MKROSKOPLAR Küçük nesnelere ait görüntüleri ayrıntılı bir ekilde inceleyecek kadar büyüten araçlardır. Mikroskoplar bugün modem bilimin birçok dalında tanı ve aratırma amacıyla kullanılmaktadır. Deiik teknik özellikler gösteriyor olmalarına karılık sonuçta amaçları aynı olup incelenecek objeye ait görüntüyü büyülterek gözün retinasına, bir fotoraf plaına veya bir ekrana iletmesi esasına dayanır. Resim 1 Binoküler ıık mikroskobu 3.2.15.1. KLASK IIK MKROSKOBU Iık kaynaı olarak ister güne ııının, ister bir lamba ııının görülebilir dalga boyunun (4000-7000 A ), büyültücü elemanı olarak da cam mercek sistemlerinin kullanıldıı mikroskop türleridir. Iık mikroskoplarının yapı ve kullanım özelliklerini esas kısımlarına göre inceleyelim. Resim 2 Kondansör Tabla; üzerine inceleyeceimiz preparatı yerletirdiimiz, ortası kondansörden gelecek ııı geçirmek üzere delik olan, düz kısımdır. Preparat bazı mikroskoplarda iki mandal yardımıyla tabla üzerine tutturulduktan sonra el yardımıyla hareket ettirilir. Daha iyi olanlarda tabla üzerinde aryo denilen bir parça takılıdır (Resim 34). aryo üzerinde tespit 1 Kaan AYANOLU Tekn.Prog.Böl.Bk.
edilen preparatı dili sistemi yardımıyla yatay eksende öne ve arkaya, saa ve sola hareket ettirerek tabla üzerinde dolatırır. aryonun ikinci bir özellii, üzerinde bulunan milimetrik bir cetvel sayesinde bir preparattaki alanın ikinci kere bakılmak istendiinde kolayca bulunmasına yardımcı olmasıdır. Resim 3 aryo Makro ve mikro ayar vidaları görüntü için netlik ayarı yapmamızı salar. Görüntünün net bir ekilde alınabilmesi için preparat ile objektiflerin birbirine yaklatırılıp uzaklatırılarak ayarlanması gerekir. Bu ilem için bazı mikroskoplarda preparatın üzerine konduu tabla dikey eksende hareketlidir. Yani preparatı objektife yaklatırıp uzaklatırarak görüntüyü elde etmemizi ve netletirmemizi salar. Bazı mikroskoplarda ise ucunda objektiflerin takılı olduu optik tüp dikey eksende hareketidir. Her iki ekilde de bu hareketler dili sistemlerine kumanda eden makro ve mikro ayar dümeleri ile salanır. Makro ayar dümesi görüntüyü yakalamak için kullanılırken mikro ayar dümesi görüntünün netletirilmesi için kullanılmaktadır. Bu kumanda dümeleri bazı mikroskoplarda yan tarafta ayrı ayrı iken, bazı mikroskoplarda birbiri üzerine monte edilmi olarak bulunmaktadır. Objektifler mikroskopta büyültmeyi salayan mercek sistemleridir. Optik tüpün alt kısmında dönen bir tabla üzerinde 3-5 adet takılı olarak bulunur. Tabla döndürülerek istenilen büyütmeyi salayacak objektif seçilir. Objektiflerin üzerinde büyültme miktarları yazılıdır. Iık mikroskoplarında en büyük büyültmeyi salayan objektif 100 lüktür. Bu objektifle çalımak için de immersiyon yöntemine bavurmak gerekir. Objektifler büyüdükçe çalıma alanı daralacaından objektif ve preparatların korunması açısından incelemeye daima küçük büyültmelerden balamak, alan bulunduktan sonra ortaya getirilerek bir büyük büyültmeye geçmek gerekir, incelenecek preparat eer bir lamelle kapatılmı ise lamelli yüzeyin daima üste gelecek ekilde konulmasına dikkat etmelidir. Eer bu duruma uyulmazsa büyük büyültmelerde görüntü elde etmemiz olanaksızdır. Çünkü bu defa obje ile objektif arasına lam girecektir. Lam lamele oranla çok daha kalın olduundan kırılma çok daha fazladır. Fazla kırılan bu ıık büyük objektifler tarafından alınamaz. Bu durumda görüntü almaya çalıırken 2
objektif ve preparatların zarar görmesine neden olabiliriz. Eer incelemede immersiyon yaı kullanılıyorsa çalımanın bitiminde bu ya objektif üzerinden mutlaka temizlenmelidir, immersiyon yaının objektif üzerinde uzun süre kalarak kuruması o objektifin kullanılamaz hale gelmesine neden olmaktadır. Resim 4 Deiik boyda objektif ve filtreler Oküler, optik tüpün üst ucunda bulunan, objektiften gelen görüntüyü tekrar büyültüp düzelterek göze ileten mercek sistemine denir. Oküler üzerinde de büyültmeyi gösteren sayılar bulunur. Mikroskobun büyültmesi, kullandıımız objektifin büyültmesi ile oküler büyültmesinin çarpımına eittir. Mikroskop üzerinde tek oküler varsa monoküler mikroskop adını alır. Eer objektiften gelen görüntü iki gözle birden incelemeye izin verecek ekilde iki ayrı oküler sistemine birden iletiliyorsa binoküler mikroskop denir. Binoküler mikroskoplarda incelemeye balamadan önce iki ayarlamanın yapılması gerekir: Birincisi okülerler arası mesafenin ayarlanmasıdır insanlarda pupillalar arası mesafe farklı olabilir. Mikroskobu kullanacak kii iki oküleri birbirine yaklatırıp uzaklatırarak bu mesafeyi ayarlar. Sonuçta her iki gözle bakıldıında görüntü alanının tek ve düzgün bir yuvarlak olarak görülmesi gereklidir. kinci ayarlama her iki gözünün görmesi aynı olmayan kiiler için önem taımaktadır. Bunun için binoküler mikroskoplarda okülerlerden bir tanesi sabit iken dieri döndürüldüünde bir miktar alçalıp yükselecek tarzda yapılmıtır. Bunun için önce ayarlamayı yapacak kii sabit okülerden o taraf gözüyle bakarken mikrometreyi oynatarak alanı en net gördüü konuma getirir. Bundan sonra makro ve mikro ayar dümeleri ellenmeden dier gözle, dier okülerden bakılırken oküler yuvasından sola ve saa çevrilir ve bu gözle de en net görüntünün alındıı konuma getirilir. Resim 5 Binoküler balık Kaan AYANOLU Tekn.Prog.Böl.Bk. 3
3.2.15.1.1. Mikroskobun Kullanılıı 1- Mikroskobun ııı açılır ve diyaframdan ıık ayarı kabaca yapılır. 2- Preparat tablaya yerletirildikten sonra tabla üzerindeki penslerle (kıskaçlarla) ayrıca tutturulur. Mikroskopta çalıma daima en az büyüten objektifle balar. Onun için en az büyüten objektif preparat üzerine getirilir. Sonra yandan, tabla hizasından daima dikkatle bakılarak makro ayar vidası yelkovanı istikametinde döndürülmek sureti ile tüp aaıya indirilir ve objektifin ucu lamele 3-5 mm kadar yaklatırılır. Okülerden bakılırken tüp yani objektif yalnız yukarı doru hareket ettirilir, kesinlikle aaı indirilmez. Çünkü preparat veya objektifin ön mercei kırılır veya hasara urayabilir. Makro ve mikro ayar vidaları sa elle döndürülür, sol el de icabında preparatı hareket ettirmede (aryo vidasında) kullanılır. 3- Kaba ayar vidası yardımı ile objektif yava yava yukarı kaldırılarak objeyi görmeye çalıılır. Obje kabaca görülünce ince ayar vidası ile netletirilir. Bundan sonra ıık ayarı, alan aydınlıı tekrar kontrol edilir. nce ayar vidası ile tüpün hareketi 2 mm kadardır. Mikrometre ile netletirmede objektif daha fazla hareket etmezse yani sona gelmise kaba ayar vidası ile pek az (0,5-1 mm Kadar) tüp yukarı kaldırıldıktan sonra yeniden ince ayar vidası ile hareket ve netletirme yapılır. 4- Az büyüten objektifle obje görüldükten sonra objektif tablası saat yelkovanı istikametinde döndürülerek daha fazla büyüten objektif preparat üzerine getirilir. Bu esnada her ihtimale karı yandan tabla hizasından bakılır. Fazla büyüten objektifler az büyütenlere nazaran daha uzundur. Mikroskop yapılırken bu durum dikkate alındıından oküler tablası döndürünce daha uzun olan fazla büyüten objektif lamele veya preparata demez. Eer objektif deitirilmise veya baka bir mikroskobun objektifi takılmısa bu takdirde objektif tablası döndürülünce objektif lamel yahut preparata deebilir. Az büyüten objektifle netletirme yani odak (netlik) ayarı yapıldıktan sonra fazla büyüten objektife veya immersiyon objektifine geçilince odak noktası bozulmaz, tekrar kaba ayar vidası ile ayarlamaya lüzum yoktur. Yalnız mikro ayar vidası ile biraz netletirme yapılır. Fazla büyüten objektif asla en önce kullanılmaz. Bu prensibin tek istisnası immersiyon objektifidir. Fakat onda da az büyütenle balamak daha uygun olur. 3.2.15.1.2. mmersiyon Objektifinin Kullanılıı mmersiyon daldırma, batırma demektir. Kuru sistemlerde lamel veya preparatla objektif arasında hava bulunur, immersiyon sistemlerinde ise Lamel veya lam üzerinde tespit 4
edilmi bakterileri tetkikte olduu gibi dorudan doruya bakılacak maddenin üzerine bir damla sıvı damlatılarak objektifin ön mercei bu sıvı içine daldırılır. Böyle kullanılan objektiflere immersiyon objektif denir. Yani bakılan cisimle objektifin ön mercei arasında sıvı vardır. mmersiyon yaı olarak genellikle sedir yaı kullanılır. Bu sebepten sedir yaına immersiyon yaı da denilir. mmersiyon objektifi ile incelemede preparatla objektif arasındaki mesafe kuru sisteme nazaran çok kısadır.bu nedenle her hangi bir problem yaamamak için daima dikkatle davranılmalıdır, immersiyon objektifi ile inceleme aaıdaki ekilde yapılır: a - Preparat tablaya yerletirildikten sonra fazla büyüten kuru bir objektifle preparatın incelenecek yeri tespit edilir. b - Objektif hafif yukarı kaldırılır ve objektif tablası döndürülerek immersiyon objektifi preparat üzerine getirilir. c - Kondansör hafifçe aaı indirilerek ön mercei üzerine büyük bir damla immersiyon yaı damlatılır. Sonra bu immersiyon yaı lama temas edinceye kadar kondansör dikkatle yukarı kaldırılır, lam ile temasta immersiyon yaı üzerinde hava kabarcıkları olmamalıdır. Preparata üstten bakılarak kontrol edilir. Bazen kondansörün ön mercei üzerine immersiyon yaı konulması ihmal edilir. d - Preparat üzerine de bir damla immersiyon yaı damlatılır. e- mmersiyon objektifinin ön mercei immersiyon yaına deinceye kadar tüp kaba, ayar vidası vasıtası ile çok yava, dikkatlice ve gözle tabla hizasından bakılarak aaı indirilir. Objektif immersiyon yaına deince yine kaba ayar vidası ile objektif hafif yukarı kaldırılır. Fakat ya damlacıı ile objektifin ayrılmamasına dikkat edilir. f- Bundan sonra artık okülerden bakılarak ince ayar vidası ile netletirme yapılır. g- Iık ayarı ve aydınlatma kontrol edilir, gerekirse diyafram ile aydınlık ayarlanır. Sedir yaı, kırma indisi lamelle aynı olduundan en iyi optik hassasiyete sahip ise de mikroskop kullanıldıktan sonra silinmesi unutulursa objektifin ön mercei üzerinde kurumakta ve zamanla reçineli maddelere dönerek temizlenmesi zorlamaktadır. Bu durumda alkolde kısmen eridiinden alkolle( Bu amaçla öncelikle ksilol kullanılır) temizlemee çalıılmalıdır.mikroskopta i bitince tüp yukarı kaldırılarak yalanmı kısımlar temizlenir. 5
3.2.15.2. DEMONSTRASYON MKROSKOPLARI Demonstrasyon uygulayarak göstererek açıklama yapmak anlamına gelen bir kelimedir. Bu tür mikroskoplar aynı görüntü alanının aynı zamanda birden çok kiinin izlemesine olanak tanıyan mikroskoplardır. Daha çok eitim amacıyla veya ortak çalımalarda kullanılır. Oldukça deiik sistemler bu tür mikroskoplarda kullanılmaktadır. Bazı türlerinde aynı objektiften gelen görüntü aynalar ve deiik optik tüpler yardımıyla deiik oküler sistemlerine gönderilir. Bu okülerlerden bakan kiiler aynı alanı izlerken preparat hakkında açıklamaları dinler veya tartımaya olanak bulurlar. Bazen mikroskop üstüne eklenen optik tüpün ucunda düz bir buzlu camdan ekran bulunur. Kuvvetli ıık kaynaklarının kullanıldıı bu mikroskoplarda objektiften gelen görüntü arkadan buzlu camı aydınlatınca önden izleyen kiiler için ortak görüntü salanır. Bu tür mikroskopların kullanılmasında ortamın karartılması gerekir. Bazen çok kuvvetli ıık kaynaı ve oküler üzerine yerletirilen bir ayna yardımıyla görüntünün bir perdeye yansıtılması eklinde demonstrasyon olanaının salanması mümkündür. Gelimi türlerde ise kapalı devre televizyon sistemi kullanılmaktadır(resim 38). Oküler üzerine yerletirilen kamera aracılıı ile görüntü bir veya birçok monitöre birden iletilebilmektedir. Resim 6 Demonstrasyon mikroskobu Resim 7 Kapalı devre TV sistemli 3.2.15.3. ARATIRMA MKROSKOPLARI (Demonstr.mikroskr) Mikroskopların hemen her türü aratırma amacıyla kullanılabilmekle beraber, aratırma mikroskopları denince daha çok, birden fazla mikroskobik tekniin kullanılmasına olanak veren gelimi mikroskoplar akla gelmekledir. Üzerlerine ilave edilmi bazı ekler yardımıyla deiik aratırmalar yapmak mümkündür. Normal ıık kaynaı dıında ark lambası, civa buharlı lambalar kullanılarak yalnızca ultraviole ııı geçiren filtreler yardımıyla kesitlerdeki doal ve yapay floresans özelliklerini aratırmak mümkündür. Bu mikroskoplarda kondansör kısmına yerletirilen bir polarizör ve objektif ile oküler arasına yerletirilen bir analizör yardımıyla polarizasyon mikroskopi teknii ile kesitlerdeki anizotropi özellii 6 Kaan AYANOLU Tekn.Prog.Böl.Bk.
aratırılabilir. Yine kondansör üzerine ilave edilen açıklıı halka biçiminde bir diyafram ve objektifin üst kısmına eklenen bir faz plaının yardımıyla faz-kontrast mikroskopi teknii uygulanarak boyanmamı preparatlarla çalıma olanaı veren deiik bir çalıma alanı salanabilir. Ayrıca bu mikroskoplarda bir optik tüpün ucuna eklenen bir fotoraf makinesi ile görüntüleri belgelemek olanaı da vardır. Resim 8 Fotomikroskop 3.2.15.4. STEREOSKOBK MKROSKOPLAR imdiye kadar saydıımız mikroskoplarda ıık kaynaı incelenecek objenin altındadır. Iık objenin içinden geçerek göze ulaır. Yani objeye ait kesit özelliklerini inceler. Stereo mikroskoplar da ise ıık obje üzerinden yansıtılarak objektife gönderilir. Böyle olunca incelenecek objenin yüzey özelliklerini ortaya koyar, görüntü üç boyutludur. Bu mikroskoplarda klasik ıık mikroskobunda ulaılan büyültmelerde görüntü almak mümkün deildir. 3.2.15.5. ELEKTRON MKROSKOPLAR Iık mikroskoplarında iki bine ulaamayan büyültme gücüne karılık elektron mikroskoplarla yüz binlerle ifade edilen büyültmeler elde etmek mümkündür. Bu tür mikroskoplarda görüntü ekte etmek için ıık mikroskoplarındaki foton yerine elektron kullanılır. Elektronlar negatif elektrik yüklü ve dalga boyları çok kısa olan partiküllerdir. Elektron demetleri ısıtılmı bir flamanın ucundan salınırlar. Elektronlar havadaki gaz molekülleri tarafından durdurulurlar. Ancak birkaç mikron gidebilirler. Bu nedenle elektron mikroskoplarda iyi bir vakum sistemine de ihtiyaç vardır. Elektron mikroskobu ile ıık mikroskopları arasındaki bir dier fark da görüntünün olumasındadır. Iık mikroskoplarında görüntünün oluması ııın farklı absorbsiyonu sonucudur. Elektron mikroskobunda ise görüntü farklı sapmalar sonucu ortaya çıkar. Elektronları geçiren kısımlar ile saptıran kısımlar bu saptırmanın derecesine göre floresans ekranda beyazdan griye hatta siyaha kadar varan koyulukta belirir. Iık mikroskoplarında ııın ince kenarlı merceklerde kırılmasıyla salanan büyültme, elektron mikroskopta baka bir prensiple salanır. Vakumlu ortamda düzgün paralel demetler eklinde ilerleyen elektronlar elektrik yükleri olmalarından yararlanılarak bir 7
manyetik alanda açılırlar. Demetlerin açılıp genilemesi oranında görüntü büyür. Elektron mikroskoplar için söyleyebileceimiz bir dier özellik görüntünün belirdii son aamadadır. Elektronlar gözle görülmedii için görüntü bir floresans ekran üzerine düürülerek incelenir. Elektron mikroskopları ıık mikroskoplarında olduu gibi kesit özelliklerini ortaya koyan transmisyon elektron mikroskopları ve yüzey özelliklerini ortaya koyan ve bunu üç boyutlu bir görüntü eklinde salayan scanning elektron mikroskopları olmak üzere iki farklı tipe ayrılmaktadır. Resim 9 Scanning elektron mikroskop Kaan AYANOLU Tekn.Prog.Böl.Bk. 8