EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ (YÜKSEK L SANS TEZ ) Astragalus trojanus (GEVEN) B TK S N N FARKLI IN VITRO BES N ORTAMLARINDA REJENERASYONU Berna OLTULU Yüksek Lisans Tezi, Biyomühendislik Anabilim Dal Bilim Dal Kodu: 612.01.00 Sunu Tarihi: 11.09.2008 Tez Dan man : Prof. Dr. Aynur GÜREL Bornova - 2008
II
III Berna Oltulu taraf ndan Yüksek Lisans Tezi olarak sunulan Astragalus trojanus (Geven) Bitkisinin Farkl In Vitro Besin Ortamlar nda Rejenerasyonu ba l kl bu çal ma E.Ü. Lisansüstü E itim ve Ö retim Yönetmeli i ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü E itim ve Ö retim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyar nca taraf m zdan de erlendirilerek savunmaya de er bulunmu ve 11.09.08 tarihinde yap lan tez savunma s nav nda aday oybirli i/oyçoklu u ile ba ar l bulunmu tur. Jüri Üyeleri: mza Jüri Ba kan : Prof. Dr. Aynur GÜREL Raportör Üye: Prof. Dr. Emine BAYRAM Üye: Prof. Dr. Erdal BED R
IV
V ÖZET Astragalus trojanus (GEVEN) B TK S N N FARKLI IN VITRO BES N ORTAMLARINDA REJENERASYONU OLTULU, Berna Yüksek Lisans Tezi, Biyomühendislik Anabilim Dal Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Aynur GÜREL Eylül 2008, 42 Sayfa Bu tezde, t bbi özelliklere sahip endemik bir bitki olan Astragalus trojanus Stev. in farkl büyüme ortamlar nda tohumdan ba lanarak in vitro rejenerasyonu incelenmi tir. Çimlendirme, sürgün olu umu ve geli imi ile köklendirme için uygun besin ortamlar ve uygulamalar denenmi tir. En iyi çimlenmeler (%25), steril ortamda tohum kabuklar n n bistüri ile çizildi i uygulama sonucunda elde edilmi tir. Çimlendirilen bir tek Astragalus trojanus Stev. tohumundan elde edilen sürgün eksplantlar ndan in vitro bitki klonlar ço alt lm t r. Klon bitkiciklerden sürgün eksplantlar sürgün ço alt m için haz rlanan 4 farkl Murashige ve Skoog (1962) (MS) ortam na aktar lm ve büyüme parametreleri; eksplant ba na dü en sürgün say s ve kallus olu turan eksplant yüzdesi incelenmi tir. Klon bitkiciklere ait sürgün eksplantlar nda, 0.5 mg/l Benzil Amino Pürin
VI (BAP) (ortalama 1,96 sürgün/eksplant) ve 1mg/L BAP (ortalama 1,84 sürgün/eksplant) içeren MS ortamlar nda en iyi sürgün geli imi sa lanm t r. Sürgün geli tirme ortam nda yeterli say ya ula an bitkicikler kök olu umu için 11 farkl MS ve 2 farkl Lloyd ve McCown (1980) (WPM) ortamlar na aktar lm t r. En iyi köklenmeler 1mg/L ndol Bütirik asit (IBA) (%17,8) ve 0,5mg/L IBA (%14,4) içeren WPM ortamlar nda elde edilmi tir. Tüm kültürlerde, 4000 lux ayd nlatma, 26±2 0 C s cakl k ve 16 saat ayd nl k, 8 saat karanl k fotoperiyot kullan lm t r. Anahtar sözcükler: Astragalus trojanus Stev., geven, in vitro, rejenerasyon, klon
VII ABSTRACT REGENERAT ON of Astragalus trojanus (Geven) in DIFFERENT IN VITRO NUTRIENT MEDIA OLTULU, Berna M.Sc. Thesis. Bioengineering Department Supervisor: Prof. Dr. Aynur GÜREL September 2008, 42 pages In this thesis, in vitro regeneration of Astragalus trojanus Stev., an endemic plant with medical characteristics has been investigated in different mediums where it is started from seed. Appropriate nutrient medium and applications are experienced on behalf of germination, shoot formation and development and also rooting media. The best germinations were derived from the applications where testa is drawn within the sterilized environment. In vitro plant clones were propagated from shoot explants which were obtained by one germinated Astragalus trojanus Stev. seed. Shoot explants of clone plantlets were transferred on 4 different Murashige and Skoog (1962) MS media prepared for shoot propagation, and growth parameters, the number of shoots per explants, and explants percent forming callus are studied. The best shoot development in shoot explants of clone plantlets
VIII was achieved on MS medium supplemented with 0,5mg /L Benzyl Amino Purine (BAP) (1,96 average number of shoots/explant) 1mg/L BAP(1,84 average number of shoots/explant). After the plantlets were reached sufficient number in shooting media, they were transferred on 11 different MS and 2 different Lloyd and McCown (1980) (WPM) media in favour of root development. The best root development was obtained on WPM medium supplemented with 1 mg/l IBA (%17,8 rooted explant percentage) and 0,5 mg/l IBA (%14,4 rooted explant percentage ). All cultures were incubated at 27 ± 40C under a light intensity of 4000 lux, with 16 hour photoperiod. Key Words: Astragalus trojanus Stev., geven, in vitro, regeneration, clone
IX TE EKKÜR Çal mam zda bana her türlü deste i sa layan dan man m Prof. Dr. Aynur GÜREL e; beni her zaman destekleyen aileme ve arkada lar ma te ekkürü bir borç bilirim.
X Ç NDEK LER Sayfa ÖZET... V ABSTRACT...VII TE EKKÜR... IX EK LLER D Z N... XIII Ç ZELGELER D Z N...XV 1.G R... 1 2. L TERATÜR B LD R LER... 6 2.1 Bitkisel özellikler... 6 2.2 T bbi özellikler... 7 2.3 Astragalus türleri üzerinde bitki doku kültürü çal malar... 10 3. MATERYAL ve METOT... 15 3.1 Materyal... 15
XI Ç NDEK LER (devam) 3.2 Metot... 15 3.2.1 Besin ortamlar n n haz rlanmas... 16 3.2.2 Birinci grup tohumlarda kullan lan sterilizasyon yöntemleri ve ön i lemler... 17 3.2.3 Birinci grup tohumlar n çimlendirme ortam na al nmas... 18 3.2.4 kinci grup tohumlarda kullan lan sterilizasyon yöntemleri ve ön i lemler... 19 3.2.5 kinci grup tohumlar n çimlendirme ortam na al nmas... 20 3.2.6 Sürgün eksplantlar n n sürgün geli imi ortam nda kültüre al nmas... 20 3.2.7 Sürgün eksplantlar n n kök geli imi ortam nda kültüre al nmas. 20 3.2.8 Sürgün eksplantlar ndan tek tohum kökenli klonlar n ço alt lmas... 21 3.2.9 Kültür ko ullar... 22 3.2.10 Denemenin kurulmas ve verilerin de erlendirilmesi... 23 4. BULGULAR... 24 4.1 Kültüre al nan tohumlarda sterilizasyon durumu... 24 4.2 Kültüre al nan tohumlarda görülen geli meler... 25
XII Ç NDEK LER (devam) 4.3 Astragalus trojanus bitkilerinde in vitro sürgün geli imi...27 4.4 Astragalus trojanus bitkilerinde in vitro kök geli imi...31 5. TARTI MA ve SONUÇ...36 KAYNAKLAR D Z N...39 ÖZGEÇM...42
XIII EK LLER D Z N ekil Sayfa 1.1 Astragalus türlerinin Dünya üzerindeki da l m... 3 2.1 (a) A.trojanus yapraklar (b) A.trojanus çiçe i... 7 4.1 kinci grup tohumlar n kullan lan sterilizasyon yöntemlerine göre kontaminasyon yüzdeleri... 25 4.2 kinci grup tohumlar n kullan lan sterilizasyon yöntemlerine göre çimlenme yüzdeleri... 27 4.3 Sürgün ortamlar ndaki eksplantlarda görülen geli meler... 28 4.4 (a) ve (b) Astragalus trojanus da sürgün geli imleri... 29 4.5 Sürgün geli tirme ortamlar na al nan eksplantlarda kallus olu umu... 30 4.6 NAA içeren sürgün geli imi ortamlar ndaki Astragalus trojanus eksplantlar nda kallus olu umu... 30
XIV 4.7 Köklendirme ortamlar nda kültüre al nan sürgün eksplantlar nda olu an kök yüzdesi... 33 4.8 (a) ve (b) WPM içeren ortamlarda kültüre al nan Astragalus trojanus ta kök geli imleri... 34 4.9 (a) ve (b) MS içeren ortamlarda kültüre al nan Astragalus trojanus ta kök geli imleri... 34 4.10 Köklendirme ortamlar na al nan Astragalus trojanus eksplantlar nda meydana gelen kararma... 35
XV Ç ZELGELER D Z N Çizelge Sayfa 2.1 Astragalus trojanus un sistematik künyesi... 6 3.1 MS (1962) ve WPM (1980) besin ortamlar n n içerdi i maddeler ve miktarlar... 16 3.2 Tohumlara uygulanan ön i lem ve sterilizasyon yöntemleri... 18 3.3 kinci grup Astragalus trojanus tohumlar na uygulanan streilizasyon yöntemleri... 19 3.4 Sürgün geli imi için kullan lan besin ortam bile eni... 20 3.5 Kök geli imi için kullan lan besin ortamlar... 21 3.6 Bitki büyüme düzenleyicilerinin in vitro Astragalus trojanus a ait klon 1 bitkilerinin büyüme parametreleri üzerine olan etkilerinin belirlenmesi için kullan lan ortamlar... 22 4.1 Birinci grup tohumlar n yüzeysel sterilizasyonu sonucu belirlenen kontaminasyon yüzdesi... 24 4.2 kinci grup tohumlar n yüzeysel sterilizasyonu sonucu belirlenen kontaminasyon yüzdesi... 24
XVI Ç ZELGELER D Z N (devam) 4.2.1 Birinci grup tohumlarda gözlenen çimlenme durumlar... 26 4.2.2 kinci grup tohumlarda gözlenen çimlenme durumlar... 26 4.3 Sürgün ortamlar ndaki 2-3 cm lik sürgün eksplantlar nda görülen geli meler... 28 4.4 Köklendirme ortamlar nda kültüre al nan sürgün eksplantlar nda görülen geli meler... 32
1 1. G R Yeryüzünde 2200 den fazla türü oldu u saptanan Astragalus, Fabaceae familyas n n Papilionoideae alt familyas nda sistematik yerini al r ve Angiospermlerin en geni genuslar ndan bir tanesi olarak belirtilir (M r c, 2004 ve Çobano lu, 1987). Ülkemizde 233 ü endemik (%59,6) olmak üzere 391 türle temsil edilen Astragalus, halk m zca GEVEN olarak tan nmaktad r (Uysal, 1997). Astragalus türlerinin besin de erlerinin yüksek olmas, çal formunda olanlar ndan kitre zamk elde edilmesi, yakacak ve hayvan yemi olarak kullan lmas yan nda erozyonu önlemede de kullan lmas nedeniyle önemi büyüktür (Uysal, 1997). Biyoçe itlilik aç s ndan önemli, kökleri 3-5 m derine inebilen ve geni dallar olan, e imli yamaçlar n erozyon bekçileri olan Astragalus türleri, yay ld alan n 2-4 kat büyüklü ündeki araziyi kaymalara kar tutmaktad r. Ahtapot misali kökleriyle çaprazlama topra korur ve e imli da yamaçlar n n zay f bitkilerini hayvanlara kar muhafaza ederler (Kaçmaz, 2007). Baz Astragalus türlerinin un, pelet veya taze halde meralarda otlatma yoluyla hayvanlara yedirildi inde, döl verme bozukluklar ve zehirlenmelere neden oldu u belirtilmi tir. Baz türlerin ise çiçek döneminden önce ve çiçek döneminde s rlar için zehir etkisi yapt rapor edilmi tir (Çobano lu, 1989). Baz Astragalus türlerinin sulu köklerinin özü Türk halk taraf ndan lösemi tedavisi ve yaralar n iyile tirilmesinde kullan lmaktad r. Astragalus türlerinin köklerinin polisakkaritler ve saponince zengin oldu u bilinmektedir. Çe itli Astragalus türlerine ait karakteristik
2 bile iklerin anti-kanser ve ba kl k sistemini güçlendirici etkileri oldu u bildirilmi tir (Ye ilada et al., 2004). Yap lan çal malar incelendi inde Astragalus cinsi bitkilerin kullan m alanlar ndan en önemlisinin t p oldu u görülmektedir. Astragalus türleri uzun y llardan beri Avrupa ülkelerinde de popüler bir t bbi bitki olarak kullan lmaktad r. Astragalus ço unlukla ginseng, melekotu, meyan kökü ve di er t bbi bitkiler ile birlikte çok say da geleneksel Çin toni inin yap s nda yer almakta ve çay eklinde de tüketilmektedir. Astragalus un yap kan özelli ine sahip öz suyu as rlardan beri geleneksel t pta yat t r c, ishal önleyici olarak kullan lmaktad r. Kitre zamk olarak adland r lan bu öz suyu t pta kullan m n n yan s ra yap kan, s k la t r c, emülsifiye edici ve kat la t r c ajan olarak di hekimli i (protez yap m ), tekstil ve besin (dondurma yap m ) endüstrisinde kullan lmaktad r (Anonim 2002). Ekonomik de eri aç s ndan önemli olan kitre zamk, özellikle A.aureus, A.brachycalyx, A.kurdicus ve A.microcephalus türlerinden elde edilmektedir (Uysal, 1997). Astragalus, Dünya da ba l ca Avrasya, Kuzey Amerika ve Güney Amerika da kurak ve yar kurak bölgelerde yay l m göstermektedir. Özellikle güneybat Asya (1000 1500 spp.), orta Asya n n Sino- Himalaya bölgesi (500 spp.), Alaska dan güney Meksika ya, Güney Amerika da (400-450 spp.) ve Kuzey Amerika da And da lar boyunca (100 spp.) yay l göstermektedir ( ekil 1.1) (Anonim, 2007a).
3 ekil 1.1 Astragalus türlerinin Dünya üzerindeki da l m Ülkemizde ise Astragalus türlerinin, Do u Anadolu ve ç Anadolu Bölgesi'ndeki 1300 3500 metre yükseltilerde, ç Ege ve Toroslar'da 1300 2300 metre yükseltilerde orman, step ve da yamaçlar nda yay l gösterdi i belirtilmi tir (Anonim, 2007b). Astragalus cinsinin endemik bir türü olan Astragalus trojanus Stev. stepte, makide, yol kenarlar nda ve toprak olu umunun iyi oldu u yerlerde bulunur. Bununla birlikte A.trojanus türünün yeti ti i toprak analizleri sonucunda orta alkali karakterli, tuzsuz, kireç bak m ndan zengin ve kumlu-t nl topraklarda yeti ti i topra n azotça orta, fosforca orta derecede zengin, potasyumca yetersiz ve organik maddece çok zengin olarak bulundu u belirtilmi tir (Uysal, 1997). A.trojanus Çanakkale Eceabat - Gelibolu aras nda 1.km de yol kenar nda 60m'de, ntepe - Tusan 10m'de yol kenar nda, Ayvac k- Küçükkuyu 320m de yol kenar ndaki yamaçta, Eceabat - Anafartalar 50m'de maki içinde yay l göstermektedir. Çanakkale d nda zmir Yamanlar Da Karagöl, Bal kesir Edremit in bat s 76. km de, zmir
4 Bornova Manisa aras nda ve Afyonkarahisar havaalan bölgesinde 1040 m yüksekliklerde yay l gösterir (Uysal, 1997). Astragalus türlerinin kökleri ter önleyici, idrar söktürücü ve canland r c olarak çok eskiden beri geleneksel ilaç olarak bilinmektedir. Ayr ca eker hastal, böbrek iltihab, kan kanseri ve rahim kanseri tedavilerinde de kullan lmaktad r. Türkiye de güneydo u Anadolu bölgesinde Astragalus köklerinden elde edilen s v ekstrakt, kan kanseri ve yara iyile tirme özelli i nedeniyle geleneksel olarak kullan lmaktad r (Bedir et al., 2000). Astragalus köklerinin bilinen biyolojik aktif bile enleri polisakkaritler ve saponinlerdir. Astragalus polisakkaritlerinin antikanser ve ba kl destekleyici özellikleri yap lan in vitro ve in vivo denemeler sonucunda bilinmektedir (Bedir et al., 2000). Bitki doku kültürü; aseptik ko ullarda, yapay bir besin ortam nda, bütün bir bitki, hücre (meristamatik hücreler, suspansiyon veya kallus hücreleri), doku (bitkinin çe itli k s mlar =eksplant) veya organ (apikal meristem, kök v.b) gibi bitki k s mlar ndan yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesini kapsamaktad r (Babao lu ve ark, 2002). Somaklonal varyasyonlar n olu turulmas, in vitro da mutantlar n seçimi, somatik hibridizasyon, h zl ço alt m, germplazm muhafazas ve gen aktar m gibi genetik manipulasyonlarda ba ar sa lanmas öncelikle doku kültürü teknikleri ile ba ar l bir bitki rejenerasyon sisteminin geli tirilmesine ba l d r (M r c, 2004). Bitkiden al nan küçük doku parçalar n n laboratuarda uygun, steril ve kontrollü ko ullar alt nda önce sürgün olu umuna yönlendirilip, sonra kök olu umunun elde edilmesiyle mikroço alt m na gidilmesi ile daha
5 stabil üretim sa lanabilecek ve do an n tahribat bir ölçüde engellenebilecektir. Sentetik madde içeren ürünlerin, insan ve çevre sa l bak m ndan yan etkilere sahip olmas nedeniyle de son zamanlarda, do al yap daki sekonder metabolitlere yo un bir ilgi ve talep art gözlenmektedir (Misawa,1994). T bbi bitkilerde var olan sekonder metabolitler, genotip ve çevreye ba l olarak de i kenlik gösterir. Ticari olarak bir bitkinin üretilmesinde standardizasyon gereklidir. Bu nedenle, doku kültürü yöntemiyle ayn genetik yap ya sahip A. trojanus fidelerinin üretilmesi önemlidir. Yine doku kültürü yöntemiyle üretimde, iklim faktörleri üretimi s n rlamayaca için hedeflenen bitki materyaline ula mak daha kolayd r. Bu projede, önemli bir t bbi bitki olan A. trojanus un normal üretim teknikleriyle ço alt lmas nda kar la lan zorluklardan dolay, tohumdan ba lanarak farkl kültür ortamlar nda rejenerasyonlar n n elde edilmesi amaçlanm t r. Daha önceki çal malarda A. cicer, A. melilotoides, A. adsurgens, A. hamosus gibi türlerde somatik embriyogenesis ve organogenesis yoluyla sürgün rejenerasyonu elde edilmi tir. Ancak, A. trojanus türü ile ilgili daha önce doku kültürü çal mas yap lmam t r. Bu projeden elde edilecek sonuçlar ile t bbi aç dan önemli sekonder metabolitlere sahip A. trojanus bitkisinin mikroço alt m yap labilecek ve bu bitkiye ait sekonder metabolitlerin hücre ve doku kültürü yöntemleriyle üretilmesinde faydal olacakt r.
6 2. L TERATÜR B LD R LER 2.1. Bitkisel Özelikler Fabaceae familyas n n Papilionoideae alt familyas nda sistematik yerini alan Astragalus, Angiospermlerin en geni genuslar ndan biridir. Sistematik künyesi çizelge 2.1 de verilmi tir (Anonim, 2007c). Çizelge 2.1 Astragalus trojanus un sistematik künyesi Sistematikteki Yeri Bitkiler Alemi (Plantea) Alt Alem Üst ube ube S n f Alt s n f Tak m Familya Botanik Ad Trachebionta Spermatophyta Magnoliophyta Mognaliopsida Rosidae Fabales Fabaceae Astragalus trojanus Astragalus trojanus Stev., 1,5 cm kadar çapl, kaz k köklü yere yay lan çal biçiminde çok y ll k bir bitkidir. Gövdeleri 30 cm kadar boylu ve villos tüylüdür. Yapraklar, koltu undan ç kan çiçeklerden daha uzundur. Birle ik yaprak tipinde olan yapra n yaprak ekseni dikenli, düz ya da e ri olup ortalama 40,1±11,0 mm boyundad r (Uysal, 1997).
7 Yapra n gövde ile birle ti i nodyumdan ç kan yapraklar sesil, çiçek durumu globos, daha çok oblong olup 3cm kadar çap nda 10 50 kadar çiçeklidir. Çiçek rengi pembedir ( ekil 2.1a, b). Üç farkl petal tipi vard r. Üst petal (veksillum) kanat eklinde olup yan ndaki iki petal (ala) ve alttaki iki petal (karina) ise birle iktir (Uysal, 1997). ekil 2.1 (a) A.trojanus yapraklar (b) A.trojanus çiçe i Meyve legümen, boyuna septal ve üzeri tüylüdür. Meyve kabu u gevrek bir sertliktedir. Tohum böbrek eklinde ve koyu kahverengidir ve kabu u serttir. Tohum ortalama 2,8±0,3 mm eninde ve 3,5±0,4 mm boyundad r. Çiçeklenme zaman 5 7. aylar olup 1040 m yüksekli e kadar yeti ebilmektedir (Uysal, 1997). 2.2. T bbi Özellikleri Astragalus cinsine ait t bbi amaçl en yayg n olarak kullan lan türler A. membranaceous, A. trigonus ve A. gummifera'dır. Çin'de Astragalus kökleri yüzy llard r yorgunluk, halsizlik, i tahs zl k, yara
8 iyile mesi, ate, terleme, kas a r s, so uk alg nl, diyare, ast m, rahim, ovaryum ve kolon kanserine kar tedavi amaçl kullan lmaktad r (Anonim, 1999). Astragalus türlerinde s kça bulunan sekonder metabolitler triterpenoitlerdir; sikloartan, lanostan ve oleanan tip triterpenoidlerin varl yap lan çal malar sonucu bulunmu tur. Sikloartan tip triterpenoidler ilk defa Astragalus bitkisinde tan mlanm t r. Bu çal malar, Astragalus bitkileri ile yap lan ara t rmalarda yeni bir sayfa açm t r. O zamandan beri sikloartan metilsteroidler ve glikozit içerikleri dünyadaki ara t rma merkezlerinde hedef ara t rma konusu olmu tur. Astragalus türlerine ait 152 tip sikloartan tan mlanm t r (Mamedova and Isaev, 2004). A.mongholicus daki glikoz ve arabinozdan olu an polisakkaritlerin fare dala nda spesifik antikor formasyonunu artt rmakla birlikte DNA, RNA ve protein sentezini de artt rd gösterilmi tir. Bununla birlikte sonraki grup bile ikler, saponinler, biyolojik olarak aktif komponentler olarak bilinir ve imdiye kadar saponinlerin bu prosesteki rolü detayl bir ekilde incelenmemi tir (Ye ilada et al., 2004). Di er taraftan Astragalus saponinleri ile yap lan çal malar sonucunda, antienflamatuar, a r kesici, idrar söktürücü, tansiyon dü ürücü ve sakinle tirici etkiler gibi biyolojik aktivite gösteren sikloartan tip triterpenoid glikozitlerin varl belirlenmi tir (Bedir et al., 2000). Türkiye deki Astragalus türleri ile ilgili çal malar sürerken çe itli sikloartan ve oleanan-tip triterpen glikozitler izole edilmi ve yap lar belirtilmi tir. Daha önceki çal malarda saponinlerin bitkilerdeki immün-modülatör etkisi üzerindeki rolü aç klan rken, A.melonophruris ten izole edilen sekiz sikloartan-tip saponin üstünde
9 lenfosit stimülasyon testleri yap lm t r. Test edilen bile iklerin yüksek konsantrasyonunun (100 200 mg/ml) timidin birle mesi üstündeki engelleyici etkiye sahip oldu u gözlenmi tir. Takip eden çal mada, insan makrofaj/monosit hücre hatlar nda nükleer faktör kapa B (NF-kB) aktivasyonu için transkripsiyon faktör-temelli biyoanaliz kullan larak on dokuz sikloartan-tip triterpen glikozidlerinin makrofajlar üzerine etkileri incelenmi tir. Sadece astragoloside-i aktif bulunmu ve NF-kB güdümlü lusiferaz ekspresyonunu %65 e ç kard görülmü tür. Ayr ca, ayn bile i in IL-1B ve TNF- gibi sitokinlerin üretimini sa layan mrna n n ekspresyonunu da te vik etti i belirtilmi tir (Ye ilada et al., 2004). Ye ilada ve ark. (2004) A.peregrinus tan dört sikloartan-tip saponin izole edilmi ve kimyasal yap s tan mlanm lard r. Bu bile iklerden 2 tanesi A ve B nin in vitro da insan kanser hücre hatlar ndaki potansiyel sitotoksik etkisi ve hayvan splenositleri kullan larak immünomodülatör etkisi incelenmi tir. Bunun sonucunda, her 2 bile ikte konkovalin-a yoklu unda ve varl nda da fare splenosit proliferasyonunu stimüle etmi ve belirgin bir sitotoksik etki göstermi tir. Bedir ve ark., (1999) Astragalus trojanus Stev.bitkisinin toprak üstü k s mlar ndan bilinen glikozitler, astragaloside II, astragaloside IV, astragaloside VII, brachyoside B, brachyoside C ve pterocarpan türevli maackiain d nda al lmam sikloartan-tip glikozitler de elde etmi lerdir. Ayn grup ara t rmac taraf ndan ayn sene yap lan di er bir çal mada A.trojanus köklerindeki bile enler incelenmi, alt s sikloartantip glikozit s n f na ait sekiz yeni bile en izole edilmi tir. Ek olarak, bir oleanan glikozit ve bir triptofan türevi izole edilmi ve s ras yla astrojanosid A ve achillamide olarak isimlendirilmi tir (Bedir et al., 1999). lerlemi küçük hücreli olmayan akci er kanserinin sistematik tedavi etkisinin dü ük ve toksisitesinin ise çok yüksek oldu u
10 belirtilmi tir. Çin de yeti en baz bitkisel ilaçlar n kemoterapinin etkinli ini artt rd ve toksisiteyi dü ürdü ü bildirilmi tir. Özellikle Astragalus un, makrofaj ve do al katil hücre aktivitesini uyararak ve T- yard mc tip 2 sitokinleri inhibe ederek immünolojik olarak faydalar oldu u gösterilmi tir. Yap lan çal ma sonucunda Astragalus temelli bitkisel ilaçlar ile platinyum temelli kemoterapi birlikte kullan lm ve ba ar oran, tümör cevab ve kemoterapinin toksik etkisi incelenmi ve kemoterapinin verimini artt rd belirtilmi tir (McCulloch et al., 2006). 2.3. Astragalus Türleri Üzerinde Bitki Doku Kültürü Çal malar Bilimsel yay nlarda Astragalus trojanus Stev. ile ilgili hücre ve doku kültürü konular nda çal ma bulunmamaktad r. Projemize kaynak olu turmas bak m ndan di er Astragalus türlerine ait doku kültürü ve ço alt m çal malar incelenmi tir. Astragalus türlerinin ülkemizde yeti en cinslerinden A.maximus ve endemik A.chrysochlorus ile doku kültürü yöntemi ile klonal ço alt m yap lmas amaçlanan bir çal ma ile ilk kez A.maximus da aksillar tomurcuk kökenli klonal ço alt m ba ar lm t r. Klonal ço alt m gövdelerin 0,5mg/l zeatin ribosid (ZR) içeren MS (Murashige ve Skoog, 1962) besin ortam nda kültüre al nmas ile elde edildi i belirtilmi tir. Ço alt lan gövdelerin daha sonra MS tuzlar n ½ ve sükrozu %1,5 oranlar nda içeren besin ortam nda köklenme sa land rapor edilmi tir. Ayr ca A.maximus da kallus olu umu ve dolayl somatik embriyogenez yolu ile somatik embriyo olu umu MS+0,5mg/L 2,4-diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) besin ortam nda elde edildi i belirtilmi tir (Turgut, 2002). Ayr ca bu çal ma ile A.chrysochlorus un somatik embriyogenez yolu ile rejenerasyon sürecinde, somatik embriyo olu turabilme
11 potansiyelini 1,5 y l koruyabilen Ac-N1 embriyogenik kallus hatt n n kültürlenmesi için uygun olan besin ortam n n 0,5 mg/l 2,4-D içeren MS besin ortam oldu u da belirlenmi tir. Ac-N1 kallus hatt ndan somatik embriyogenez yoluyla gövde rejenerasyonu, 0,5 mg/l indol asetik asit (IAA) içeren s v MS besin ortam nda gerçekle tirilmi tir. Bu ko ullarda elde edilen 71 gövdecikten 29 unun MS temel tuzlar n ½ ve sükrozu %1.5 oranlar nda içeren besin ortam nda köklendirildi i rapor edilmi tir (Turgut, 2002). A. polemoniacus un yaprak sap ve yaprak eksplantlar kullan larak yap lan çal mada farkl büyüme düzenleyicileri denenmi ve yüksek oranda adventif sürgün rejenerasyonu tan mlanm t r. MS temel besin ortam na 6-benzilaminopurin (BAP), naftalenasetik asit (NAA) ve thidiazuron (TDZ) gibi bitki büyüme düzenleyicilerinin farkl konsantrasyonlar ilave edilmi tir. En yüksek adventif sürgün rejenerasyon oran (%100) ve eksplant ba na sürgün say s (14.3 adet) yaprak sap eksplant ndan 4 mg/l BAP ve 0.1 mg/l NAA içeren besin ortam ndan elde edilmi tir. In vitro da geli en sürgünler büyüme düzenleyicisi içermeyen veya NAA (0.5, 1 ve 2 mg/l) içeren ortamlarda köklenmeye al nm t r. En iyi köklenme 2 mg/l NAA içeren veya büyüme düzenleyicisi içermeyen ortamdan elde edilmi tir. Köklenen fideler torf bulunan ve üzeri plastik torba ile kapat lan saks larda d ko ullara al t r lm t r. Köklenen fidelerin kök uçlar nda yap lan kromozom say mlar nda 2n=16 normal kromozom say s tespit edilmi tir (M r c, 2004). Astragalus adsurgens e ait hipokotil k s mlar kullan larak kallus ve bitki rejenerasyonunu te vik eden etkili bir prosedür geli tirilmi tir. Yap lan bu çal mada, bitki büyüme düzenleyicilerinin farkl kombinasyonlar n n ve konsantrasyonlar n n kullan m n n kallus olu um miktar n ve olu an kalluslar n tiplerini etkiledi i kadar kallusun
12 farkl la ma potansiyelini de etkiledi i belirtilmi tir. 9.0µM 2,4-D ve 2.2µM benziladenin (BA) eklenen MS besin ortam nda geli meleri te vik edilen ye il gev ek yap l kalluslar n daha sonra 0.5µM NAA ve 8.9µM BA içeren MS ortam na transfer edilmeleri ile en yüksek sürgün rejenerasyon oran na (%75) ula lm t r. Daha sonra rejenere olan sürgünler büyüme düzenleyicileri içermeyen yar m MS ortam nda köklendirilmi lerdir. Bitkiciklerin kallus kültüründen rejenerasyonu 7 8 hafta sürmü tür (Luo and Jia, 1998). Astragalus melilotodies bitkisinde hipokotil eksplantlar ndan ve hipokotil veya gövdeden türevlenmi kalluslardan bitki rejenerasyonu için oldukça etkili bir prosedür geli tirilmi tir. Somatik embriyo olu um frekans 2,69µM NAA ve 4,44µM BA içeren MS ortam na direkt konulan hipokotillerde 5 hafta içinde oldukça yüksek bir de ere ula m t r (%98,3). 9,05µM 2,4-D ve 2,22 4,44 µm BA içeren MS ortam nda hipokotil ve gövde segmentlerinden üç tip kallus elde edilmi tir. 2,69µM NAA ve 4,44 8,89µM BA içeren MS ortam nda hipokotil türevli kallustan somatik embriyo ve adventif sürgünler elde edilirken gövde türevli kallustan yaln zca adventif sürgün elde edilmi tir. Somatik embriyolardan büyüme düzenleyicisi içermeyen MS ortam nda, adventif sürgünlerden ise 14,78µM indolbütirik asit (IBA) içeren MS ortam nda 3 hafta kültür sonras nda bitkicikler elde edilmi tir. Rejenere olan bitkilerin tümü topra a aktar ld ktan sonra beklenilen morfoloji ve büyüme özelliklerini göstermi ve fertil tohumlar elde edilmi tir (Hou and Jia, 2004). Astragalus melilotoides ile yap lan ba ka bir çal mada, mikrokalluslar n NAA ve BA içeren MS ortam na al nmas n n somatik embriyogenesis ve organogenesis arac l ile rejenerasyonu te vik etti i belirtilmi tir. En yüksek miktarda somatik embriyo olu umu (%56.3±4.1) 0.5 mg/l NAA ve 1.0 mg/l BA içeren MS ortam nda kültüre al nan kalluslardan 3 hafta içerisinde elde edilmi tir. Takibindeki 2 hafta
13 sonunda somatik embriyolar n %84 ünden 0.5-2.0 cm uzunlu unda bitkicikler meydana gelmi tir. Ayn besin ortam ndaki 1g kallustan ortalama 5.4 somatik embriyo meydana geldi i belirtilmi tir. Sonras nda hormonsuz MS ortam na transferde bitkiciklerin h zl bir ekilde geli ti i ve A.melilotoides de dü ük seviyedeki NAA kullan lmas n n daha yüksek seviyede BA kullan lmas na göre somatik embriyogenezisi daha fazla te vik etti i belirtilmi tir. Bu durum di er türlerle yap lan çok say daki çal ma ile de örtü mektedir. Ek olarak, 0.5 mg/l NAA ve 2.0 mg/l BA içeren MS ortam n n organogenezis için en uygun besin ortam oldu u belirlenmi tir. Olu an kalluslar n yakla k %21,6 s tomurcuk ve sonras nda 1.0-1.5 cm boyunda sürgün olu turdu u belirtilmi tir. 3.0 mg/l IBA içeren MS ortam na adventif sürgünlerin transferinden 2 hafta sonra bitkicikler meydana gelmeye ba lam t r. yi geli me gösteren tüm bitkicikler topra a aktar lm ve sera ko ullar alt nda %81 i canl l n koruyabilmi lerdir, bununla birlikte geli en bitkilerde morfoloji ve büyüme karakteristikleri aç s ndan anormallik gözlenmemi tir (Hou and Jia, 2004). Astragalus hamosus Akdeniz bölgesindeki otlaklarda tar msal aç dan önemli tek y ll k baklagillerden yem bitkisidir. Di er baklagil bitkileri gibi çimlenmenin gecikmesi veya engellenmesi ile sonuçlanan bir dormansi gösterir. Astragalus hamosus un mekanik, fiziksel ve kimyasal skarifikasyon gibi dormansinin k r lmas için yap lan uygulamalara verdi i yan t incelenmi tir. Z mpara ka d ile yap lan uygulaman n nerdeyse tüm tohumlarda dormansiyi k rmas ve en h zl sonuç vermesi dormansinin tohum kabu undan kaynakl n göstermektedir. S cak suda bekletme uygulamas n n da tohum kabu undan kaynaklanan dormansinin uzakla t r lmas nda etkili oldu u, fakat 80 0 C nin üzerindeki s cakl klarda tohumlarda meydana gelen hasar %97,9 a ç kard belirtilmi tir (Patane and Gresta, 2006).
14 Astragalus maximus Wild. türü ile yap lan bir çal mada ait koltuk alt tomurcu u kullan larak 30 günlük bitkicikler ile mikroço alt m gerçekle tirilmi tir. Mikroço alt m için bitkiciklerden al nan sürgünler eksplant olarak kullan lm t r. Eksplantlar, BA (0.2, 0.5, 1.0mg/l), zeatin ribosid (ZR) (0.2, 0.5, 1.0mg/l) ve 0.4 mg/l NAA ile kombinasyonlar n içeren MS besin ortamlar nda kültüre al nm t r. 20 gün sonras nda, 0.5mg/l ZR içeren MS ortam n n mikroço alt m en çok te vik eden ortam oldu u gözlenmi tir. Ço alt lan sürgünler büyüme düzenleyicisi içermeyen MS ortam nda, 0.2-1.5mg/l NAA içeren MS ortam nda ve %1.5 sükroz içeren ½ MS ortam nda kültüre al nm lard r. 20 günün sonunda sadece %1.5 sükroz içeren ½ MS ortam nda kültüre al nan eksplantlarda köklenme gerçekle mi tir. Bitki büyüme düzenleyicileri içermeyen MS ve 0.2, 0.4, 0.8, 1.2 ve 1.5mg/l NAA içeren MS besin ortamlar nda kök olu umu gözlenmemi tir ( Kara and Ar, 2006).
15 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Bergama Kozak Yaylas nda bulunan Astragalus trojanus Stev. bitkilerinden toplanan tohumlar materyal olarak kullan lm t r ( ekil 3.1). ekil 3.1 Çal mada kullan lan Astragalus trojanus tohumlar 3.2. Metot Ara t rmada, mikroço alt m için kullan lmak üzere Astragalus trojanus Stev. bitkisinden al nan tohumlar steril olarak çimlendirilmeye çal lm t r. Besin ortamlar n n haz rlanmas, tohumlar n sterilizasyonu, çimlendirilmesi ve eksplantlar n kültüre al nmas ile ilgili yöntemler a a da ayr nt l ekilde sunulmu tur.
16 3.2.1 Besin ortamlar n n haz rlanmas Ara t rmada mineral maddeler, vitaminler, bitki büyüme düzenleyicileri ve agar içeren MS ve WPM (Lloyd ve McCown, 1980) besin ortamlar kullan lm t r (Çizelge 3.1). Çizelge 3.1 MS (1962) ve WPM (1980) besin ortamlar n n içerdi i maddeler ve miktarlar. Maddeler MS Besin Ortam ndaki WPM Besin Ortam ndaki Miktarlar(mg/L) Miktarlar(mg/L) NH 4 NO 3 1650 400 KNO 3 1900 - K 2 SO 4-999 Ca(NO 3 ) 2-386 MgSO 4.7H 2 O 370 180.7 MnSO 4.4H 2 O 22.3 22.3 ZnSO 4.7H 2 O 8.6 8.6 CuSO 4.5H 2 O 0.025 0.25 H 3 BO 3 6.2 6.2 KH 2 PO 4 170 170 Na 2 MoO 4.2H 2 O 0.25 0.25 CaCl 2.2H 2 O 440 72.2 KI 0.83 - CoCl 2.6H 2 O 0.025 - myo-inositol 100 100 Tritriplex(Na 2 EDTA) 37.3 37.3 FeSO 4.7H 2 O 27.8 27.9 Nikotinik asit 0.5 0.5 Pridoksin-HCl 0.5 0.5 Tiamin-HCl 0.1 1
17 Sürgün olu umu, sürgün geli imi ve köklenme için bitki büyüme düzenleyicilerinin farkl kombinasyonlar n içeren MS ve WPM ortamlar denenmi tir. Sürgün olu umunda, geli iminde ve köklenmesinde kullan lan yar kat besin ortamlar n n haz rlanmas için, önceden olu turulmu stok çözeltilerden, 1 litre besin ortam için gerekli olan miktarlar ve büyüme düzenleyicileri behere aktar lm t r. Gereken miktarda sükroz eklendikten sonra ortam, destile su ile 1 litreye tamamlanm t r. Sükroz iyice çözündükten sonra seyreltilmi NaOH (sodyum hidroksit) ve HCl (hidrojen klorür) kullan larak ph= 5,8 e ayarlanm t r. 7 g/l agar ilave edildikten sonra sürekli kar t r larak berrakla ncaya kadar kaynat lan ortamlar, s cak olarak cam kavanozlara, her biri yakla k 25 er ml olmak üzere dökülmü tür. A zlar kapat lan kavanozlar, otoklavda 121ºC de 15 dakika steril edilmi lerdir. 3.2.2 Birinci grup tohumlarda kullan lan sterilizasyon yöntemleri ve ön i lemler Astragalus trojanus Stev. tohumlar n n öncelikle kabuklar uzakla t r lm ve distile suda bekletilmi tir, su yüzeyinde kalan tohumlar n ölü oldu una karar verilip dibe çöken tohumlar kullan lm t r. Astragalus tohumlar nda çimlenme problemi oldu u için gibberellik asit (GA) uygulamas yap lm t r, tohumlar 400mg/L GA içeren solüsyonda, karanl k ortamda, 28 0 C de bir gece bekletilmi tir. GA solüsyonundan al nan tohumlar, üç kere distile su ile y kand ktan sonra filtre kâ d üzerine b rak larak fazla sular uzakla t r lm t r. Tohumlar n yüzey sterilizasyonu için steril ortamda, 5 dakika %30 luk sülfürik asit çözeltisinde bekletilmi lerdir (Çizelge 3.2).
18 Bu i lemin ard ndan, 3 kez steril distile su ile y kanan tohumlar, steril filtre ka d üzerine b rak larak fazla sular ndan ar nd r lm lard r. Sülfirik asit, sterilizasyon ve ayn zamanda tohum kabuklar n n zedelenerek dormansinin k r lmas nda yard mc olmas amac ile uygulanm t r. Çizelge 3.2 Tohumlara uygulanan ön i lem ve sterilizasyon yöntemleri Uygulama Gibberellik asit Ön i lem uygulamas Sterilizasyon Sülfirik asit uygulamas 400mg/L 1 gece %30'luk 5 dakika 3.2.3 Birinci grup tohumlar n çimlendirme ortam na al nmas Tohumlar n çimlendirilmesi için distile su ile slat lm steril pamuklu ortamlar kullan lm t r. Kavanozlar n içine yerle tirilen pamuklar distile su ile slat lm t r. Kapaklar kapat lan kavanozlar, otoklavda 121ºC de 15 dakika steril edilmi lerdir. Sterilizasyon yöntemi uygulanan tohumlar, her kavanozda 10 tohum olacak ekilde daha önce haz rlanm steril pamuklu çimlendirme ortamlar nda kültüre al nm lard r.
19 3.2.4 kinci grup tohumlarda kullan lan sterilizasyon yöntemleri ve ön i lemler Daha sonraki dönemde sa lanan tohumlar ile farkl sterilizasyon ve ön i lem denemeleri uygulanm ve sonuçlar gözlenmi tir. kinci grup Astragalus trojanus Stev. tohumlar n n da öncelikle kabuklar uzakla t r lm ve distile suda bekletilmi tir ve dibe çöken tohumlar kullan lm t r. Tohumlar n sterilizasyonunda be farkl yöntem kullan lm t r. Kullan lan yöntemler Çizelge 3.3 de özetlenmi tir. Fakat k sa dönem içerisinde bilimsel bilgi verebilecek kadar yeterli sürgün say s na ula lamad için bu çal mada de inilmemi tir. Çizelge 3.3 kinci grup Astragalus trojanus tohumlar na uygulanan streilizasyon yöntemleri Ön i lem Sterilizasyon ve dormansinin k r lmas için yap lan i lemler Uygulama 1 2 3 4 5 Gibberellik asit 400mg/L uygulamas 24 saat %1.5'lik NaOCl 20dakika Sülfirik asit %30'luk uygulamas 5 dakika Bistüri ile tohumlar n çizilmesi 400mg/L 400mg/L 24 saat 24 saat %1.5'lik %1.5'lik 20dakika 20dakika %30'luk %30'luk 10 15 dakika dakika 400mg/L 400mg/L 24 saat 24 saat %1.5'lik %3 lük 20 20dakika dakika %30'luk 30 - dakika Steril ortamda - - - - tohum kabuklar bistüri ile çizildi
20 3.2.5 kinci grup tohumlar n çimlendirme ortam na al nmas Tohumlar n çimlendirilmesi için 30g/L sükroz içeren MS besin ortam kullan lm t r. Sterilizasyon yöntemi uygulanan tohumlar, her kavanozda 10 tohum olacak ekilde çimlendirme ortamlar nda kültüre al nm lard r. 3.2.6 Sürgün eksplantlar n n sürgün geli imi ortamlar nda kültüre al nmas In vitro ko ullarda çimlendirilen Astragalus tohumlar ndan geli en steril bitkiciklerden elde edilen 2-3cm lik sürgün eksplantlar hipokotil yapraklar uzakla t r ld ktan sonra, her bir kavanoza bir eksplant olacak ekilde, sürgün geli imi ortam içeren kavanozlara aktar lm t r. Sürgün geli imi için BAP içeren MS ortam kullan lm t r (Çizelge 3.4). Yar kat besin ortam n n sükroz ve bitki büyüme düzenleyici içeri i çizelgede verilmi tir. Çizelge 3.4 Sürgün geli imi için kullan lan besin ortam bile eni Ortam Sükroz Bitki büyüme düzenleyicileri MS 30g/L 0.5mg/l BAP 3.2.7 Sürgün eksplantlar n n kök geli imi ortamlar nda kültüre al nmas Tohum kökenli bitkiciklerden elde edilen sürgün eksplantlar köklendirme ortamlar na al nm t r. Kök geli imi için kullan lan 13 farkl
21 besin ortam n n sükroz ve bitki büyüme düzenleyicilerinin içerikleri Çizelge 3.5 de verilmi tir. Çizelge 3.5 Kök geli imi için kullan lan besin ortamlar Ortam Besin ortamlar Sükroz Bitki büyüme düzenleyicileri Aktif karbon MS 1 MS 30 g/l 0.5 mg/l IBA MS 2 MS 30 g/l 0.5 mg/l IBA 500 mg/l MS 3 MS 15 g/l 0.5 mg/l IBA MS 4 MS 15 g/l 0.5 mg/l IBA 500 mg/l MS 5 MS - 0.5 mg/l IBA MS 6 MS 45 g/l 0.5 mg/l IBA MS 7 MS 1/2 15 g/l 0.5 mg/l IBA MS 8 MS 1/2 15 g/l 1 mg/l IBA MS 9 MS 30 g/l 1mg/L IBA MS 10 MS 30 g/l 0.5 mg/l NAA MS 11 MS 30 g/l 0.5mg/L NAA+0.5 mg/l IBA WPM 1 WPM 30 g/l 0.5 mg/l IBA WPM 2 WPM 30 g/l 1 mg/l IBA 3.2.8 Sürgün Eksplantlar ndan Tek Tohum Kökenli Klonlar n Ço alt lmas Sürgün geli imi için kullan lan besin ortam nda en h zl geli im ve ço alma gösteren tek bir tohuma ait (klon1) sürgün eksplantlar seçilerek
22 3 tekerrürlü deneme ba lat lm t r. Seçilen sürgünler s ras yla MS 0.5 BAP, MS 1 BAP, MS 0.5 BAP+0.5 NAA ve MS 1 BAP+0.5 NAA ortamlar nda iki er hafta süreyle iki kez alt kültüre al nm t r (Çizelge 3.6). Çizelge 3.6 Bitki büyüme düzenleyicilerinin in vitro Astragalus trojanus a ait klon 1 bitkilerinin büyüme parametreleri üzerine olan etkilerinin belirlenmesi için kullan lan ortamlar. Ortam Sükroz Bitki büyüme düzenleyicileri 1 MS 30g/L 0.5mg/L BAP 2 MS 30g/L 1mg/L BAP 3 MS 30g/L 0.5mg/L BAP+0.5mg/L NAA 4 MS 30g/L 1mg/L BAP+0.5mg/L NAA Ara t rmada incelenen büyüme parametreleri; eksplant ba na ortalama sürgün say s (adet), sürgün eksplant ba na ortalama kök say s (adet) ve sürgün eksplantlar n n ortalama kallus olu turma yüzdeleridir. 3.2.9 Kültür ko ullar Tüm kültürler, flouresan nda 4000 lux ayd nlatma alt nda, 16 saat ayd nl k periyotta ve 26 ± 2 C s cakl kta tutulmu lard r.
23 3.2.10 Denemenin Kurulmas ve Verilerin De erlendirilmesi Sürgün ortamlar ndaki 2-3cm lik sürgün eksplantlarda görülen kallus olu umlar nda tek faktör olarak besin ortamlar kullan lm t r (Çizelge 4.3). Üç tekerrürlü olarak kurulan denememiz tesadüf parsellerine göre olu turulmu ve denenmi tir. Tüm de erlendirmelerde farkl l klar n önem düzeylerinin ve boyutlar n n saptanabilmesi için asgari önemli fark (AÖF=LSD) test yöntemi kullan lm t r (Aç kgöz, 1998). Çal mada, oransal olarak ifade edilen verilerin de erlendirilmesinde 0 de erleri içeren verilere log transformasyonu uygulanm t r. Bu transformasyon tipinde s f r de erlerinin her birine 1 de eri eklendikten sonra transformasyon yap lm t r. Orijinal verilerin 1 den küçük oldu u durumlarda tüm veriler sabit bir say (100) ile çarp larak negatif sonuç önlenmi ve 10 tabanl logaritma uygulanm t r (Aç kgöz, 1988).
24 4. BULGULAR 4.1. Kültüre Al nan Tohumlarda Sterilizasyon Durumu Çal mam zda, farkl zamanlarda olmak üzere çimlendirilmek için 2 grup tohum al nm t r. Birinci grup 186, ikinci grup 196 olmak üzere toplam 372 tohum kullan lm t r. Her iki grup tohum için kullan lan farkl uygulamalarda (bkz. Çizelge 3.2 ve Çizelge 3.3) görülen kontaminasyon yüzdelerinin ortalamalar Çizelge 4.1 ve 4.2 de gösterilmi tir. Çizelge 4.1 Birinci grup tohumlar n yüzeysel sterilizasyonu sonucu belirlenen kontaminasyon yüzdesi Toplam tohum Kontamine olan Kontaminasyon say s tohum say s yüzdesi (%) 186 23 12.36 Çizelge 4.2 kinci grup tohumlar n yüzeysel sterilizasyonu sonucu belirlenen kontaminasyon yüzdesi Uygulama Kullan lan Kontamine olan Kontaminasyon yüzdesi tohum say s tohum say s (%) 1 47 15 31.91 2 59 12 20.33 3 48 14 29.16 4 22 6 27,27 5 20 8 40
25 Kkkkontaminasyon yüzdesi (%) Kontamine olan tohum yüzdesi (%) 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 Uygulama numaras ekil 4.1 kinci grup tohumlar n kullan lan sterilizasyon yöntemlerine göre kontaminasyon yüzdeleri 4.2. Kültüre Al nan Tohumlarda Görülen Geli meler Sterilizasyon prosedürü sonucunda çimlendirilmek üzere kültüre al nan birinci grupta bulunan 186 adet tohumdan 17 tanesi çimlenmi tir (Çizelge 4.2.1). lk çimlenme kültüre al nd ktan 4 gün sonra gözlenmi ve sürgün boyu 1 hafta içerisinde 3cm ye ula m t r. Be farkl sterilizasyon yöntemi uyguland ktan sonra 30g/L sükroz içeren MS besin ortam nda kültüre al nan ikinci grup tohumlar Çizelge 4.2.2 de gösterilmi tir.
26 Çizelge 4.2.1 Birinci grup tohumlarda gözlenen çimlenme durumlar Toplam tohum Çimlenen tohum Çimlenme say s say s yüzdesi (%) 186 17 9.14 Çizelge 4.2.2 kinci grup tohumlarda gözlenen çimlenme durumlar Uygulama Kullan lan tohum say s Çimlenen tohum say s Çimlenen tohum yüzdesi (%) 1 47 8 4.25 2 59 5 8.47 3 48 1 2.08 4 22 - - 5 20 5 25 Yap lan uygulamalar içerisinde sülfürik asit uygulamas yap lmadan steril kabinde tohum kabuklar n n bistüri ile çizildi i 5 numaral uygulama çimlenme yüzdesi (%25) bak m ndan en olumlu sonucu vermi tir ( ekil 4.2), bununla birlikte 5 numaral uygulama kontaminasyon yüzdesi (%40) bak m ndan en yüksek de ere sahiptir (Çizelge 4.2.1 ve Çizelge 4.2.2).
27 Çimlenen tohum yüzdesi (% 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 Uygulama numaras ekil 4.2 kinci grup tohumlar n kullan lan sterilizasyon yöntemlerine göre çimlenme yüzdeleri 4.3. Astragalus trojanus Bitkilerinde In Vitro Sürgün Geli imi Steril pamuklu çimlendirme ortam nda kültüre al nan tohumlardan geli en sürgünler MS 05 mg/l içeren sürgün geli imi ortam na aktar lm ve en iyi geli im gösteren tek tohum kökenli sürgünler farkl sürgün geli im ortamlar n n (Çizelge 3.6) denenebilmesi için ço alt lm t r. Çizelge 3,6 da ki farkl sürgün geli imi ortamlar na aktar lan eksplantlarda 4 hafta sonra yap lan gözlemler sonucunda en yüksek sürgün say s de eri (1.96), MS 0.5 BAP ortam ndan elde edilirken, en dü ük de erler (0.82), 1mg/l BAP ve 0.5mg/l NAA içeren MS ortam ndan elde edilmi tir ( ekil 4.3 ve Çizelge 4.3).
28 Çizelge 4.3 Sürgün ortamlar ndaki 2-3cm lik sürgün eksplantlar nda görülen geli meler. Ortam MS 0.5 BAP MS 1 BAP MS 0.5 BAP+ 0.5NAA MS 1 BAP+ 0.5NAA Eksplant say s Eksplant ba na dü en sürgün say s (adet) Kallus olu turan eksplant yüzdesi (%) Tek.1 Tek.2 Tek.3 Top. Tek.1 Tek.2 Tek.3 Ort. Tek.1 Tek.2 Tek.3 Ort. 20 21 18 59 1,68 2,27 2 1,96 0 10 0 3,33 20 20 20 60 1,85 2,25 1.9 1,84 5 10 10 8,33 17 18 19 54 1,76 1,44 2 1,73 17,64 11,76 29.41 19,6 18 18 18 54 0,55 0,83 1,1 0,82 22,22 11,11 11,11 14,81 Sürgün say s (adet) 3 2 1 0 MS 0,5BAP MS 1BAP MS 0,5BAP+0,5NAA MS1BAP+1NAA Besin Ortamlar ekil 4.3 Sürgün ortamlar ndaki eksplantlarda görülen sürgün geli meleri
29 Sürgün ortamlar na al nan eksplantlarda sürgünlerin ço almas çoklu sürgün olu umu eklinde olmu tur, bununla birlikte kültür süresince meydana gelen kararma problemi eksplantlar iki haftada bir alt kültüre almaya zorunlu k lm t r ( ekil 4.4 a ve b). ekil 4.4 (a) ve (b) Astragalus trojanus da sürgün geli imleri Sürgün eksplantlar n n geli imi için kullan lan ortamlar n tümünde kallus olu umlar tespit edilmi tir (Çizelge 4.3). Sürgün ortamlar ndaki 2-3cm lik sürgün eksplantlarda görülen kallus olu umlar n n yüzde de erlerine yap lan istatistiksel de erlendirmede besin ortamlar aras farkl l k önemsiz bulunmu tur (HKO= 0.317, F= 0.557). Eksplantlarda kallus olu umu bak m ndan en yüksek de ere sahip MS 0.5 BAP + 0.5 NAA ortam %19.60 de eri ile birinci grupta yer al rken, %3.33 de eri ile MS 0.5 BAP ortam son grubu olu turmu tur ( ekil 4.5).
30 Kallus olu turan eksplant yüzdesi (%) 25 20 15 10 5 0 MS 0,5BAP MS 1BAP MS MS1BAP+1NAA 0,5BAP+0,5NAA Besin Ortamlar ekil 4.5 Sürgün geli tirme ortamlar na al nan eksplantlarda kallus olu umu. Yap lan gözlemler sonucunda NAA içeren ortamlarda kültüre al nan eksplantlarda ilk haftan n bitimiyle kallus olu umu tespit edilmi tir ( ekil 4.6). ekil 4.6 NAA içeren sürgün geli imi ortamlar ndaki Astragalus trojanus eksplantlar nda kallus olu umu.
31 4.4. Astragalus trojanus Bitkilerinde In Vitro Kök Geli imi Çal mam zda kök olu umu için yap lan denemelerde büyüme düzenleyicileri tipleri ve konsantrasyonlar, sükroz konsantrasyonlar ve aktif karbon kullan m bak m ndan farkl 11 MS ve büyüme düzenleyici konsantrasyonlar bak m ndan farkl 2 WPM ortam kullan lm t r (Çizelge 3.5). Köklendirme ortamlar na al nan eksplantlarda 3 hafta sonra yap lan gözlemler sonucunda belirlenen kök say s bak m ndan WPM 2 ortam 5,33 ortalama kök say s ile en yüksek de ere sahipken MS 1, MS 2, MS 3, MS 4, MS 5, MS 6, MS 7, MS 10 ve MS 11 ortamlar nda 3 hafta sonunda yap lan gözlemler sonucunda kök olu umu gözlenmemi tir (Çizelge 4.4 ve ekil 4.7).
32 Çizelge 4.4 Köklendirme ortamlar nda kültüre al nan sürgün eksplantlar nda görülen geli meler Ortamlar Ortalama Kök Say s (adet) Kararma gözlenen eksplant say s (adet) Tek.1 Tek.2 Tek.3 Ort. Tek.1 Tek.2 Tek.3 Ort. MS 1 0 0 0 0 3 2 4 3 MS 2 0 0 0 0 0 0 0 0 MS 3 0 0 0 0 5 3 6 4,66 MS 4 0 0 0 0 0 0 0 0 MS 5 0 0 0 0 0 0 0 0 MS 6 0 0 0 0 4 2 5 3,66 MS 7 0 0 0 0 5 2 4 3,66 MS 8 2 0 1 1 2 4 3 3 MS 9 0 1 0 0,33 4 5 2 4 MS 10 0 0 0 0 4 3 6 4,33 MS 11 0 0 0 0 5 4 4 4,33 WPM 1 6 4 3 4,33 2 1 1 1,33 WPM 2 4 7 5 5,33 1 2 2 1,66 *Her bir tekerrürde kültüre al nan eksplant say s 10 adettir.
33 Kök olu turan eksplant yüzdesi (%) 100 80 60 40 20 0 MS 1 MS 2 MS 3 MS 4 MS 5 MS 6 Seri 1 0 0 0 0 0 0 0 3,33 1,1 0 0 14,417,8 MS 7 MS 8 Besin Ortamlar MS 9 MS 10 MS 11 WP M 1 WP M 2 ekil 4.7 Köklendirme ortamlar nda kültüre al nan sürgün eksplantlar nda olu an kök yüzdesi. WPM ortamlar nda kültüre al nan sürgün eksplantlar nda ilk haftan n bitimiyle birlikte ilk kök olu umlar gözlenmeye ba lam t r. Olu an köklerin MS 8 ve MS 9 ortamlar nda olu an köklere göre çok daha canl olduklar gözlemlenmi tir ( ekil 4.8 a ve b). MS içeren ortamlarda olu an köklerde yo un bir ekilde kararma meydana gelmi tir ( ekil 4.9 a ve b).
34 ekil 4.8 (a) ve (b) WPM içeren ortamlarda kültüre al nan Astragalus trojanus ta kök geli imleri. ekil 4.9 (a) ve (b) MS içeren ortamlarda kültüre al nan Astragalus trojanus ta kök geli imleri Sürgün eksplantlar ndan kök geli imi için kullan lan aktif karbon içermeyen ortamlar n tümünde kararmalar gözlenmi tir, fakat aktif karbon içeren ortamlarda da kök olu umu meydana gelmemi tir (Çizelge 4.4; ekil 4.10). Kararma sorunu s k alt kültüre al narak çözülmeye çal lm t r.
ekil 4.10 Aktif karbon içermeyen köklendirme ortamlar na al nan Astragalus trojanus eksplantlar nda meydana gelen kararma 35
36 5. TARTI MA VE SONUÇ Astragalus trojanus Stev. tohumlar n n yüzeysel sterilizasyonunda, tohumlar en yüksek çimlenme yüzdesini tohum kabuklar n n steril ortamda bistüri ile çizildi i 5 uygulamas nda ula lm t r. Çimlenme yüzdesi %30 luk sülfirik asit çözeltisinde 15 dakika bekletilen tohumlarda dü meye ba lam, en dü ük çimlenme yüzdesi ise %0 de eri ile %30 luk sülfirik asit çözeltisinde 30 dakika bekletilen tohumlarda gözlenmi tir. Fabaceae familyas na ait bitki türlerinin birço unda sert kabuklar ndan kaynaklanan dormansi görülmektedir, bu nedenle dormansiyi k rmak ve çimlenmeyi artt rmak amac yla mekanik ve sülfürik asit çözeltisinin kullan ld kimyasal yöntemler s kl kla kullan lmaktad r (Ruiz and Devesa, 1998). Ayr ca tohumlara GA uygulamas n nda çimlenme üzerinde olumlu etkileri oldu u yap lan çal malar sonucunda bulunmu, A. glycyphyllos tohumlar yla yap lan bir çal mada 300 mg/l GA uygulamas n n tohum çimlenmesini 11.5 kat artt rd belirtilmi tir (Gubisova and Klcova, 2008). Ara t rmam zda da kimyasal ve fiziksel skarifikasyon yöntemlerinin yan s ra tohumlara GA uygulamas yap lm t r. Astragalus trojanus Stev. tohumlar n n, in vitro ko ullarda çimlendirilmesi için yap lan çal malarda kullan lan distile su ile slat lm steril pamuklu ortamlar ile 30g/L sükroz içeren hormonsuz MS ortamlar aras nda bir fark belirlenmemi her iki uygulamada da ilk hafta içerisinde çimlenmeler gözlenmi tir. Tek bir tohumdan elde edilen klon sürgün eksplantlar ile yap lan sürgün geli imi denemelerinde BAP n farkl konsantrasyonlar ve farkl konsantrasyonlardaki BAP n 0.5 mg/l NAA ile kombinasyonlar n içeren MS ortamlar kullan lm t r. Kullan lan ortamlar n tümünde kallus olu umu gözlenmekle birlikte NAA içeren ortamlarda kallus olu umunda art oldu u belirlenmi tir. Kallus olu umu %19,6 de eri ile 0.5mg/L BAP ve 0.5mg/L NAA içeren MS ortam nda en yüksek olarak
37 belirlenmi tir. Kallus olu turan eksplantlarda olu an sürgünlerde yüksek seviyede sararma belirlenmi ve bu sürgünlerin kallus olu turmayan sürgünlere göre daha c l z oldu u, iyi geli emedi i gözlenmi tir. Yap lan denemelerde büyüme parametreleri incelendi inde, elde edilen bulgulara göre NAA içermeyen dü ük konsantrasyonlarda BAP içeren MS ortamlar nda en iyi sürgün geli imi gerçekle mi tir. Sürgün say s bak m ndan en iyi büyüme düzenleyicisi olan BAP n, en uygun konsantrasyonunun eksplant ba na ortalama 1.96 sürgün say s ile 0.5mg/L oldu u belirlenmi tir. Astragalus trojanus ta in vitro kök olu umu için IBA n n, sükrozun ve MS tuzlar n n farkl konsantrasyonlarda kullan ld aktif karbon içeren ve içermeyen 11 farkl MS ortam ve IBA n n farkl konsantrasyonlar n içeren iki farkl WPM besin ortamlar kullan lm t r. Yap lan denemeler sonucunda elde edilen bulgularda kök geli imi bak m ndan en iyi sonuç 1mg/L IBA içeren WPM ortam nda elde edilmi, MS besin ortamlar nda çok dü ük oranlarda kök meydana gelmi, meydana gelen köklerin de oldukça zay f oldu u görülmü tür. Da çile i ile yap lan bir çal mada da benzer sonuçlar elde edilmi tir, WPM tuzlar yerine MS tuzlar kullan lan denemelerde, oksidadif kararmalar gerçekle mi ve 3. hafta sonunda bitki geli imi aç s ndan olumlu sonuçlar al namam t r. Bu kararmalar n, ortamlarda bulunan yüksek konsantrasyonlardaki tuz ya da amonyum nitrat (NH 4 NO 3 ) varl ndan oldu u dü ünülmü tür (Mereti et al., 2001). Ara t rmam zda da MS içeren kök geli im ortamlar nda, sürgün geli im ortamlar nda oldu u gibi kararma önemli bir problem olmu tur, kararmay engellemek amac yla aktif karbon kullan lm fakat aktif karbonlu ortamlarda da kök geli imi gözlenmemi tir. Ara t rmam zda, Astragalus trojanus Stev. bitkisinin rejenerasyonu ile ilgili hem sürgün olu umu, hem de kök geli imi aç s ndan olumlu bulgular elde edilmi ve mikroço alt m protokolü ile ilgili ilk bilgiler elde edilmi tir. Bununla birlikte, klonal ço alt ma yönelik bu protokolün
38 h zland r lmas ve ço altma katsay lar n n artt r lmas için büyüme düzenleyicilerinin ve besin ortamlar n n farkl kombinasyonlar ile yeni denemeler kurulmas uygun olacakt r. Astragalus trojanus un içerdi i sekonder metabolitlerin hücre kültürü yöntemiyle üretimi amac yla yap lacak çal malar için ara t rmam z sonucunda elde etti imiz kallus olu turan eksplant yüzdeleri hücre kültürlerinde kullan lmak amac yla kallus olu umunun artt r lmas aç s ndan yol gösterici olacakt r. Ayr ca in vitro ortamda kök geli iminin sa lanabilmi olmas özellikle Astragalus trojanus un köklerinde bulunan sekonder metabolitlerin daha yüksek miktarlarda üretilebilmesi için kök geli imini artt rmaya yönelik yap lacak yeni denemelerle mümkün olabilecektir.
39 KAYNAKLAR D Z N Aç kgöz, N., 1988, Tar mda Ara t rma ve Deneme Metodlar, Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yay nlar No:478, zmir, 181-189s. Anonim, 2007a, http://loco.biosci.arizona.edu/astragalus/distribution.htm Anonim, 2007b, http://www.bugday.org/article.php?id=1737 Anonim, 2007c, http://www.bitkisayar.com/index.php?op=show&plid Anonim, 2002, http://www.mcp.edu/herbal/default.htm Anonim, 1999a, http://www.mcp.edu/herbal/default.htm Babao lu, M., Yorganc lar, M., Akbudak, M.A., 2002, Doku Kültürü: Temel Laboratuar Teknikleri, Bitki Biyoteknolojisi Doku Kültürü ve Uygulamalar, Babao lu, M., Gürel, E., Özcan, S., (ed), 2-3 Bedir,E., Çal,., Aquino, R., Piacente, S., Pizza, C., 1999, Secondary Metabolites from the Roots of Astragalus trojanus, J. Nat. Prod. 62: 563 568 Bedir,E., Çal,., Aquino, R., Piacente, S., Pizza, C., 1999, Trojanoside H: a cycloartane-type glycoside from the aerial parts of Astragalus trojanus, Phytochemistry 51 1017-1020 Bedir,E., Çal,., Ikhlas, K. A., 2000, Macrophyllosaponin E: A Novel Compound from the Roots of Astragalus oleifolius, Chem. Pharm. Bull. 48 (7) 1081 1083 Çobano lu, D., 1987, Astragalus cepholotes Banks.& Sol var. Brevicialyx Eig. (Fabaceae) in Morfolojik ve Sitolojik Özellikleri, VIII. Ulusal Biyoloji Kongresi, 199-214, zmir Çobano lu, D., 1989, Astragalus macrouroides Hub-Mor., Astragalus altanii Hub-Mor., Astragalus elazigenze, Ekim (Fabaceae) in Morfolojik Özellikleri, Do a T.U. Bio., Say :1, 17-33,