraş merkez ve ilçelerine bağlı köylere ait 30 numune üzerinde bulunan küf florası araştırmıştır. Sonuç olarak örneklerde 1.7x10³ ile 1.5x10 9 kob/g arasında değişen değerler bulmuştur. Bu çalışma sırasında en fazla Penicillium cinsi küfler tespit etmiştir. 6

16 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Tatlı ve Özdemir (2005), yaptıkları çalışmada Adana ve Osmaniye illerinde 2001 yılında 47, 2003 yılında 32, olmak üzere toplam 79 adet II. ürün mısır numuneleri funguslar açısından incelemişlerdir. Yapılan izolasyonlar sonucunda 2001 yılında 163 izolat elde edilmiş ve bu izolatların % 28,83 ünü Fusarium moniliforme, % 22,08 i Fusarium spp., % 20,85 i Aspergillus niger, % 12,26 sı A.flavus, % 11,04 ü Penicillum sp., % 0,18 i F.oxysporium, % 0,18 i Alternaria sp., ve % 0,2 sini Trichoderma sp., 2002 yılında ise elde edilen 125 izolatın ise; % 34,40 ı F.moniliforme, % 32,20 si A.niger, % 15,20 si Fusarium spp., % 12,00 ı Penicillum sp., % 3,20 si A.flavus, % 1,60 ı Trichoderma sp. fungusları olduğunu bildirmişlerdir. Aluç ve Aluç (2005), aflatoksin kontaminasyonu bakımından ve 2004 sezonlarında yetiştirilen Antep fıstığı örneklerinin aflatoksin miktarını incelemişlerdir sezonuna ait 134 örnekten 24 ünde 2 ppb nin üzerine aflatoksin B 1 (2,04-55,1 ppb), 19 örnekte de 4 ppb nin üzerinde toplam aflatoksin (4,55-60,03 ppb), 2003 sezonuna ait 165 örnekten 18 inde 2 ppb üzerinde aflatoksin B1 (2,19-39,59 ppb), 13 örnekte 4 ppb nin üzerinde toplam aflatoksin (4,96-44,9 ppb), 2004 sezonuna ait 68 örnekten 3 ünde 2 ppb nin üzerinde aflatoksin B 1 (2,43-6,82 ppb), 2 örnekte 4 ppb nin üzerinde toplam aflatoksin (4,24-15,25 ppb) tespit etmişlerdir. Çalışma sonucunda sezonlar aflatoksin içeriği yönünden karşılaştırıldığında 2004 sezonunun 2002 ve 2003 sezonlarına göre iyi olduğunu tespit etmişlerdir. Demir ve ark. (2005), Samsun merkez ve ilçe köylerinden, 2000 yılı hasat mevsiminde toplam 100 mısır örneğinde Fusarium moniliforme infeksiyonu, fumonisin B 1 (FB 1 ) ve fumonisin B 2 (FB 2 ) nin doğal kontaminasyonu belirmişlerdir. Fumonisin analizi HPLC ile gerçekleştirmişlerdir. Toplam 100 mısır örneğinde F.moniliforme infeksiyon oranı % 94 olarak bulunmuştur. F.moniliforme bulunma sıklığı % arasında değiştiği bulmuşlardır. 100 örneğin 52 sinde FB 1 50 (belirleme limiti) ng/g ve 25 örnekte FB ng/g seviyelerinde değişmiş olduğunu belirtmişlerdir. Emir ve ark. (2005), yaptıkları çalışmada Van piyasasında satışa sunulan mısır cipsi örneklerinde aflatoksin varlığını incelemişlerdir. Van piyasasından satışa sunulan 6 farklı firmanın ürettiği farklı çeşitlerde 30 adet örnek alınmış ve bu örneklerde aflatoksin aranmıştır. Sonuç olarak HPLC sistemleri kullanılarak yapılan bu çalışma sonunda analiz edilen mısır cipsi örneklerinde 13 adetinde (% 43 ünde) AFB 1 (1,2-11,2 µg\kg) ve toplam aflatoksin (1,2-12,3 µg\kg) bulmuşlardır. Numunelerin hiçbirinde AFG 1 ve AFG 2 ye rastlamamışlardır. AFB 1 ve AFB 2 bulunan numunelerin 4 adetinde 0,1-1,1 ppb düzeyinde ve 1 inde iz miktarda rastlamışlardır. Yapılan istatistik analizde aflatoksin düzeyleri yönünden firmalar arasında fark bulunurken (p=0,026) ürün tipleri (ekstrude ve levhalaştırılmış) arasında farklılık görülmemiştir (p=0,753). Giray ve ark. (2005), yaptıkları çalışmada ülkemizde beslenmede büyük önemi olan buğday ve mısır örneklerinde total aflatoksin, okratoksin A düzeylerinin ELİSA yöntemi kullanılarak tespit edilmesini sağlamışlardır. Bu doğrultuda en büyük toplama ve depolama birimi olan Toprak Mahsülleri Ofisi ve bölgesel pazar ve marketlerden toplanan 34 buğday örneğinde ve yine bölgesel pazar ve marketlerden toplanan 47 mısır örneğinden ön işlemleri takiben ELİSA kitleri (r-biopharm, Ridascreen) kullanılarak total aflatoksin ve okratoksin A düzeyleri tayin edilmiştir. Sonuç olarak buğday örneklerinde total aflatoksin düzeylerinin 67,2-711,15 ng\kg aralarında olduğu saptanmıştır. Bu düzeyler tahıl ve tahıl ürünleri için izin verilen total aflatoksin düzeylerinin altındadır. Okratoksin A düzeyinde 7

17 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ise ng\kg aralığındadır ve sadece 1 örnekte (% 3) izin verilen düzeyin üzerinde olduğu belirtilmiştir. Mısır örneklerinde yapılan analizlerde, total aflatoksin düzeyleri ( ng\kg) açısından analiz edilen örneklerin % 8 inde; okratoksin A düzeyleri ( nk\kg) yönünden % 2 inde verilen düzeylerin üzerinde bir kontaminasyon olduğunu saptanmışlardır. Leslie ve ark. (2005), sorgum ve darıdan elde ettikleri Fusarium izolatlarının çoğunlukla F. moniliforme olarak tanımlandığını bildirmişler. Her bir Fusarium türünden (F.andiyazi, F.nygamai, F.pseudonygamai, F.thapsinum, ve F.verticillioides) beş ırkı fumonisin ve moniliformin üretimi, ördek yavrularına toksisiteleri bakımından analiz etmişler, sonuç olarak bu izolatların sorgum ve darıda bulunan izolatlara benzer olduklarını bildirmişlerdir. F.pseudonygamai ve F.thapsinum yüksek düzeyde moniliformin üretirken, hiç veya çok az fumonisin üretimi gösterterdiğini belirtmişlerdir. F.verticillioides ve F.nygamai yüksek düzeyde fumonisin üretirken hiç veya çok az moniliformin üretmiştir. Yukarıda belirtilen dört tür de ördek yavruları üzerinde yüksek tosisite göstermişlerdir. Ancak F.andiyazi türünün hiçbir toksin üretmediği ve ördek yavruları üzerinde toksik olmadığını bildirmişlerdir. Uçkun ve Yıldız (2005), Marmara bölgesinin önemli mısır alanlarında (Bursa- Karacabey ve Mustafakemalpaşa ile Sakarya-Adapazarı) 2003 yılında yürütülmüş olan bu çalışmada, koçan çürüklüğüne neden olan Fusarium türleri ve hastalık nedeniyle oluşan Fumonisin ve Deoxynivalenol (DON) miktarları saptanmışlardır. Bölgeden alınan 178 örnekteki koçanlardan ortalama % 51 oranında Fusarium spp. izole edilmiş ve başlıca etmen olarak F.moniliforme (% 48) belirlemişlerdir. Bunu, F.graminearum (% 2.19) ve F.oxysporum (% 0.27) daha düşük bir paydaya sahip olduğunu bulmuşlardır. Bölgeden alınan örneklerin tümünde hastalık etmenlerine rastlanmış, yaygınlık oranı % 100 olarak bulmuşlardır. Elisa yöntemiyle yapılan mikotoksin testlerinde, 69 örneğe ait Fumonisin değerleri µg\kg, arasında değişirken, 15 örnekte DON değerleri ise µg\kg sınırları içinde kaldığı belirlemişlerdir. Abbas ve ark. (2006), Fusarium ve Aspergillus spp. ile doğal olarak infekteli 65 hibrid mısırı mikotoksin bulaşıklığına karşı dayanıklılık bakımından değerlendirmişlerdir. Hasatta dane mısır örnekleri aflatoksin ve fumonisin bakımından test edilmiştir yılında bütün hibrid mısır örnekleri ABD de FDA in belirlemiş olduğu 20 µg\kg aflatoksin ve 2 µg\kg fumonisin limitini aşmıştır. Arkansas da 1999 ve 2001 yıllarında aynı ve farklı bölgelerde ekilen hibrid mısır örnekleri 0 ile µg\kg aflatoksin ve 0.3 ile 83.6 ppm arasında değişen fumonisin içerdiğini bildirmişlerdir yılında fumonisin (0.3 ile 83.6 arasında değişmiş) seviyesi bütün hibritlerde çok yüksek iken aflatoksin (<5 ve 131 µg\kg arasında değimiş) seviyesinin düşük olduğunu bidirmişlerdir. Şener (2006), yapmış olduğu çalışmada Kahramanmaraş merkez ve bağlı köylerde 2005 üretim sezonunda yetiştirilen II. ürün mısırda hasat sonrası fungal cinsleri ve aflatoksin miktarı araştırmıştır. Sonuç olarak 28 numuneden aflatoksin B 1 için 12 tanesi 5 ppb den yüksek çıktığını belirlemiştir. Minimum değer 7.70 µg\kg, maksimum değer ise µg\kg bulmuştur. Kural ve Topaç (2007), yaptıkları çalışmada Kahramanmaraş ilçe ve köylerinin, Mardin in Kızıltepe ve Şırnak ın Silopi ilçesinin 2006 yılı hasat sonrası I. ve II. ürün 8

18 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR mısırlarda fungal cinslerini ve aflatoksin miktarını araştırmışlardır. Sonuç olarak 30 numune üzerinden aflatoksin B 1 için 3 tanesi 5 µg\kg den yüksek bulmuşlardır Diğer Çalışmalar Homdork ve ark. (2000), farklı depolama koşullarının mikotoksin üretimi ve Fusarium la bulaşık buğday danelerinin kalitesi üzerine etkilerini incelemişlerdir. Aşırı derecede bulaşık dane örneklerinde (>% 50) depolama şartları ne olursa olsun Deoxynivalenol (DON) içeriği sabit kalsada, (Buğday yüksek nem 25 C/ % 90 nispi nem) koşullarında depolandığında depolamanın sonuna doğru danelerdeki zearalenone (ZEA) içeriğinin artığını bildirmişlerdir. Hasattan hemen sonra hiçbir örnekte nivalenol (NIV) e rastlanmamıştır fakat depoda serin ve ılık (15 C/% 84 nispi nem) koşullarda saklanan danelerde rastlanmış, sıcak ve çok nemli (25 C/% 90 nispi nem) şartlarda rastlanmamıştır. Depolama esnasında Fusarium bulaşık yüzdesi ile mikotoksin içeriği arasında bir ilişki bulamamışlardır. İlaveten, tohum ve dane ürünlerinin kalitesinin bozulmadan depolanması için sıcak ve nemli şartların uygun olmadığını bildirmişlerdir. Duman (2001), yaptığı çalışmada farklı kurutma tekniklerinde Kahramanmaraş ve Şanlıurfa çeşidi kırmızı biberlerin kurutulup işlenmesi ile elde edilen kırmızı pul biber işleme tekniklerinin küf gelişimi ve aflatoksin oluşumunu araştırmıştır. Kahramanmaraş ve Şanlıurfa yöntemleriyle güneşte 8-12 gün, kurutucuda 65 / 85 ºC de saatte kurutulan ve 6 ay süreyle depolarda saklanan kırmızı pul biberde; su aktivitesi, ph, nem, kuru madde, küf sayımı ve aflatoksin analizleri yapmıştır. Kahramanmaraş yöntemi ile kurutulan örneklerde aflatoksin oluştuğu gözlenmiştir. Sonuç olarak en uygun kurutma derecesinin 65 ºC olduğunu bulmuştur. Aluç ve Aluç (2003), yaptığı çalışmada sezonundaki çiğ fındıklarda ve kavrulmuş fıstıklarda aflatoksin düzeyi belirlemişlerdir. Örnekler Akçakoca, Ordu ve Giresun dan temin etmişlerdir. Sonuç olarak Akçakoca yöresinden 186 parti çiğ fındıktan 10 partide (B 1 = µg/kg, toplam= ,93 µg/kg), Giresun yöresinden 160 parti çiğ fındıktan 20 partide (B 1 = ,68 µg/kg, toplam= ,08 µg/kg), Ordu yöresinden 177 parti çiğ fındıktan 16 partide (B 1 =2.1-29,44 µg/kg, toplam=3,61-135,51 µg/kg) aflatoksin tespit etmişlerdir. Fındığın uzun süre bekletilmesi durumunda kavrularak bekletilmesinin en uygun yöntem olduğu tespit etmişlerdir. Sonuç olarak aflatoksin sorununun ağaçtan başlayarak üretim, teknoloji ve depolama hataları gibi çeşitli, nedenlere bağlı olduğu bulmuşlardır. Heperkan (2003), yapmış olduğu çalışmada gıdalarda mikotoksinler ve ülkemiz açısından önemini araştırmıştır. Çalışmada Karadeniz bölgesinde Ordu, Giresun ve Tirebolu dan temin edilen 140 örnek incelenmiş, 25 adet fındık örneğinin 5 inde aflatoksin belirmiştir. Araştırma sonunda fındıkta aflatoksin oluşumunun kurutma sırasında oluşmaya başladığı bulmuştur. Heperkan ve ark. (2003), yaptıkları çalışmada gıdalarda mikotoksin önlenmesini araştırmışlardır. Sonuç olarak mikroorganizmaların, ışınlamanın, kimyasalların ve baharatların etkileri ile iyi üretim uygulamaları (GMP), iyi depolama pratikleri (GSP), iyi hijyen üretimi (GHP) ve tehlike analizleri (HACCP) sisteminin doğru kullanılmasıyla mikotoksin düzeylerinin indirgenebileceği bulmuşlardır. 9

19 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Özkaya ve ark. (2003), yaptıkları çalışmada, Flavobacterium aurantiacum NRRL B- 184 çeşidinin, ülkemizde aflatoksin sorunu yaşanan kuru kırmızıbiber ve yerfıstıklarında aflatoksin B 1 in (AFB 1 ) in azaltılması veya giderilmesinde etkili olup olmadığını araştırmışlardır. Çalışma sonucunda F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun PFT ortamının yanı sıra kırmızıbiber ve yerfıstığı örneklerinde de AFB 1 i önemli ölçüde azalttığı veya tamamen ortamdan uzaklaştırdığını bulmuşlardır. Seçer (2003), yaptığı çalışmada küflerin tahıllarda kalite ve kantite yönünden % 25 oranında kayba neden olduğunu bildirmiştir. Sonuç olarak gelişen fungal floranın çok çeşitli olmasından dolayı tahıllarda 90 dan fazla mikotoksin belirlenmiştir. Bunlardan en önemlileri; aflatoksin, penisilik asit, kojik asit, luteosikrin, Alternaria metabolitleri ve ergot alkoloitlerinin olduğu bildirilmiştir. Yazıcıoğlu ve Omurtağ (2003), yaptıkları çalışmada hububat ve bakliyat ürünlerinde T-2 toksinin yüksek basınçlı sıvı kromatografisi yöntemi ile araştırılması çalışmalarında marketlerden ve pazardan temin edilmiş hububat ve bakliyat ürünlerinde T-2 toksini araştırılmışlardır. Araştırıcılar T-2 toksin ince tabaka kromatografisi (İTK) ve UV dedektörlü yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (YBSK) ile tayin etmişlerdir. Çalışmada YBSK ile T-2 toksin tespit edilen örneklerden 1 ppm miktarında bulunanların aynı zamanda İTK ile de analizlerini yapmışlar ve İTK ile YBSK çalışmalarının sonuçları birbiriyle uyumlu bulmuşlardır. Araştırıcılar hububat örneklerinin % 15,38 inde bakliyat örneklerinin % 33,33 ünde T-2 toksin tespit etmişlerdir. Yurdun (2003), yapmış olduğu çalışmada İstanbul piyasasından sağlanan çeşitli besin maddelerinde mikotoksinleri araştırmıştır. 328 adet örnekte yapılan çalışmada fıstık ezmesi ( µg\kg), kırmızı biber (0, µg\kg), süt ( µg\kg), peynir ( µg\kg), yoğurt ( µg\kg), ve süt tozu (0.021 µg\kg) örneklerinde aflatoksin miktarlarını saptamıştır. Örneklerin %74,1 inde ise Türkiye standartlarında kabul edilen 50 ppb nin üzerinde patulin bulmuştur. Arıcı ve ark. (2005), yaptıkları çalışmada salamura siyah zeytinlerde aflatoksin kirliliğini araştırmışlardır. Tekirdağ ve Çorlu da marketler, bakkallar ve halk pazarlarında açık olarak satışa sunulan 64 adet salamura siyah zeytin üzerinden yürütmüşlerdir. Örneklerde aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) analizleri HPLC yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Sonuç olarak analiz edilen 64 örneğin 30 unun 0,05 ile 0,31 µg/kg arasında AFB 1, 11 inin 0,04 ile 0,07 µg/kg AFB 2, 6 sının 0,04 ile 0,13 µg/kg AFG 1 ve 1 inin 0,07 µg/kg AFG 2 ile kontamine olduğu belirlenmiştir. Aflatoksin bulunan toplam 35 örnekte aflatoksin düzeyi ortalama 0,11 µg/kg olarak tespit edilmiştir. Bu sonuçlara göre örneklerin hiçbirinin Türk Gıda mevzuatında belirtilen maksimum aflatoksin limitlerini aşmadığı belirlenmiştir. Gürsoy ve Biçici (2005), bu çalışmada 38 i hasattan hemen sonra, 38 i kurutma ve depolama evrelerinde alınmış kabuklu ve kabuksuz toplam 76 yerfıstığı örneklerinden yapılan mikolojik izolasyonlar sonucunda % 80 Aspergillus niger, % 15 A. flavus ve % 4 Pestalotiopsis arachidis ve Rhizophus stolonifer izole etmişlerdir. Örneklerdeki toplam aflatosin oluşumlarının belirlenmesinde CD-ELISA ( Competitive Direct-Enyzm Linked Immuno Sorbent Assay ) yöntemini kullanmışlardır. Hasattan hemen sonra alınmış olan 38 örneğin 5 inde toksin içeriği saptanmaksızın 33 örnekte µg\kg seviyelerinde toksin bulaşıklığı belirlemişlerdir. Kabuksuz halde kurutma, kavrulma ve depolama 10

20 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR dönemlerinden alınmış olan 38 yer fıstığı örneğinin 2 sinde toksin bulaşıklığı belirlemeksizin 36 örnekte µg\kg düzeylerinde toksin içeriği saptanmışlardır. İnanç ve ark. (2005), yapmış oldukları çalışmada kırmızı pul biber örneklerini bir yıl boyunca oda ve buzdolabı sıcaklığında olmak üzere iki farklı ortamda depolamış ve aflatoksin miktarlarını incelenmişlerdir. Oda sıcaklığında, katılan bitkisel yağ oranlarına bağlı olarak aflatoksin miktarlarının depolama süresince önemli bir artış olduğu, buzdolabı sıcaklığındakilerde ise daha düşük oranlarda artığı belirlemişlerdir. Oda sıcaklığındaki depolama süresinin sonunda % 6 soya yağı katkılı örnekte en yüksek toplam aflatoksin oluştuğu belirlemişlerdir. Buna karşın % 2 çiğit yağı katkılı biber örneklerinde en düşük toplam aflatoksin miktarı tespit etmişlerdir. Buzdolabı şartlarında muhafaza edilen örneklerde depolama süresi sonunda en yüksek toplam aflatoksin oluşumu % 6 susam yağı katkılı örnekte belirlemişlerdir. En düşük toplam aflatoksin değeri % 2 ayçiçek yağı katkılı örneklerde tespit etmişlerdir. Oda sıcaklığında depolanan örneklerde depolama süresi sonunda en yüksek aflatoksin B 1 değeri % 4 soya yağı katkılı, en düşük aflatoksin B 1 değeri % 2 çiğit yağı katkılı örnekte belirlemişlerdir. Buzdolabında muhafaza edilen örneklerde en yüksek aflatoksin B 1 değeri % 6 susam yağı katkılı örnekte tespit edilmiş olup, en düşük değer % 4 fındık yağı katkılı örnekte belirlemişlerdir. Oruç (2006), yaptığı çalışmada küf üremesi ve mikotoksin oluşumunu, ürün kompozisyonu, sıcaklık, nem, havalandırmasını, insektlerin verdiği zararları ve küfün spor miktarını ve etkileşimlerine bağlı olarak gıda, yem ve yem hammaddelerinde şekillenebildiğini bildirmiştir. Sonuç olarak mikotoksinlerin öneminin ve tanı yöntemlerinin iyi bilinmesinin önemini bildirmiştir. Samapundo ve ark. (2006), çalışmalarında başlangıç headspace karbondioksit konsatrasyonu ve su aktivitesi (a w ) ile interaksiyonunun gelişim ve fumonisin B 1 üretimi, üzerine etkisi değerlendirilmiştir. Çalışılan bütün a w değerleri, başlangıç headspace de artış koloni gelişim hızında (g, mm gün-1) ve maksimum koloni çapında (Dmax, mm) azalmaya ve lag faz süresinde (λ, gün) artışa neden olduğunu bildirmişlerdir. a w ve başlangıç headspace CO 2 konsatrasyonunun her ikiside gelişme üzerine önemli ve sinergistik etki a w de en yüksek etkiyi göstermiştir. Çok az IH CO 2 konsantrasyonu (%10) F.verticillioides in fumonisin üretimini tamamıyla önlemiştir. F. proliferatum daha çok dayanıklılık göstermiş ve fumonisin üretinmini tamamıyla önlemek için 0,984, 0,951 ve 0,930 a w değerlerinde sırasıyla 40, 30 ve %10 IH CO 2 e ihtiyaç olduğunu bildirmişlerdir. Samapundo ve ark. (2007), doğal fenolik bileşiklerin (Vanillik ve kafeik asid) ve su aktivitesinin (a w ) Fusarium ve Aspergillus izolatlarının mısırda büyüme ve mikotoksin üretimleri üzerine etkisini araştırmışlardır. Genel olarak F. verticillioides ve F. proliferatum için kafeik asid ve vanilik asid konsantrasyonundaki artışın koloni gelişim hızını azalttığı, lag faz süresini arttırdığını belirtmişlerdir. Fusarium izolatlarının gelişimi en yüksek 0,97 değerindeki su aktivitesinde (a w ) tam olarak durmamıştır, gelişmenin ancak yüksek fenolik asid konsantrasyonu ( 2000 µg g -1 ) ve düşük a w değerinde ( 0,948) tam olarak durduğunu gözlemişlerdir. Denemelerinde Aspergillus türlerinin gelişimi fenolik bileşiklerler tarafından etkilenmemiştir. Fenolik bileşiklerle muamele Fumonisin B 1 ve Aflatoksin B 1 üretimini önemli düzeyde azaltmıştır. 11

21 MATERYAL VE METOT 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Bu projede test materyali olarak yılı üretim sezonunda Kahramanmaraş merkez ve ilçelerine bağlı köylere ait tarlalarda üretilip hasat edilen birinci ve ikinci ürün mısırda küf florasının ve aflatoksin risk faktörlerinin araştırılması için örnekler alınmıştır yılında toprak Mahsulleri Ofisi nin belirlemiş olduğu alım fiyatları düşük olduğundan, tüm üreticiler ürünlerini özel şirketlere satmışlardır. Bu nedenle örnekler, 2006 yılı eylül ve 2007 yılı şubat ayları arasında hasat edilip satılmak üzere kamyonlarla Kahramanmaraş Toros Tarım AŞ. ye getirilen mısırlardan temin edilmiştir. Toros Tarım A.Ş. silo ve mısır alım ünitelerinin genel görünümü aşağıdaki şekillerde verilmiştir (Şekil 3.1, Şekil 3.2 ve Şekil 3.3). Şekil 3.1. Örneklemenin yapıldığı Kahramanmaraş Toros Tarım A.Ş. yem fabrikası silosu genel görünüşü. 12

22 MATERYAL VE METOT Şekil 3.2. Örneklemenin yapıldığı Kahramanmaraş Toros Tarım A.Ş. yem fabrikası mısır alım ünitesi. Şekil 3.3. Örneklemenin yapıldığı Kahramanmaraş Toros Tarım A.Ş. yem fabrikası mısır depolama tankları. 13

23 MATERYAL VE METOT 3.2. Metot Üreticiler tarafından döneminde hasat edilip satılmak için Toros Tarım Aş. ye getirilen mısırdan, 170 cm uzunluğunda ve 2,5 cm çapında bir sonda ile kamyon kasasının 6 farklı yerinden numune alınmıştır. Alınan numuneler kamyon kasasının üzerinde plastik bir kaba boşaltılmıştır. Kamyondan indirildikten sonra kap içerisindeki mısır homojen dağılım göstermesi için iyice karıştırılmıştır. Bu karışımdan 500 gr alt örnek alınıp kese kağıdı içerisine konulmuştur. Kese kağıdı üzerine tanıtıcı bilgiler (çiftçinin adı soyadı, bağlı bulunduğu ilçesi ve köyü, mısırın nem değeri) etiketlenmiştir. I. üründen 24, II. üründen 17 olmak üzere toplam 41 adet örnek analize alınmıştır. Analiz için labaratuara getirilen örnekler analize alınıncaya kadar -20ºC de derin dondurucu da muhafaza edilmiştir I. ve II. Ürün Mısırda Tane Yüzeyindeki Fungusların Tespiti Analiz edilmek üzere laboratuara getirilen 50 adet mısır örneğinin her birinden analiz yapılmak üzere 10 gr alt örnekleme yapılmıştır. Bu örnekler içlerinde 90 ml fizyolojik tuzlu su bulunan 250 ml lik erlenler içerisine konularak tane yüzeyindeki mikroorganizma florasının ortam sıvısına geçişi sağlanmıştır. 1 litre fizyolojik tuzlu su hazırlamak için, Protein Tuz 1 gr\l 8,5 gr\l Protein ve tuz eklendikten sonra saf su eklenerek ortam 1 lt ye tamamlanmıştır. Fizyolojik tuzlu su, mısır örnekleri üzerindeki mikroorganizmaları canlı olarak seyrelterek agar ortamı üzerine kolayca aktarmak için kullanılmıştır. PDA besi ortamı: Potato Dextrose Agar (PDA) hazır ortamdan (38 gr/lt) 1500 cc karışım hazırlanmıştır. Hazırlanan karışım 121 C de 1 atm. basınçta 15dk otoklav edilmiştir cc lik ortama %10 luk 15 cc laktik asit (%10 luk hazırlanan laktik asit otoklavda 121ºC de 15 dk da sterilize edilmiştir) eklenmiştir. Steril kabinde Temiz (1996) ya göre petrilere fungus besi ortamı dökülerek hazırlanmıştır. Saf su ile 1lt FTS çözeltisi hazırlanmıştır, her örnek için 1 adet 250 cc lik beher ve 5 adet tüp içerisine (beherlere 90 cc, tüplere 9cc) fizyolojik tuzlu su aktarıldıktan sonra ağızları pamuk ve alüminyum folyo ile sarılarak 121 C de 1 atm. Basınç altında 15 dk. otoklavda sterilize edilmiştir (Şekil 3.4). Alınan mısır örnekleri 10 gram olacak şekilde 250 lik beher içindeki FTS içerisinde tartılmıştır. Erlenler çalkalanarak tohum yüzeyindeki küf sporlarının fizyolojik tuzlu su içerisine geçmesi sağlanmıştır. Her örneği seyreltmek için 5 adet 9 cc lik tüp kullanılmıştır (Gürgün ve Halkman, 1990). 250 cc lik erlen içerisine konulan 90 ml fizyolojik tuzlu suya 10 ar gram tartılan mısır örnekleri atıldıktan sonra çalkalayıcıda karıştırılmıştır, pipetle 1ml karışım alınmış ve tüpteki 9 ml fizyolojik tuzlu suya ilave edilmiştir. Bu şekilde

24 MATERYAL VE METOT ve 10-6 ya kadar hedeflenen seyreltme yapılmıştır. Potato Dextrose Agar (PDA) ortamına steril kabinde petrilere dökülmeden önce kullanılan tüm cam malzeme etüvde 180 C de 2 saat steril edildikten sonra kullanılmıştır. Son olarak Temiz (1996) ya göre steril kabinde ortam üzerine yayma ekim yapılmıştır. Şekil 3.4. Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi, Bitki Koruma Bölümü laboratuarında kullanılan etüv ve otoklav. Küf sayımları, izolasyonu ve tanımlamasında Potato Dextrose Agar (PDA) besi yeri kullanılmıştır. Besi ortamı üzerinde gelişen küf kolonilerin teşhis ve tanımlanması Samson ve Hoekstra (1988) ya göre yapılmıştır. Uygun seyreltimler hazırlandıktan sonra, yayma ekim yöntemiyle ekim yapılan, petriler hava almayacak şekilde parafilimle sıkıca kapatılmıştır. 25 C de 7 10 gün inkübasyona bırakılıp sayıma alınmıştır (Aran ve ark., 1994; Temiz, 1996). Daha sonrada küflerin teşhisi gerçekleştirilmiştir. 7 gün sonunda koloni gelişimi beklenmiş ve koloniler spor oluşturarak renklenmişlerdir. Kolonilerin 10-4 ve 10-6 da ki fungus yüzey sayısı belirlenmiştir (Samson ve ark., 1988) I. ve II. Ürün Mısırda Hasat Sonrası Aflatoksin Miktarının Saptanması Aflatoksin miktarının saptanması 3 aşamada gerçekleşmektedir (Anonim, 2006b). 1. Ekstraksiyon işlemi 2. İmmüno affinite kolonları (IAC) ile temizleme aşaması 3. HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromotoğrafi sistemi) ayırma ve miktar tayini. 15

25 MATERYAL VE METOT Alınan örnekler kese kağıdından çıkarılıp yine ayrı ayrı öğütülmüştür. Öğütülme esnasında her örnekten sonra makine açılıp iyice temizlenmiştir Ekstraksiyon İşlemi Öğütülmüş mısır örneklerinden 25 gram alınıp blender içerisine boşaltılmıştır. Buna ilaveten üzerine 5 gr NaCI, 125 ml ekstraksiyon solventi (% 70 metanol, % 30 su ilave edilmiştir. En yüksek hızda 2 dk iyice karıştırıldıktan sonra çift kat flitre kağıdı konulan 50 cc lik erlen içerisine dökülmüştür. Süzülen karışımdan 15 ml başka bir behere alınıp üzerine 30 cc saf su eklenmiştir. İyice karıştırıldıktan sonra şırınga ucuna IAC takılarak 15 cc süzülmüştür İmmüno Affinite Kolonları (IAC) İle Temizleme Aşaması IAC şırınga ucuna takılmış cam filtre kağıdı 15 cc olarak süzülmüş süzüntü 1-2 damla saniye arasında Alfatest P kolonundan geçirilmiştir. Kolondan yaklaşık 2 damla\saniye sabit hızla 2 defa 10 ml saf su geçirilerek kolon yıkanıp aflatoksinin şırınga ucuna takılan Alfatest P kolonun ucundaki kısma geçmesi sağlanır. Daha sonra şırıngayla birlikte kolon test için gönderilecek kapanabilir tüp üzerine konularak üzerine 1 ml metanol eklenmiştir. Metanol kolonun ucunda biriken aflatoksinin süzünlüp tüpe geçmesi sağlamaktadır HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromotoğrafi Sistemi) Ayırma ve Miktar Tayini HPLC kolonlarından ağzı kapanabilir cam tüplere süzülen solüsyon ağzı iyice kapatıldıktan sonra içi buz dolu dondurma kaplarında aflatoksin tayini için Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı Gaziantep İl Kontrol Laboratuarı na gönderilmiştir. 16

26 BULGULAR VE TARTIŞMA 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. I. ve II. Ürün Mısırda Tane Yüzeyindeki Fungusların Tespiti I.ve II. ürün mısırda hasat sonrası küf florasını saptamak için yapılan bu çalışmada, Kahramanmaraş merkez ve ilçe köylerden gelen toplam 50 adet mısır örneği testlenmiştir. Bu çalışmada örnekler yoğun olarak merkez ve Türkoğlu ilçesine bağlı köylerden gelmiştir. Yapılan analizler sonucu veriler çizelge haline getirilmiştir (Çizelge 4.1). Çizelge 4.1. I. Ürün mısır örneklerinin kaynağı, hasat tarihleri, nem oranları ve koloni oluşturan birim sayıları. No İlçe Köy Hasat Tarihi Nem (%) Sulandırma katsayısı Koloni oluşturan birim(kob/g) 1 Türkoğlu Göllühöyük Türkoğlu Bilehöyük Türkoğlu Dedeler Türkoğlu Göllühöyük Pazarcık Evri Kasabası Pazarcık Merkez Pazarcık Bölükçam Elbistan Merkez Türkoğlu Tahtadedeler Türkoğlu Şekeroba Pazarcık Osmandede Türkoğlu Cumhuriyet Pazarcık Evri Kasabası Merkez Şerefoğlu Türkoğlu Göllühöyük Merkez Abbaslar Türkoğlu Şekeroba Pazarcık Ördekdede Pazarcık Kerpiçler Pazarcık Karahöyük Pazarcık Akdemir Türkoğlu Merkez Türkoğlu Hacıbebek Türkoğlu Hacıbebek Türkoğlu Merkez

27 BULGULAR VE TARTIŞMA I.Ürün mısır örneklerine yapılan analizde 13 adet Türkoğlu, 9 adet Pazarcık, 2 adet Merkez, 1 adet Elbistan ilçelerinden gelen örnekler testlenmiştir. En düşük nem seviyesine (%12) Elbistan merkez ve Pazarcık Karahöyük den gelen numunelerde rastlanmıştır. En yüksek nem seviyesine (%19) ise Pazarcık Ördekdede köyünden gelen numunelerde rastlanmıştır (Çizelge 4.1). I.ürün mısırın nem oranıyla küf sayıları karşılaştırıldığında nemle küf sayısı oluşumu arasında bir ilişki kurulamamıştır. Küf oluşumunun sadece nem içeriğiyle ilişkilendirilmesi doğru değildir. Küf oluşumunu nem içeriğinin yanında diğer çevresel faktörlerde etkilemekte ve çevresel faktörlerin dışında hasat, harman ve taşınma sırasında kullanılan alet ve ekipmanlarının temizliğide etkilemektedir. Biçilen ilk mısır tarlasındaki küf sporları makine içine yapışıp daha sonraki biçimlerde diğer ürünlere bulaşmaktadır. Hasat edilen mısır ve diğer ürünler toprakta eski yöntemlerle kurumaya bırakıldılarında toprak kökenli funguslarla infeksiyon riski artmaktadır. Özellikle hasat sırasında dane yüzeyi deforme olan ürünlerin fungus sporuyla infekte olma riskleri artmakta ve nemin dışında hasat şeklide fungal etmenlerin oluşumunu etkilemektedir. Çizelge 4.2. I. Ürün Mısırdaki Funguslar ve Koloni Sayıları (kob/g) Aspergillus Penicillium Fusarium Rhizopus No a B a b a b a b a b a b a b a b

28 BULGULAR VE TARTIŞMA Çizelge 4.1 ve Çizelge 4.2 de görüldüğü gibi I. ürün mısırda 10-4 ve 10-6 seyreltme değerlerine bakıldığında 10-4 ve 10-6 da en fazla Aspergillus türlerine, en az Rhizopus türlerine raslanmıştır. Aspergillus, Penicillium ve Fusarium sıklıkla görülmekle birlikte Rhizopus türlerine sadece 3 örnekte rastlanmıştır. Aspergillus türlerine 3. ve 12. numunelerde, Penicillium türlerine 10. ve 11. numunelerde, Fusarium türlerine 4., 5. ve 18. numunelerde yoğun olarak rastlanmıştır. Rhizopus türlerine ise sadece 3, 15 ve 20 inci numunelerde rastlanmıştır. Şekil 4.1. I. Ürün Mısırda Fungusların Koloni Oluşturma Sayısı (a= 10-4, b=10-6 seyreltme değerlerinde saptanan fungusların koloni oluşturma sayıları). Çizelge 4.1 ve Şekil 4.1 de de görüldüğü gibi en yüksek koloni sayısına 10-4 seyreltilerek alınan örneklerde rastlanmıştır. Buda o numunelerin daha az seyreltilmesinden dolayı içerisindeki fungal hastalık etmenlerinin daha yoğun olmasındandır. En fazla koloniye 7, 9 ve 18. örneklerde rastlanmıştır. En düşük koloniye ise 8. örnekte rastalanmıştır. 7. numunede Aspergillus ve Fusarium cinslerine, 9. numunede Aspergillus, Penicillium cinslerine, 18. numunede ise Penicillium ve Fusarium cinslerine ve 8. numunede Aspergillus cinslerine sıklıkla rastlanmıştır seyreltilerek alınan örneklerde ise en fazla koloniye 5 numaralı numunede ve 13 numaralı numunede rastlanmıştır. 5 numaralı örnekte Penicillium, Fusarium cinslerine, 6 numaralı numunede Aspergillus cinslerine, 8 numaralı numunede Aspergillus, Fusarium ve 13 numaralı numunede Aspergillus cinsi küflere sıklıkla rastlanmıştır. 19