ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAZI TURUNÇGİL ANAÇLARINDA EKSPLANT KAYNAĞI VE BÜYÜME DÜZENLEYİCİLERİN EMBRİYOGENİK KALLUS ELDESİ ÜZERİNE ETKİLERİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAZI TURUNÇGİL ANAÇLARINDA EKSPLANT KAYNAĞI VE BÜYÜME DÜZENLEYİCİLERİN EMBRİYOGENİK KALLUS ELDESİ ÜZERİNE ETKİLERİ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Bu Tez / /2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir Doç.Dr.Yıldız AKA-KAÇAR Doç.Dr.Yeşim YALÇIN MENDİ Prof.Dr. Selim ÇETİNER DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu Tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF2009YL23 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAZI TURUNÇGİL ANAÇLARINDA EKSPLANT KAYNAĞI VE BÜYÜME DÜZENLEYİCİLERİN EMBRİYOGENİK KALLUS ELDESİ ÜZERİNE ETKİLERİ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Danışman : Doç.Dr. Yıldız AKA-KAÇAR Yıl: 2010, Sayfa: 89 Jüri : Doç.Dr. Yıldız AKA-KAÇAR : Prof.Dr. Selim ÇETİNER : Doç.Dr. Yeşim YALÇIN-MENDİ Bu çalışmada on bir turunçgil anacının in vitro koşullarda geliştirilen bitkilerinin kök segmentleri, kotiledon, epikotil, yaprak ve embriyo eksplantları kullanılarak embriyogenik kallus (EK) eldesi hedeflenmiştir. Eksplantlar farklı besi ortamlarında kültüre alınmıştır. Çalışma sonucunda, embriyo eksplantlarından elde edilen kalluslardan en yüksek embryogenik kallus oluşum oranı 2,4-D (2 mg/l)+bap (0.5 mg/l) içeren besi ortamında Troyer sitranjı (Citrus sinensis (l) Osb. X Poncirus trifoliata (L) Raf) anacında %80 EK oluşumu gözlenmiştir. Epikotil, yaprak ve kotiledon kültürlerinin her üçünde de en iyi besi ortamı 2,4-D (2 mg/l)+kin (0.5 mg/l)+naa (2 mg/l) içeren denemede EK oluşumu gözlenmiştir. Epikotil eksplantı denemesinde, en iyi EK oluşumu Rubidoux (Poncirus trifoliata (L) Raf.) üç yapraklı genotipinde görülürken, yaprak eksplantında Severinia buxifolia genotipi en iyi EK olarak bulunmuştur. Kotiledon eksplantı denemesinde de en iyi EK oluşumu Troyer sitranjı genotipinde rastlanmıştır. Kök eksplantı denemesinde en yüksek EK Gou Tou turuncu (Citrus aurantium L.) genotipinde görülmüştür. En iyi besi ortamı ise 2,4-D (2 mg/l) + KİN (0.5 mg/l) olmuştur. Anahtar Kelimeler: Turunçgil, İn vitro, Embriyogenik kallus, Anaç ıslahı I

4 ABSTRACT MSc THESIS THE EFFECT OF EXPLANT SOURCE AND PLANT GROWTH REGULATORS TO OBTAINE OF EMBRYOGENIC CALLUS ON SOME CITRUS ROOTSTOCKS ÇUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF HORTICULTURE Supervisor : Assoc. Prof. Yıldız AKA-KAÇAR Year: 2010, Pages: 89 Jury : Assoc. Prof. Yıldız AKA-KAÇAR : Assoc. Prof Selim ÇETİNER : Assoc. Prof. Yeşim YALÇIN-MENDİ In this research, eleven citrus rootstocks were cultured to obtain embryogenic callus (EC) from root, cotyledon, epicotyls and leaf segments of in vitro plantlets and embryo culture of seeds. Explants were cultured in different plant growth media. The results showed that the highest EC obtained from embryo culture of Troyer rootstock in the plant medium including 2,4-D (2 mg/l)+bap (0.5 mg/l) with 80 %. In the all epicotyls, leaf and cotyledon culture, the best plant media in the formation of EC was 2,4-D (2 mg/l)+kin (0.5 mg/l)+naa (2 mg/l). In the experiment of epicotyls explants, the best formation of EC was observed in Rubidoux (Poncirus trifoliata (L) Raf.), where as the best genotype for EC production was Severinia buxifolia in leaf explant. By using cotyledons explant, Troyer citrange also showed the best EC formation. In the experiment of root explants, the highest EC production was obtained from Gou Tou sour orange (Citrus aurantium L.). The best plant medium was 2,4- D (2 mg/l) + KİN (0.5 mg/l). Key Words: Citrus, In vitro, Embryogenic callus, Rootstock breeding II

5 TEŞEKKÜR Yüksek lisans tez konumun belirlenmesi, yürütülmesi ve yazım aşamasında yönlendirici katkılarıyla desteğini bulduğum danışman hocam Sayın Doç. Dr. Yıldız AKA-KAÇAR sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Denemede kullanılacak olan materyallerin belirlenmesinde ve temininde yardımlarını esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Turgut YEŞİLOĞLU, Yrd. Doç. Dr.Bilge YILDIRIM ve Arş. Gör. Meral İNCESU hocalarıma teşekkürlerimi borç bilirim. Tezimin yürütülmesi aşamasında bilgi ve deneyimlerini benden esirgemeyen hocam Yeşim YALÇIN-MENDİ ye şükranlarımı sunarım. Tezim süresince bana destek veren arkadaşlarım Ar. Gör. Özhan ŞİMŞEK Yüksek Ziraat Müh. Belgin BİÇEN e, Melda BONCUK, Aygül TURUNÇ a ve Fatma ASLAN a teşekkür ederim. Yüksek Lisans Tezimin istatistik analizlerinin yapılmasında ve tezimin yazımında engin bilgi ve deneyimini paylaşan Sayın Yrd. Doç. Dr. Mustafa BOĞA a şükranlarımı sunarım. Yaşamım boyunca bana göstermiş oldukları maddi-manevi fedakârlıklardan dolayı sevgili aileme, sabrından dolayı eşime ve son olarak hayatımın en güzel varlığı olan Oğlum Oğul Can a yürekten teşekkür ediyorum. Yüksek Lisans Tez çalışmaları esnasında tüm bölüm olanaklarından yararlanmamı sağlayan Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bölüm Başkanlığı na, maddi destek veren Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi ne (Proje no: ZF2009YL23) içten teşekkürlerimi sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ...I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VI ŞEKİLLER DİZİNİ... VIII SİMGELER VE KISALTMALAR...XII 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOD Materyal Bitkisel Materyal Metod Doku Kültürü Çalışmaları Tohum Örneklerinin Alınması Kültüre Alınacak Bitki Parçacığının Sterilizasyonu ve Kültür Ortamlarının Hazırlanması Yaprak Eksplantlarının Kültüre Alınması Epikotil Eksplantlarının Kültüre Alınması Kotiledon Eksplantlarının Kültüre Alınması Kök Eksplantlarının Kültüre Alınması Embriyo Eksplantlarının Kültüre Alınması Elde Edilen Kalluslardan Embriyogenik Kallus ve Somatik Embriyo Elde Edilmesi Çalışmada Yapılan Sayım ve Gözlemler BULGULAR VE TARTIŞMA Embriyo Kültürü Deneme Sonuçları Embriyo Eksplantlarında Canlılık Oranlarının Saptanması Embriyo Eksplantlarında Kallus Oluşum Oranlarının Saptanması Embriyo Eksplantlarından Elde Edilen Embriyogenik Kallus Oluşum Oranlarının Saptanması Embriyo Eksplantlarından Elde Edilen Embriyogenik Kallusların Ağırlık Ortalamaların Saptanması Kök Eksplantı Kültürü Deneme Sonuçları Kök Eksplantlarında Canlılık Oranlarının Saptanması Kök Eksplantlarından Kallus Oluşum Oranlarının Saptanması Kök Eksplantlarından Elde Edilen Embriyogenik Kallus Oluşum Oranlarının Saptanması Kök Eksplantlarından Elde Edilen Embriyogenik Kallus Ağırlık Ortalamalarının Saptanması IV

7 4.3. Yaprak, Epikotil ve Kotiledon Eksplantı Deneme Sonuçları Yaprak, Epikotil ve Kotiledon Eksplantlarında Canlılık Oranlarının Saptanması Yaprak, Epikotil ve Kotiledon Eksplantlarından Kallus Oluşturma Oranlarının Saptanması Yaprak, Epikotil ve Kotiledon Eksplantlarından Embriyogenik Kallus Oluşturma Oranlarının Saptanması Yaprak, Epikotil Eksplantlarından Elde Edilen Embriyogenik Kallusların Ağırlık Ortalamaların Saptanması Epikotil Eksplantlarında Elde Edilen Embriyogenik Kallusların Ağırlık Ortalamaların Saptanması Yaprak Eksplantlarından Elde Edilen Embriyogenik Kallusların Ağırlık Ortalamaların Saptanması Kotiledon Eksplantlarından Elde Edilen Embriyogenik Kallusların Ağırlık Ortalamaların Saptanması SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge Denemede Kullanılan Bitkisel Materyal...20 Çizelge 3.2. Çalışmada yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarından kallus oluşumu için 1. deneme de kullanılan ortam içerikleri..24 Çizelge 3.3. Çalışmada yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarından kallus oluşumu için 2. denemede kullanılan ortam içerikleri..25 Çizelge 3.4. Çalışmada yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarından kallus oluşumu için 3. deneme de kullanılan ortam içerikleri.25 Çizelge 3.5. Çalışmada kök eksplantından kallus oluşumu için 1. deneme de kullanılan ortam içerikleri..26 Çizelge 3.6. Çalışmada embriyo eksplantından kallus oluşumu için kullanılan ortam içerikleri...26 Çizelge 3.7. Çalışmada kullanılan, MS ortamı makro ve mikro elementleri ve miktarları Çizelge 3.8. Çalışmada kullanılan, MS vitaminden modifiye edilmiş MT vitamin içeriği 32 Çizelge 4.1. Embriyo kültürlerinin canlılık yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları...34 Çizelge 4.2. Embriyo kültürlerinin kallus yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları..37 Çizelge 4.3 Embriyo kültürlerinin EK oluşum yüzdelerine ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları.41 Çizelge 4.4. Embriyo eksplantlarından elde edilen embriyogenik kallus ağırlıklarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları 46 Çizelge 4.5. Kök kültürlerinin canlılık oranlarına ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları.49 Çizelge 4.6. Kök kültürlerinin kallus oluşumlarına ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları..52 VI

9 Çizelge 4.7. Kök kültürlerinin EK oluşumlarına ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları...56 Çizelge 4.8. Kök eksplantlarından elde edilen embriyogenik kallus ağırlıklarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları 60 Çizelge 4.9. Yaprak, Epikotil ve Kotiledon eksplantlarının canlılık oranlarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmalar Çizelge Yaprak, Epikotil ve Kotiledon eksplantlarının kallus oluşum oranlarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları. 67 Çizelge Yaprak, Epikotil ve Kotiledon eksplantlarının EK oluşum oranlarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları 70 Çizelge Epikotil eksplantlarından elde edilen embriyogenik kallus ağırlıklarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları.. 74 Çizelge Yaprak eksplantlarından elde edilen EK ağırlıklarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları...76 Çizelge Kotiledon eksplantlarından elde edilen EK ağırlıklarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları.77 VII

10 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Denemede kullanılan tohumların meyvelerden izole edilmesi..21 Şekil 3.2. Tohumların Sterilizasyon Aşamaları...22 Şekil 3.3. Yaprak, epikotil, kök ve kotiledon eksplantları için bitki elde edilmesi...23 Şekil 3.4. Bitkiciklerin gelişim aşamaları Şekil 3.5. Yaprak eksplantından kesim yapılması ve besin ortamına aktarılması.. 28 Şekil 3.6. Epikotil eksplantından kesim yapılması ve besin ortamına aktarılması..29 Şekil 3.7. Kotiledon eksplantından kesim yapılması ve besin ortamına aktarılması...30 Şekil 3.8. Kök eksplantından kesim yapılması ve besin ortamına aktarılması 31 Şekil 4.1. Embriyo kültürlerinin canlılık yüzdelerine ait ortalamalar, standart sapma değerlerinin grafikleri...35 Şekil 4.2. Embriyo kültürlerinin kallus yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları Şekil4.3. Embriyo eksplantından elde edilen kallusların görüntüleri 39 Şekil 4.4. Denemedeki embriyo kültürlerinin EK oluşumlarına ait ortalama grafikleri...42 Şekil 4.5. Embriyo eksplantlarından elde edilen EK görüntüleri..44 Şekil 4.6. Embriyo esplantlerinden elde edilen EK ların ağırlıklarına ait ortalama grafikleri.47 VIII

11 Şekil 4.7 Kök kültürlerinin canlılık oranlarına ait ortalama, standart sapma ve ortalama grafikleri...50 Şekil 4.8. Kök kültürlerinin kallus oluşumlarına ait ortalama, standart sapma ve ortalama grafikleri Şekil 4.9. Kök eksplantlarından elde edilen kallusların görüntüleri Şekil Kök kültürlerinin EK oluşumlarına ait ortalama, standart sapma ve ortalama grafikleri Şekil Kök eksplantlarından elde edilen EK görüntüleri...58 Şekil Kök eksplantlarından elde edilen EK ağırlıklarına ait ortalama grafikleri..59 Şekil Yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarının canlılık oranlarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları...63 Şekil Yaprak eksplantlarından elde edilen kallusların görüntüleri...64 Şekil Epikotil eksplantlarından elde edilen kallus görüntüleri.65 Şekil Kotiledon eksplantlarından elde edilen kallusların görüntüleri 65 Şekil Yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarının kallus oluşum oranlarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırma grafikleri.. 68 Şekil Yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarının EK oluşum oranlarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama grafikleri.71 Şekil Yaprak eksplantlarından elde edilen EK görüntüleri...72 Şekil Epikotil eksplantlarından elde edilen EK görüntüleri..72 Şekil Kotiledon eksplantlarından elde edilen EK görüntüleri..73 IX

12 Şekil Epikotil eksplantlarından elde edilen EK ağırlıklarına ait ortalama grafikleri...74 Şekil Yaprak eksplantlarından elde edilen EK ağırlıklarına ait ortalama grafikleri...76 Şekil Kotiledon eksplantlarından elde edilen EK ağırlıklarına ait ortalama grafikleri...78 X

13 XI

14 SİMGELER VE KISALTMALAR 2.4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 4-CPA (4 -chlorop henoxyacetic acid) BAP : Benzylamino Purine IBA: İndol-3-büttürik asit NAA : Naphthalene acetic acid KİN: Kinetin GA3 : Giberillic Acid 2IP : İzopentil adenin ME : Malt Extract MS : Murashige & Skoog MT : Murashige & Tucker PCR: Polymerase Chain Reaction (Polimeraz zincir reaksiyonu) RAPD: Randomly Amplified Polymorfic DNA PEG: Polyethyleneglycol ETOH : ethanol EK : Embriyogenik kallus Atm : Atmosfer ºC : Santigrad derece dk : Dakika g : Gram l : Litre mg : Miligram mg/l : Miligram/Litre ml : Mililitre μg : Mikrogram M: Molar μm : Mikromol XII

15 XIII

16 1.GİRİŞ 1. GİRİŞ Turunçgiller dünyada yetiştiriciliği yapılan en önemli meyve gruplarından biridir. Turunçgillerin ekonomik olarak üretimi yapılan türleri portakal, mandarin, limon ve altıntoptur. Turunç ise acı tadından dolayı taze olarak değil, reçel, marmelat yapımında ve özellikle turunçgil yetiştiriciliğinde anaç olarak kullanılmaktadır. Zengin bir C vitamini içeriğine sahip olan turunçgiller insan sağlığı için son derece önemlidir. Taze olarak tüketimlerinin yanında meyve suyu olarak da tüketilirler. Ayrıca eczacılık ve parfüm sanayinde de aromalarından faydalanılmaktadır. Gelişmiş ülkelerde işlenmiş turunçgil ürünlerinin tüketimi taze tüketimden daha büyük bir artış göstermektedir. Gelişmiş ülkelerde modern işleme tesislerinin bulunması ve işlenmiş ürünlerin nakliye ve depolama koşullarına uygunluğu bu ürünlerin tüketimini artırmaktadır (Anonim, 2008a). Dünyada turunçgil üretimi 35 Kuzey ve Güney paraleller arasındaki bölgeler de yapılmaktadır. Kuzey Yarıküre de, Kuzey ve Orta Amerika ile Akdeniz ülkeleri, Güney Yarıküre de ise Güney Amerika, Güney Afrika ve Okyanusya da ekonomik olarak üretilmektedir (Karahocagil, 2003). Dünyadaki en büyük turunçgil üreticisi ülkeler; Brezilya, ABD ve Çin dir. Brezilya 20,3 milyon ton üretimle birinci sırada, 18,4 milyon tonluk üretimle Çin ikinci, 11,5 milyon tonluk üretimle ABD ise üçüncü sırada yer alırken, Türkiye tonla dünya turunçgil üretiminde 9. sırada yer almaktadır (Anonim, 2008a). Türkiye de toplam turunçgil üretiminin % 91 i Akdeniz, % 8,5 i Ege, % 0,5 i ise Doğu Karadeniz bölgelerinden elde edilmektedir (Yeşiloğlu, 2007). Dünya turunçgil üretimi, yaklaşık 115 milyon ton olup bunun % 60 ını portakal, % 22 sini mandarin, % 13 ünü limon ve % 5 ini altıntop oluşturmaktadır. Değişen tüketici tercihleri nedeniyle, son on yılda, portakal üretimindeki artış % 2,2 de kalırken, limon üretimi % 47, mandarin üretimi % 33 artmış, altıntop üretimi ise % 9 azalmıştır. Turunçgil üretimindeki toplam artış ise % 11 olmuştur (Anonim, 2008b). Turunçgil yetiştiriciliğini sınırlayan en önemli faktör düşük sıcaklıklardır. Türlerin düşük sıcaklıklara dayanıklılıkları farklılık gösterir. İkinci önemli iklim 1

17 1.GİRİŞ olayı rüzgârdır. Rüzgâr gerek şiddeti gerekse de soğukluğu ile narenciye ürünlerine zarar verir (Akgün, 2006). Turunçgiller renk ve koku özellikleri yönünden insanların çok hoşuna gitmektedir. Tüm kozmetik sanayisinde turunçgil esansı mutlaka yer alır. Lezzet bakımından çok dengeli, ferahlatıcı ve aromatik meyvelerdir. Çeşit zenginliği vardır. Çeşitlerin olgunlaşma zamanları da büyük bir varyasyon gösterir. Eylül den Temmuz a kadar değişik turunçgil meyveleri görülebilir. Turunçgiller ağaç üzerinde uzun süre kalabilirler. Ağaç üzerinde muhafazası daha fazladır. Bu nedenle pazara taze sunum uzun süre yapılabilmektedir. Bunun yanında depoda muhafazaya da çok elverişlidirler. C vitamini içerikleri fazladır. Üç portakal günlük C vitamini ihtiyacını karşılar. C vitamini depolanmadığı için günlük olarak alınmalıdır. Mineral maddeler bakımından oldukça zengindir (Ca, P, Mg, Fe). Sanayide önemli bir hammaddedir. İşlenmiş şekilde konserve edilip tüketime gidebilir (Yeşiloğlu, 2007). Turunçgillerin anavatanı esas olarak Güneydoğu Asya bölgesidir. Ancak I. ve II. derecede anavatanları olmak üzere 2 kısma ayrılmaktadır (Yeşiloğlu, 2007). I.Derecede Anavatanı olarak kabul edilen yerler; Çin in güney kıyıları ve Sarı Irmak Vadisi nin iç kısımları, Tayland, Vietnam, Kamboçya ve Malezya II. Derecede Anavatanı olarak kabul edilen yerler; Himalayalar ın güney etekleri, Hindistan Dünya da ve Türkiye'de büyük öneme sahip turunçgiller genellikle tohum, çelik ve öteki vegetatif yöntemlerle kolaylıkla çoğaltılabilirse de, özellikle hastalıklardan korunma, iklim ve toprak koşullarına uyum sağlayabilme, verim ve kaliteyi arttırma, bitki büyümesini kontrol edebilme gibi nedenlerden dolayı anaç kullanma zorunluluğu ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, turunçgillerde çekirdeksiz çeşitlerin tohumla çoğaltılmalarının olanaksızlığı, çeşit muhafazasında mutasyon eğilimleri, monoembriyonik çeşitlerin çok heterojen bir genetik yapıya sahip 2

18 1.GİRİŞ olmaları sonucu açılımların meydana gelmesi, anaç kullanımını gerektiren diğer etmenlerdir (Biçen, 2008). Türkiye de yer alan her bölgenin sahip olduğu farklı iklim, toprak ve yetiştiricilik koşulları, o bölgede kullanılacak çeşit ve çeşidin anaç ile uyumu, kullanılacak anacı belirlemede en önemli kriterlerdir. Bu kriterler göz önünde bulundurulduğunda bölgeye uyum sağlayan bir anacın kalem ile iyi uyuşması ve anacın özellikle verim ve meyve özellikleri bakımından çeşit üzerine olumlu etki yapması gerekmektedir. Anacın çeşit ile uyuşmazlık göstermesi, anacın bölgeye uygun olmaması yeni anaç geliştirme arayışı içerisine girmemize neden olmaktadır (Biçen, 2008). Dünyada kullanılan bazı turunçgil anaçları arasında, Amerika ve Arjantin de üç yapraklı ve melezleri, Florida ve Brezilya da Citrus jamphiri ve Citrus limonia, Güney Afrika da ise Kleopatra mandarini ve melezleri yer almaktadır. Ülkemizde ise, turunçgil meyveleri üretiminin büyük bir bölümünün sağlandığı Akdeniz Bölgesinde en yaygın anaç turunçtur. Kuzeydoğu Ege ve Doğu Karadeniz bölgelerinde ise üç yapraklı kullanılan tek anaç durumundadır. Geçit Ege bölgesi yani Büyük Menderes vadisinde ise turunç ve üç yapraklı karışık olarak kullanılmaktadır. Son yıllarda Ege ve Akdeniz Bölgesinde Carrizo sitranjının portakal, mandarin ve altıntop türlerine anaç olarak kullanımı hızlı bir artış göstermiştir (Tuzcu ve ark., 2001). Turunçgillerin dünyada katdettikleri hızlı gelişmede klasik yöntemlerde karşılaşılan sorunların çözümünde kullanılan in vitro bitki doku kültürü teknikleri ve moleküler çalışmalar büyük rol oynamaktadır. Turunçgil ıslah çalışmaları ve genetik kaynakların muhafazasında in vitro doku kültürü teknikleri hızlı bir şekilde gelişmektedir. Modern ıslah ve muhafaza yöntemleri içerisinde; sürgün ucu kültürü, embriyogenik kallus eldesi, somatik embriyogenesis, somatik hibridizasyon, gen aktarma çalışmaları yer almaktadır (Biçen, 2008). Bitki ıslahında yoğun bir şekilde kullanılan biyoteknolojik yöntemlerden birisi de somatik embriyogenesisdir. Vejetatif hücrelerden gelişen embriyolar somatik embriyo olarak adlandırılmaktadır. Somatik embriyolar, kültüre alınan eksplantın somatik hücrelerinden gelişirler ve eksplantın alındığı bitkinin genotipini 3

19 1.GİRİŞ muhafaza ettirdiklerinden dolayı klon oluştururlar. Somatik embriyogenesisin en önemli kullanım alanları; somatik hibridizasyon, partikül tabancası ve Agrobacterium tumefaciens aracılığı ile bitkilere gen aktarımıdır. Somatik embriyogenesis hızlı çoğaltımda, sentetik tohum üretiminde ve gen aktarımında önemli bir potansiyele sahiptir. Ancak, eksplant kaynağı, genotip, bitki büyüme düzenleyicileri, azot kaynağı ve çevre şartları gibi etmenler somatik embriyogenesisi önemli ölçüde etkileyen faktörlerdir (Özcan ve ark., 2001). Yüksek oranda başarı için eksplantın hızlı hücre bölünmesine sahip iyi gelişen ve sağlıklı bitkilerden alınması gerekmektedir. Eksplant uygun gelişme fizyolojisindeki bitkilerden alındığı takdirde birçok bitki kısmı somatik embriyogenesis için kullanılabilmektedir. Ancak genç doku ve organlar genellikle yaşlı doku ve organlardan daha başarılı olmaktadır. Odunsu bitkileri ve buğdaygilleri de içine alan birçok bitki türünde somatik embriyogenesis için en uygun eksplantın olgunlaşmamış zigotik embriyoların olduğu belirlenmiştir. Baklagillerde ise olgunlaşmamış kotiledonlardan yüksek oranlarda somatik embriyo oluşumu gözlenebilmektedir (Özcan ve ark., 2001). Somatik embriyo oluşturma frekansı bakımından türler arasında önemli farklılıklar gözlendiği gibi, aynı tür içerisindeki farklı genotip ve çeşitlerin dahi embriyo oluşturma kabiliyetleri farklı olmaktadır (Özcan ve ark., 2001). Besin ortamına ilave edilen büyüme düzenleyicilerden oksinler, somatik embriyo oluşumunu en fazla etkileyen bileşiktir. Eksplantın önce kısa bir süre oksin içeren ortamda kültüre alınması daha sonra da oksin içermeyen ortama aktarılmasıyla birçok bitki türünde yüksek oranlarda somatik embriyo gelişimi teşvik edilmiştir. Tam bir embriyo olgunlaşması ve bitki gelişimi için içsel hormon seviyesine bağlı olarak çok düşük oranlarda sitokinin gerekli olmaktadır. Murashige ve Skoog (1962) tarafından geliştirilen MS temel besin ortamı somatik embriyogenesis çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Yüksek oranda indirgen N formu somatik embriyo oluşumunu ve gelişmesini teşvik etmektedir. Sakkaroz embriyogenesisi hızlandırmaktadır. Ancak sakkaroz oksin sentezini engelleyici etki yaptığından dolayı embriyo teşvik aşamasında düşük oranlarda (% 10-20) sakaroz kullanılmalı, embriyo olgunlaştırma aşamasında ise yüksek oranlarda (% 50-60) sakkaroz 4

20 1.GİRİŞ kullanılmalıdır. Işık kaynağı, yoğunluğu ve süresi ile sıcaklık somatik embriyo oluşumunda önemli rol oynamaktadır. Kültüre alınan eksplantlardan hızlı bölünen embriyogenik hücreleri elde etmek için öncelikle yüksek konsantrasyonlarda oksine (genellikle 2,4-D) ihtiyaç duyulmaktadır. Embriyogenik hücreler oldukça küçük olmakla birlikte, yoğun sitoplazma içeriğine, büyük çekirdek ve küçük vakuollere sahiptirler. Oksin içeren besin ortamlarında embriyo oluşumu teşvik edildikten sonra kültürler oksin içermeyen ortamlara aktarılmalıdır. Bu safhada ortama oksin ilave edilmesi embriyo gelişimini engellemektedir (Özcan ve ark., 2001). Somatik embriyogenesis direk olacağı gibi, embriyogenik kalluslardan da (indirek somatik embriyo oluşumu) elde edilebilir. Direkt somatik embriyogenesiste; embriyo kallus oluşumu olmadan direkt olarak somatik bir hücreden oluşur. Bu tip embriyogenesis için çok genç bitki doku ve hücreleri kullanılır. İndirekt somatik embriyogenesiste ise önce kallus oluşur. Daha sonra bu kallustan somatik embriyolar oluşur. Somatik embriyo oluşturan kallusa embriyogenik kallus adı verilir. Embriyogenik kallus; kompakt yapıda ve beyazdan açık sarı renge kadar değişen renklerdedir (Hatipoğlu, 1997). Somatik embriyogenesis, somatik hibridizasyon ve gen aktarma çalışmalarında ara ürün olarak embriyogenik kallusların elde edilmesi çok önemlidir. Embriyogenik kalluslar tek hücre kaynaklı olduğundan özellikle gen aktarma çalışmalarında amaca ulaşmada önemli rol oynar. Bunların yanında hücre süspansiyonu hazırlama ve protoplast füzyonunda kaynak olarak yine embriyogenik kalluslar kullanılır (Özcan ve ark., 2001). Somatik embriyogenesis birçok bitki türünün, özellikle de orman ağaçlarının hızla klonal çoğaltılmasında önemli bir potansiyele sahiptir. Teorik olarak tek bir eksplant sınırsız sayıda somatik embriyo üretebilir. Bu sınırsız üretim, anaç bitkiden alınan kısıtlı miktardaki materyale bağlı olan çelikle çoğaltım karşısında çok büyük bir avantaja sahip olmaktadır. Özellikle, birçok bitki türü için geliştirilen hücre süspansiyon teknikleriyle az bir işçilikle, çok kısa bir sürede çok sayıda iyi gelişmiş embriyo elde etmek mümkün olmaktadır (Süle, 2005). 5

21 1.GİRİŞ Somatik embriyogenesis ilk defa havuç bitkisinin somatik dokularından elde edilmiştir. Genel olarak somatik embriyo üretimi için çok değişik bitki kısımları kullanılabilmektedir. Günümüzde buğday (Maes ve ark., 1996), mısır (Bronsema, 1997; Emeklier ve ark., 1999), çeltik (Ozawa ve Komamıne, 1989), soya (Hartweck ve ark., 1988), bezelye (Özcan ve ark., 1993) ve yonca (Lai ve Mckersıe, 1994) gibi birçok önemli kültür bitkisinde yüksek oranda somatik embriyo üreten yöntemler geliştirilmiştir (Özcan ve ark., 2001). Turunçgillerde genetik transformasyon çalışmaları in vitro muhafaza ve somatik hibridizasyon için etkili bir doku kültürü ve embriyogenesis protokolünün geliştirilmesi gereklidir. Bu konuda özellikle anaç ıslahı çalışmalarında önemli olabilecek genotiplerde yapılan çalışma sayısı oldukça azdır. Turunçgillerde embriyogenik kallus ve somatik embriyogenesis üzerine yapılan çalışmalar incelendiğinde kullanılan eksplantın çoğunlukla çiçek organları (ovül, stigma veya stil) olduğu gözlemlenmiştir. Bu eksplantlar için çok kısıtlı bir dönemin olması bu tür çalışmaların yapılmasını sınırlamaktadır. Bu nedenle çiçeklenme dönemine bağlı kalınmaksızın çimlendirilen tohumların belli kısımlarının eksplant kullanıldığı çalışmaların yapılması gerekliliği ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada, Çukurova Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Bölümü ne ait Tuzcu Turunçgiller Koleksiyonu içerisinde yer alan 11 turunçgil anacının embriyo, yaprak, epikotil, kotiledon ve kök eksplantlarından, farklı besi ortamlarında kültüre alınarak embriyogenik kallus oluşturma olanakları araştırılmıştır. 6

22 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bu güne kadar turunçgillerde farklı eksplantlar kullanılarak bitki rejenerasyonları gerçekleştirilmiştir. Bunlardan bazıları; gövde ve epikotil segmentleri (Grinblat, 1972; Duran-Vila ve ark., 1992; Moreira-Dias ve ark., 2001; Costa ve ark., 2004), kök eksplantları (Gill ve ark., 1994), yaprak kesitleri (Gill ve ark., 1995; Tao ve ark., 2002), döllenmemiş ovül (Button ve Bornman, 1971), izole edilmiş nüceller embriyolar (Litz ve ark., 1985), anter (Hidaka ve ark., 1981; Germena, ve ark., 1994), stil ve stigma (Carimi ve ark., 1995; Carra ve ark., 2006) ve pistil (Carimi ve ark., 1999) eksplantlarıdır. Nito ve ark. (1990) yapmış oldukları çalışmada Satsuma mandarinin (Citrus unshiu Marc.) in vitro koşullarda usare keseciklerinden kallus ve sürgün gelişimi sağlanmıştır. MS (1962) ortamına NAA, KİN ve GA 3 eklenmesiyle elde edilen besi ortamında kallus oluşumu teşvik edilmiştir. Kültüre alınan eksplantlardan 60 gün sonra kallus oluşumu gözlenmiştir. Kallus oluşumu için en iyi ortamın MS ortamına NAA (1 mg/l) ve KİN (1 mg/l) eklenmesiyle elde edilen besi ortamı olduğu tespit edilmiştir. Kalluslardan 7-10 gün sonra somatik embriyoların oluştuğu bulunmuştur. Somatik embriyolardan bitki gelişimi 1 mg/l GA 3 içeren MS ortamında gözlenmiştir. Beloualy, (1991) Citrus aurantium, Poncirus trifoliata ve Carrizo sitranj (C. sinensis x Poncirus trifoliata) anaçlarından kallus kültürü ile bitki elde etmeye çalışılmıştır. In vitro da geliştirilen nüseller fidanlarının kök segmentleri, kotiledon, epikotil ve hipokotil eksplantlarından kallus kültürleri oluşturulmuştur. Epikotil kültürlerinden elde edilen kalluslardan somatik embriyo ve organogenesis yoluyla bitki elde edilmiştir. Epikotil ve kök kültürlerinin her ikisinden de NAA ve BA içeren ortamda bitki gelişimi gözlenmiştir. En yüksek bitki gelişim (1 mg/l) NAA + (5 mg/l) BA içeren besi ortamında Poncirus trifoliata ve Carrizo sitranj anaçlarında ve (1 mg/l) NAA + (10 mg/l) BA içeren ortamda Citrus aurantium anacında gözlenmiştir. Bitkilerin köklenmesinin teşviki için (1 mg/l) GA 3 ve (1 mg/l) NAA kullanılmıştır. Gill ve ark. (1994) yapmış oldukları çalışmada Kinnow mandarinin in vitro da geliştirilen nüseller fidanlarının yaprak, epikotil, kotiledon ve kök 7

23 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR eksplantlarından kallus kültürü oluşturulmuştur. Kültüre alınan eksplantlardan bir hafta sonunda kallusların oluştuğu gözlenmiştir. Modifiye edilmiş MT ortamında kotiledon eksplantı kallus kültürü için en iyi eksplant olmuştur. Somatik embriyogenesis oluşumu ve gelişimi için en iyi ortamın MS ortamına BA (3 mg/l), NAA (0,5 mg/l), ME (500 mg/l) eklenmesiyle elde edilen besi ortamı olduğu tespit edilmiştir. Çeşitli köklendirme ortamlarında kültür yapıldıktan 7-10 gün sonra köklerin gelişimi gözlenmiştir. Goh ve ark. (1995) in vitro da şadok (Citrus grandis Osbeck) bitkisinin farklı yöntemlerle sürgün gelişimini araştırmışlardır. In vitro da geliştirlen fidanların yaprak ve kotiledon eksplantlarından kallus kültürleri oluşturulmuştur. Epikotil eksplantı ve kök segmentinde direk organogenesis ile bitki rejenerasyonları sağlanmıştır. Kotiledon eksplantlarında en iyi kallus oluşumu MS (1962) ortamına (26,9 μm) NAA, (2,3 μm) 2,4-D ve (4,4 μm) BA eklenmesiyle bulunmuştur. Yaprak eksplantlarında en iyi kallus oluşumu (4,52 μm) 2,4-D ve (4,4 μm) BA içeren MS (1962) ortamında bulunmuştur. Tüm kallusların % 50 sinde sürgün oluşumu gözlenmiştir. Elde edilen sürgünler (2,5 μm) IBA içeren MS (1962) ortamında köklendirilmiştir. Gill ve ark. (1995) Citrus reticulata Blanca Local Sangtra çeşidinin in vitro da geliştirilen nüseller fidanlarının kök segmentleri, kotiledon, epikotil ve yaprak eksplantlarından kallus kültürleri oluşturulmuştur. Kültürlerin 10. gününde kesim uçlarında kallus oluşumları başlamış ve epikotil segmentleri kallus oluşumunda en iyi eksplant olarak bulunmuştur. En iyi kallus oluşumu NAA (10 mg/l) ve KİN (0,5 mg/l) büyüme düzenleyici içeren MS ortamından elde edilmiştir. En iyi somatik embriyogenesis oluşum ortamı MS ortamına NAA (10 mg/l), KİN (1 mg/l) ve MS vitaminleri eklenmesiyle bulunmuştur. Epikotillerden elde edilen kalluslar diğer eksplantlardan elde edilenlere göre istatiksel olarak daha fazla bulunmuştur (% 83). Somatik embriyoların çoğu normal embriyo gibi çimlenmiş fakat bazıları yalnızca sürgün oluşturmuştur. Sürgünlerden kök oluşumu 7-10 gün sürmüş, her sürgün için elde edilen kök sayısı ve uzunluğu kullanılan besi ortamına göre değişmiştir. Jumin ve ark. (1996) Altı farklı Citrus türlerinde protoplast füzyonu ile nükleer ve sitoplazmik gen transferine olanak sağlamak amacıyla hücre süspansiyon 8

24 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR kültürlerinden izole edilen protoplastları kullanarak ebriyogenik kallus oluşumunu araştırmışlardır. İzole edilen protoplastlardan somatik embriyo oluşumu ve bitki rejenerasyonu çalışılmıştır. Protoplastların kültüründe MT (1969) basal ortamına % 5 sakkaroz, (0,0, 0,001, 0,01, 0,1 ve 1,0 mg/l) BA ve 0,6 M sorbitol ilave edilerek kullanılmıştır. Bütün türler için en iyi somatik embriyo oluşumu MT basal, % 5 sakkaroz ve (0,001 mg/l) BA içeren besi ortamında sağlanmıştır. Altı türde de en yüksek sürgün oluşumu 0,1 mg/l GA 3 içeren besi ortamından sağlanmıştır. Carimi ve ark. (1998) üç farklı ortamda (MS + ME, MS + ME + 4,6 M KİN, MS + ME + 13,3 M BA) Navel grubuna ait 11 farklı genotipte stigma, stil ve ovül eksplantlarını somatik embriyogenesis ve bitki regenerasyonu oluşumunda kullanmışlardır. En yüksek somatik embriyo oluşumu BA içeren ortamda stigma, stil ve ovül eksplantlarından elde edilmiştir. Grosser ve ark. (1998) turunçgillerde anaç ıslahı programı çerçevesinde somatik hibridizasyon çalışmaları yaparak 12 farklı turunçgil ebeveyni kullanmış ve 11 yeni somatik hibrit turunçgil anacı geliştirmişlerdir. Tüm hibritler sitolojik ve PCR analizleri ile kontrol edilmiş, çoğaltılarak aşılanmış ve dış koşullardaki performanslarına bakılmıştır. Onay, (1998) (100 mg/l) hidrolize-kazein, (100 mg/l) I-askorbik asit ve BA ile desteklenen sıvı MS besi ortamında kültüre alınan Pistacia atlantica nın tohumlarından embriyogenik doku rejenere edilmiştir. Embriyogenik dokular sıvı besi ortamında BA (0,5-4 mg/l) ile kültüre alındıktan üç hafta sonra tohum eksplantlarından direkt olarak farklılaşmışlardır. Rejenere olan dokular BA ile aynı besi ortamında birkaç kez alt kültürü yapıldıktan sonra somatik embriyolar üretilmiştir. Olgunlaşmamış somatik embriyo grupları olgunlaşma için katılaştırılmış MS (1962) besi ortamına transfer edilmiştir. Olgunlaşmış somatik embriyolar bitki büyüme düzenleyicisi olmayan besi ortamında çimlendirilerek fideler elde edilmiştir. Koç ve ark. (1999) Limonda (C. limon (L.) Burm. f.) protoplast füzyonu ile uçkurutan hastalığına (Phoma tracheiphila Kanc. ve Ghik.) dayanıklı bitkiler elde etme olanaklarını embriyogenik ovüler kalluslardan elde edilmiş hücre süspansiyon kültürlerinden izole edilen protoplastları kullanarak araştırmışlardır. Kütdiken limon çeşidi hücre süspansiyon kültürlerinden izole edilen protoplastlara Zagara Bianca 9

25 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR limonu yapraklarından izole edilen protoplastlar PEG aracılığı ile füzyona uğratılmış, füzyon sonucu (0,6 M) sükroz içeren MT ortamında kültüre alınan füzyon ürünü protoplastlardan oluşan globüler embriyolardan bitki regenerasyonu gerçekleşmiştir. Füzyon sonucu elde edilen bireylerde RAPD ve flow sitometri analizleri yapılmıştır. Carimi ve ark. (1999) Turunçgillerde somatik embriyogenesis ve bitki regenerasyonu çalışmalarında altı farklı turunçgil çeşidinin pistillerini üç farklı ortamda (MS, MS mg/l ME, MS+ 500 mg/l ME + 13,3 μm BA) kültüre almışlardır. Yaptıkları çalışmada kullanılan genotipin, eksplantın ve besi ortamın bitki regenerasyonu, somatik embriyo ve kallus oluşumu üzerinde farklı etkileri olduğunu belirtmişlerdir. Chakravarty ve Goswami. (1999) embriyonik kallus elde etmeye yönelik turunçgillerde (Citrus acida) epikotil eksplantlarında yapılan çalışmalarda 2,4-D (1 mg/l) ve BA (0,5 mg/l) kombinasyonlarında en yüksek kallus oluşum oranı gözlenmiştir. Kalluslar modifiye edilmiş MT (1969) ortamında alt kültüre alınmıştır. 2,4-D nin bulunmadığı BA ve KİN bulunan ortamlarda kallustan sürgün oluşumu sağlanmıştır. BA kullanımı ile kalluslar yeşil ve kompakt hale gelmekte gün içinde sürgün oluşumu başlamaktadır. Sürgün oluşumu sitokinin konsantrasyonunun 0,5 mg/l den 1 mg/l ye arttırılması ile artmakta fakat yüksek sitokinin konsantrasyonu sürgün oluşumunu engellemektedir. Sitokinlerden KİN in sürgün oluşturmada BA ya göre daha düşük bir oran sergilediği belirtilse de bazı Citrus türlerinde sürgün oluşumunda KİN in BA ya göre daha olumlu sonuçlar verdiği bildirilmiştir. Calovic ve ark. (2000) Yapmış oldukları çalışmada beş farklı limon çeşidinden aldıkları stilleri kallus oluşumu için MT ortamına aktarmışlar ve elde ettikleri kalluslardan da 2-3 ay sonunda somatik embriyo oluşumunu gözlemlemişlerdir. Embriyonik potansiyele sahip kallusları MS (1962) ortamında kültüre almışlar ve somatik embriyolardan bitkicikler elde etmişlerdir. Bordon ve ark. (2000) Dört tür ve bir hibrit turunçgilin epikotil eksplantını kullanarak eksplantın ortama yerleştirilme durumu, hormonlar ve ışığın etkilerini araştırmışlardır. Tüm denemelerde eksplant dikey olarak yerleştirildiğinde kallus oluşturmaksızın direk organogenesis yolu ile sürgünler elde edilmiş fakat Troyer 10

26 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR sitranjı nın epikotillerini yatay olarak kütüre aldıklarında kallus oluşumu gözlenmiştir. Direk organogenesis yolu ile sürgün oluşumu karanlık ortamda engellenmiş fakat bu engelleyici faktör sitokinin (BAP) kullanımıyla Troyer sitranjında tam olarak diğerlerinde kısmi olarak ortadan kalkmıştır. Troyer sitranjında organogenik kallus oluşumu sitokinin/oksin dengesi kurulduğunda meydana gelmiştir. C. macrophylla karanlık denemesinde kallus oluştururken aydınlıkta oluşturulmamıştır. Elde edilen sürgünler NAA ile birlikte düşük dozlarda BAP kullanılarak köklendirilmişlerdir. Bu çalışma her genotip için uygun regenerasyon koşullarının optimizasyonunun gerekliliğini ortaya koymuştur. Tomaz ve ark. (2001) Yaptıkları çalışmada beş farklı turunçgilde somatik embriyogenesiste farklı karbonhidrat kaynaklarının (galaktoz, laktoz, maltoz, glikoz ve sakkaroz) etkilerini araştırmışlardır. Galaktoz, maltoz ve laktoz da üç genotipte yüksek embriyogenesis oluşumu gözlemlenmiştir. Jimenez ve ark. (2001) Nüseller citrus türlerinde kallusların ilk oluşum esnasındaki içsel hormon düzeylerinde karbonhidrat kaynaklarının etkilerini araştırmışlardır. Farklı nüseller turunçgil türlerinde embriyogenik kallus oluşumunda sakkaroz ve gliserol karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. Sakkaroz kallusların çoğalmasını sağlarken Gliserol ise somatik embriyo oluşumunu teşvik ettiği rapor edilmiştir. İçsel hormon kültüründe ebriyonun gelişmesindeki ilk adım 2-5 gün sonra görülmüştür. İçsel hormon düzeyin de en çok farklılık beş gün sonraki gelişmenin olduğu kültürde gözlenmiştir. Farklı citrus genotiplerinin kalluslarının içsel hormon içerikleri de karşılaştırılmıştır. Karşılaştırılan bu kallusların hormon düzeylerinde farklılıklar bulunmuştur. Ricci ve ark. (2002) Bazı turunçgillerden elde edilen kalluslardan somatik embriyo elde etmede farklı karbonhidratlar denemişler, kültür ortamı olarak MT ortamında sakkaroz, galaktoz, glukoz, maltoz ve laktoz un (18, 37, 75, 110 ve 150 mm) konsantrasyonlarını kullanmışlardır. Elde edilen embriyolar olgunlaştırılma amacıyla (0,5 g/l) aktif karbon bulunan ve (0, 15, 29, 44, 58, 73 mm) sakkaroz içeren ortamda kültüre alınmıştır. Kullanılan turunçgil türleri için, kalluslardan embriyo elde etmede karbonhidrat kaynağı olarak galaktoz ve laktoz en iyi sonuçları vermiştir. 11

27 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Tao ve ark. (2002) Citrus grandis (L.) Osbeck (pummelo) genotipinin yaprak eksplantlarından kallus oluşumu ve sürgün gelişimini çalışmışlardır. Pummelo tohumlarından elde edilen bitkinin yapraklarından kallus oluşumunu sağlamak için yedi farklı (BA, 4-CPA, 2,4-D, Dicamba, MCPA, NAA, Picloram, 2,4,5-T) oksin konsantrasyonları içeren besi ortamı kullanmışlardır. 2,4-D içeren besi ortamı kallus oluşumu için en etkili bulunmuştur. 0,9 ve 0,4 µm 2,4-D içeren besi ortamları yeşil renkli sıkı yapılı kalluslar meydana getirmişlerdir. Her bir kallus başına 13 sürgün oluştuğu bulunmuştur. Sürgünlerden köklü bitkiler elde etmek için (9.84 µm) IBA ve (5.37 µm) NAA içeren besi ortamı kullanmışlardır. Taner, (2002) Yapmış olduğu çalışma da katı ve sıvı kültürlerde somatik embriyo ve kallus oluşumu üzerine; Kuşçular, Yuva ve Kırkağaç kavun çeşitlerine ait in vitro bitkilerden alınan değişik bitki parçalarının (kök, hipokotil, kotiledon, sürgün ve yaprak), oksin-sitokinin (2,4-D, NAA KİN, 2iP) dengesinin ve farklı kuvvetteki MS besin ortamlarının etkilerini belirlemişlerdir. Araştırma sonucunda kallus üretimi ve somatik embriyo oluşumu üzerine bitki genotipinin, kullanılan bitki parçası tipinin, besin ortamı bileşimi ve ortamdaki oksin-sitokinin dengesinin etkili olduğu bulunmuştur. Kallus kültürleri yoluyla elde edilen somatik embriyoların, % 93 ü kotiledon, % 7'i ise hipokotil parçalarından elde edilmiştir. Çeşitlere göre değişmekle birlikte en fazla embriyo oluşumu 1/2 kuvvetli (0,5 mg/l) 2,4-D ve (0,5 mg/l) KİN içeren MS besin ortamında % 78,3'le Kuşçular kavununda sağlanmıştır. Bu çeşidi % 18,6 ile Yuva, % 3,1 ile Kırkağaç çeşitleri izlemiştir. Sıvı kültürü çalışmalarında Kuşçular kavununda (0,5 mg/l) 2,4-D içeren, Yuva çeşidinde ise 2,4- D içermeyen sıvı kültürlerde somatik embriyo elde edilirken Kırkağaç çeşidinde herhangi bir sonuç alınamamıştır. Araştırma sonucunda katı ve sıvı kültürlerden elde edilen toplam 234 adet embriyodan % 15 oranında normal, % 85 oranında da anormal gelişimli bitki elde edilmiştir. Fiore ve ark. (2002) kallus oluşumu, somatik embriyogenesis ve bitki regenerasyonu kültürlerinde, limon (Citrus limon (L.) Burm. cv Feminello ) ve portakalın (Citrus sinensis (L) Osb. cv Washington Navel GS ) stil ve stigmalarını kullanmışlardır. Denemede 2,4-D ve 4-CPPU nun dört farklı konsantrasyonlarından (0, 0,4, 4, 12 μm) oluşan 16 farklı ortamı denemişlerdir. Limonda stigma 12

28 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR eksplantının kullanıldığı (4 Μm) 4-CPPU içeren besi ortamının en iyi sonucu verdiğini bildirmişlerdir. Gürcan, (2003) Çalışmada armut (Pyrus communis L. cv Ankara ), ayva (Cydonia oblonga Mill. cv "Ekmek"), elma (Malus x domestica Borkh. cv Gloster"), erik (Prunus domestica L. cv "Stanley"), kayısı (Prunus armeniaca L. cv Şekerpare ), kiraz (Prunus avium L. cv Dalbastı ), vişne (Prunus cerasus L. cv Kütahya ), ceviz (Juglans regia L. Kaman ), fındık (Corylus avellana L. cv Tombul ) ve limonda (Citrus limon (L.) Burm. cv. Kara limon") dişi organ dokularından stigma, stil ve ovaryumdan somatik embriyo ve kallus oluşum oranları üzerine (1, 3, 5 mg/l) BA ve 2,4-D nin etkileri incelenmiştir. Besin ortamı olarak (500 mg/l) ME, (50 g/l) sakkaroz ve (7 g/l) agar katılan değiştirilmiş MS ortamı esas alınmıştır. Kültürler 25±1 C sıcaklık ve 16 saat aydınlık koşullarda inkübe edilmiştir. İki yıl yapılan çalışmalar sonucunda erik dışındaki tüm türlerde özellikle 2,4-D uygulamalarında kallus oluşumları meydana gelmiştir. Somatik embriyo oluşumu, sadece limonda 5 mg/l BA uygulamasında ovaryumdan % 21 ve stilden % 23,5 oranlarında belirlenmiştir. Begum ve ark. (2004) Turunçgillerde kallus oluşumu, somatik embriyogenesis ve bitki rejenerasyonu gibi in vitro oluşumlarının sürgün ucu kültürü ve gelişmemiş ovullerden elde edilebileceğini bildirmişlerdir. Şan ve ark. (2005) Bazı ceviz ( Juglans regia L.) genotiplerinde apomiktik ve açıkta tozlanmış tohumların olgunlaşmamış kotiledonlarından somatik embriyogenesis araştırılmıştır. Apomiktik tohumları elde etmek için dişi çiçekler keselenmiş ve/veya Golden Delicious ( Malus x domestica Borkh.) elma çiçek tozları ile tozlanmıştır. Somatik embriyogenesis için en iyi kotiledon aşaması, 10 ceviz genotipinin açıkta tozlanmış tohumlarında belirlenmiştir. Olgunlaşmamış kotiledonlar tam çiçeklenmeden 8, 9, 10, 11 ve 12 hafta sonra kültüre alınmıştır. Bu denemenin sonucuna göre apomiktik orijinli olduğu düşünülen tohumların kotiledonları tam çiçeklenmeden 8 hafta sonra kültüre alınmıştır. Başlangıç kültürlerinde (1 mg /l) BAP, (2 mg/ l) KİN, (0,01 mg/l) IBA ve (250 mg/l) L- glutamin ile desteklenmiş DKW ortamı kullanılmıştır. Eksplantlar alt kültürlerde büyümeyi düzenleyici maddeler ve L-glutamin bulunmayan DKW ortamına transfer 13

29 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR edilmiştir. Dördüncü alt kültürün sonunda apomiktik ve apomiktik olmayan tohumlardan orijinini almış embriyogenik kotiledonların oranı % 3,6 dan % 25 e kadar değişmiştir ve kotiledon başına embriyo sayısı 1 den 9,7 ye değişmiştir. Somatik embriyogenesis ile Tokat-1 ceviz genotipinin apomiktik tohumlarının olgunlaşmamış kotiledonlarından orijinini almış tekrar eden bir embriyogenik embriyo hattı sağlanmıştır. Erişen, (2005) Yonca nın yüksek rejenerasyon yeteneğine sahip verco çeşidinde eksplantların ve uygulanan farklı protokollerin somatik embriyogenesise etkisi araştırılmıştır. Beş farklı eksplant (hipokotil, kotileden, gövde, yaprak ve yaprak sapı) iki farklı protokol uygulanarak kültüre alınmıştır. Eksplant kaynağı ile uygulanan protokoller arasında anlamlı farklılığın bulunduğu tespit edilmiştir. I. protokolde eksplantlar ilk olarak (1 mg/l) BA, (1 mg/l) 2,4-D, (0,2 mg/l) KİN içeren besin ortamında kültüre alınmıştır. Gelişen embriyo toplulukları MS besin ortamında alt kültüre alınarak bitkicik gelişimi gözlenmiştir. Bu denemede en fazla eksplant başına somatik embriyo 78 adet ile hipokotil eksplantından elde edilmiştir. MS besin ortamında alt kültüre alınan embriyolar bitkiye dönüşmüştür. Bu denemede ise en fazla eksplant başına somatik embriyo yaprak eksplantından (94 adet) elde edilmiştir. Oluk-Akçam ve ark. (2005) Haşhaş (Papaver somniferum L.) bitkisinin tohumları MS besi ortamında in vitro şartlarda çimlendirilmiştir. Bu ortamda yetişen bitkilerin hipokotil eksplantlarından (1 mg/l) NAA içeren MS besi ortamında kallus kültürleri elde edilmiştir. Bu kallusların hormonsuz besi ortamına aktarılmasıyla somatik embriyogenesisin ortaya çıktığı gözlenmiştir. Aynı ortamda alt kültüre alınmaya devam edilen embriyolardan ileri dönemde rejenere sürgünler gelişerek tam bir bitkiciğe dönüşmüşlerdir. In vitro tohum çimlenmesinden rejenerantların ortaya çıkışına kadar olan işlemler dizisini kapsayan bu prosedür yaklaşık 12 hafta gibi kısa bir sürede başarılmıştır. Süle, (2005) Yapmış olduğu çalışmada; farklı oksinler kullanılarak, yonca (Medicago sativa L.) da somatik embriyo üretimi amaçlanmıştır. Elçi yonca çeşidine ait tohumlar in vitro da çimlendirilmiş ve 6 günlük fidelerden hipokotil ve kotiledon segmentleri, (1 mg/l) 2,4-D, NAA, picloram veya dicamba + (0,2 mg/l) KİN içeren SH ortamında kültür edilmişlerdir. Araştırma 14

30 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR sonucu; kullanılan oksin çeşidine bağlı olarak kallus indüksiyon oranı % 23,6 ile % 50,8 arasında değişmiş ve en yüksek değer 2,4-D oksin grubu büyüme düzenleyici içeren ortamlardan elde edilmiştir. Oluşan kallusların ağırlığı ortam kombinasyonlarına bağlı olarak 0,660 mg ile 1,472 mg arasında değişim gösterirken, picloramın ilave edildiği besi ortamlarından en yüksek ortalama elde edilmiştir. Yonca da somatik embriyo elde etme açısından 2,4-D oksini en etkin büyüme düzenleyicisi olarak saptanmıştır. Kayım ve ark. (2006) Turunçgillerde üç tür ve dört farklı çeşitte somatik embriyogenesis çalışması gerçekleştirmişlerdir [C.clemantina (Klemantin mandarini), C.sinensis (Washington Navel portakalı), C.limon (Kütdiken ve Zagara Bianca limonu)]. Dört farklı Citrus ovüllerinden sağlanan kalluslar için farklı konsantrasyonlarda (% 1-5) karbonhidratların (Galaktoz, Laktoz, Glikoz, Sorbitol, Gliserol) etkisi çalışılmıştır. Kalluslardan en iyi embriyo oluşumu % 4-5 oranlarındaki gliserol konsantrasyonlarında görülmüştür. % 4 lük gliserol konsantrasyonundan 67 adet Washington Navel portakal embriyosu ve 137 adet Zagara Bianca limon embriyosu sağlanmıştır. % 5 lik gliserol konsantrasyonunda ise 808 adet Klemantin mandarini ve 853 adet Kütdiken limon embriyosu sağlanmıştır. Bu çalışmada sorbitol ve laktoz gibi karbonhidrat konsantrasyonları turunçgil kalluslarında daha az etkili olduğu görülmüştür. Singh ve ark. (2006) Kinnow mandarininin embriyogenik kültürleri açılmamış çiçek tomurcuklarından ayrılmış döllenmemiş ovüllerden sağlanmıştır. In vitro da uyartılmış çiçeklerin kültürleri farklı konsantrasyonlarda KİN ve Sukroz kullanılarak farklı fotoperiyod tabi tutulmuşlardır. Ovüller MS (1962) besi ortamına ek olarak (2 mg/l) KİN içeren ortamda kültüre alınmıştır. Maksimum gelişme MS (1962) ortamına ilave edilen (2 mg/l) KİN ve (40 g/l) sukroz ortamında ve 12 saat fotoperyot muamelesin sonucu % 31,94 kallus oluşumu ve her bir kallus başına somatik embriyo üretimi 5,58 olarak gözlenmiştir. Varol, (2006) Çalışmasında on farklı turunçgil genotipinden elde edilen embriyonik kallusların in vitro da azaltılmış büyüme koşullarında muhafazası ve farklı muhafaza sürelerinde (30, 60, 90 gün) bu kalluslardan sürgün ve bitkicik elde etme olanakları araştırılmıştır. İn vitro muhafaza sonrasında elde edilen sürgün ve 15

31 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR bitkiciklerden molekül analizler gerçekleştirilerek in vitro koşullardan muhafaza sırasında genetik yapılarında bir değişim olup olmadığı belirlenmiştir. Embriyogenik kalluslar tam çiçeklenmeden 2-8 hafta sonra kültüre alınan ovüllerden elde edilmişlerdir. Çalışma sonunda elde edilen RAPD yöntemi ile yapılan bitkicik ve sürgünlerin genetik stabiliteleri RAPD yöntemi ile saptanarak, ismine doğru oldukları ortaya konulmuştur. Biçen, (2008) On turungil genotipinde [Citrus aurantium L. (cv Tuzcu 891 ), Citrus aurantium L. (cv Tuzcu ), Citrus aurantium L. (cv Gou Tou ), Citrus sinensis (L.) Osb. (cv Alanya Dilimli ), Citrus reshni Hort. ex.tan. (cv Cyprus Cleopatra mandarine ), Poncirus trifoliata (L) Raf (cv Pomeroy ), Citrus sinensis (L) Osb. x Poncirus trifoliata (L) Raf. (cv Tuzcu M2 Citrange ), Citrus sinensis (L) Osb. x Poncirus trifoliata (L) Raf. (cv Carrizo Citrange ), Citrus paradisi Macf. x Poncirus trifoliata (L) Raf. (cv Swingle Citrumelo), Citrus volkameriana Tan.& Pasg. (cv CRC 01 Volkameriana )] stil ve ovül kültürü kullanılarak kallus oluşumu, somatik embriyogenesis ve bitki rejenerasyonu sağlanmıştır. Eksplantlar farklı besi ortamlarında kültüre alınmıştır. MS makro ve mikro elementleri ve MT vitaminlerine ek olarak 500 mg/l ME ile 1 mg/l 2.4D, 3 farklı BA konsantrasyonu (0, 0,5, 1 mg/l) birinci yıl denemelerinde besi ortamı olarak kullanılmıştır. İkinci yıl stil eksplantları, MS basal ortamı, ME ile beraber 3 farklı BA konsantrasyonu (1, 2, 3 mg/l) içeren ortamda kültüre alınmıştır. İkinci yıl denemelerinde MS makro ve mikro elementleri, MT vitaminleri ile ME herhangi bir büyümeyi düzenleyici içermeyen ortamda kültüre alınmış, ayrıca 2.4D (1 mg/l) ve 3 farklı BA (0, 0,5, 1 mg/l) konsantrasyonu içeren ortamlar ovül eksplantları için kullanılmıştır. Sükroz (50 g/l) tüm denemelerde karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. Stil ve ovül kültürlerinden somatik embriyo oluşumuna genotipler farklı tepkiler vermiştir. Stil eksplantlarından somatik embriyo oluşumu % 0 (AREC Swingle Sitrumelo, M2 Sitranjı, Volkameriana, Pomeroy üç yapraklısı) ve % 100 (Gou Tou turuncu) arasında değişirken aynı şekilde ovül eksplantlarında somatik embriyo oluşum oranları % 0 (Carrizo Sitranjı, Alanya Dilimli portakalı, AREC Swingle Sitrumelo) ile % 100 (Tuzcu 891 ve Kleopatra Mandarini) arasında değişmiştir. Somatik embriyolar yaklaşık 4 hafta sonra bitkiye dönüşmüşlerdir. 16

32 3.MATERYAL VE METOD 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Tez Çalışması kapsamında Çukurova Üniversitesi Tuzcu Turunçgiller Koleksiyonu içerisinde yer alan ve Çizelge 3.1. de belirtilen 11 turunçgil anacı bitkisel materyal olarak kullanılmış, denemeler Çukurova Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Bölümü Bitki Biyoteknoloji Laboratuvarında yürütülmüştür Bitkisel Materyal Gou Tou Turuncu (Citrus aurantium L.) : Çin kökenli bir anaç olup Tristeza hastalığına tolerant olması dışında toprak isteği veya diğer hastalıklara dayanımı konusunda bir bilgi yoktur. Florida da Gou Tou anacı üzerine aşılı bitkiler diğer turunçlar üzerine aşılı olanlara göre daha büyük bir habitüse sahip olmuşlardır (Saunt, 2000). Tuzcu 891 (Citrus aurantium L.) : Prof. Dr. Önder Tuzcu tarafından Avustralian SRA turuncundan aşı gözü seleksiyonu yoluyla elde edilmiştir. Uçkurutana dayanıklıdır (Biçen, 2008). Antalya Kleopatra (Citrus reshni Tan. var Kleopatra Antalya) Mandarini: Antalya Kleopatra mandarini dünyada yaygın kullanılan bir anaç değildir. Ancak anaç olarak kullanımını arttıracak önemli özellikleri gözlemlenmiştir. Florida da hala yaygın olarak kullanılan anaçlardan biridir. Kleopatra üzerine aşılı altıntop çeşitlerinin meyve kalitesi mükemmel olmakta ancak ağaçlarda düşük verimlilik ve küçük meyve oluşumuna neden olmaktadır. Kleopatra mandarini değişik toprak koşullarına kolayca uyum sağlayabilmektedir. Hafif tuzlu topraklardan ağır killi topraklara kadar geniş uyum yeteneğine sahiptir. Kumlu - ağır killi topraklarda iyi gelişmektedir. Yüksek tuzluluk ve ph'ya dayanıklıdır. Antalya Kleopatra mandarininin en önemli avantajı, temel bazı turunçgil virüs ve viroid hastalıklarına karşı diğer anaçlardan daha tolerant 17

33 3.MATERYAL VE METOD olmalarıdır. Tristeza (Göçüren - CTV), Exocortis (Cüceleşme - CEV) ile Xyloporosis (Gözenekleşme) virüs ve viroid hastalıklarına karşı toleranttır. Nematodlara duyarlı, Phytophthora citrophthora'ya orta derecede duyarlı ve soğuklara dayanıklı bir anaçtır (Biçen, 2008). Carrizo Sitranjı (Poncirus trifoliata Raf. x Citrus sinensis Osb. Var Carrizo ) : donlarından sonra üç yapraklının soğuklara dayanıklılık özelliğinden yararlanarak yeni anaç elde edilmesi amaçlanmış ve Swingle tarafından 1897 yılında Carrizo sitranjı, Washington Navel portakalı x Üç yapraklı melezlemesi ile elde edilmiştir. Birçok nedenlerden dolayı portakal ve altıntoplar için anaç olarak çok yaygın şekilde kullanılmaktadır. Carrizo sitranjı meyveleri çekirdekli ve yüksek oranda nüseller embriyoni göstermektedir ve anaç olarak kolaylıkla çoğaltılabilmektedir. Tohumla çoğaltımı ve aşılanması kolaydır. Üzerine aşılı ağaçlar kumlu, kumlu tınlı topraklarda iyi gelişmektedir. Kireçli topraklarda zayıf gelişmektedir. Ancak, kireçli topraklara adaptasyon bakımından üç yapraklı anacından daha avantajlı görünmektedir. Kaliforniya da ve Akdeniz Ülkelerinde anaç olarak başarı ile kullanılmaktadır. Troyer sitranjına göre daha hızlı gelişmekte ve meyve kalitesine daha olumlu etki yapmaktadır. Verimliliği yüksek, meyveye yatması erkendir. Kök nematoduna (Radopholus similis Cob.) toleranttır. Uçkurutan hastalığına dayanıklıdır. Troyer sitranjına göre kuraklığa daha dayanıklıdır (Biçen, 2008). Severinia buxifolia: Dikenli bodur ya da küçük bir ağaçtır. Yaprakları koyu yeşil renklidir. Her bir yaprakta tek dikenler vardır (Ağar, 2007). Üç Yapraklı (Poncirus trifoliata) : Temel özelliği yapraklarının üç parçadan oluşmasıdır. Ağaçları 4-5 m büyüyen küçük ağaçlardır. Meyveleri küçük, üzerleri pürüzlü ve ince tüylerle kaplıdır. Soğuklara dayanıklı, meyveleri önce gri renkli olgunlaşınca açık sarı renklidir. Meyve eti acı-ekşidir. Bol miktarda çekirdeklere sahiptir. Kalın, sivri dikenleri vardır. Çiçekleri beyaz, hoş kokuludur. Çeşitli hastalıklara karşı dayanıklı olması bakımından daha çok anaç olarak kullanılır. Citrus cinsi için anaç olarak kullanılan en eski türdür (Ağar, 2007). 18

34 3.MATERYAL VE METOD Eremocitrus glauca (Lindl.) Swing.: Turunçgil türleri içerisinde kserofitik özellik taşıyan tek türdür. Çöl bitkisi gibi özellik gösterir. Eremocitrus glauca tek türdür. Avustralya nın kuzeyinde yer alan çöllerde- steplerde bulunur (Varol, 2007). Tuzcu Kleopatra Mandarin (Citrus reshni Hort. ex. Tan.): Kleopatra mandarini dünyada yaygın olarak kullanılan bir anaç değildir. Ancak son yıllarda anaç olarak kullanımını artıracak önemli özellikleri gözlemlenmiştir (Davies ve Albrigo, 1994). Portakal çeşitlerinden Hamlin için yaygın olarak kullanılmakta, diğer portakal çeşitlerinde özellikle de Valencia portakalında anaç olarak kullanılmasıyla düşük verimlilik görülmektedir. Kleopatra üzerine aşılı altıntop çeşitlerinin meyve kalitesi mükemmel olmakta ancak, ağaçlarda düşük verimlilik ve küçük meyve oluşumuna neden olmaktadır. Kleopatra mandarini değişik toprak koşullarına kolayca uyum sağlayabilmektedir. Hafif tuzlu topraklardan ağır killi topraklara kadar oldukça geniş uyum yeteneğine sahiptir. Kumlu - ağır killi topraklarda iyi gelişmektedir. Yüksek tuzluluk ve ph'ya dayanıklıdır (Davies ve Albrigo, 1994; Saunt, 2000). Troyer Sitranjı (Citrus sinensis (L) Osb. x Poncirus trifoliata (L) Raf.) : 1909 yılında California da Washington Navel portakalı x Üç yapraklı melezlemesi ile elde edilmiş bir hibrittir. Swingle tarafından 1934 yılında Troyer olarak isimlendirilen bir meyvedir. Yirmi beş yıldan daha az bir süre içerisinde en çok dikilen ürün olmuş ve diğer bölgelerde de talep görmüştür. Kuvvetli büyüyen, dik-yaygın ve orta büyüklükte, ince gövdeli yapıya sahiptir. Orta büyüklükte yaprağı bulunan troyer sitranjı yaprağını fazla dökmeyen özelliğe sahiptir. Verimli ve dayanıklıdır (Anonim, 2009a). Rubidoux Üç Yapraklı (Poncirus trifoliata (L) Raf) : Günümüzde özellikleri iyi bilinen Poncirus trifoliata Rubidoux Üç Yapraklı olarak isimlendirilmektedir yılında California dan getirilmiştir. Küçük çiçekli gruplara ait olmasına karşın diğer bitkilere kıyasla orta kuvvetli olmaktadır (Anonim, 2009b). Swingle sitrumelo (CRC 4475) : Citrus paradisi Macf. x Poncirus trifoliata (L) Raf. melezi olan genotip 1907 yılında Florida da bulunmuştur yılında Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı tarafından üretilmesine izin verilmiştir. Nematodlara ve Phytophthora dayanıklıdır. Kuvvetli büyüyen, orta büyüklükte ve 19

35 3.MATERYAL VE METOD yüksek verimli ağaç yapısına sahiptir. İyi meyve tutma kabiliyetine sahiptir. Meyveler çok sulu ve meyve suyu orta asidik içeriğe sahiptir (Anonim, 2009c). Çizelge Denemede Kullanılan Turunçgil Anaçları No Genotip Latince 1 Gou Tou turuncu Citrus aurantium L. 2 Tuzcu 891 turuncu Citrus aurantium L. 3 Carrizo sitranjı Citrus sinensis (L) Osb. x Poncirus trifoliata (L) Raf. 4 Troyer sitranjı Citrus sinensis (L) Osb. x Poncirus trifoliata (L) Raf. 5 Yerli üç yapraklı Poncirus trifoliata 6 Rubidoux üç yapraklı Poncirus trifoliata (L) Raf 7 Kleopatra mandarini Citrus reshni Hort. ex. Tan. 8 Antalya Kleopatra mandarini Citrus reshni Hort. ex. Tan. 9 Swingle sitrumelo ( CRC 4475) Citrus paradisi Macf. x P. trifoliata (L) Raf. 10 Severinia buxifolia Severinia buxifolia 11 Eremocitrus glauca Eremocitrus glauca 3.2. Metod Doku Kültürü Çalışmaları Tohum Örneklerinin Alınması Tez kapsamında bitkisel materyal olarak kullanılan turunçgil anaçlarına ait tohumlar olgunlaşmış meyvelerden sağlanmıştır. Alınan meyveler laboratuvara getirilmiş ve tohumları çıkarılarak (Şekil 3.1.) kültür öncesi sterilizasyonları gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.1.). 20

36 3.MATERYAL VE METOD a b c d Şekil 3.1. Denemede kullanılan tohumların meyvelerden izole edilmesi: a. Tohumların meyve etinden dışarı çıkarılışı, b. Meyve kabuğunun tohumdan uzaklaştırılması, c. Meyve nin suyunun sıkılıp tohumun çıkarılışı, d. Tohumların genel görünümü Kültüre Alınacak Bitki Parçacığının Sterilizasyonu ve Kültür Ortamlarının Hazırlanması Turunçgil anaçlarına ait tohum örneklerinin kültür öncesi yüzey sterilizasyonları gerçekleştirilmiştir. Sterilizasyon aşamasında tohumlar 3 dk % 70 lik EtilAlkol (EtOH) içerisinde bekletilmiş ve arkasından 10 dk % 10 lik Hypo damla Tween 20 içeren solüsyonda bekletilip steril kabin içerisinde sterilant maddelerin uzaklaştırılması için 3 kez steril saf su ile çalkalanmıştır (Şekil 3.2.). 21

37 3.MATERYAL VE METOD a b c d Şekil 3.2. Tohumların Sterilizasyon Aşamaları: a. Tohumların su ile temizlenmesi, b. Tohumların (EtOH) içerisinde bekletilmesi c. Eksplantlarının steril saf su ile çalkalanışı, d Steril saf su içerisinde bekletilmesi. Steril edilen tohumların kabukları soyularak bitki büyüme düzenleyici içermeyen MS (1962) bazal ortamına (Çizelge 3.2.) aktarılmıştır (Şekil 3.3.). Gelişen bitkicikten yaprak, epikotil, kotiledon ve kök parçaları alınarak farklı büyüme düzenleyici içeren embriyogenik kallus oluşturma ortamlarına aktarılmıştır. Elde edilen bitkiciklerden alınan yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarından embriyogenik kallus eldesi için, birinci denemede Gill ve Singh (1994) in kullandıkları MS (1962) bazal + NAA (0 mg/l, 1 mg/l, 5 mg/l, 10 mg/l) + (0.5 mg/l) Kinetin+(30 g/l) sükroz + (7.5 g/l) agar içeren besi ortamı (Çizelge 3.3.) kullanılmıştır. Birinci deneme sonucunda yüksek NAA miktarının olumsuz etkilediği gözlemlenince 2.denemede NAA konsantrasyonu 0 ile 3 mg/l arasında belirlenmiştir (Çizelge 3.4.). Bu denemede 1 ve 2 denemenin ardından yapılan literatür çalışmaları sonucunda 2,4-D içeren üçüncü bir deneme daha kurulmuştur. Birinci ve ikinci denemeden farklı olarak MS (1962) bazal + (2 mg/l) NAA + (0.5 mg/l) KİN +(2 22

38 3.MATERYAL VE METOD mg/l) 2,4-D + (30 g/l) sükroz + (7.5 g/l) agar içeren besi ortamında (Çizelge 3.5.) eksplantlar kültüre alınmıştır (Şekil 3.5.)-(Şekil 3.6.)-(Şekil 3.7.). Aynı yöntemlerle elde edilen bitkilerden alınan kök eksplantlarından embriyogenik kallus eldesi için, birinci denemede Gill ve Singh (1994) in kullandıkları MS (1962) bazal + 2,4-D (0 mg/l, 0.5 mg/l, 1 mg/l, 2 mg/l) mg/l KİN+(30 g/l) sükroz + (7.5 g/l) agar içeren besin ortamında (Çizelge 3.6.) kültüre alınmıştır (Şekil 3.8.). Sterilizasyonu gerçekleştirilen tohumlardan çıkarılan embriyolardan embriyogenik kallus eldesi için eksplantları, Benyahia ve Talha (2002) in izledikleri yöntemler kullanılmıştır. Bu yönteme göre eksplantlar, MS bazal+ (0.5 mg/l) BAP +(0 mg/l, 0.5 mg/l, 1 mg/l, 2 mg/l) 2,4-D + (30 g/l) sükroz + (7.5g/l) agar ortamında (Çizelge 3.7.) kültürleri gerçekleştirilmiştir. Şekil 3.3. Yaprak, Epikotil, Kök ve Kotiledon eksplantları için bitki elde edilmesi: a. Tohum kabuğunun temizlenmesi b. Tohum kabuğunun soyulması c. Tohumun çimlendirme ortamına aktarılışı 23

39 3.MATERYAL VE METOD a b c d Şekil 3.4. Bitki gelişim aşamaları: a. Antalya Kleopatra mandarini, b. Kleopatra mandarini, c. Carrizo sitranjı, d. Troyer sitranjı Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan, MS ortamı (Murashige ve Skoog, 1962) makro ve mikro elementleri ve miktarları Bileşik Konsantrasyon (mg/l) Makro Elementler (MS, 1962) MgSO 4.7H 2 O 370 KH 2 PO KNO NH 4 NO CaCl 2.2H 2 O 440 Mikro Elementler (MS, 1962) H 3 BO MnSO 4.H 2 O 15.6 ZnSO 4.7H 2 O 8.6 Na 2 MoO 4.2H 2 O 0.25 CuSO 4.5H 2 O CoCl 2.6H 2 O KI 0.83 FeSO 4.7H 2 O 27.8 Na 2 EDTA

40 3.MATERYAL VE METOD Çizelge 3.3. Çalışmada yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarından kallus oluşumu için 1. denemede kullanılan ortam içerikleri; Ortam Uygulamalar içeriği I.Uygulama II.Uygulama III.Uygulama IV.Uygulama V.Uygulama MS 4.4 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l bazal Sükroz 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l NAA 0 mg/l 0 mg/l 1 mg/l 5 mg/l 10 mg/l KİN 0 mg/l 0.5 mg/l 0.5 mg/l 0.5 mg/l 0.5 mg/l ph Agar 7.5 g/l 7.5 g/l 7.5 g/l 7.5 g/l 7.5 g/l Çizelge 3.4. Çalışmada yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarından kallus oluşumu için 2. denemede kullanılan ortam içerikleri Ortam Uygulamalar içeriği I.Uygulama II.Uygulama III.Uygulama IV.Uygulama V.Uygulama MS 4.4 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l bazal Sükroz 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l NAA 0 mg/l 0 mg/l 1 mg/l 1.5 mg/l 3 mg/l KİN 0 mg/l 0.5 mg/l 0.5 mg/l 0.5 mg/l 0.5 mg/l ph 5.7 5, Agar 7.5 g/l 7.5 g/l 7.5 g/l 7.5 g/l 7.5 g/l 25

41 3.MATERYAL VE METOD Çizelge 3.5. Çalışmada yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarından kallus oluşumu için 3. denemede kullanılan ortam içerikleri; Ortam içeriği Uygulamalar I.Uygulama II.Uygulama MS bazal 4.4 g/l 4.4 g/l Sükroz 30 g/l 30 g/l NAA 0 mg/l 2 mg/l KİN 0 mg/l 0.5 mg/l 2.4-D 0 mg/l 2 mg/l ph Agar 7.5 g/l 7.5 g/l Çizelge 3.6. Çalışmada kök eksplantından kallus oluşumu için kullanılan ortam içerikleri; Ortam Uygulamalar içeriği I.Uygulama II.Uygulama III.Uygulama IV.Uygulama V.Uygulama MS 4.4 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l bazal Sükroz 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l 2.4-D 0 mg/l 0 mg/l 0.5 mg/l 1 mg/l 2 mg/l KİN 0 mg/l 0.5 mg/l 0.5 mg/l 0.5 mg/l 0.5 mg/l ph Agar 7.5 g/l 7.5 g/l 7.5 g/l 7.5 g/l 7.5 g/l 26

42 3.MATERYAL VE METOD Çizelge 3.7. Çalışmada embriyo eksplantından kallus oluşumu için kullanılan ortam içerikleri; Ortam Uygulamalar içeriği I.Uygulama II.Uygulama III.Uygulama IV.Uygulama V.Uygulama MS 4.4 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l 4.4 g/l bazal Sükroz 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l 2,4-D 0 mg/l 0 mg/l 0.5 mg/l 1 mg/l 2 mg/l BAP 0 mg/l 0.5 mg/l 0.5 mg/l 0.5 mg/l 0.5 mg/l ph Agar 7.5 g/l 7.5 g/l 7.5 g/l 7.5 g/l 7.5 g/l Yapılan çalışmalardaki kültüre alma öncesi ortamların ph 5.7 ye ayarlanmış ve katılaştırıcı olarak (7.5 g/l) agar kullanılmıştır. Çimlendirme ortamı otoklav öncesi tüplere katılmıştır ve diğer ortamlarla birlikte 121 ºC de 1.05 atm basınç altında 15 dk sterilizasyon amacı ile otoklav edilmiştir. Otoklav sonrası diğer ortamlar 90 mm x15 mm lik petri kaplarına dökülmüştür. Tüm kültürler 27 ºC ± 2 ºC sıcaklık ve 16/8 saat aydınlık/karanlık koşullarında tutulmuştur ve kültürler 4 haftada bir kez yeni besi ortamına aktarılmışlardır. Altkültürler boyunca elde edilen kalluslara ait gözlemler gerçekleştirilmiştir ve embriyogenik kallus ağırlıkları hassas terazi ile steril koşullarda kabin içerisinde alınmıştır. Her eksplant için hormon içermeyen kontrol ortamı kullanılmıştır (Çizelge 3.2.) Yaprak Eksplantlarının Kültüre Alınması In vitro koşullarda çimlendirilen tohumlardan elde edilen bitkiler, steril kabin içerisinde, steril pens ve bistüri yardımı ile yapraklar 3 farklı ortamda her petri içerisine 5 eksplant ve 3 er petri ile kültüre alınmıştır. Kültüre alınmış eksplantlardan bazı genotiplerden 4-6 hafta sonunda kallus oluşumları gözlenmiştir. 27

43 3.MATERYAL VE METOD a b c d Şekil 3.5. a. Gelişmiş bitkinin tüpten çıkarılması: b. Bitkiciğin kurutma kağıdı üzerindeki görünümü, c. Yaprak eksplantının kesilmesi, d. Yaprak eksplantının besin ortamına yerleştirilmesi Epikotil Eksplantlarının Kültüre Alınması Tohumların çimlendirilmesiyle elde edilen bitkiciklerden, steril kabin içerisinde, steril pens ve bistüri yardımı ile epikotil eksplantı izole edilerek kültüre alınmıştır (Şekil 3.6.). Üç farklı ortam denemesinde de her petri içerisine 5 eksplant bulunuyor ve çalışma 3 tekerrürlü yapılmıştır. Her petri içerisine 25 ml ortam konulmuştur. 28

44 3.MATERYAL VE METOD a b c d e f Şekil 3.6. a. Gelişmiş bitkicik, b. Gelişmiş bitkicik, c. Epikotil eksplantının bitkiden kesilmesi, d. Epikotil parçası e. Epikotil eksplantının kesilmesi f. Epikotil eksplantının besi yerine yerleştirilmesi Kotiledon Eksplantlarının Kültüre Alınması Çimlendirilmiş tohumlardan elde edilen bitkilerden, steril kabin içerisinde, steril pens ve bistüri yardımı ile ilk oluşan yaprakları (kotiledonları) izole edilerek kültüre alınmıştır (Şekil 3.7.). Üç farklı ortam denemesinde de her petri içerisine 5 eksplant ile 3 tekerrürlü yapılmıştır. Her petri içerisine 25 ml ortam konulmuştur. 29

45 3.MATERYAL VE METOD a b c d Şekil 3.7. a. Gelişen bitkiciğin görünüşü, b. Kotiledon eksplantının bitkiden kesilmesi c. Kotiledon eksplantının kesilmesi, d. Kotiledon eksplantının besi yerine yerleştirilmesi Kök Eksplantlarının Kültüre Alınması Elde edilen bitkilerden, steril kabin içerisinde, steril pens ve bistüri yardımı ile saçak kökler kesilerek kültüre alınmıştır (Şekil 3.8.). Beş farklı ortam kullanılmış ve bu ortamlarda da aynı uygulamalar yapılmıştır. Kültüre alınmış eksplantlardan bazı genotiplerden 4-6 hafta sonunda kallus oluşumları gözlenmiştir. 30

46 3.MATERYAL VE METOD a b c d Şekil 3.8. a. Gelişmiş bitkicik, b. Gelişmiş bitkicik, c. Kök eksplantının bitkiden kesilmesi, d. Kök eksplantının besi yerine yerleştirilmesi Embriyo Eksplantlarının Kültüre Alınması Sterilizasyonu tamamlanan tohumlardan, steril kabin içerisinde, steril pens ve bistüri yardımı ile embriyolar izole edilerek kültüre alınmıştır. Tohum kabukları embriyolardan uzaklaştırılmıştır. 5 farklı ortam kullanılmıştır. Her petri içerisine 25 ml ortam konulmuş ve her bir petriye de 5 eksplant gelecek şekilde kültüre alınmıştır. Kültüre alınmış eksplantlardan 4-6 hafta sonunda kallus oluşumları gözlenmiştir Elde Edilen Kalluslardan Embriyogenik Kallus Elde Edilmesi Yaprak, epikotil, kotiledon, embriyo ve kök eksplantlarının kültüre alınması sonucu elde edilen embriyogenik kallusları herhangi bir büyümeyi düzenleyici 31

47 3.MATERYAL VE METOD içermeyen MS tuzları, MT vitaminleri (Çizelge 3.8.), ME (500 mg/l), myo-inositol (100 mg/l), sükroz (50 g/l) ve agar (7.5 g/l) içeren ortamda kültüre alınmıştır. Çizelge 3.8. Çalışmada kullanılan, MS vitaminden modifiye edilmiş MT vitamin içeriği. Vitamin MS (1962) ortamı (mg/l) MT (1969) ortamı (mg/l) Moleküler ağırlık (g) Glycine Myo-inositol Nicotinamide Pyridoxine HCl Thiamine HCl Çalışmada Yapılan Sayım ve Gözlemler Çalışmada tesadüf blokları deneme deseni uygulanmış, denemede 5 farklı eksplant ve her eksplant için de 5 farklı ortam kullanılmıştır. Çalışma 3 tekerrürlü yapılmıştır. Canlılık oranları her bir eksplant için ayrı ayrı hesaplanarak yüzde (%) ve ortalama değerlerinin analizleri yapılmıştır. Kallus gelişimleri gözlemlenmiş ve kallus oluşum ortalamaları ve yüzde (%) değerleri hesaplanarak istatistiksel analizleri yapılmıştır. Her bir genotip için oluşan embriyogenik kalluslar morfolojik olarak (parlak ve kırılgan) ayırt edilip EK oluşum oranları, EK ağırlıkları ve ortalamaları yüzde (%) olarak bulunmuştur. İstatistiksel analizler SPSS programı kullanılarak yapılmıştır. Denemede değerlendirilen değişkenler için varyans analiz tabloları DUNCAN prosedürü kullanılarak oluşturulmuştur. İlgili grafikler Microsoft Excel programı ile yapılmıştır. 32

48 4.BULGULAR ve TARTIŞMA 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Embriyo Kültürü Deneme Sonuçları Embriyo Eksplantlarında Canlılık Oranlarının Saptanması Materyal ve Metod kısmında da belirtildiği gibi tohumlar genotipe göre değişmekle birlikte olgun meyvelerden izole edilerek kültüre alınmışlardır. Embriyo kültüründe beş farklı ortam (herhangi bir büyüme düzenleyici içermeyen kontrol ortamı; 2,4-D (0 mg/l) + BAP (0.5 mg/l); 2,4-D (0.5 mg/l) + BAP (0.5 mg/l); 2,4-D (1 mg/l) + BAP (0.5 mg/l); 2,4-D (2 mg/l) + BAP (0.5 mg/l) kullanılmıştır. Bu ortamlar içerisinde en iyi sonuç 2,4-D (2 mg/l) + BAP (0.5 mg/l) uygulamasında görülmüştür. Genel ortalama değerlendirildiğinde embriyo kültürüne en iyi tepki veren en iyi canlılık oranına sahip genotip, Troyer sitranjı, en düşük yaşama oranına sahip olan genotip ise E. glauca olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.1.; Şekil 4.1.). Denemede kullanılan genotipler arasındaki sayısal farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur. Troyer sitranjı genotipi canlılık oranı bakımından en yüksek değere sahip olmuştur. Besin ortamları arasındaki farklılık istatistiki olarak önemli olmakla birlikte, kontrol ortamının canlılık oranı üzerinde daha etkili olduğu bulunmuştur (P<0.05). 33

49 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Çizelge 4.1. Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik 2,4-D ve BAP uygulamaları içeren ortamlarındaki embriyo kültürlerinin canlılık yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları; Genotip Gou Tou turuncu Tuzcu 891 turuncu Besin Ortamı 1.ortam 2.ortam 3.ortam 4.ortam 5.ortam ortam ±sh 3 -%20 1-%7 4-%26 3-%20 4-% bc±0.3 3-%20 1-%7 1-%7 1-%7 3-%20 1.8de± 0.3 Carrizo sitranjı 3-%20 3-%20 1-%7 4-%26 3-%20 2.8bcd±0.3 Troyer sitranjı 4-%26 3-%20 5-%33 5-%33 5-%33 4.4a± 0.3 Yerli üç yapraklı Kleopatra mandarini Antalya Kleopatra mandarini Swingle sitrumelo 5-%33 2-%13 4-%26 2-%13 1-%7 2.8bcd±0.3 4-%26 5-%33 2-%13 3-%20 4-%26 3.6ab± %20 1-%7 1-%7 2-%13 2-%13 1.8de± %26 1-%7 1-%7 3-%20 3-%20 2.4cde±0.3 S. buxifolia 3-%20 2-%13 5-%33 4-%26 3-%20 3.4abc±0.3 E. glauca 1-%7 2-%13 3-%20 1-%7 1-%7 1.6e± 0.3 ortalama±sh 3.3a± b± ab± ab± ab±0.2 genotip 0.00 ortam 0.04 Ö.d genotip * ortam 0.00 (*1:kontrol, 2: 2,4-D (0 mg/l) BAP (0.5 mg/l), 3: 2,4-D (0.5 mg/l), BAP (0.5 mg/l) 4:2,4-D (1 mg/l) BAP (0.5 mg/l), 5: 2,4-D (2 mg/l) BAP (0.5 mg/l)). 34

50 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Şekil 4.1. Turunçgil genotiplerinin değişik 2,4-D ve BA uygulamaları içeren ortamlarındaki embriyo kültürlerinin canlılık yüzdelerine ait ortalamalar, standart sapma değerlerinin grafikleri (*1:kontrol, 2: 2,4-D (0 mg/l) BAP (0.5 mg/l), 3: 2,4-D (0.5 mg/l), BAP (0.5 mg/l) 4:2,4-D (1 mg/l) BAP (0.5 mg/l), 5: 2,4-D (2 mg/l) BAP (0.5 mg/l)). 35

51 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Embriyo Eksplantlarında Kallus Oluşum Oranlarının Saptanması Kültürde tutulan embriyoların kallus oluşturma oranları incelendiğinde; denemenin kontrol uygulamasında, on genotipte kallus oluşumu gözlenmemiştir. Rubidoux üç yapraklı genotipine ait tohumlar bakteri ile bulaşık olduğundan embriyo eksplantı denemesine alınamamıştır. Genel ortalamalar değerlendirildiğinde en iyi kallus oluşum yüzdesi 2,4-D (2 mg/l) + (0.5 mg/l) BAP içeren besi ortamında gözlenirken, en yüksek kallus olşumu Troyer sitranjı anacında gerçekleşmiş ve bu genotipi Carrizo sitranjı, Kleopatra mandarini, Gou Tou turuncu genotipleride izlemiştir (Çizelge 4.2.; Şekil 4.2.). Denemede kullanılan genotipler arasındaki sayısal farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur. Troyer sitranjı ve Carrizo sitranjı genotipleri kallus oluşumu bakımından en yüksek değere sahip olmuştur. Besin ortamları arasındaki farklılık istatistiki olarak önemli olmakla birlik de 2,4-D (2 mg/l) ve BAP (0.5 mg/l) içeren besin ortamı en yüksek değere sahip olduğu bulunmuştur (P<0.05). Swingle sitrumelo, Yerli üç yapraklı, E. glauca ve Antalya Kleopatra Mandarini genotiplerinde gözlenen bu düşük kallus oluşum oranlarının genotipe bağlı olabileceği düşünülmekle beraber bundan sonra yapılacak çalışmalarda bu genotiplerde daha yüksek kallus oluşumunun sağlanması amacıyla farklı besi ortamları farklı oksin ve sitokinin konsantrasyonları ve kombinasyonları denenmelidir. Embriyo kültüründe çalışılan tüm turunçgil anaçlarına ait kallusların görüntüleri Şekil 4.3. verilmiştir. Chakravarty ve Goswami 1999 embriyonik kallus elde etmeye yönelik turunçgillerde (Citrus acida) yaprak eksplantlarında yaptıkları çalışmada 2,4-D (1 mg/l) ve BA (0.5 mg/l) kombinasyonlarında en yüksek kallus oluşum oranları gözlenmiştir. Yaptığımız çalışmada benzer şekilde en iyi kallus oluşumu (2 mg/l) 2,4-D içeren besi ortamında elde edilmiştir. Araştırıcıların bulguları ile aradaki farkın kullanılan esplant ile besi ortamının içeriğinden ve genotip kaynaklı olabileceği düşünülmüktedir. Bu durumunda embriyogenik kallus oluşumu için yüksek oranlarda oksin (2,4-D) içeren ortam kullanımı önerilebilir. 36

52 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Çizelge 4.2. Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik 2,4-D ve BAP uygulamaları içeren ortamlarındaki embriyo kültürlerinin kallus yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları. Besin Ortamı Genotip 1.ortam 2.ortam 3.ortam 4.ortam 5.ortam ortalama±sh Gou Tou turuncu 2-%13 1-%7 1-%7 2-%13 4-%26 2bc±0.34 Tuzcu 891 turuncu Carrizo sitranjı Troyer 2-%13 2-%13 1-%7 1-%7 3-%20 1.8d± %20 2-%13 4-%26 3-%20 4-%26 3.2a±0.34 sitranjı 4-%26 3-%20 4-%26 3-%20 5-%33 3.8a±0.34 Yerli üç yapraklı Kleopatra mandarini Antalya Kleopatra mandarini Swingle sitrumelo S. 2-%13 1-%7 1-%7 1-%7 2-%13 1.4d± %20 2-%13 3-%20 3-%20 4-%26 3ab± %13 1-%7 2-%13 1-%7 1-%7 1.4d± %13 1-%7 1-%7 1-%7 2-%13 1.4d±0.34 buxifolia 2-%13 1-%7 2-%13 2-%13 3-%20 2bc±0.34 E. glauca 2-%13 1-%7 1-%7 1-%7 2-%13 1.4d±0.34 ortalama ±sh Ö.d 2.4ab± c±0.24 2bc± bc±0.24 3a±0.24 genotip 0.00 ortam 0.00 genotip * ortam 1.00 (*1:kontrol 2:2,4-D (0 mg/l) BAP (0.5 mg/l), 3: 2,4-D (0.5 mg/l), BAP (0.5 mg/l) 4:2,4-D (1 mg/l) BAP (0.5 mg/l), 5: 2,4-D (2 mg/l) BAP (0.5 mg/l)) 37

53 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Şekil 4.2. Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik 2,4-D ve BAP uygulamaları içeren ortamlarındaki embriyo kültürlerinin kallus yüzdelerine ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmalarına ait grafikleri (*1:kontrol 2:2,4-D (0 mg/l) BAP (0.5 mg/l), 3: 2,4-D (0.5 mg/l), BAP (0.5 mg/l) 4:2,4-D (1 mg/l) BAP (0.5 mg/l), 5: 2,4-D (2 mg/l) BAP (0.5 mg/l)) 38

54 4.BULGULAR ve TARTIŞMA a b c d e f g h ı Şekil 4.3. Embriyo eksplantından elde edilen kallusların görüntüleri; a. Antalya Kleopatra mandarini, b. Carrizo sitranjı c. E. glauca, d. Gou Tou turuncu e. Swingle sitrumelo, f. Tuzcu 891 turuncu, g. Kleopatra mandarini, h. Troyer sitranjı ı. Tuzcu 891 turuncu Embriyo Eksplantlarından Elde Edilen Embriyogenik Kallus Oluşum Oranlarının Saptanması Uygulanan denemelerde, embriyo eksplantlarından gün sonra elde edilen kalluslar stereo mikroskop altında incelenerek oluşan embriyogenik kalluslar saptanmaya çalışılmıştır. Embriyogenik kalluslar (EK); parlak, kırılgan, kolay dağılabilen, dolgun yuvarlak yapılarıyla diğer kalluslardan ayırt edilmişlerdir. 39

55 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Kontrol uygulamasının EK oluşumuna etkisi görülmemiştir. Denemede kullanılan genotipler arasındaki sayısal farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur. Troyer sitranjı genotipi EK oluşumu bakımından en yüksek değere sahip olmuştur. Besin ortamları arasındaki farklılık istatistiki olarak önemli olmamakla birlikte kullanılan besin ortamları sayısal olarak kontrole göre yüksek değerlere sahip olduğu bulunmuştur (P<0.05) (Çizelge 4.3.; Şekil 4.4.). Varol, (2006) Çalışmasında ovül eksplantını kullanarak in vitro koşullarda kallus oluşumunu ve bitki oluşumunu araştırmıştır. Deneme sonuçlarına bakıldığında en yüksek kallus oluşturma oranı C. aurantium (% 52) türünden elde edilmiş, bunu % 40 kallus oluşturma oranı ile P. trifoliata (% 40) izlemiştir. En düşük kallus oluşturma oranı % 5 ile C. medica da gerçekleşmiştir. C. grandis türünden kallus oluşumu gözlenmemiştir. Yaptığımız çalışmada ise embriyo, epikotil, kotiledon, kök ve yaprak eksplantları kullanılmıştır. Deneme sonuçlarına bakıldığında benzer şekilde kallus oluşumu P. trifoliata genotipinden sağlanmıştır. Araştırıcıların bulguları ile aradaki farkın kullanılan eksplant ve besin ortamı kaynaklı olabileceği düşünülmektedir. 40

56 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Çizelge 4.3. Turunçgil genotiplerinin değişik 2,4-D ve BA uygulamaları içeren ortamlarındaki embriyo kültürlerinin EK oluşum yüzdelerine ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları; Besin Ortamı Genotip 1.ortam 2.ortam 3.ortam 4.ortam 5.ortam Ortam±sh Gou Tou turuncu % % % % bc±0.15 Tuzcu 891 turuncu % % % % bc±0.15 Carrizo sitranjı Troyer sitranjı Yerli üç % % % %80 0.8ab± % % % %80 1a±0.15 yapraklı % % % %20 0.4bc±0.15 Kleopatra mandarini Antalya Kleopatra mandarini Swingle % % % %60 0.8ab± % % % % bc±0.15 sitrumelo % % % % c±0.15 S. buxifolia % % % % bc±0.15 E. glauca % % % % c±0.15 Ortalama±s h 0b± a± a± a± a±0.1 genotip 0.00 ortam 0.00 Ö.d genotip * 1.00 ortam (*1:Kontrol, 2: 2,4-D 0 mg/l) BAP (0.5 mg/l), 3: 2,4-D (0.5 mg/l), BAP (0.5 mg/l) 4:2,4-D (1 mg/l) BAP (0.5 mg/l),5: 2,4-D (2 mg/l) BAP (0.5 mg/l)). 41

57 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Şekil 4.4. Denemedeki embriyo kültürlerinin EK oluşumlarına ait ortalama grafikleri (*1:Kontrol, 2: 2,4-D 0 mg/l) BAP (0.5 mg/l), 3: 2,4-D (0.5 mg/l), BAP (0.5 mg/l) 4:2,4-D (1 mg/l) BAP (0.5 mg/l),5: 2,4-D (2 mg/l) BAP (0.5 mg/l)). 42

58 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Genel ortalama değerlendirildiğinde genotipler içerisinde en yüksek EK Troyer sitranjında gözlenmiştir. En iyi EK 2,4-D (2 mg/l)+ BAP (0.5 mg/l) uygulamasında gözlenmiştir. Bu durumda genotipi için embriyogenik kallus oluşumunda 2,4-D nin (2 mg/l) kullanılması önerilebilir. Elde edilen EK görüntüleri alınmıştır (Şekil 4.5.). Tez çalışması kapsamında söz konusu on anaca ait kalluslardan dışarıdan eklenen bitki büyüme düzenleyici olmaksızın EK elde edilmiştir. Aynı şekilde Biçen (2008) turunçgillerde yapmış oldukları ovül kültürü çalışmalarında MS (1962) ve Malt Ekstrakt kullanarak başarılı bir şekilde EK elde etmişlerdir. 43

59 4.BULGULAR ve TARTIŞMA ı i Şekil 4.5. Embriyo eksplantlarından elde edilen EK görüntüleri; a. Carrizo sitranjı, b.troyer sitranjı, c. S. buxifolia, d. Swingle sitrumelo, e. Yerli Üç Yapraklı, f. Tuzcu 891 turuncu, g. Antalya Kleopatra Mandarini, h. Kleopatra Mandarini, ı. E. glauca, i. Gou Tou Turuncu Embriyo Eksplantlarından Elde Edilen Embriyogenik Kallusların Ağırlık Ortalamaların Saptanması Embriyolar kültüre alındıktan gün sonra ilk alt kültürleri gerçekleştirilmiştir. İkinci alt kültürlerinden sonra kallus oluşumları görülmüştür. Elde edilen bu kalluslar hormonsuz ortama aktarılmıştır. Büyüme düzenleyici 44

60 4.BULGULAR ve TARTIŞMA bulunmayan ortama aktarılan kalluslarda ikinci altkültüre alındıktan sonra embriyogenik kallus oluşumu görülmüştür. Kültüre alma öncesi elde edilen EK ağırlıkları steril kabin içerisinde hassas terazi ile ölçülmüştür. Swingle sitrumelo 1.13 g, Carrizo sitranjı 0.98 g, Troyer sitranjı 0.85 g ile en yüksek kallus ağırlıklarının saptandığı genotipler olarak belirlenmiştir. Yerli üç yapraklı 0.61 g, S.buxifolia 0.45 g, Tuzcu 891 Turuncu 0.45 g, Kleopatra mandarini 0.44 g, Gou Tou turuncu 0.41 g, E. glauca 0.30 g, Antalya Kleopatra mandarini 0.25 g kallus ağırlığına sahip genotipler olarak bulunmuştur (Çizelge 4.4.; Şekil 4.6.). Denemede kullanılan genotipler arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). Swingle sitrumelo genotipi EK ağırlığı bakımından önerilmektedir. Besin ortamı arasında ki farklılık ve besin yeri*genotip interaksiyon arasındaki farklılık önemli bulunmuştur (P<0.05). 2,4-D (2 mg/l) +BAP (0.5 mg/l) ortamı en yüksek EK ağırlığını sağlamış ortam olarak bulunmuştur. EK oluşumu için bu ortam önerilmektedir. 45

61 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Çizelge 4.4. Embriyo eksplantlarından elde edilen embriyogenik kallus ağırlıklarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları; Genotip 1. Ortam 2. Ortam 3. Ortam 4. Ortam Ortalama±sh Gou Tou turuncu f±0.03 Tuzcu 891 turuncu e±0.03 Troyer sitranjı c±0.03 Carrizo sitranjı b±0.03 Yerli üç yapraklı d±0.03 Kleopatra mandarini Antalya Kleopatra mandarini Swingle sitrumelo e± f± a±0.03 S. buxifolia e±0.03 E. glauca e±0.03 Ortalama±sh 0.60a± b± a± a±0.02 Genotip 0.00 Ö. d Ortam 0.00 Genotip * Ortam 0.00 (*1:kontrol, 2: 2,4-D (0 mg/l) BAP (0.5 mg/l), 3: 2,4-D (0.5 mg/l), BAP (0.5 mg/l) 4:2,4-D (1 mg/l) BAP (0.5 mg/l), 5: 2,4-D (2 mg/l) BAP (0.5 mg/l). 46

62 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Şekil 4.6. Embriyo esplantlerinden elde edilen EK ların ağırlıklarına ait ortalama grafikleri (*1:2,4-D 0 mg/l+bap 0.5 mg/l, 2:2,4-D 0.5 mg/l+bap 0.5 mg/l, 3:2,4-D 1 mg/l+bap 0.5 mg/l, 4:2,4-D 2 mg/l+bap 0.5 mg/l) 47

63 4.BULGULAR ve TARTIŞMA 4.2. Kök Eksplantı Kültürü Deneme Sonuçları Kök Eksplantlarında Canlılık Oranlarının Saptanması Materyal ve Metod kısmında da belirtildiği gibi tohumlar genotipe göre değişmekle birlikte olgun meyvelerden izole edilerek kültüre alınmışlardır. Steril edilmiş tohumlar bitki büyümeyi düzenleyici içermeyen MS (1962) bazal ortamına aktarılmıştır. 4-6 hafta sonra gelişen bitkicikten kök parçaları alınmıştır. Kök kültüründe beş farklı ortam (kontrol ortamı; 2,4-D (0 mg/l) + KİN (0.5 mg/l); 2,4-D (0.5 mg/l) + KİN (0.5 mg/l); 2,4-D (1 mg/l) + KİN (0.5 mg/l); 2,4-D (2 mg/l) + KİN (0.5 mg/l) kullanılmıştır. Bu ortamlar içerisinde canlılık oranlarına bakıldığında bitkilerin canlılıkları içerisinden en iyi sonucu 2,4-D (2 mg/l) + KİN (0.5 mg/l) bulunduran ortamdan sağlanmıştır. Kültürde tutulan köklerin canlılık oranları incelendiğinde; denemenin kontrol uygulamasında on bir genotipte sararma ve kuruma görülmüştür. Denemede kullanılan genotipler arasındaki sayısal farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur. E. glauca genotipi canlılık oranı oluşumu bakımından en yüksek değere sahip olmuştur. Besin ortamları arasındaki farklılık istatistiki olarak önemli olmakla birlikde kullanılan besin ortamlarından 2,4-D (2 mg/l) + KİN (0.5 mg/l) hormonlarını içeren besin ortamı sayısal olarak yüksek değerlere sahip olduğu bulunmuştur (P<0.05). Genotip ve besin ortamının birlikte etkisi istatistiki olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). S. buxifolia da gözlenen düşük canlılık oranlarının genotipe bağlı olabileceği düşünülmekle beraber bundan sonra yapılacak çalışmalarda bu genotipte daha yüksek canlılık oranı sağlanması amacıyla farklı besi ortamları farklı oksin ve sitokinin konsantrasyonları ve kombinasyonları denenmelidir. Genel ortalamalar değerlendirildiğinde en yüksek canlılık oranına 2,4-D (2 mg/l) + (0.5 mg/l) KİN içeren besin ortamında E. glauca anacında gerçekleşmiş ve bu genotipi Carrizo sitranjı ve Swingle sitrumelo genotipleri izlemişlerdir (Çizelge 4.5.; Şekil 4.7.). 48

64 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Çizelge 4.5. Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik 2,4-D ve KİN uygulamaları içeren ortamlarındaki kök kültürlerinin canlılık oranlarına ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları. Besin ortamı Genotip 1.ortam 2.ortam 3.ortam 4.ortam 5.ortam ortalama ± sh Gou Tou turuncu % % % % ab±0.16 Tuzcu 891 turuncu % % % % bc±0.16 Carrizo sitranjı % % % % ab±0.16 Troyer sitranjı % % % % ab±0.16 Yerli üç yapraklı % % % d±0.16 Rubidoux üç yapraklı % % %7 0.4d±0.16 Kleopatra mandarini % % %13 0.4d±0.16 Antalya Kleopatra mandarini % % % bc±0,16 Swingle sitrumelo % % % % ab±0,16 S.buxifolia % % % % d±0.16 E.glauca % % % % a±0.16 ortalama± sh 0d± c± bc± a± ab±0.11 genotip 0,00 ortam 0,00 genotip * Ö.d. ortam 0,00 (*1:Kontrol,2:2,4-D 0 mg/l+kin 0.5 mg/l, 3:2,4-D 0.5 mg/l+kin 0.5 mg/l, 4:2,4-D 1 mg/l+kin 0.5 mg/l, 5:2,4-D 2 mg/l+kin 0.5 mg/l). 49

65 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Şekil 4.7. Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik 2,4-D ve KİN uygulamaları içeren ortamlarındaki kök kültürlerinin canlılık oranlarına ait ortalama, standart sapma ve ortalama grafikleri (*1:Kontrol,2:2,4-D 0 mg/l+kin 0.5 mg/l, 3:2,4-D 0.5 mg/l+kin 0.5 mg/l, 4:2,4-D 1 mg/l+kin 0.5 mg/l, 5:2,4-D 2 mg/l+kin 0.5 mg/l). 50

66 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Kök Eksplantlarından Kallus Oluşum Oranlarının Saptanması Elde edilen bitkilerin kök eksplantlarından kallus oluşturma oranları incelendiğinde; denemenin kontrol uygulamasında; on genotipte kallus oluşumu gözlenmemiştir. Denemede kullanılan genotipler arasındaki sayısal farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur. Gou Tou turuncu, Swingle sitrumelo, Carrizo sitranjı, S.buxifolia ve E.glauca genotipleri kallus oluşumu bakımından en yüksek değere sahip olmuştur. Besin ortamları arasındaki farklılık istatistiki olarak önemli olmakla birlikte kullanılan besin ortamlarından 2,4-D (1 mg/l)+kin (0.5 mg/l) ve 2,4-D (2 mg/l)+kin (0.5 mg/l) hormonlarını içeren besin ortamı sayısal olarak yüksek değerlere sahip olduğu bulunmuştur (P<0.05) (Çizelge 4.6.; Şekil 4.8.). Genel ortalamalar değerlendirildiğinde en iyi kallus oluşum yüzdesi 2,4-D (2 mg/l) + KİN (0.5 mg/l) içeren besi ortamında gözlenirken en yüksek kallus oluşumu Gou Tou turuncu anacında gerçekleşmiş ve bu genotipi E. glauca genotipi izlemiştir. Bundan sonraki yapılacak çalışmalarda besin ortamı olarak 2,4-D (2 mg/l) içeren besin ortamı önerilebilir. Çalışmada KİN (0.5 mg/l) oranı düşük oranda kullanılmıştır. Bazı araştırıcılar KİN nin artmasının kallus oluşumunun azalmasına neden olduğunu belirtmiştir. Bu araştırıcıların Kinnow mandarininde yaptıkları çalışmalarında ovül eksplantı kullanılarak maksimum kallus oluşumu (% 31.94) (2 mg/l) KİN içeren ortamdan elde edilmiştir (Singh ve ark., 2006). Rubidoux üç yapraklı ve Kleopatra mandarini nde gözlenen düşük kallus oluşum oranlarının genotipe bağlı olabileceği düşünülmekle beraber bundan sonra yapılacak çalışmalarda bu genotipte daha yüksek kallus oluşumunun sağlanması amacıyla farklı besi ortamları farklı oksin ve sitokinin konsantrasyonları ve kombinasyonları denenmelidir. Kök kültüründe çalışılan tüm turunçgil anaçlarına ait kallusların görüntüleri Şekil 4.9. da verilmiştir. 51

67 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Çizelge 4.6. Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik 2,4-D ve KİN uygulamaları içeren ortamlarındaki kök kültürlerinin kallus oluşumlarına ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları; Besin ortamı Genotip 1.ortam 2.ortam 3.ortam 4.ortam 5.ortam Ortalama ± sh Gou Tou turuncu % % % % a±0.16 Tuzcu 891 turuncu % % % % ab±0.16 Carrizo sitranjı % % % % a±0.16 Troyer sitranjı % % % % abc±0.16 Yerli üç yapraklı Rubidoux üç yapraklı % %13 0.4bcd± %20 0.2d±0.16 Kleopatra mandarini Antalya Kleopatra mandarini Swingle sitrumelo % %7 0.2d± % % cd± % % % % a±0.16 S.buxifolia % % % % a±0.16 E.glauca % % % %27 1a±0.16 Ortalama±sh 0c± b± b± a± a±0.11 Genotip 0.00 Ö.d. Ortam 0.00 genotip * ortam 0.37 (*1:Kontrol,2:2,4-D 0 mg/l+kin 0,5 mg/l, 3:2,4-D 0.5 mg/l+kin 0,5 mg/l, 4:2,4-D 1 mg/l+kin 0,5 mg/l, 5:2,4-D 2 mg/l+kin 0,5 mg/l). 52

68 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Şekil 4.8. Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik 2,4-D ve KİN uygulamaları içeren ortamlarındaki kök kültürlerinin kallus oluşumlarına ait ortalama, standart sapma ve ortalama grafikleri (*1:Kontrol,2:2,4-D 0 mg/l+kin 0.5 mg/l, 3:2,4-D 0.5 mg/l+kin 0.5 mg/l, 4:2,4-D 1 mg/l+kin 0.5 mg/l, 5:2,4-D 2 mg/l+kin 0.5 mg/l). 53

69 4.BULGULAR ve TARTIŞMA a b c d e f g h ı i j k Şekil 4.9. Kök eksplantlarından elde edilen kallusların görüntüleri: a. Troyer sitranjı, b. Yerli üç yapraklı, c. E. glauca, d. S. buxifolia, e. Rubidoux üç yapraklı f. Carrizo sitranjı, g. Swingle sitromelo, h. Tuzcu 891 turuncu, ı. Kleopatra mandarini i. Gou Tou turuncu, j. Antalya Kleopatra mandarini k. Kleopatra mandarini. 54

70 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Kök Eksplantlarından Elde Edilen Embriyogenik Kallus Oluşum Oranlarının Saptanması Uygulanan denemelerde, köklerden gün sonra elde edilen kalluslar stereo mikroskop altında incelenerek oluşan EK saptanmaya çalışılmıştır. EK parlak, kırılgan, kolay dağılabilen, dolgun yuvarlak yapılarıyla diğer kalluslardan ayırt edilmişlerdir. On bir genotip içeresinde bazı genotiplerde EK oluşumu gözlenmiştir Denemede kullanılan genotipler arasındaki sayısal farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur ve Gou Tou turuncu genotipi EK oluşumu bakımından en yüksek değere sahip olmuştur. Besin ortamları arasındaki farklılık istatistiki olarak önemli olmakla birlikte kullanılan besin ortamlarından 2,4-D (2 mg/l)+kin (0.5 mg/l) hormonlarını içeren besin ortamı sayısal olarak yüksek değerlere sahip olduğu bulunmuştur (P<0.05). Genotip ve besin ortamının birlikte etkisi istatistiki olarak önemli bulunmuştur (P<0.05) (Çizelge 4.7.; Şekil 4.10.). Genel ortalama değerlendirildiğinde; Gou Tou turuncu genotipi en yüksek EK oluşumuna sahip genotip olarak gözlenmiştir. 2,4-D (2 mg/l) + KİN (0.5 mg/l) uygulamasında en fazla EK saptanmıştır (Şekil 4.11.). Tez çalışması kapsamında söz konusu yedi anaca ait kalluslardan dışarıdan eklenen bitki büyüme düzenleyici olmaksızın EK elde edilmiştir. Aynı şekilde Gill ve ark. (1994) turunçgillerde yapmış oldukları yaprak, kotiledon, epikotil ve kök kültürü çalışmalarında MS (1962) ve ME (500 mg/l) kullanarak başarılı bir şekilde EK elde etmişlerdir. 55

71 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Çizelge 4.7. Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik 2,4-D ve KİN uygulamaları içeren ortamlarındaki kök kültürlerinin EK oluşumlarına ait ortalama, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları; Besin ortamı ortalama Genotip 1.ortam 2.ortam 3.ortam 4.ortam 5.ortam ± sh Gou Tou turuncu % % % %80 1.8a±0.19 Tuzcu 891 turuncu Carrizo sitranjı Troyer sitranjı % % % % % % % % % % % %20 0.6cd± bc± cd±0. 19 Yerli üç yapraklı d±0.19 Rubidou üç Yapraklı d±0.19 Kleopatra mandarini Antalya Kleopatra mandarini d± d±0.19 Swingle sitrumelo % % % %53 1bc±0.19 S.buxifolia % % % %47 E. glauca % % % %53 ortalama ± sh Ö.d. 0c± b± b± b± a±0.12 genotip 0.00 bortam 0.00 genotip * bortam ,06bc± ab±0. 19 (*1:Kontrol,2:2,4-D 0 mg/l+kin 0.5 mg/l, 3:2,4-D 0.5 mg/l+kin 0.5 mg/l, 4:2,4-D 1 mg/l+kin 0.5 mg/l, 5:2,4- D 2 mg/l+kin 0.5 mg/l). 56

72 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Şekil Denemede test edilen turunçgil genotiplerinin değişik 2,4-D ve KİN uygulamaları içeren ortamlarındaki kök kültürlerinin EK oluşumlarına ait ortalama, standart sapma ve ortalama grafikleri (*1:Kontrol,2:2,4-D 0 mg/l+kin 0.5 mg/l, 3:2,4-D 0.5 mg/l+kin 0.5 mg/l, 4:2,4-D 1 mg/l+kin 0.5 mg/l, 5:2,4-D 2 mg/l+kin 0.5 mg/l) 57

73 4.BULGULAR ve TARTIŞMA a b c d e f g Şekil Kök eksplantlarından elde edilen EK görüntüleri: a. Carrizo sitranjı, b. S. buxifolia, c.troyer sitranjı, d. Tuzcu 891 turuncu, e. E. glauca, f. Gou Tou turuncu, g. Swingle sitrumelo Kök Eksplantlarından Elde Edilen Embriyogenik Kallus Ağırlık Ortalamalarının Saptanması Kökler kültüre alındıktan gün sonra ilk alt kültürleri gerçekleştirilmiştir. EK oluşumları ikinci alt kültürün sonlarında meydana geldiği gözlenmiştir. Kültüre alma öncesi elde edilen EK ağırlıkları alınmıştır. Elde edilen bu EK hormonsuz ortama aktarılmıştır. 58

74 4.BULGULAR ve TARTIŞMA S. buxifolia (0.39 g) en yüksek EK ağırlığına sahip genotip olarak bulunmuştur. Gou Tou turuncu 0.24 g, E. glauca 0.23 g, Troyer sitranjı ve Swingle sitrumelo 0.22 g, Tuzcu 891 turuncu 0.20 g, Carrizo sitranjı en düşük EK ağırlığına sahip (0.06 g) genotip olarak saptanmıştır (Çizelge 4.8., Şekil 4.12.). Denemede kullanılan genotipler arasındaki farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). Genotipler arasında S.buxifolia genotipi EK ağırlığı bakımından önerilmektedir. Besi ortamı arasında ki farklılık ve besin yeri*genotip interaksiyon arasındaki farklılık önemli bulunmuştur (P<0.05). Kök denemesinde besin ortamları içerisinden 2,4-D (1 mg/l) +KİN (0.5 mg/l) besin ortamı en yüksek EK ağırlığı sağlamış olarak önerilmektedir. Şekil Kök eksplantlarından elde edilen EK ağırlıklarına ait ortalama grafikleri (*1:2,4-D 2 mg/l+kin 0.5 mg/l, 2:2,4-D 1 mg/l+kin 0.5 mg/l, 3:2,4-D 0.5 mg/l+kin 0.5 mg/l, 4:2,4-D 0 mg/l+kin 0.5 mg/l). 59

75 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Çizelge 4.8. Kök eksplantlarından elde edilen embriyogenik kallus ağırlıklarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları; Genotip 1.Ortam 2.Ortam 3.Ortam 4.Ortam Ortalama±sh Gou Tou turuncu Tuzcu 891 turuncu b± c±0.013 Carrizo sitranjı d±0.013 Troyer sitranjı bc±0.013 Swingle sitrumelo bc±0.013 S.buxifolia a±0.013 E.glauca bc±0.013 Ortalama±sh 0.19c ± d ± a ± b ±0.01 Ö.d. Genotip 0.00 Besiyeri 0.00 (*1:kontrol,2 2:2,4-D (0 mg/l),kin (0.5 mg/l), 3: 2,4-D (0.5 mg/l),kin (0.5 mg/l), 4: 2,4-D (1 mg/l),kin (0.5 mg/l), 5: 2,4-D (2 mg/l),kin (0.5 mg/l)) Yaprak, Epikotil ve Kotiledon Eksplant Kültürü Deneme Sonuçları Yaprak, Epikotil ve Kotiledon Eksplantlarında Canlılık Oranlarının Saptanması Materyal ve Metod kısmında da belirtildiği gibi tohumlar genotipe göre değişmekle birlikte olgun meyvelerden izole edilerek kültüre alınmışlardır. Steril edilmiş tohumlar bitki büyümeyi düzenleyici içermeyen MS (1962) basal ortamına aktarılmıştır. 4-6 hafta sonra gelişen bitkicikten yaprak, epikotil ve kotiledon parçaları alınmıştır. Birinci denemede eksplantları beş farklı ortam (kontrol ortamı; NAA (0 mg/l) + KİN (0.5 mg/l); NAA (1 mg/l)+ KİN (0.5 mg/l); NAA (5 mg/l) + KİN (0.5 mg/l); 60

76 4.BULGULAR ve TARTIŞMA NAA (10 mg/l) + KİN (0.5 mg/l) kullanılmıştır. Bu deneme sonucunda eksplantlarda sararma ve kuruma gözlenmiştir. İkinci denemede birinciden farklı olarak NAA oranlarında değişiklik yapılmıştır. İkinci denemede (kontrol ortamı; NAA (0 mg/l) + KİN (0.5 mg/l); NAA (1 mg/l) + KİN (0.5 mg/l); NAA (1.5 mg/l) + KİN (0.5 mg/l); NAA (3 mg/l) + KİN (0.5 mg/l) ortamlar kullanılmıştır. Uygulanan beş farklı ortamdan da kallus oluşumu görülmemiştir. Birinci denemedeki gibi kuruma görülmüştür. Üçüncü deneme olarak 2,4-D (2 mg/l) + NAA (2 mg/l) + KİN (0.5 mg/l) uygulaması epikotil eksplantında kullanılmıştır. Bazı genotiplerde kallus ve EK oluşumu bulunmuştur. Diğer iki denemeden farklı olarak kullanılan 2,4-D (2 mg/l) büyüme düzenleyicisi eksplantların üçünde de kallus ve EK oluşumunu sağlanmıştır. Üçüncü denemede kullanılan genotipler arasındaki sayısal farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur. Swingle sitrumelo, S.buxifolia genotipleri canlılık oranı oluşumu bakımından en yüksek değere sahip olmuştur. Besin ortamının etkisi kontrole göre önemli bulunmuştur. Genotip*ortam ile birlikte etkisi istatistiki olarak önemli bulunmuştur. Eksplantlar arasındaki farklılık ve eksplant*ortam ve genotip*eksplant*ortam arasındaki farklılık istatistiki olarak önemli bulunmamıştır (P<0.05). Turunçgil anaçlarında yapılan epikotil kültürlerinde canlılık oranlarında 2,4-D (2 mg/l) +NAA (2 mg/l) + KİN (0.5 mg/l) besin otamı önerilebilmektedir (Çizelge 4.9., Şekil 4.13.). Kontrol uygulamasının on bir genotipte canlılık oranına saptanmamıştır. Üç ayrı denemede de kullanılan kontrol ortamlarında sonuç aynı olmuştur. Eksplantlar da sararma ve kuruma gözlenmiştir. 61

77 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Çizelge 4.9. Yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarının canlılık oranlarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları; 1.Yaprak 2.Epikotil 3.Kotiledon Genotip 1.ortam 2.ortam 1.ortam 2.ortam 1.ortam 2.ortam ortalama±sh Gou Tou turuncu bc±0.08 Tuzcu 891 turuncu d±0.08 Carrizo sitranjı ,5ab±0.08 Troyer sitranjı ,66a±0.08 Yerli üç yapraklı d±0.08 Rubidoux üç yapraklı cd±0.08 Kleopatra mandarini d±0.08 Antalya Kleopatra d±0.08 mandarini Swingle sitrumelo a±0.08 S. buxifolia a±0.08 E. glauca d±0.08 ortalama±sh 0.28± ± ±0.05 genotip 0.00 ekplant 0.46 ortam 0.00 genotip * 0.34 ekplant Ö.d. genotip * 0.00 ortam ekplant * 0.46 ortam genotip * ekplant * 0.34 ortam (*1:kontrol, 2:2,4-D (2 mg/l)+naa(2 mg/l)+kin (0.5 mg/l)). 62

78 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Şekil Yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarının canlılık oranlarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları (*1:kontrol, 2:2,4-D (2 mg/l)+naa(2 mg/l)+kin (0.5 mg/l)). 63

79 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Yaprak, Epikotil ve Kotiledon Eksplantlarından Kallus Oluşturma Oranlarının Saptanması 4-6 hafta arasında gelişen bitkilerden sağlanan epikotil eksplantları 2,4-D (2 mg/l) + NAA (2 mg/l) + KİN (0.5 mg/l) uygulamasında bazı yaprak (Şekil 4.14.), epikotil (Şekil 4.15.) ve kotiledon (Şekil 4.16.) eksplantlarında kallus oluşumu sağlanmıştır. Kontrol uygulamasında hiçbir gelişme gözlenmemiştir. a b c d e Şekil Yaprak eksplantlarından elde edilen kallusların görüntüleri: a. Swingle sitrumelo, b. Troyer sitranjı, c. Gou Tou turuncu, d. Carrizo sitranjı, e. S.Buxifolia 64

80 4.BULGULAR ve TARTIŞMA a b c d e f Şekil Epikotil eksplantlarından elde edilen kallus görüntüleri; a. Rubidoux üç yapraklı, b. Troyer sitranjı, c. Swingle sitrumelo, d. Carrizo sitranjı, e. Gou Tou turuncu, f. S. buxifolia. a b c Şekil Kotiledon eksplantlarından elde edilen kallusların görüntüleri; a. Troyer sitranjı, b. Carrizo sitranjı, c. Swingle sitrumelo. Gill ve ark. (1995) Citrus reticulata Blanca Local Sangtra çeşidinin in vitro da geliştirilen nüseller fidanlarının kök segmentleri, kotiledon, epikotil ve yaprak eksplantlarından kallus kültürleri oluşturulmuştur. Kültürlerin 10. gününde kesim uçlarında kallus oluşumları başlamış ve epikotil segmentleri kallus oluşumunda en iyi eksplant olarak bulunmuştur. En iyi kallus oluşumu NAA (10 mg/l) ve KİN (0,5 mg/l) büyüme düzenleyicisi içeren MS ortamından elde edilmiştir. Araştırıcıların bulguları ile aradaki farkın kullanılan genotip kaynaklı olabileceği düşünülmektedir. 65

81 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Embriyogenik kallus oluşumu için NAA ve KİN e ek olarak 2,4-D nin kullanılabileceği önerilebilir. Denemede kullanılan genotipler arasındaki sayısal farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur. Gou Tou turuncu, Carrizo sitranjı, Troyer sitranjı, Rubidoux üç yapraklı, Swingle sitrumelo ve S.buxifolia genotipleri kallus oluşumu bakımından en yüksek değere sahip olmuştur. Besin ortamının etkisi kontrole göre önemli bulunmuştur (2,4-D (2 mg/l) + NAA (2 mg/l) + KİN (0.5 mg/l)). Genotip*ortamın etkisi, eksplantlar arasındaki farklılık ve eksplant*ortam ve genotip*eksplant*ortam arasındaki farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). Epikotil kültürü yaprak ve kotiledon kültürlerine göre daha iyi kallus oluşum oranına sahip bulunmuştur. Genotipler içerisinde de en iyi sonucu S.buxifolia genotipi sağlamıştır (Çizelge 4.10.; Şekil 4.17.). Yerli üç yapraklı, Kleopatra mandarini, Antalya Kleopatra mandarini, E. glauca, Tuzcu 891 turuncu genotiplerinde kallus oluşumları gözlenmemiştir. Bu durumun genotip kaynaklı olabileceği düşünülmektedir. 66

82 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Çizelge Yaprak, Epikotil ve Kotiledon eksplantlarının kallus oluşum oranlarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları; 1.yaprak 2.embriyo 3.kotiledon Genotip 1.ortam 2.ortam 1.ortam 2.ortam 1.ortam 2.ortam ortala ma±sh Gou Tou 0.66a± % % turuncu 0.9 Tuzcu 891 uruncu b±0.9 Carrizo 0.72a± % % sitranjı 0.9 Troyer 0.72a± % %13 sitranjı 0.9 Yerli üç yapraklı b±0.9 Rubidoux üç 0.66a± % %27 yapraklı 0.9 Kleopatra mandarini b±0.9 Antalya Kleopatra b±0.9 mandarini Swingle 0.72a± % % %20 sitrumelo 0.9 S.buxifolia % ,33-% a± 0.9 E. glauca b±0.9 ortalama±sh 0.46± a± b±0.05 Ö.d. genotip 0.00 eksplant 0.00 ortam 0.00 genotip * eksplant 0.00 genotip * ortam 0.00 eksplant * ortam 0.00 genotip * eksplant * ortam 0.00 (*1:kontrol, 2:2,4-D (2 mg/l)+naa(2 mg/l)+kin (0,5 mg/l)). 67

83 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Şekil Yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarının kallus oluşum oranlarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırma grafikleri (*1:kontrol, 2:2,4-D (2 mg/l)+naa(2 mg/l)+kin (0.5 mg/l)). 68

84 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Yaprak, Epikotil ve Kotiledon Eksplantlarından Embriyogenik Kallus Oluşturma Oranlarının Saptanması Uygulanan denemelerde, epikotil eksplantlarından gün sonra elde edilen kalluslar stereo mikroskop altında incelenerek oluşan embriyogenik kalluslar saptanmaya çalışılmıştır. Embriyogenik kalluslar (EK); parlak, kırılgan, kolay dağılabilen, dolgun yuvarlak yapılarıyla diğer kalluslardan ayırt edilmişlerdir. Denemede kullanılan genotipler arasındaki sayısal farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur. Carrizo sitranjı genotipi EK oluşumu bakımından en yüksek değere sahip olmuştur. Besin ortamının etkisi, Genotip*ortamın etkisi, eksplantlar arasındaki farklılık ve eksplant*ortam ve genotip*eksplant*ortam arasındaki farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). Eksplantlar içerisinde en iyi sonuç epikotil kültüründe görülmüştür. Genotipler arasındaki farklılığın eksplant ve besin ortamı kaynaklı olduğu düşünülebilmektedir. Aynı besin ortamı kullanılarak yapılan yaprak, epikotil ve kotiledon kültürlerinde en iyi sonucu epikotil eksplantının sağladığı bulunmuştur. Yapılacak diğer çalışmalarda epikotil eksplantı önerilebilir (Çizelge 4.11.; Şekil 4.18.). Tez çalışması kapsamında söz konusu anaçlara ait EK oluşumu bazı genotiplerde görülmüştür. Yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarından elde edilen EK ların görüntüleri (Şekil ), (Şekil 4.20.) ve (Şekil 4.21.) verilmiştir. Gill ve ark. (1994,1995) mandarinlerde yaptıkları çalışmada NAA nın EK oluşturmada daha etkili bir oksin olduğunu vurgulamışlardır. Araştırıcılar 2,4-D nin ise embriyogenik olmayan kallus oluşturmada etkili olduğunu bildirmişlerdir. Tao ve ark. (2002) ise EK oluşumunda 2,4-D nin NAA den daha etkili olduğunu belirtmişlerdir. Farklı araştırıcıların bu konuda farklı sonuçlar elde etmesi 2,4-D ve NAA oksinlerinin kallus oluşumu üzerinde farklı rollerinin bulunması ve bu görevlerin kullanılan eksplant kaynağına, genotipe ve kültürün hangi dönemde olduğuna bağlı olduğu düşünülmektedir. 69

85 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Yaptığımız çalışmada 2,4-D ve NAA oksinlerinin birlikte kullanıldığı kombinasyonlarda embriyogenik kallus oluşumunun daha başarılı olduğu saptanmıştır. Çizelge Yaprak, Epikotil ve Kotiledon eksplantlarının EK oluşum oranlarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları 1.Yaprak 2.Epikotil 3.Kotiledon Genotip 1.ortam 2.ortam 1.ortam 2.ortam 1.ortam 2.ortam ortalama±sh Gou Tou turuncu % % ab±0.09 Tuzcu 891 uruncu c±0.09 Carrizo sitranjı % % % a±0.09 Troyer sitranjı % % % ab±0.09 Yerli üç yapraklı , c±0.09 Rubidoux üç yapraklı % b±0.09 Kleopatra mandarini c±0.09 Antalya Kleopatra mandarini c±0.09 Swingle sitrumelo % % % b±0.09 S.Buxifolia % % ab±0.09 E. Glauca c±0.09 ortalama±sh 0.30b± a± b±0.05 genotip 0.00 eksplant 0.00 Ortam 0.00 genotip * eksplant 0.00 genotip * ortam 0.00 eksplant * ortam 0.00 Ö.d genotip * eksplant *. ortam 0.00 (*1:kontrol, 2:2,4-D (2 mg/l)+naa(2 mg/l)+kin (0.5 mg/l)) 70

86 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Şekil Yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantlarının EK oluşum oranlarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama grafikleri (*1:kontrol, 2:2,4-D (2 mg/l)+naa(2 mg/l)+kin (0.5 mg/l)). 71

87 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Şekil Yaprak eksplantlarından elde edilen EK görüntüleri; a. Troyer sitranjı, b. S.buxifolia, c. Swingle sitrumelo, d. Carrizo sitranjı, e. Gou Tou turuncu a b c d e f Şekil 4.20 Epikotil eksplantlarından elde edilen EK görüntüleri; a. Rubidoux üç yapraklı, b. Troyer sitranjı, c. Swingle sitrumelo, d. Carrizo sitranjı, e. Gou Tou turuncu, f. S. buxifolia 72

88 4.BULGULAR ve TARTIŞMA a b c Şekil Kotiledon eksplantlarından elde edilen EK görüntüleri; a. Troyer sitranjı, b. Carrizo sitranjı, c. Swingle sitrumelo Embriyogenik Kallusların Ağırlık Ortalamaların Saptanması Epikotil Eksplantından Elde Edilen Embriyogenik Kallusların Ağırlık Ortalamaların Saptanması Epikotil eksplantları kültüre alındıktan gün sonra ilk alt kültürleri gerçekleştirilmiştir. Kültüre alma öncesi elde edilen EK ağırlıkları alınmıştır. Elde edilen bu EK hormonsuz ortama aktarılmıştır. EK sadece 2,4-D (2 mg/l) + NAA (2 mg/l) + KİN (0.5 mg/l) uygulamasında gözlemlenmiştir. Troyer sitranjı 0.27 g, Rubidoux üç yapraklı 0.23 g, Carrizo sitranjı 0.21 g, Severinia buxifolia 0.14 g, Gou Tou turuncu 0.11 g EK ağırlığına sahip genotipler olarak bulunmuştur. Genotipler arasındaki farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). Genotipler arasında en yüksek EK ağırlığına sahip Troyer sitranjı ve Rubidoux üç yapraklı genotipleri olmuştur. Altkültürler arasındaki farklık ve altkültür*genotip interaksiyon etkisi arasındaki farklılık önemli bulunmamıştır (P<0.05) (Çizelge 4.12.),; (Şekil 4.22.). 73

89 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Çizelge Epikotil eksplantlarından elde edilen embriyogenik kallus ağırlıklarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları; Genotip 1.altkültür 2.altkültür 3.altkültür Ortalama±sh Gou Tou turuncu c ±0.03 Carrizo sitranjı ab ±0.03 Troyer sitranjı a ±0.03 Rubidoux üç yapraklı a ±0.03 S. buxifolia bc ±0.03 Ortalama ±sh 0.22± ±0, ±0.02 Genotip 0.00 Ö.d. Tarih(Altkültürler) 0.25 Genotip * Tarih 0.15 Şekil Epikotil eksplantlarından elde edilen EK ağırlıklarına ait ortalama grafikleri. 74

90 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Yaprak Eksplantlarından Elde Edilen Embriyogenik Kallusların Ağırlık Ortalamalarının Saptanması Yapraklar kültüre alındıktan gün sonra ilk alt kültürleri gerçekleştirilmiş ve kültüre alma öncesi EK ağırlıkları alınmıştır. Elde edilen bu EK hormonsuz ortama aktarılmıştır. Embriyogenik kalluslar sadece 2,4-D (2 mg/l) +NAA (2 mg/l) + KİN (0.5 mg/l) uygulamasında görülmüştür. Swingle sitrumelo 0.23 g ve Troyer sitranjı 0.17 g en yüksek EK ağırlıklarının saptandığı genotipler olarak belirlenmiştir. S. buxifolia 0.16 g, Gou Tou turuncu 0.12 g ve Carrizo sitranjı 0.11 g EK ağırlıklarına sahip genotipler olarak saptanmıştır. Genotipler arasındaki farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). Genotipler arasında en yüksek EK ağırlığına sahip genotip Swingle sitrumelo olmuştur. Altkültürler arasında ki farklılık önemli bulunmuş (P=0.05) ancak Altkültür*genotip interaksiyon etkisi önemli bulunmamıştır (P<0.05). Altkültürler arasındaki farklılık yaprak denemesinde 3. altkültür ağırlıkları diğer tarihlere göre daha ağır bulunduğu için önerilmektedir (Çizelge 4.13.),; (Şekil 4.23.). 75

91 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Çizelge Yaprak Eksplantlarından elde edilen EK ağırlıklarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları; Genotip 1.alt kültür 2.alt kültür 3.alt kültür Ortalama±sh Gou Tou turuncu b ±0.019 Carrizo sitranjı b ±0.019 Troyer sitranjı b ±0.019 Swingle sitrumelo a ±0.019 S. buxifolia b ±0.019 Ortalama±sh 0.13b ± ab ± a ±0.015 Genotip 0.00 Ö.d. Tarih(Alt kültürler) 0.05 Genotip * Tarih 0.63 Şekil Yaprak Eksplantlarından elde edilen EK ağırlıklarına ait ortalama grafikleri. 76

92 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Kotiledon Eksplantlarından Elde Edilen EK Ağırlık Ortalamaların Saptanması Kotiledon eksplantları kültüre alındıktan gün sonra ilk alt kültürleri gerçekleştirilmiştir. Kültüre alma öncesi elde edilen EK ağırlıkları alınmıştır. Elde edilen EK hormonsuz ortama aktarılmıştır. EK sadece 2,4-D (2 mg/l) + NAA (2 mg/l) + KİN (0.5 mg/l) uygulamasında görülmüştür. Troyer sitranjı ve Swingle sitrumelo en yüksek EK ağırlığına sahip (0.03 g) genotip olarak bulunmuştur. Carrizo sitranjı ise en düşük EK ağırlığını sahip genotip (0.02 g) olarak bulunmuştur. Genotipler arasındaki farklılık istatistiki olarak önemli bulunmamıştır (P<0.05). Altkültürler arasındaki farklılık ve altkültür*genotip interaksiyon etkisi arasındaki farklılık da önemli bulunmamıştır (P<0.05) (Çizelge 4.14.).; (Şekil 4.24.). Çizelge Kotiledon eksplantlarından elde edilen EK ağırlıklarına ait ortalamalar, standart sapma ve ortalama karşılaştırmaları Genotip 1.altkültür 2.altkültür 3.altkültür Ortalama±sh Carrizo sitranjı Troyer sitranjı Swingle sitrumelo ± ± ±0.01 Ortalama±sh 0.02± ± ±0.01 Genotip 0.65 Tarih(Altkültürler) 0.28 Ö.d. Gengenotip * Tarih

93 4.BULGULAR ve TARTIŞMA Şekil Kotiledon eksplantlarından elde edilen EK ağırlıklarına ait ortalama grafikleri. 78

94 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Turunçgiller dünyada yetiştiriciliği yapılan en önemli meyve gruplarından biridir. Anaç ıslahı turunçgil genetik ve ıslah çalışmaları arasında çok önemli konulardan biridir. Turunçgillerde anaç ıslahı çalışmalarında en temel hedefler; bodur, güçlü bitkiler oluşturan verim ve kaliteye olumlu etki eden, hastalıklara dayanıklılık sağlayan (özellikle CTV ve kök nematodu), biyotik ve abiyotik stres faktörlerine dayanıklı anaç geliştirmektir. Bu çalışmaları yapabilmek için genetik materyale ihtiyaç duyulmaktadır. Üniversitemiz Turunçgil genetik koleksiyonu içerisinde çok sayıda genotip mevcut olup bu genotipler anaç ve/veya çeşit ıslahı çalışmalarında çok önemli bir kaynak niteliğindedir. Modern bitki ıslahı ve muhafaza yöntemleri içerisinde; sürgün ucu kültürü, embriyogenik kallus eldesi, somatik embriyogenesis, somatik hibridizasyon, gen aktarma çalışmaları yer almaktadır. Turunçgillerde protoplast füzyonu ile somatik hibridizasyon; özellikle klasik ıslah stratejileri ile melezlenmesi mümkün olmayan, yani birbiri ile uyuşmayan türler ve/veya cinsler arasında in vitro koşullarda gerçekleştirilen bir yöntemdir. Turunçgillerde çekirdeksizlik ıslahında önem arz eden triploid çekirdeksiz çeşit ıslahı, tetraploid bir ebeveyn ile diploid bireyin hibridize edilmesi (4X x 2X) ile elde edilebilir. Burada protoplast kaynağı olarak yaprak mezofil hücreleri, EK, embryogenik süspansiyon kültürleri kullanılabilir. Yine aynı amaçlı özellikle somatik hibridizasyon çalışmalarında EK eldesi zorunludur. Yine gen aktarma çalışmalarında EK eldesi ve ardından da somatik embriyogenesisin gerçekleştirilmesi gerekmektedir. Bu güne kadar bölümümüzde yapılan çalışmalarda bazı turunçgil çeşit ve anaçlarında somatik embryogenesis yoluyla bitki eldesi başarı ile elde edilmiştir (Varol, 2006; Biçen, 2008). Fakat bu çalışmalarda ovül, stil ve stigma gibi çiçek organları kullanılmıştır. Bu çalışmalarda kısıtlayıcı faktörlerden biri yılın çok kısa bir döneminde yani çiçeklenme döneminde eksplant alınması sorun olmaktadır. Yapmış olduğumuz bu tez çalışması kapsamında çiçek organları dışında yılın herhangi bir döneminde tohumların çimlendirilerek farklı ekplantlardan EK eldesi hedeflenmiştir. 79

95 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Çalışmamızda on bir turunçgil anacında farklı eksplant kaynakları, farklı besi ortamları kullanılarak EK elde edilmesi amaçlanmıştır. İn vitro koşullarında ekilen tohumlardan geliştirilen bitkiciklerin kök segmentleri, kotiledon, epikotil, yaprak ile tohum içerisinden izole edilen embriyo eksplantları kullanılarak embriyogenik kallus oluşumu sağlanmıştır. Farklı büyüme düzenleyicilerin farklı eksplantlar üzerine etkilerini görmeyi hedefleyen bu yüksek lisans tez çalışmasında elde edilen sonuçlar aşağıda özetlenmiştir. 1. Embriyo eksplantının kullanıldığı denemelerde yer alan genotiplerden embryogenik kallus oluşturma anlamında genotipler arasında istatistiki anlamda farklılık gözlenirken (P<0.05), kontrol ortamı hariç ortamlar arasında istatistiki olarak farklılık gözlenmemiştir. EK oluşturma bakımından en iyi genotip Troyer Sitranjı olmuş, Swingle Sitrumelo ve E. galuca genotipleri embriyo eksplantına en az tepki veren genotipler olmuştur. Kallus oluşum oranlarına göre en iyi ortam (2mg/l) 2,4 D ve (0.5mg/l) BAP kullanılan ortam olmuştur. Herhangi bir büyüme düzenleyici içermeyen kontrol ortamında eksplantların canlılık oranları en yüksek olurken, kallus oluşturma anlamında kontrol ortamı en düşük cevabı vermiştir. Bu da beklenen bir sonuçtur. Eksplant kallus oluşturmak için belli oranlarda oksin sitokinin dengesine ihtiyaç duymaktadır. 2. Kök eksplantlarının kullanıldığı denemelerde embriyo eksplantının tersine kontrol ortamında en düşük canlılık oranları gözlenmiş genotiplerin hiçbirinde bu ortamda gelişme gözlenmemiştir. Eksplantın canlılığını koruyabilmesi için en iyi hormon kombinasyonu 2,4 D (1 mg/l) ve KİN (0.5 mg/l) olmuştur. Kök segmentlerinin kullanıldığı denemede Gou Tou turuncu EK oluşturma anlamında öne çıkan bir genotip olmuştur. Yerli üç yapraklı, Rubidoux üç yapraklı, Klemantin mandarin, Antalya Kleopatra mandarini kök eksplantına tepki vermemiş ve kallus oluşturmamışlardır. Bu genotipler için farklı eksplant kaynaklarının kullanımı önerilmektedir. Kök denemesinde kullanılan genotipler arasında EK ağırlığı bakımından farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). Genotipler arasında S. buxifolia genotipi EK ağırlığı bakımından en yüksek kallus ağırlığına sahip genotip olmuştur. Besin ortamı arasındaki farklılık ve besin yeri*genotip interaksiyon 80

96 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER arasındaki farklılık da önemli bulunmuştur (P<0.05). Kök denemesinde besin ortamları içerisinden 2,4-D (0.5 mg/l) +KİN (0.5 mg/l) besin ortamı en yüksek EK ağırlığı sağlamış ortam olarak önerilmektedir. 3. Epikotil eksplantının kullanıldığı denemelerde; genotipler arasındaki EK ağırlıkları farkı istatistiki olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). Genotipler arasında en yüksek EK ağırlığına sahip Troyer sitranjı ve Rubidoux üç yapraklı genotipleri olmuştur. Bu eksplant için altkültürler arasındaki farklık ve altkültür*genotip interaksiyon etkisi arasındaki farklılık önemli bulunmamıştır (P<0.05). Yaprak, epikotil ve kotiledon eksplantları arasında EK oluşturma bakımından en iyi eksplant epikotil olduğu belirlenmiştir. Ortam olarak önerilen ortam ise 2,4 D (2mg/l) + NAA (2mg/l) + KİN (0.5mg/l) kombinasyonu olmuştur. 4. Yaprak eksplantından elde edilen EK oluşumunda en düşük genotip Swingle sitrumelo (% 13) olmuştur. Yaprak kültüründen elde edilen EK ağırlıklarının genotipler arasındaki farklılık istatistiki olarak önemli bulunmuş ve genotipler arasında en yüksek EK ağırlığına sahip genotip Swingle sitrumelo olmuştur. Altkültürler arasındaki farklık önemli bulunmuş (P=0.05) ancak altkültür*genotip interaksiyon etkisi önemli bulunmamıştır (P<0.05). Altkültürler arasındaki farklılık yaprak denemesinde 3. altkültür ağırlıkları diğer tarihlere göre daha ağır bulunduğu için önerilmektedir. 5. Kotiledon eksplantının kullanıldığı denemede Troyer sitranjı en yüksek EK oluşturma oranına sahip (% 20) genotip olarak bulunmuştur. Swingle sitrumelo % 13 EK oluşturma oranına sahip iken Carrizo sitranjı en düşük EK oluşturan genotip (% 7) olarak bulunmuştur. Düşük EK oluşum oranlarının genotipe bağlı olabileceği düşünülmekle beraber bundan sonra yapılacak çalışmalarda bu genotipte daha yüksek EK oluşumunun sağlanması amacıyla farklı besi ortamları farklı oksin ve sitokinin konsantrasyonları ve kombinasyonları denenmelidir. Çalışmamızda elde edilen EK lar bölümümüzde halen devam eden anaç ıslahı çalışmaları kapsamında yapılacak somatik hibridizasyon uygulamalarında alternatif protoplast kaynağı veya kallus kaynağı olarak kullanılabilecektir. 81

97 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ayrıca ileride yapılacak genetik mühendisliği ve gen aktarma çalışmalarında her genotip için hangi eksplant ve hangi besi ortamının kullanılacağına dair elde edilen protokoller ve yapılan optimizasyon çalışmaları EK oluşturma sürecini kısaltacaktır. Bundan sonra yapılacak çalışmalarda bu kalluslardan embriyo ve embriyolardan bitki eldesi konusuna yoğunlaşılmalı ve bu konuda alternatif besin ortamları ve farklı büyüme düzenleyicilerin kullanımı konularında çalışılması önerilmektedir. 82

98 KAYNAKLAR AKGÜN, C., ANONİM,2008a. 07_ pdf, 2008b. http.// 2009a b c. BEGUM, F., AMİN, M.N., ISLAM, S., AZAD, M.A.K., A comparative Study of Axillary Shoot Proliferation from the Nodal Eksplants of Three Varieties Pummelo (Citrus grandis [L. ] Osb.). Biotechnology, 3 (1): BELOUALY, N.,1991. Plant regeneration from callus culture of three Citrus rootstocks. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 24: BİÇEN, B., Bazı Turunçgil Anaçlarında Farklı Eksplant Kaynağı ve Besi Ortamlarının Somatik Embriyogenesis Üzerine Etkileri Çukurova Üniversitesi Fen bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi s:87 BUTTON, J. and C.H. BORNMAN Development of nuceller plants from unpollinated and unfertilized ovules of the Washington navel orange in vitro. J. S. Afr Bot. 37: BORDON, Y., GUARDIOLA, J.L. and GARCIA-LUIS, A Genotype affects the morphogenic response in vitro of Epicotyl Segments of Citrus Rootstocks. Annals of Botany 86: , CALOVIC, M., VILORIA, Z., NIELSEN, B., GMITTER, F.G., JR, CASTLE, W.S., ve GROSSER, J.W., Somatic Embryogenesis from Lemon Style and Analysis of Genetic Stability in Regenerated Plants Using RAPD and Flow Cytometry. Global Citrus Germplasm Network Meeting, December. CARIMI, F., PASQUALE, F. De and CRESCIMANNO, F.G Somatic embryogenesis in Citrus from style culture. Plant Sci. 105:

99 CARIMI, F., PASQUALE, F.D., CRESCIMANNO, F.G Somatic embryogenesis and plant regenaration from pistil thin cell layers of Citrus. Plant Cell Reports 18: CARIMI, F., TORTORICI, M.C., PASQUALE, F.D., CRESCIMANNO, F.G., Somatic embryogenesis and plant regeneration from undeveloped ovules and stigma/style eksplant of sweet orange navel group (Citrus sinensis (L.) Osb.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 54: CARRA, A., F. DE PASQUALE, A. RICCI and F. CARIMI Diphenylurea derivatives induce somatic embryogenesis in Citrus. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 87: CHAKRAVARTY, B., GOSWAMI, B.C., Plantlet Regeneration from Long- Term Callus Cultures of Citrus acida Roxb. and the Uniformity of Regenerated Plants. Scientia Horticulture 82 (1999) COSTA, M.G.C., V.S.ALVES, E.R.G. LANİ, P.R.MOSQUİM, C.R. CARVALHO and W.C. OTONİ Morphogenic gradients of adventitious bud and shoot regeneration in epicotyl explants of Citrus. Sci. Horti. 100: DAVIES, F.S., and ALBRIGO, L. G., Rootstocks. In: Athern, J., Rees. A. (Eds.), Citrus. CAB International, Wallingford, UK, 254p. DURAN-VILA, N., Y. GOGORCENA, V., ORTEGA, J. ORTIZ and L. NAVARRO Morphogenesis and tissue culture of sweet orange (Citrus sinensis (L.) Osb.): effect of temperature and photosynthetic radiation. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 29: ERİŞEN, S., Yonca (Medicago sativa L.) da Somatik Embriyogenesis Aracılığıyla Bitki Rejenerasyonu. Tarım Bilimleri Dergisi, 11 (3) FIORE, S., PASQUALE, F.D., CARIMI, F., SAJEVA, M Effect of 2,4- D and 4-CPPU on somatic embryogenesis from stigma and style transverse thin cell layers of Citrus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 68: 57-63, GERMENA, M.A., Y.Y. WAMG, M.G. BARBAGALLO, G. IANNOLINO and F.G. CRESCIMANNO Recovery of haploid and diploid plantlets from anther culture of Citrus clementina Hort. Ex Tan. and Citrus reticulate Blanco. J. Hort.Sci. 69:

100 GILL, M.I.S. SINGH, Z., DHILLON, B.S., GOSAL, S.S Somatik Embryogenesis and Plantlet Regeneration On Calluses Derived From Seedling Explants Of Kinnow Mandarin (Citrus nobilis Lour. X Citrus deliciosa Tenora). Sci. Hort. 69(2) GILL, M.I.S. SINGH, Z., DHILLON, B.S., GOSAL, S.S Somatic Embryogenesis and Plantlet Regeneration in Mandarin (C. reticulata Blanco). Sci. Hort. 63 (3-4) P GOH C.J., SIM G. E., MORALES C. L. and LOH C. S Plantlet regeneration through different morphogenic pathways in pommelo tissue culture. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 43: GRINBLAT, V Differentation of citrus stem in vitro. J.Am.Soc.Hort.Sci. 97: GROSSER, J.W., JIANG, J., LOUZADA, E.S., CHANDLER, J.L., GMITTER, F.G.,JR Somatic Hybridization, an Integral Component of Citrus Cultivar Improvement: II. Rootstock Improvement. Hort Science 33(6): GURCAN, K., Bazı Meyve Türlerinin Dişi Organ Dokularında Somatik Embriyo Oluşumu. Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi S:54. HATİPOĞLU, R Bitki Biyoteknolojisi. Ders kitapları Yayın No: A 58 HIDAKA, T., Y. YAMADA and T. SHICHIJO Plantlet formation from anthers of C. aurantium L. Proc. Int. Soc. Citricult. 1: KARAHOCAGİL, P., Turunçgiller, T.E.A.E Bakış, 2:11. KAYIM, M., KOÇ, N.K., The Effects Of Some Carbohydrates On Growth and Somatic Embryogenesis in Citrus Callus Culture. Scientia Horticulturae, 109: KOÇ, N.K., KAYIM, M., ÇINAR, A., Protoplast Fuzyonu (Somatik Hibridizasyon) ile Limonda Uçkurutan Hastalığına (Phoma tracheiphila Kanc. et Ghik.) Dayanıklı Bitkiler Elde Etme Olanaklarının Araştırılması. Tr. J. of Agriculture and Forestry 23:

101 LITZ, R.E., G.A. MOORE and C. SRINIVASAN In vitro system for propagation and improvement of tropical fruits and palm. Hortic Rev. 7: MOREIA-DIAS, J.M., R.V. MOLINA, J.L. GUARDIOLA and A. GARCIA-LUIS Daylength and photon flux density influence the growth effects on morphogenesis in epicotyl segments of Troyer citrange. Sci Horti. 87: MURASHIGE T and F. SKOOG A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): NİTO N. And IWAMASA M In vitro plantlet formation from juice veicle callus of satsuma (Citrus Unshiu Marc.). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 20: OLUK, AKÇAM, E., Papaver somniferum L. var. Office-95 Kallus Kültürlerinde Somatik Embriyogenesis ve Sürgün Rejenerasyonu. Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 18(2), ONAY, A., Pistacia atlantica nın Olgun Tohumlarında Somatik Embriyogenesis. Turk J Agric For , A., Kültürdeki Antepfıstıgı (Pistacia vera L.) Yaprak Eksplantlarında Somatik Embriyogenesisin Histolojisi. Turk J Bot ÖZCAN, S., BABAOĞLU, M., SANCAK, C Somatik embriyogenesis, Bitki Biyoteknolojisi I-Doku Kültürü ve Uygulamaları, Selçuk Üniv. s: RICCI, A.P., FILHO, F.A.A.M., MENDES, B.M.J., PIEDADE, S.M.S., Somatic Embryogenesis in Citrus sinensis, C. reticulata and C. nobilis x C. deliciosa. Scienta Agricola, v.59, n.1, p SAUNT, J., Citrus Varieties of the World. Sinclair Int. Limited, Norwich, England. SULE, R., Farklı Oksin Çeşitlerinin Yonca (Medicago sativa L.)`Da Somatik Embriyo Oluşumuna Etkisi Üzerinde Bir Araştırma. Mustafa Kemal Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Tarla Bitkileri Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi. S:70. 86

102 SINGH, B., SHARMA, S., RANI,G., VIRK, G. S., ZAIDI, A. A and NAGPAL, A., In vitro flowering in embriyogenic cultures of Kinnow mandarin (Citrus nobilis Lour x C. deliciosa Tenora). African Journal of Biotechnology Vol. 5 (16), pp ŞAN, B., DUMANOĞLU, H., Cevizde ( Juglans regia L.) Apomiktik ve Apomiktik Olmayan Tohumların Olgunlaşmamış Kotiledonlarından Somatik Embriyogenesis. Turk J Agric For TANER, Y., K., Kavunda (Cucumis melo L.) Somatik Embriyogenesis Yoluyla Bitki Eldesi. Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Doktora Tezi Özeti s:12. TAO, H., P. SHAOIN, D. GAOFENG, Z. LANYING and L. GENGGUANG Plant regeneration from leaf-derived callus in Citrus grandis (pummelo): Effects of auxins in callus induction medium. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 69: TUZCU, Ö., YEŞİLOĞLU, T., YILDIRIM, B., Citrus 2001 Reports : Turkey. Florida Grower Annual Edition. Mid. TOMAZ, M.L., MENDEZ, B.M.J., FILHO, F.D.A.A.M., DEMETRIO, C.G.B., JANSAKUL, N., RODRIGUEZ, A.P.M., Somatic Embryogenesis In Citrus SPP.: Carbohydrate Stımulation and Histodifferentiation. In vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37: TOKGONUL, S., ÇINAR, O., and RUDOLPH, K., The effect of soil solarization on bacterial canker of tomato in the Mediterranean Region of Turkey. Second International Conference on Soil Solarization and Integrated Managment of Soilborne Pests. March, 16-21, Aleppo, Syria JIMENEZ V. M., GUEVARA E. and HERRERA J.,2001. Endogenous hormone levels in habituated nucellar citrus callus during the initial stages of regeneration. Plant Cell Rep.20: JUMIN, H. B. and NITO N., Plant regeneration via somatic embryogenesis from protoplasts of six plant species related to Citrus.Plant Cell Rep.15:

103 VAROL, İ., Bazı Turunçgil Türlerinde Embriyogenik Kallusların İn Vitro Muhafazası ve Genetik Kararlılıklarının RAPD Markırları ile Araştırılması. Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi. s:80. YEŞILOĞLU, T., Turunçgil Ders Notları. Adana (Yayınlanmamış) 88

104 ÖZGEÇMİŞ 1986 yılında Adana doğdu. İlk, orta ve lise öğrenimimi Adana da tamamladı yılında başladığı Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkilerine Bölümünden 2007 yılında mezun oldu. Aynı yıl yüksek lisans öğrenimine başladı. Evli ve bir çocuk annesidir. 89