TUTUKLANMIŞ KARIŞIK REKOMBİNANT E.coli KÜLTÜRLERİNDE PLAZMİD STABİLİTESİNİN İNCELENMESİ Vildan DİNÇBAŞ ve Amable HORTAÇSU Boğaziçi Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Bebek-îstanbııl-Türkiye. A STU D Y O P PLASM ID S T A B IL IT Y IN IM M OBILIZED MIXED CULTURES O F RECOMBINANT E.coli SU M M A R Y Recent advances in bacterial genetics and molecular biology led to the development o f Recombinant DNA Technology. With new techniques, a microorganism Üke a bacterium carrying a foreign gene in a vector is used to produce a foreign protein. The growth behavior o f a mixed culture o f plasmid-free and plasmid-containing E.coli cells in free suspension and immobilized conditions were studied experimentally. It was found that immobilization delayed the reduction o f plasmid-containing fraction for a period o f time inversely related to the total number of cells immobilized initially. A simple structured model that assumes compartmentalization o f cells in the immobilization matrix at the beginning o f growth gave a fit which was in good argument with the data.: ÖZET Bakteri genetiği ve moleküler biyolojideki son ilerlemeler, rekombinant DNA teknolojisinin gelişmesine yol açti. Yeni teknikler sayesinde, yabancı bir genin bulunduğu vektörü taşıyan bir mikroorganizma, örneğin bir bakteri, yabancı bir protein üretmek için kullanılmaktadır. Plazmid YEp352 içeren ve içermeyen E.coli HB101 hücrelerinden oluşan karışık kültürlerin askılı ve tutuklanmış ortamlardaki büyüme hareketleri deneysel olarak incelendi. Tutuklamanın, başlangıçta tutuklanan hüre sayısı ile ters orantılı bir süre içinde plazmid içeren bakteri yüzdesinin azalasım geçiktirdiği bulundu. Büyüme başlangıcında tutuklanmış hücrelerin ayn bölmelerde bulunduğunu varsayan basit bir model verilerle uyumlu bir sonuç verdi. GİRİŞ... Rekombinant DNA teknolojisinin endüstriye uygulanmasındaki başlıca problemlerden biri, rekombinant plazmidin stabil halde kalmasıdır. Uzun süreli fermentasyoniarda plazmid içeren mikroorganizma yüzdesi azalmaktadır. Bu durumun şimdilik bilinen iki sebebi vardır: spesifik bir genin klonlandığı plazmid zam anla hücrelerden kaybolmaktadır, veya, plazmid içermeyen hücreler, diğerlerine oranla daha hızlı büyümekte, böylece ortamda çoğalmaktadırlar. Rekombinant plazmidlerin stabilitelerinin arttırılması için bazı yöntemler önerilmektedir (1). Bunula birlikte, bu yaklaşımların çoğu ya plazmidin yapısında bazı değişiklikler yaptırmayı gerektirir, veya endüstriyel kullanımda bazı sakıncaları olabilir; fermantasyon ortamına, plazmid-içeren bakteri seçimi için antibiyotik ilave edilmesi gibi. 331
Rekombinant plazmid içeren hücrelerin matriksler içine tutuklanması, stabiliteyl arttıncı bir method olarak kullanılabilir (2,3,4,5). Tutuklanmanın plazmid stabiliteşine olan bu etkisini anlamak için, YEp 352 piazmid vektörünü içeren ve içermeyen B.coli HB101 hücrelerinden oluşan karışık kültür, besi ortamında, askıda ve aynca İmmobilize edilmiş olarak büyütüldü. Deneylerde gözlenen stabiliteyl açıklayacak basit bir model kullanıldı. DENEL BÖLÜM Organizma ve plazmid Plazmid vektör YEp352 içeren ve içermeyen Eschertchia coli HB101 suşu, Manchester Üniversitesinden Prof. Ferda Mavituna'nın hediyesidir. YEp352 plazmldl, 5.2 kb büyüklöğündedir. Ampisiline dayanıklılık geni (Amp^) ve lac operonunun promoter ve lacza bölgeleri bulunmaktadır. 3 M. jt O P r f l E.colt hücreleri, -70 C deki gliserin solüsyonunda saklandı; Deneylerde kullanılan besi ortamı M9 Minimal Medlum dur. Bir litre distüe ve deionlze suda: İmi İM MgSC>4.7H20, İmi İM CaCİ2, 10 mi 20%llk glukoz, 20mg L-leucİne, 20 mg L-proÜne, İmi İM Thiamine-HCl, 6g Na2HP0 4, 3g KH2PO4, lg NH4CI, O.Sg NaCİ bulunmaktadır. Hücrelerin büyüme hızlarını arttırmak için glukoz ve aminoasitlerin miktan iki katma çıkarıldı (M9+). 50 mi lik sıvı ortam içeren iki erlene, paralel olarak 0.1 nü lik ekim yapıldı. Her iki erlen 38.5 C de, çalkalayıcıda bırakıldı. Belli zamanlarda alınan numuneler, 0.85% lik steril şaline İle seyreltildikten sonra petri kaplarına ekildi. Minimum 150 koloni, kadife bir bez ile ampisiunsiz LB ağardan, ampisilinliye transfer edildi. Plazmid-içeren bakteri yüzdesi böyle bulunmuştur. İmıppfrflfre QM uş.,bf l G ^ Immobllizasyon, Ca-aljinat jel toplan içine yapılmıştır. Kullanılan method Martinsen tarafından tarif edilene benzemektedir(6). Yaklaşık 1000 top içeren iki erlen 38.5 C de, çalkalayıcıda bırakıldı. Her numune İçin 10 top alınmıştır. 50mM lik Na-citrate solüsyonu, Ca-alginatı ağını çözmek için kullanılmıştır. Plazmid İçeren bakteri yüzdesi yukarıda belirtildiği gibi yapılmıştır. SONUÇLAR VE TARTIŞMA Bakteriler askılı ve kesikli ortamda büyütüldüklerinde, her iki bakteri aynı sübstrat için yarışmaktadır. Bu durumda plazmidsiz bakteriler, büyüme hızları daha yüksek olduğundan, daha çabuk çoğalmakta, böylece de popülasyondaki yüzdeleri zamanla artmaktadır. Şekil l de deney verileri gösterilmiştir.
0.0 o 20 40 60 80 Zaman (saat)?ekü' L Askılı ortamda P+ hücrelerinin yüzdesinin zamanla değişimi. Karışık kültürün Ca-aljlnat ağ yapısı içine immobilize olması, kesikli ortamda büyüdüklerinde, bakteri popülasyonunun kinetik özelliklerinde gözle görülür bir farklılık yaratmıştır. Şekil 2 de görüldüğü gibi, başlangıçta tutuklanan hücre sayısına göre 10-40 saatlik süreler boyunca plazmid-içeren bakteri yüzdesl hemen hemen sabit kalmıştır. Hücrelerin ayrı bölmelerde büyümeleri (compartmen tallzation), askılı ortamda hemen başlayan besi için, yarışmalarını geçiktirmektedir. Böylece iki tür bakteri birbirlerinden etkilenmeden büyüyebilecekleri bir ortam bulmaktadırlar. Hücre sayısı belli bir miktan geçtikten sonra ağın içindeki boşluklar genişlemekte, böylece bu ayrılma ortadan kalkmaktadır. Bu zamandan sonra immobilize sistem, askılı sistem gibi davranır ve popülasyon kanşık bir kültür olarak devam eder. Tftblo i a.plazmld İçeren ve içermeyen hücrelerin askılı sistemdeki bazı özellikleri bakteri iflrft Mmffltihfcll M g J U İfafoMm \. P+ 0.187 0.3 IxlO10 P- 0.288 0.7 1.2X1011 b.flazmid İçeren ve İçermeyen hücrelerin immobilize sistemdeki bazı özellikleri bakteri tûrû Umax fhr-1) Ksİtg/Ll P+ 0.187 0.5 P- 0.288 1.0
\ \ s 1.0 9 Deney 1 A Deney 2 Simulasyon 1 Simuiasyon 2 \ \\ 0.0 i O 20 40 60 80 100 Zaman(Saat) Başlangıçtaki hücre m iktan; deney 1: 10 hücre/ml; deney2: 10& hücre/ml. Benzeştirme (Simulation) için kullanılan model Monod un büyüme kinetiği modelinin aynıdır (7). Sadece plazmid-içeren ve içermeyen iki tür için ayrı ayrı yazılmıştır. Modelde kullanılan değişkenler Tablo 1 de verilmiştir. İmmobilizasyon yapıldığında hücrelerin birbirlerinden ayrı büyümeleri, hücre sayısı 5x10 hücre/ml ye ulaşıncaya kadar sürmektedir. De Gooijer, K~ carrageenan toplarına yapılan immobilizasyondaki hücre taşmasına sebep olan maksimum hücre miktarını 10x109 hücre/ml olarak {8), Monbouquette ise 5 x 1 0 * olarak bildirmiştir(9). Glukozun difî2yönü taşıyıcı matriks içinde daha zor olduğundan kütle transferini limitlemektedir. Doym uşluk sabiti Ks, tutuklanmış ortamın modellemesi sırasında daha yüksek değer almaktadır. KAYNAKLAR 1. D.D.Y. Ryu ve S.B. Lee, "Development and optimization of recombinant fermentation processes", Horizons o f Biochemical Engineering, 11 (1987) 56-68. 2. S. Sayadi, N. Nasri, J.N. Barbotin ve D.Thomas. "Effect o f enviromental growth conditions on plasmid stability, plasmid copy number and cathecol 2,3- dioxygenase activity in free and immobilized E.coli cells." Biotechnol. Bioeng. 33 (1989) 801-806. 3. T.K. W alls ve J.L. Gainer. "Retention of plasm id bearing cells by immobilization" Biotechnol. Bioeng.34 (1989) 717-722. 334
4. P. Oriel, "immobilization of recombinant E.coli in silicone polymer beads", Enzyme and Microb. Technol. 10 (1988) 518-523. 5. N. Nasri, S. Sayadi, J.N. Barbolin, P. Dhulster ve D.Thomas. "Influence of immobilization of ptg201 recombinant plasmid in some strains of E.coli", AppL Environ. Microbiol. 53 (1987) 740-746. 6. A. Martinsen.G. Skjak-Brsek ve O. Smidsrad, "Alginate as immobilization material: 1. Correlation between chemical and physical properties of alginate gel beads", Biotechnol. Bioeng. 35 (1990) 609-621. 7. J.E. Bailey ve D.F. Ollis, "B ioch em ical E n gin eerin g F undam entals", 2.basim, McGrawHiU, Singapore. (1986) 382-403. 8. C.D. De Grooijer, R.H. Wijffels ve J. Tramper, "Growth and substrate consumption of Nitrobacter agilis cells immobilized in Carrageenan: Part 1. Dynamic modelling", Bio technol. Bioeng. 38 (1991) 224-229. 9. H.G. Monbouquette, G.D. Sayles ve D.F. Ollis, "Immobilized cell biocatalyst activation and pseudo-steady-state behaviour: Model and experiment" Biotechnol. Bioeng. 35 (1990) 609-820.