Cilt:6 Sayı:12003 KRONİK PERİODONTİTİSLİ HASTALARDA SİGARA KULLANIMININ POLİMORFONÜKLEER LÖKOSİTLERİN FAGOSİTİK AKTİVİTESİ ÜZERİNDEKİ ETKİLERİ Dr. Ebru Olgun ERDEMİR* Yrd. Doç. Dr. İsmet DURAN* Prof. Dr. İlhami ÇELİK** ÖZET Polimorfonükleer lökositler (PMNL), periodontal enfeksiyonlarda patojen mikroorganizmalara karşı konak savunma sisteminin ilk basamağını oluşturur. Periodontitis için risk faktörü olan sigara kullanımı ise lokal ve sistemik konak savunma sistemini etkilemektedir. Bu çalışmanın amacı, kronik periodontitisli hastalarda sigara kullanımının in vitro PMNL fagositik aktivitesi üzerine etkisinin değerlendirilmesidir. Araştırmaya klinik ve radyografik olarak kronik periodontitis teşhisi konmuş 15 sigara içen ve 10 sigara içmeyen hasta dahil edildi. Sigara içen ve içmeyen her iki hasta grubundan başlangıç periodontal tedavi yapıldıktan bir ay sonra periodontal klinik parametreler ölçüldü ve aynı seansta in vitro PMNL fagositik aktivitesi için kan örnekleri alındı. Sigara içen ve içmeyen gruplar arasında klinik periodontal parametrelerde, in vitro PMNL fagositik aktivitesinde ve her bir nötrofil başına düşen C. albicans sayısında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunamamıştır (P>0.05). Bu çalışmanın sınırları içerisinde, sigaranın in vitro PMNL fagositik aktivitesine etkisiz olduğu ve gelecekte diğer olası mekanizmaların değerlendirilmesi gereklidir. Anahtar kelimeler: Sigara, kronik periodontitis, polimorfonükleer lökositler, fagositoz SUMMARY Polymorphonuclear leukocytes (PMN) compose the first step of host defense system against pathogen microorganisms. Cigarette smoking which is a risk factor for periodontitis affects local and systemic host defense systems. The aim of this study was to evaluate the effect of smoking on phagocytic activity of peripheral PMN in patients with chronic periodontitis. The study included 15 smokers and 10 nonsmokers with chronic periodontitis as evidenced by clinically and radiographically. One month after initial periodontal therapy, clinical parameters were measured and at the same session blood samples were collected for in vitro phagocytic activity of peripheral PMN. However, there was no difference between two groups in clinical parameters, in vitro phagocytic activity of peripheral PMN and the mean number of C. albicans for each neutrophil (P>0.05). In the limits of this study, cigarette smoking has no effect on in vitro phagocytic activity of peripheral PMN and in the future it must be evaluated with other possible mechanisms. Key Words: Smoking, chronic periodontitis, polymorphonuclear leukocytes, phagocytosis GİRİŞ Periodontal hastalıkların başlamasında ve ilerlemesinde mikrobiyal plak bakterileri ve ürünleri primer etyolojik etken olmakla birlikte, konak savunma sistemi ve bireysel duyarlılık da önemlidir. 1,2 Bakteriyel enfeksiyonlara karşı konağın ilk savunma hattını oluşturan polimorfonükleer lökositler (PMNL), özellikle akut lezyonlarda bazı kemoatraktanlar aracılığıyla enfeksiyon alanına çekilirler, sonra çoğu mikroorganizmayı fagosite ederler ve içerdiği enzimlerle onları öldürür, sindirir ve nötralize ederler. 3,4,5 Bununla birlikte nötrofiller, doku tamiri ve yapımı dahil enflamatuar cevabın koordinasyonundan sorumlu bazı mediatörlerin salınımına karşın, 4 doku yıkımında da rol oynar. 5 * Selçuk Üniversitesi, Dişhekimliği Fakültesi, Periodontoloji Anabilim Dalı, Konya ** Selçuk Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Histoloji Anabilim Dalı, Konya
Cilt:6 Sayı:12003 PMNL lerde kemotaktik defektler, adezyonda yetmezlik, spesifik granüllerin eksikliği gibi anormalliklerin varlığı, periodontal hastalıkların daha şiddetlenmesine yol açabilir. 5,6 Sağlıklı kontrollere kıyasla lokalize juvenil periodontitis hastalarında genellikle sistemik olarak nötrofillerin kemotaktik 3,5,7 ve fagositik yeteneklerinde 5,8 azalma söz konusudur. Periodontitis için önemli ve tek çevresel majör risk faktörü olduğu belirtilen 911 sigara kullanımı, lokal ve sistemik konak savunma sistemlerini olumsuz yönde etkilemektedir. Lokal olarak, sigarada bulunan nikotinin kan damarları üzerine vazokonsrüktif etkisi, dişetinde kan akımında yavaşlamaya ve muhtemelen dişetine geçen hücre sayısında, oksijen miktarında ve diğer kan içeriklerinde azalmaya neden olmakla birlikte doku yıkım ürünlerini uzaklaştırma yeteneğini de düşürür. 12 Sistemik olarak, periferal kandaki nötrofil fonksiyonunu engeller ve antikor üretimini azaltır. 13 Epidemiyolojik ve klinik çalışmalar 10,12,1417 sigara tüketimi ve periodontal hastalık oluşumu ve ilerlemesi arasında bir ilişki olduğunu göstermiştir. Periodontitis ve sigara kullanımı kombinasyonunun beyaz kan hücreleri ve özellikle nötrofillerin sayısında artışa neden olduğu ortaya konmuştur. 18,19 Sigara kullanımının ve sigaradaki suda çözünebilen komponentlerin ve tütün metabolitlerinin normal PMNL kemotaktik ve fagositik yeteneğini olumsuz yönde etkilediği gösterilmiştir. 8 Ayrıca, Marrigio ve ark. 20 sigara içen periodontitisli bireylerin dişeti oluğu sıvısında yüksek oranda PMNL apoptozisi belirlemişler ve nikotinin bu hücreler üzerinde apoptotik etkisi olduğunu bulmuşlardır. Periodontitisli hastalarda sigaranın PMNL aktiviteleri üzerine etkilerini araştıran sınırlı sayıdaki crosssection çalışmalarda 8,21 sonucu etkileyebilecek plak ve enflamasyon gibi faktörler elimine edilmemiştir. Bu çalışmada, kronik periodontitisli hastaların başlangıç tedavileri sonrası sigaranın in vitro PMNL fagositik aktiviteleri üzerine etkilerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. GEREÇ VE YÖNTEM Araştırma, S.Ü. Dişhekimliği Fakültesi Periodontoloji Kliniği ne başvuran, klinik ve radyografik olarak kronik periodontitis teşhisi konan 25 gönüllü hasta üzerinde yürütüldü. Hasta seçiminde herhangi bir sistemik hastalığın bulunmamasına, son 6 ay içerisinde antibiyotik kullanmamış ve daha önceden periodontal tedavi görmemiş olmalarına dikkat edildi. Çalışmaya dahil edilen hastalar iki gruba ayrıldılar; 1. Sigara içen grup : Günde yaklaşık bir paket (ortalama 20 adet/gün) sigara içen ve sigara içme süreleri ortalama 21.14±8.49 yıl olmak üzere yaşları 32 59 arasında değişen (ortalama 45.06±8.70) toplam 15 hastadan oluşmaktadır. 2. Sigara içmeyen grup S(): Çalışma süresine kadar hiç sigara içmeyen ve yaşları 3659 arasında değişen (ortalama 46.7±6.61) toplam 10 hastadan oluşmaktadır. Çalışmaya dahil edilen her hastaya öncelikle oral hijyen motivasyonu, diş yüzeyi temizliği ve kök yüzey düzleştirmesinden oluşan başlangıç periodontal tedavileri uygulandı. Tedavi sonrası 1. ayda her iki hasta grubunun, periodontal durumları klinik olarak Plak İndeksi (Pİ), 22 Gingival İndeks (Gİ), 23 Sondalama Cep Derinliği (SCD) ve Klinik Ataşman Kaybı (KAK) ölçümleri ile değerlendirildi. Periodontal parametreler açısından her diş için ortalama değerler kullanılarak her bireye ait ortalama değerleri hesaplanmıştır. Aynı seansta her hastadan in vitro PMNL fagositik aktivitesi için kan örnekleri alındı. Sondalama cep derinliği, dişlerin vestibül ve palatinal/lingual yüzeylerinde mesial, orta, distal olmak üzere toplam altı bölgesinden Williams periodontal sonda (HuFriedy, Chicago, IL, USA) kullanılarak milimetrik olarak ölçüldü. Ölçüm esnasında sondanın, dişin uzun aksına paralel olmasına ve aşırı kuvvet uygulanmamasına dikkat edildi. Klinik ataşman kaybı ise, minesement sınırından periodontal cep tabanına kadar olan mesafe milimetrik olarak ölçülerek elde edildi. İn vitro PMNL fagositik aktivite tespiti Her hastanın ön kolundan 10 ml periferal kan alındı ve PMNL lerin in vitro fagositik aktiviteleri, S.Ü. Veteriner Fakültesi Histoloji Anabilim Dalı laboratuarında değerlendirildi. Kan örnekleri % 3 oranında dekstran içinde PBS ile 1/5 oranında karıştırılarak oda ısısında 1 saat bekletildi. Üst kısımdaki lökositten zengin plazma tabakası alınarak 10 ml Histopaque 1077 (Sigma, Chemical CO. St.Louis MO 63178 USA) ile tabakalandırıldı. 500 g de 30 dk 20 0 C da santrifüjden sonra elde edilen nötrofiller Medium 199 (Sigma, Chemical CO. St.Louis MO, 63178, USA) içerisinde süspanse edilerek konsantrasyonu 3x10 7 hücre/ml olacak şekilde ayarlandı. Hücrelerin saflık oranları 2
Cilt:6 Sayı:12003 WrightGiemsa boyaması ile, canlılık oranları ise Tripan blue yöntemi ile belirlendi. Sonuçta elde edilen hücre kültüründe en az %95 oranında saflık sağlanması amaçlandı. Nötrofillerin fagositik fonksiyonlarının belirlenmesinde test mikroorganizması olarak C. albicans kullanıldı. Katı besi yerinde üretilen C. albicans M 51, günlük olarak ihtiyaç oranında sıvı besi yerlerine ekilip 37 0 C de 18 saat süre ile inkübe edildikten sonra; PBS solüsyonu içerisinde süspanse edilerek 200g de 5 dakika santrifüj edildi. Metilen mavisi ile (2x10 1 mmol/l) yapılan testte canlılık oranları %99 olarak bulundu. Hemositometre ile sayım yapılarak, Medium 199 içerisinde yapılan süspansiyonun konsantrasyonu 6x10 7 hücre/ml olarak ayarlandı. Total inkübasyon ortamı 2 ml/tüp olacak şekilde belirlendi. Buna göre her bir tüpe; 0.5 ml nötrofil süspansiyonu, 0.5 ml C albicans süspansiyonu, 0.2 ml inaktif insan serumu (5 0 C de 30 dakika) ve 0.8 ml Medium 199 solüsyonu ilave edildi. Bütün inkübasyon ortamları 37 0 C de 1 saat süreyle 4 rpm de su banyosunda tutuldu. PMNL lerin fagositoz aktiviteleri, WrightGiemsa boyama yöntemi ile ışık mikroskobunda belirlendi. Her örnekten hazırlanan ikişer preparattan rasgele seçilen bölgelerdeki 100 nötrofil sayıldı. PMNL lerin fagositik aktivitesi (FA), sayılan 100 nötrofilden fagositoz yapanların yüzdesi olarak ifade edildi ve aşağıdaki formül ile hesaplandı. FA(%): (Fagositoz(+) nötrofil / toplam nötrofil sayısı) x 100. Fagitoz yapan nötrofil başına düşen C. albicans sayıları (C) ise, fagosite edilen C. albicans/hücre olarak ifade edildi. İstatitiksel analiz Nötrofillerin fagositik aktivitesi ve nötrofil başına düşen C. albicans sayısında gruplar arası farklılıklar Studentt Testi kullanılarak, bu iki parametre ve klinik parametreler arasındaki ilişki Pearson Correlation Testi ile değerlendirilmiştir. BULGULAR Başlangıç periodontal tedavi sonrası kaydedilen klinik periodontal parametre değerlerinde gruplar arasında herhangi bir farklılık bulunmamıştır (P>0.05) (Tablo 1). Parametreler (n=15) S() (n=10) Gİ 1.35±0.31 1.49±0.22 0.629 0.436 Pİ 1.51±0.33 1.17±0.18 2.390 0.136 SCD 3.17±0.49 3.19±0.52 0.051 0.824 KAK 5.13±0.65 4.70±0.62 0.057 0.813 Tablo 1. Klinik parametrelerin ortalama değerleri ve ile S() verileri arasındaki istatistiksel analiz sonuçları (ort±ss) Sigara içen ve içmeyen kronik periodontitisli hastalardan elde edilen periferal kandaki PMNL lerin in vitro fagositik aktivitesi ve nötrofil başına düşen C. albicans sayısı mikroskobik olarak incelenmiştir (Resim 1). Fagositoz yeteneğine sahip nötrofil yüzdesi ve nötrofil başına düşen C. albicans sayısında gruplar arasında istatistiksel olarak herhangi bir farklılık bulunamamıştır (P>0.05) (Tablo 2). Resim 1: Candida albicans ı fagosite eden nötrofil (FA) (x1000). (n=15) S() (n=10) FA 65.87±10.62 69.70±13.73 0.735 0.400 C 1.09±0.18 1.08±0.24 2.011 0.170 Tablo 2. Fagositik kapasite (FA) ve nötrofil başına düşen C. albicans sayısının (C) ortalama değerleri (ort±ss) Klinik parametreler ile FA ve C değerleri arasındaki ilişki incelendiğinde ise S() grupta, FA ve C ortalama değerleri ile Gİ ortalama skorları arasında şiddetli ve orta şiddette negatif, grupta FA ortalama değeri ile F F P P 3
Cilt:6 Sayı:12003 SCD ortalama skoru arasında orta şiddette negatif korelasyon gözlenmiştir (Tablo 3). FA Gİ Pİ SCD KAK S() (n=15) (n=10) 0.282 0.883** C 0.209 0.677* S() S() S() (n=15) (n=10) (n=15) (n=10) (n=15) (n=10) 0.257 0.084 0.124 0.588* 0.171 0.166 0.352 0.616 *P<0.05 seviyesinde ilişki (Pearson correlation) **P<0.01 seviyesinde ilişki 0.003 0.044 0.143 0.139 Tablo 3. FA ve C ile klinik parametreler arasındaki korelasyon analizinden elde edilen r değerleri TARTIŞMA Bu çalışmada periodontal tedavileri yapıldıktan sonra periodontal durumları eşleştirilmiş olan kronik periodontitisli hastalarda sigara kullanımının konak savunma sistemi hücrelerinden in vitro PMNL fagositik aktivitesi üzerine etkisiz olduğu görüldü. Periodontal hastalıkların prevalansı ve şiddeti üzerine sigara kullanımının etkisi sıklıkla araştırılmaktadır. Ancak sigara kullanımının, hangi mekanizma ile periodontal hastalığın ilerlemesi katkıda bulunduğu halen tam olarak anlaşılamamıştır. Genellikle, sigara kullanımı iki farklı mekanizmayla konak cevabını değiştirerek artmış periodontal yıkıma yol açabilir: 1) Enfeksiyon nötrolizasyonunda normal konak cevabının bozulması ve 2) Sağlıklı periodontal dokuların yıkımına neden olan değişiklikler. 24 Agresif periodontitisli bireylerin periferal kan nötrofillerinde kemotaktik ve fagositik fonksiyonlarında anormallikler olduğu ve enfeksiyonlara karşı yatkınlıklarının arttığı rapor edilmiştir. Ancak kronik periodontitisli bireylerde ise enflamasyon şiddeti bakteriyel plak varlığı ile yakından ilişkili olup, herhangi bir serum, nötrofil veya monosit anormalliği tanımlanamamıştır. 25 Bu nedenle, sigaranın PMNL fonksiyonları üzerindeki etkilerinin en iyi kronik periodontitiste saptanabileceği düşünülerek çalışmamızda bu hasta grubu kullanılmıştır. Aynı zamanda dental plak ve enflamasyon şiddeti gibi faktörler nötrofillerin sayısında ve fonksiyonunda artışa neden olmaktadır. 19 Dolayısıyla bu etkilerini ortadan kaldırılması ve sigara içen ve içmeyen hasta gruplarının periodontal durumlarını eşleştirebilmek için başlangıç tedavisinden sonra bir ay beklenildi. Böylece bu çalışmada sadece sigaranın nötrofil fagositik aktivitesi üzerindeki etkisinin araştırılması amaçlandı. MacFarlene ve ark, 21 sigara içen ve içmeyen hastaların periferal kandaki nötrofil fagositik ve kemotaktik aktivitelerini değerlendirmişler ve sigaranın fagositik aktivite üzerine etkisini bulamamışlardır. Ancak sigara kullanımının sağlıklı kontrollere kıyasla lökosit sayılarında bir artışa neden olduğu 18 ve fonksiyonlarında da önemli derecede azalma gösterdiği çalışmalar 5,8,26,27 vardır. Sigara içen ve içmeyen hastaların periferal kandaki nötrofil fagositik ve kemotaktik aktivitelerini araştıran Noble ve Penny, 28 siklik 3, 5 adenozin monofosfatın (camp) sigara içenlerde aktif olduğunu ve geçici olarak arttığını, bunun da nötrofillerin fagositik kapasitesi üzerinde ters etkilere sahip olduğunu açıklamıştır. 3 mm dibütiril camp ın insan lökositlerinde C. albicans fagositozunu azalttığını belirtmişler ancak iki grup arasında fark bulamamışlardır. Benzer olarak bu çalışmada da, PMNL fagositik aktivite kapasitelerini değerlendirmek için C. albicans kullanıldı ve gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olmadığı saptandı. Klinik parametreler ile FA ve C değerleri arasındaki ilişki incelendiğinde, ilginç olarak grupta sadece fagositoz yeteneği olan nötrofillerin yüzde ortalama değerleri ile SCD ortalama skoru arasında orta şiddetli negatif korelasyon gözlenmiştir. Çalışmanın sınırları içinde sigara kullanımı ile plak miktarı arasında bir aylık dönemde herhangi bir korelasyon saptanamamıştır. Eğer daha uzun dönemde ve daha fazla sayıda hasta değerlendirilseydi, belki de sigaranın plak miktarını arttırabileceği bulunabilirdi. Sigara kullanımı ile Gİ arasında korelasyonun olmaması ise sigaranın enflamasyon üzerine baskılayıcı etkilerinden kaynaklanıyor olabilir. Periodontal hastalık çok çeşitli risk faktörleri ile ilişkilidir. Konak genetik faktörler ve çevresel faktörler arasındaki etkileşimler, periodontitis üzerinde bireysel faktörlerden daha çok etkiye sahip olabilir. Bu çalışmanın sınırları içerisinde sigaranın in vitro PMNL fagositik aktivitesine etkisiz olduğu ve gelecekte diğer olası mekanizmaların değerlendirilmesi gereklidir. 4
Cilt:6 Sayı:12003 KAYNAKLAR 1. Genco RJ. Host responses in periodontal diseases: Current concepts, J Periodontol; 63, 338355,1992. 2. Socransky SS, Haffajee AD. The bacterial etiology of destrucive periodontal disease: Current concepts J Periodontol, 63, 322331,1992. 3. Daniel MA, Van Dyke TE. Alterations in phagocyte function and periodontal infection, J Periodontol, 67, 10701075,1996. 4. Miyasaki KT. The neutrophil: Mechanisms of controlling periodontal bacteria, J Periodontol, 62, 761774,1991. 5. Nisengard RC, Newman MG, Sanz M. Host response: Basic concepts In Clinical Periodontology Ed. by Carranza FA and Newman MG 111120, W. B Saunders Company Philadelphia, 1996. 6. Wilton JMA, Johnson NW, Curtis MA. Spesific antibody responses to subgingival plaque bacteria as aids to the diagnosis and prognosis of destructive periodontitis, J Clin Periodontol, 18, 115,1991. 7. Ashkenazi M, White RR, Dennison DK. Neutrophil modulation by Actinobacillus actinomycetemcommitans I. Chemotaxis, surface reseptor expression and F actin polymerization. J Periodont Res, 27, 264273,1992. 8. Pabst MJ, Pabst KM, Collier JA, Coleman TC, Godat MS, Waring MB, Babu JP. Inhibition of neutrophil and monocyte defensive functions by nicotine, J Periodontol, 66, 1047 1055,1995. 9. Haber J, Kent RL. Cigarette smoking in a periodontal practice, J Periodontol, 63, 100106,1992. 10. Haber J, Wattles J, Crowley M, Mandell R. Evidence for cigarette smoking as a major risk factor for periodontitis, J Periodontol, 64, 1623,1993. 11. Tomar SL, Asma S. Smokingattributable periodontitis in the United States: Findings from NHANES III, J Periodontol, 71, 743751,2000. 12. RiveraHidalgo F. Smoking and periodontal disease A review of the literature, J Periodontol, 57, 617624, 1986. 13. Genco RJ. Current view of risk factors for periodontal diseases, J Periodontol, 67, 10411049, 1996. 14. Bergström J, Preber H. Tobacco use as a risk factor, J Periodontol, 65, 545550, 1994. 15. Bergström J, Eliasson S, Dock J. A 10Year prospective study of tobacco smoking and periodontal health, J Periodontol, 71, 13381347, 2000a. 16. Bergström J, Eliasson S, Dock J. Exposure to tobacco smoking and periodontal health, 27, 6168, 2000b. 17. Genco RJ, Löe H. The role of systemic conditions and disorders in periodontal disease, Periodontology 2000, 2, 98 116, 1993. 18. Fredriksson M, Gustafsson A, Asman B, Bergström K. Hyperreactive peripheral neutrophils in adult periodontitis: generation of chemiluminescence and intracellular hydrogen peroxide after in vitro priming and FcγRstimulation, J Clin Periodontol, 25, 394398, 1998. 19. Fredriksson M, Figueredo CMS, Gustafsson A, Bergström K, Asman B. Effect of periodontitis and smoking on blood leukocytes and acutphase proteins, J Periodontol, 70, 1355 1360, 1999. 20. Mariggio MA, Laforgia A, Santacroce R, Curci E, Montemurro P, Fumarulo R. Nicotine effects on polymorphonuclear cell apoptosis and lipopolisaccharideinduced monocyte functions. A possible role in periodontal disease? J Periodont Res, 36, 3239, 2001. 21. MacFarlane GD, Herzberg MC, Wolff LF, Hardie NA. Refractory periodontitis associated with abnormal polymorphonuclear leukocyte phagocytosis and cigarette smoking, J Periodontol, 63, 908913, 1992. 22. Silness J, Löe H. Periodontal disease in pregnancy. II. Correlation between oral hygiene and periodontal condition, Acta Odontol Scand, 22, 121135, 1964. 23. Löe H, Silness J. Periodontal disease in pregnancy. I. Prevalence and severity, Acta Odontol Scand, 21, 533551, 1963. 24. Lamster IB. The host response in GCF: Potential applications in periodontitis clinical trials. J Periodontol, 63, 11171123, 1992. 25. Carranza FA, Newman MG. Clinical Periodontology 8 th Ed. W. B Saunders Company Philadelphia, 1996. 26. Nishimura F, Nagai A, Kurimoto K, Isoshima O, Takashiba S, Kobayashi M et al. A family study of a mother and daughter with increased susceptibility to earlyonset periodontitis: Microbiological, immunological, host defensive and genetic analyses, J Periodontol, 61, 755765, 1990. 27. Suzuki JB, Collison BC, Falkler WA, Nauman RK. Immunologic profile of juvenil periodontitis II. Neutrophil chemotaxis, phagocytosis and spore germination, J Periodontol, 55, 461467, 1984. 28. Noble RC, Penny BB. Comparison of leukocyte count and function in smoking and nonsmoking young men. Infect Immun, 12, 55055, 1975. 5
Cilt:6 Sayı:12003 Yazışma Adresi: Yrd.Doç.Dr. İsmet DURAN Selçuk Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Periodontoloji Anabilim Dalı 42079 KampüsKONYA Tel: +90 332 241 15 71 Eposta: iduran@selcuk.edu.tr 6