Özgün Çalışma/Original Article Mikrobiyol Bul 2016; 50(1): 122-132 doi: 10.5578/mb.10682 Candida Türlerinin Triazol Antifungal Duyarlılık Profilleri: Antifungal Direncin Belirlenmesinde Yeni CLSI Türe Özgü Klinik Direnç Sınır Değerleri ve Epidemiyolojik Eşik Değerlerinin Uygulanması* Antifungal Susceptibility Profiles of Candida Species to Triazole: Application of New CLSI Species-Specific Clinical Breakpoints and Epidemiological Cutoff Values for Characterization of Antifungal Resistance Nilgün KARABIÇAK, Nihal ALEM Türkiye Halk Sağlığı Kurumu, Mikoloji Referans Laboratuvarı, Ankara. Public Health Institution of Turkey, Mycology Reference Laboratory, Ankara, Turkey. * Bu çalışma, 24. European Clinical Microbiology and Infectious Diseases Congress (ECCMID; 10-13 Mayıs 2014 Barselona, İspanya) Kongresinde sunulmuştur. Geliş Tarihi (Received): 23.06.2015 Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 08.12.2015 ÖZ Klinik ve Laboratuvar Standartlar Enstitüsü (Clinical and Laboratory Standards Institute; CLSI) Antifungal Duyarlılık Testleri Alt Komitesi flukonazol ve vorikonazol için yeni türe özgü klinik direnç sınır değerleri (clinical breakpoint; CBP) önermiştir. CBP belirlenemediğinde, vahşi tip minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) dağılımları saptanır ve epidemiyolojik eşik değerleri (epidemiological cutoff value; ECV) direncin gösterilmesinde yararlıdır. Bu çalışmanın amacı, yeni CLSI CBP yi kullanarak, Candida izolatlarında triazollere dirençli türleri belirlemektir. Çalışmaya, 2011-2012 döneminde Türkiye deki çeşitli yoğun bakım ünitelerinde yatan invazif kandidozlu hastaların kan kültürlerinden izole edilen ve referans laboratuvarımıza gönderilen 140 Candida kökeni alınmıştır. İzolatlar, konvansiyonel yöntemler ile tanımlanmış; flukonazol, itrakonazol ve vorikonazol için duyarlılık testleri, CLSI sıvı mikrodilüsyon (BMD) metodu ile 24 saatlik inkübasyon sonrası değerlendirilmiştir. Kökenlerin azol direnç oranları, yeni türe özgü CBP ler ve uygun olduğunda ECV ler kullanılarak saptanmıştır. İzolatların tür dağılımı; C.parapsilosis (n= 31), C.tropicalis (n= 26), C.glabrata (n= 21), C.albicans (n= 18), C.lusitaniae (n=16), C.krusei (n= 16), C.kefyr (n= 9), C.guilliermondii (n= 2) ve C.dubliniensis (n= 1) şeklindedir. Yeni belirlenen CLSI CBP ye İletişim (Correspondence): Uzm. Dr. Nilgün Karabıçak, Türkiye Halk Sağlığı Kurumu, Mikoloji Referans Laboratuvarı, Sıhhiye 06100, Ankara, Türkiye. Tel (Phone): +90 312 565 5504, E-posta (E-mail): nilgunkarabicak@yahoo.com
Karabıçak N, Alem N. göre, flukonazol ve C.albicans, C.parapsilosis, C.tropicalis [duyarlı (S), 2 μg/ml; doza bağlı duyarlı (SDD), 4 μg/ml; dirençli (R), 8 μg/ml) ve C.glabrata (SDD, 32 μg/ml; R, 64 μg/ml) için üç C.albicans, bir C.parapsilosis ve bir C.glabrata izolatı; vorikonazol ve C. albicans, C.parapsilosis, C.tropicalis (S, 0.12 μg/ml; SDD, 0.25-0.5 μg/ml; R, 1 μg/ml) ve C.krusei (S, 0.5 μg/ml; SDD, 1 μg/ml; R, 2 μg/ml) için iki C.albicans ve iki C.tropicalis izolatı dirençli bulunmuştur. Vorikonazol için vahşi tip (MIC ECV) C.glabrata kökenlerini, vahşi olmayan tip (MIC > ECV) kökenlerden ayırmak amacıyla ECV 0.5 μg/ml değeri kullanılmıştır. Beş C.glabrata izolatı vorikonazol için vahşi olmayan tip olarak değerlendirilmiştir. Nadir türler için CBP nin belirlenmemesi nedeniyle flukonazol, itrakonazol ve vorikonazol için ECV değerleri, sırasıyla, C.lusitaniae (2 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.03 μg/ml), C.guilliermondii (8 μg/ml, 1 μg/ml, 0.25 μg/ml), C.dubliniensis (0.5 μg/ml, 0.25 μg/ml, 0.03 μg/ml), ve C.kefyr (1 μg/ml, 0.015 μg/ml) vahşi ve vahşi olmayan tip ayırımında kullanılmıştır. Epidemiyolojik eşik değerlere göre flukonazol için birer C.lusitaniae, C.dubliniensis ve C.kefyr izolatı ve vorikonazol için, üç C.lusitaniae ve bir C.kefyr izolatı vahşi olmayan tip olarak değerlendirilmiştir. Sonuç olarak, toplam 140 kökenden beşi flukonazole ve dördü vorikonazole dirençli bulunmuş ve bu dirençli kökenler arasından birer C.parapsilosis, C.tropicalis, C.glabrata, C.lusitaniae, C.kefyr ve üç C.albicans izolatının en az iki triazole çapraz dirençli olduğu saptanmıştır. Sonuç olarak, in vitro olarak dirençli ve vahşi olmayan tip olarak tanımladığımız kökenlerin, klinik geçerliliğinin saptanabilmesi için moleküler ve in vivo çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir. Anahtar sözcükler: Candida; azoller; antifungal direnç; klinik sınır değer; epidemiyolojik eşik değer. ABSTRACT The Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing has newly introduced species-specific clinical breakpoints (CBPs) for fluconazole and voriconazole. When CBPs can not be determined, wild-type minimal inhibitory concentration (MIC) distributions are detected and epidemiological cutoff values (ECVs) provide valuable means for the detection of emerging resistance. The aim of this study is to determine triazole resistance patterns in Candida species by the recently revised CLSI CBPs. A total of 140 Candida strains isolated from blood cultures of patients with invasive candidiasis hospitalized in various intensive care units in Turkey and sent to our reference laboratory between 2011-2012, were included in the study. The isolates were identified by conventional methods, and susceptibility testing was performed against fluconazole, itraconazole and voriconazole, by the 24-h CLSI broth microdilution (BMD) method. Azole resistance rates for all Candida species were determined using the new species-specific CLSI CBPs and ECVs criteria, when appropriate. The species distribution of the isolates were as follows; C.parapsilosis (n= 31 ), C.tropicalis (n= 26 ), C.glabrata (n= 21), C.albicans (n= 18), C.lusitaniae (n= 16), C.krusei (n= 16), C.kefyr (n= 9), C.guilliermondii (n= 2), and C.dubliniensis (n= 1). According to the newly determined CLSI CBPs for fluconazole and C.albicans, C.parapsilosis, C.tropicalis [susceptible (S), 2 μg/ml; dose-dependent susceptible (SDD), 4 μg/ml; resistant (R), 8 μg/ml], and C.glabrata (SDD, 32 μg/ml; R 64 μg/ml) and for voriconazole and C.albicans, C.parapsilosis, C.tropicalis (S, 0.12 μg/ml; SDD, 0.25-0.5 μg/ml; R, 1 μg/ml), and C.krusei (S, 0.5 μg/ml; SDD, 1 μg/ml; R, 2 μg/ml), it was found that three of C.albicans, one of C.parapsilosis and one of C.glabrata isolates were resistant to fluconazole, while two of C.albicans and two of C.tropicalis were resistant to voriconazole. The ECVs of 0.5 μg/ml for voriconazole and C.glabrata were used to differentiate wild-type (MIC ECV) from non-wild-type (MIC > ECV) strains. Five of C.glabrata were non-wt for voriconazole. Due to the lack of CBPs for the less common species, the ECVs for fluconazole, itraconazole and voriconazole, respectively, were used for C.lusitaniae (2 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.03 μg/ml), C.guilliermondii (8 μg/ml, 1 μg/ml, 0.25 μg/ml), C.dubliniensis (0.5 μg/ml, 0.25 μg/ml, 0.03 μg/ml), and C.kefyr (1 μg/ml, 0.015 μg/ml) to categorize isolates of these species as wildand non-wild-type. When the ECVs were used for fluconazole, one each of C.lusitaniae, C.dubliniensis and C.kefyr; for voriconazole, three of C.lusitaniae and one of C.kefyr were detected as non-wild-type. Overall, 123
Candida Türlerinin Triazol Antifungal Duyarlılık Profi lleri: Antifungal Direncin Belirlenmesinde Yeni CLSI Türe Özgü Klinik Direnç Sınır Değerleri ve Epidemiyolojik Eşik Değerlerinin Uygulanması a total of five Candida species were resistant to fluconazole and four to voriconazole and among these species one each of C.parapsilosis, C.tropicalis, C.glabrata, C.lusitaniae, C.kefyr and three of C.albicans exhibited cross-resistance at least against two azoles. It was concluded that, the strains identified as resistant and non-wild-type in this in vitro study should be supported by molecular and in vivo studies for the determination of their clinical validity. Keywords: Candida; azoles; antifungal resistance; clinical breakpoint; epidemiological cutoff. GİRİŞ Epidemiyolojik sürveyans çalışmalarında, Candida albicans ın yanı sıra albicans-dışı Candida türlerinin neden olduğu sistemik mantar enfeksiyonlarının görülme sıklığının son 10 yılda giderek arttığı bildirilmektedir 1. İmmün yetmezlikli kandidemi olgularında görülen yüksek mortalite nedeniyle, antifungal ilaçların daha yüksek dozlarda ve uzun süreli kullanımı sonucu özellikle triazollere dirençli kökenler ortaya çıkmakta ve direncin tanımlanması, erken ve uygun tedavinin sağlanması açısından giderek daha da önem kazanmaktadır 1-5. Bu nedenle, dirençli kökenlerin daha duyarlı ve kısa sürede tanımlanabileceği, klinikle uyumlu, antifungal duyarlılık testleri (AFDT) ne ihtiyaç doğmuştur 3,5,6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), son yıllarda, Candida türleri için triazol direnç sınır değerlerini revize etmiş ve türe özgü klinik direnç sınır değerleri (clinical breakpoint; CBP) nin kullanılmasının, direnci belirlemede daha özgün ve duyarlı olduğunu ve 24 saatlik inkübasyon sonunda sonuçların değerlendirilebileceğini bildirmiştir 7. Günümüzde, Candida türleri için sıvı mikrodilüsyon (BMD) yöntemi ile AFDT çalışılmasına yönelik uluslararası tanımlanmış iki standart metod mevcuttur. Bunlardan biri CLSI dokümanı 8, diğeri de European Committee of Antifungal Susceptibility Testing (EUCAST) tarafından yayımlanan EUCAST dokümanıdır 9. Bu iki standart dokümanda, Candida türleri için triazol CBP nin birbiriyle uyumlulaştırılması hedeflenmektedir 10,11. Bu dinamik süreçte CLSI, Candida türleri için sıvı mikrodilüsyon yöntemi ile elde edilen minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerlerinin yorumlanmasında türe özgü CBP in kullanımını önermiştir 7. Türe özgü CBP nin geliştirilmesi için yeterli veri bulunmadığı durumlarda ise, tedaviye daha az yanıt verecek izolatların tanımlanması için epidemiyolojik eşik değerler (epidemiological cutoff value; ECV) in kullanımı gündeme gelmiştir. Epidemiyolojik eşik değerlerin; vahşi tip (antifungal ile karşılaşmamış veya kazanılmış direnç mekanizmaları saptanmayan) ile vahşi olmayan tip (mutasyonel veya kazanılmış dirençli izolatlar) ayırımında kullanılması önerilmektedir 5,10-13. Duyarlılık testleri antifungal tedaviye yön vermekle birlikte, in vitro koşullarda dirençli izolatların belirlenmesini de sağlamaktadır 5,12-16. Bu çalışmada, Türkiye Halk Sağlığı Kurumu, Mikoloji Referans Laboratuvarı (THSK-MRL) nda, kan kültürlerinden izole edilen ve tanımlanan Candida kökenlerinde, standart mikrodilüsyon yöntemi ile CLSI tarafından önerilen yeni türe özgü CBP ve ECV ye göre triazol duyarlılık profillerinin ve dirençli kökenlerin belirlenmesi amaçlanmıştır. 124
Karabıçak N, Alem N. GEREÇ ve YÖNTEM Klinik İzolatlar ve Standart Suşlar Çalışmaya dahil edilen Candida kökenleri (n=140), 2011-2012 döneminde Türkiye deki çeşitli yoğun bakım ünitelerinde yatan invazif kandidozlu hastaların kan kültürlerinden izole edildi. Klinik izolatlar, öncelikle laboratuvarımızın maya izolatları standart tanımlama prosedürü ne göre saf kültür elde etmek ve morfolojik özelliklerinin belirlenmesi amacıyla, siklohekzimid içeren ve içermeyen kloramfenikollü Sabouraud dekstroz agar (SDA) (Oxoid, England) ve kromojenik besiyerine (CHROMagar Candida; Becton Dickinson, ABD) ilaveten mısır unu/tween-80 besiyerine Dalmau yöntemiyle 17 ekildi. Candida ların tür düzeyinde tanımlanması, kromojenik besiyerinde oluşturduğu renk, koloni morfolojisi ve mısır unu/tween-80 besiyerindeki mikro-morfolojik görünümleri, çimlenme borusu (germ tüp) testi ve API 20C AUX testi (biomérieux, Fransa), pigment üretimi, nitrat asimilasyonu, üre hidrolizi ve çeşitli ısılarda üremeyi (25 C, 37 C ve 42 C) içeren fizyolojik ve morfolojik özelliklerinin birlikte değerlendirilmesiyle yapıldı 17-19. Antifungal Duyarlılık Testleri İzolatların, flukonazol, itrakonazol ve vorikonazole duyarlılıkları, BMD ile M27-A3 dokümanına uygun olarak çalışıldı 8. Kontrol olarak, C.krusei ATCC 6258 ve C.parapsilosis ATCC 22019 standart suşları kullanıldı. Potensi bilinen saf antifungal ilaç tozlarının (flukonazol ve vorikonazol: Pfizer; itrakonazol: Merck-Sharp-Dohme), seri çift kat dilüsyonlarını içeren (flukonazol: 0.125-256 μg/ml; vorikonazol ve itrakonazol: 0.015-32 μg/ml) mikroplaklar hazırlandı. Test edilecek inokulümün yoğunluğu spektrofotometrik olarak 530 nm dalga boyunda %78-80 geçirgenlikte ayarlandıktan sonra, hazırlanan plaklara son inokulüm konsantrasyonu 0.5-2.5x10 3 cfu/ml olacak şekilde 100 er μl ekildi. Sonuçların Değerlendirilmesi Mikroplaklar, 35 C de 24 saatlik inkübasyon sonrasında, çıplak gözle değerlendirilerek MİK değerleri saptandı. Tüm ilaçlar için antifungal içermeyen kontrol kuyucuğundaki üremeye kıyasla üremenin %50 azalma gösterdiği kuyucuktaki en düşük antifungal konsantrasyonu, MİK değeri (μg/ml) olarak belirlendi. Dirençli kökenler, CLSI tarafından 2012 yılında revize edilen türe özgü CBP ye 7 göre, CBP önerisi olmayan Candida türleri ve antifungaller (itrakonazol ve C.glabrata türlerinde vorikonazol) için Pfaller ve Diekema 12 tarafından yapılan çalışmada belirtilen ECV ye göre saptandı (Tablo I). C.krusei flukonazole doğal dirençli olarak kabul edildi. Yeni önerilere göre, C.glabrata için flukonazole duyarlı kategorisi kaldırıldı. Duyarlı (S), doza bağlı duyarlı (SDD), ve dirençli (R) kökenlerin belirlenmesinde CBP kullanıldı 7. Vahşi tip (MİK < ECV) ile vahşi olmayan tip (MİK > ECV) kökenlerin ayrımında ise ECV kullanıldı 12. BULGULAR Laboratuvarımızda konvansiyonel mikolojik yöntemlerle tanımlanan 140 Candida kökeninin tür dağılımı; C.parapsilosis (n= 31), C.tropicalis (n=2 6), C.glabrata (n= 21), 125
Candida Türlerinin Triazol Antifungal Duyarlılık Profi lleri: Antifungal Direncin Belirlenmesinde Yeni CLSI Türe Özgü Klinik Direnç Sınır Değerleri ve Epidemiyolojik Eşik Değerlerinin Uygulanması Tablo I. CLSI BMD Yöntemi ile 24 Saatlik İnkübasyon Sonrası Sık Görülen Candida Türlerinin Seçilmiş Triazoller İçin Klinik Direnç Sınır Değerleri (CBP) ve Epidemiyolojik Eşik Değerleri (ECV)* Antifungal ECV (μg/ml) CBP (μg/ml) Candida türü ilaçlar VT VOT S SDD R C.albicans Flukonazol 0.5 > 0.5 2 4 8 Itrakonazol 0.12 > 0.12 U U U Vorikonazol 0.03 > 0.03 0.12 0.25-0.5 1 C.glabrata Flukonazol 32 > 32-32 64 Itrakonazol 2 > 2 U U U Vorikonazol 0.5 > 0.5 U U U C.krusei Flukonazol 64 > 64 - - - Itrakonazol 1 > 1 U U U Vorikonazol 0.5 > 0.5 0.5 1 2 C.parapsilosis Flukonazol 2 > 2 2 4 8 Itrakonazol 0.5 > 0.5 U U U Vorikonazol 0.12 > 0.12 0.12 0.25-0.5 1 C.tropicalis Flukonazol 2 > 2 2 4 8 Itrakonazol 0.5 > 0.5 U U U Vorikonazol 0.06 > 0.06 0.12 0.25-0.5 1 *Kaynak 7 ve 12 den uyarlanmıştır. BMD: Sıvı mikrodilüsyon; CBP: Klinik direnç sınır değerleri; ECV: Epidemiyolojik eşik değerleri; VT: Vahşi tip; VOT: Vahşi olmayan tip; S: Duyarlı; SDD: Doza bağlı duyarlı; R: Dirençli; U: Uygulanamaz. C.albicans (n= 18), C.lusitaniae (n= 16), C.krusei (n= 16), C.kefyr (n= 9), C.guilliermondii (n= 2) ve C.dubliniensis (n= 1) olarak belirlenmiştir. Yeni türe özgü CLSI CBP ve ECV ye göre, Candida izolatlarının mikrodilüsyon (24 saatlik inkübasyon) ile belirlenen antifungal duyarlılık test sonuçları Tablo II de görülmektedir. Buna göre, 5 Candida izolatı (3 C.albicans, 1 C.parapsilosis ve 1 C.glabrata) flukonazole dirençli; birer C.lusitaniae, C.dubliniensis ve C.kefyr izolatı ise vahşi olmayan tip olarak saptanmıştır. Ayrıca 4 Candida izolatı (2 C.albicans, ve 2 C.tropicalis) vorikonazole dirençli ve 9 Candida izolatı (5 C.glabrata, 3 C.lusitaniae, ve 1 C.kefyr) vahşi olmayan tip olarak değerlendirilmiştir. Candida türlerinde itrakonazol için önerilen ECV ye göre; 9 C.albicans, 4 C.krusei, 2 C.glabrata, 1 C.parapsilosis ve 1 C.tropicalis olmak üzere toplam 17 Candida izolatı vahşi olmayan tip olarak saptanmıştır. Tüm Candida türleri içinde, birer C.parapsilosis, C.tropicalis, C.glabrata, C.lusitaniae ve C.kefyr ile 3 C.albicans izolatı, iki veya daha fazla triazol antifungale karşı çapraz dirençli veya vahşi olmayan tip olarak bulunmuştur. Candida türlerinin her bir antifungal ilaç için MİK aralığı ve MİK50-MİK90 değerleri Tablo III de görülmektedir. Tüm Candida kökenleri için vorikonazol MİK90 değerleri, flukonazol değerlerinden daha düşük bulunmuştur. C.glabrata için itrakonazol MİK90 değeri, diğer kökenlere göre daha yüksek bulunmuştur. TARTIŞMA Candida türleri, invazif fungal enfeksiyon etkenleri arasında en sık (%73.4) rastlanılan mantarlardır 20. İnvazif kandidoz (İK) lar, yüksek mortalite oranlarıyla seyretmekte ve 126
Karabıçak N, Alem N. Tablo II. Kan Kültürlerinden İzole Edilen Candida Kökenlerinin (n= 140) CLSI Mikrodilüsyon Yöntemi ile Flukonazol, Itrakonazol ve Vorikonazol İçin Duyarlılık Kategorileri Türler (İzolat sayısı) Antifungal ilaçlar Yeni ECV ye göre izolat sayısı Yeni CBP ye göre izolat sayısı VT VOT S SDD R C.albicans (n= 18) Flukonazol 13 5 14 1 3 Itrakonazol 9 9 U U U Vorikonazol 12 6 13 0 2 C.parapsilosis (n= 31) Flukonazol 29 2 29 1 1 Itrakonazol 30 1 U U U Vorikonazol 29 2 29 0 0 C.glabrata (n= 21) Flukonazol 20 1 U 20 1 Itrakonazol 19 2 U U U Vorikonazol 16 5 U U U C.tropicalis (n=26) Flukonazol 26 0 26 0 0 Itrakonazol 25 1 U U U Vorikonazol 19 7 22 0 2 C.krusei (n= 16) Flukonazol - - - - - Itrakonazol 12 4 U U U Vorikonazol 16 0 16 0 0 C.lusitaniae (n= 16) Flukonazol 15 1 U U U Itrakonazol 16 0 U U U Vorikonazol 13 3 U U U C.kefyr (n= 9) Flukonazol 8 1 U U U Itrakonazol - - - - - Vorikonazol 8 1 U U U C.guilliermondii (n= 2) Flukonazol 2 0 U U U Itrakonazol 2 0 U U U Vorikonazol 2 0 U U U C.dubliniensis (n= 1) Flukonazol 0 1 U U U Itrakonazol 1 0 U U U Vorikonazol 1 0 U U U ECV: Epidemiyolojik eşik değerleri; CBP: Klinik direnç sınır değerleri; VT, Vahşi tip; VOT: Vahşi olmayan tip; S: Duyarlı; SDD: Doza bağlı duyarlı; R: Dirençli; U: Uygulanamaz. hastanede kalış sürelerinin uzamasına neden olmaktadır. Günümüzde, İK etkenleri arasında C.albicans ın en sık izole edilen tür olduğu, ancak albicans-dışı Candida türlerinin de giderek artan sıklıkta tanımlandığı bildirilmektedir 21. Son yıllarda kandidemi epidemiyolojik verilerindeki albicans-dışı Candida türlerinin lehine olan bu artış ve antifungal ilaçlara dirençli kökenlerin ortaya çıkması ile tedavide uygun antifungalin seçimi daha da önemli hale gelmiştir 1,2. CLSI, AFDT alt komitesinin 2012 yılında, sık görülen beş Candida türünün (C.albicans, C. glabrata, C.tropicalis, C.parapsilosis ve C.krusei ) BMD testlerinde, sistemik etkili triazoller (flukonazol ve vorikonazol) ve ekinokandinler (anidulafungin, kaspofungin ve mikafungin) için yeni türe özgü CBP belirlemesi nedeniyle, tür tanımlamasının artık daha da önemli 127
Candida Türlerinin Triazol Antifungal Duyarlılık Profi lleri: Antifungal Direncin Belirlenmesinde Yeni CLSI Türe Özgü Klinik Direnç Sınır Değerleri ve Epidemiyolojik Eşik Değerlerinin Uygulanması Tablo II. Kan Kültürlerinden İzole Edilen Candida Kökenlerinin (n=140) CLSI Mikrodilüsyon Yöntemi ile Flukonazol, Itrakonazol ve Vorikonazol İçin MİK Aralıkları, MİK50 ve MİK90 Değerleri Türler (İzolat sayısı) Antifungal ilaçlar MİK Aralığı (μg/ml) MİK 50 (μg/ml) MİK 90 (μg/ml) C.albicans (n= 18) Flukonazol < 0.125- > 64 0.25 16 Itrakonazol 0.015- > 8 0.06 0.5 Vorikonazol < 0.015- > 16 0.03 0.25 C.parapsilosis (n= 31) Flukonazol < 0.125-8 0.5 2 Itrakonazol < 0.015-1 0.06 0.25 Vorikonazol < 0.015-0.25 0.015 0.125 C.glabrata (n= 21) Flukonazol 0.5- > 64 4 8 Itrakonazol 0.015-8 1 2 Vorikonazol 0.015-2 0.25 1 C.tropicalis (n= 26) Flukonazol < 0.125-2 0.25 0.5 Itrakonazol < 0.015-2 0.125 0.5 Vorikonazol < 0.015-1 0.03 0.5 C.krusei (n= 16)* Flukonazol - - - Itrakonazol 0.5-2 0.125 1 Vorikonazol 0.015-0.5 0.25 0.5 C.lusitaniae (n= 16) Flukonazol < 0.125-32 0.25 0.5 Itrakonazol 0.015-0.5 0.125 0.25 Vorikonazol < 0.015-0.5 0.015 0.5 C.kefyr (n= 9) Flukonazol < 0.125-2 - - Itrakonazol < 0.015-0.5 - - Vorikonazol < 0.015-1 - - C.guilliermondii (n= 2) Flukonazol < 0.125-2 - - Itrakonazol 0.06-0.125 - - Vorikonazol 0.03-0.06 - - C.dubliniensis (n= 1) Flukonazol 1 - - Itrakonazol 0.015 - - Vorikonazol < 0.015 - - * C.krusei MİK değerinden bağımsız olarak flukonazole doğal dirençli kabul edildiğinden çalışılmamıştır. olduğu ve Candida sp. veya Candida sp. non-albicans olarak tanımlamanın yeterli olmayacağı vurgulanmaktadır 1,2,7,10. Çalışmamızda C.albicans (n= 18) dışında, C.parapsilosis (n= 31), C.tropicalis (n= 26), C.glabrata (n= 21), C.lusitaniae (n= 16), C.krusei (n= 16), C.kefyr (n= 9), C.guilliermondii (n= 2) ve C.dubliniensis (n= 1) olmak üzere sekiz farklı tür tanımlanmıştır. Referans laboratuvar olmamız nedeniyle, tedaviye yanıt vermeyen enfeksiyonların etkeni olarak, albicans-dışı Candida türlerinin AFDT için daha fazla gönderilmesi sonucu Candida tür dağılımları epidemiyolojik olarak değerlendirilememiştir. Triazol antifungaller için yeni belirlenen CBP 7, C.glabrata türleri haricinde, önceki CBP ye göre 2-3 kat daha düşük dilüsyonlardadır 7,22. Bu nedenle, yapılan çalışmalarda sonuçlar, yeni CBP ye göre değerlendirildiğinde, daha çok izolatın SDD ve R olarak tespit edildiği bildirilmektedir 2,14. Fothergill ve arkadaşları 14, yeni CBP ye göre C.albicans (n= 1196) için triazollere direnç oranlarını değerlendirdikleri çalışmalarında, flukonazol direnç oranında 128
Karabıçak N, Alem N. istatistiksel olarak anlamlı bir farkla artış [yeni CBP: %5.7; eski CBP: %2.1 (p< 0.0001)] tespit etmişlerdir. Tüm dünyada antifungal ilaçların duyarlılık ve direnç oranlarının izlendiği SENTRY 2 antimikrobiyal sürveyans programında, yeni türe özgü CLSI M27-S4 CBP kullanıldığında flukonazole direnç oranları; C.albicans, C.tropicalis, C.parapsilosis ve C.glabrata için sırasıyla, %0.4, %1.3, %2.1 ve %8.8 olarak bildirilmiştir. Ülkemizde yapılan çalışmalarda, eski CBP ye göre farklı flukonazol direnç oranları saptanmıştır. Altuncu ve arkadaşları 23 neonatal Candida enfeksiyonu etkenlerinden izole ettikleri kökenlerde BMD ile flukonazol direnç oranını %5.5 (C.albicans da %2.8; albicans-dışı Candida türlerinde %11) bulmuşlardır. Aydın ve arkadaşları 24, C.glabrata kökenlerinde, Saraçlı ve arkadaşları 25 C.parapsilosis kökenlerinde; Gürcüoğlu ve arkadaşları 26 ise C.glabrata ve C.parapsilosis kökenlerinde flukonazol direnci saptarken, kökenlerin %90 ının flukonazole duyarlı olduğunu bildirmişlerdir. Tosun ve arkadaşları 27, bir C.parapsilosis sensu stricto kökenini flukonazole SDD olarak tespit etmişlerdir. Yeni belirlenen CLSI CBP ye göre çalışmamızda, üç C.albicans, bir C.parapsilosis ve bir C.glabrata kökeni flukonazole dirençli bulunmuştur. Çalışma sonuçlarımız, ülkemizde yapılan çalışmalarda 23-27 bildirilen kökenlerle uyumlu bulunmasının yanı sıra, yeni CBP nin kullanımı sonucunda direnç oranlarında yükselmeler saptanmıştır. Çalışmamızdaki C.albicans kökenlerinde flukonazol direnci (3/18), SENTRY çalışması 2 verilerinden (%0.4) de yüksek bulunmuştur. Bu durum, özellikle triazoller ile tedaviye yanıt vermeyen sorunlu hastaların C.albicans izolatlarının BMD ile AFDT çalışılması ve doğrulama amacıyla THSK-MRL ye daha fazla gönderilmesi ile açıklanabilmektedir. Fothergill ve arkadaşlarının 14 çalışmasında da, ülkelerinde referans laboratuvar olma özelliğinden dolayı flukonazole dirençli C.albicans ların oranı (%5.7), SENTRY çalışması 2 verilerinden (%0.4) yüksek bulunmuştur. Çalışma sonuçlarımıza göre, nadir görülen Candida türlerinden birer C.lusitaniae (MİK> 2 μg/ml), C.guilliermondii (MİK> 8 μg/ml) ve C.dubliniensis (MİK> 0.5 μg/ml) izolatı flukonazol için, vahşi olmayan tip (MİK>ECV) 12 olarak değerlendirilmiştir. Yeni önerilen direnç sınır değerlerine 7 göre Candida türleri için vorikonazol direnç oranlarının araştırıldığı SENTRY çalışmasında 2, C.glabrata için yüksek direnç saptanmışken [%10.5 (MİK> 0.5 μg/ml; vahşi olmayan tip)], C.krusei için %1.3 olarak bulunmuş ve vorikonazolün diğer Candida türlerine karşı etkin olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmada da, CLSI M27-S4 e göre vorikonazol direnci; ikişer C.albicans (2/18) ve C.tropicalis (2/26) izolatında gözlenmiştir. Vorikonazol için Candida türleri arasında; beş C.glabrata (5/21), üç C.lusitaniae (3/21; MİK> 0.03 μg/ml) ve bir C.kefyr izolatı (1/9; MİK> 0.015 μg/ ml) vahşi olmayan tip (MİK> ECV) olarak değerlendirilmiştir. Tosun ve arkadaşları 27 ile Gültekin ve arkadaşları 28 yeni CBP ye göre yaptıkları çalışmada, Candida türlerinde vorikonazol direnci saptamamışlardır. Fothergill ve arkadaşları 14, Candida türlerinin tümünde, vorikonazol direnç oranlarının eski direnç oranlarına göre arttığını, bu artışın özellikle C.glabrata türlerinde istatistiksel olarak anlamlı [yeni direnç oranı: %18.4; eski direnç oranı: %6.1 (p< 0.0001)] olduğunu bildirmişlerdir. Bizim bulgularımıza göre de, çalışmaya dahil edilen Candida türleri arasında vorikonazol direnci en sık C.glabrata (5/21) kökenlerinde saptanmıştır (Tablo II ). Çalışmamızdaki itrakonazol sonuçları, CBP belirlenmediğinden, sekiz Candida türü için bildirilen ECV 13 değerlerine göre yorumlanmıştır. Çalışmamızda, itrakonazol için 129
Candida Türlerinin Triazol Antifungal Duyarlılık Profi lleri: Antifungal Direncin Belirlenmesinde Yeni CLSI Türe Özgü Klinik Direnç Sınır Değerleri ve Epidemiyolojik Eşik Değerlerinin Uygulanması vahşi olmayan tip (MİK > ECV) kökenler, sık görülen Candida türleri arasından, dokuz C.albicans, dört C.krusei, iki C.glabrata ve birer C.parapsilosis, C.tropicalis olarak tespit edilmiştir. Gültekin ve arkadaşları 28, yeni CBP ye göre değerlendirdikleri çalışmalarında, beş C.glabrata kökeninin üçünün itrakonazole dirençli olduğunu saptamışlardır. Çalışmamızdaki nadir görülen türlerin (C.dubliniensis, C.guilliermondii ve C.lusitaniae) itrakonazol için vahşi tip (WT, MİK < ECV) olduğu saptanmıştır (Tablo II). İtrakonazol ECV değeri sekiz Candida türü için belirlenirken 13 C.kefyr için belirlenmemiştir. Çalışmamızda C.kefyr izolatlarının MİK aralığı (< 0.015-0.5 μg/ml ) düşük değerlerde bulunmuştur (Tablo III). Çalışmamıza dahil edilen Candida kökenleri arasından, iki C.albicans ve bir C.glabrata kökeninde üç triazol antifungale çapraz direnç saptanmıştır. İlaveten birer C.albicans, C.parapsilosis (flukonazol ve itrakonazol) ve C.tropicalis izolatında (itrakonazol ve vorikonazol) iki triazole çapraz direnç tespit edilmiştir. Nadir görülen türler arasında ise, iki triazole çapraz direnç (MİK > ECV) 12, bir C.kefyr (flukonazol MİK > 1 μg/ml; vorikonazol MİK > 0.0015 μg/ml) ve bir C.lusitania izolatında (flukonazol MİK > 2 μg/ml; vorikonazol MİK > 0.03 μg/ml) saptanmıştır. Bizim çalışmamızla benzer şekilde SENTRY 2 çalışmasında da, nadir görülen türler arasında C.lusitaniae (3/55) izolatları çapraz dirençli bulunmuştur. Çalışmamızda, flukonazolün in vitro aktivitesinin Candida türlerine göre değişebileceği, itrakonazolün in vitro aktivitesinin ise C.glabrata (MİK 90: 2 μg/ml) ve C.krusei (MİK90: 1 μg/ml) dışındaki tüm türler için birbirine benzer (MİK90: 0.25-0.5 μg/ml) olduğu gözlenmiştir. Benzer şekilde vorikonazolün C.glabrata (MİK 90: 1 μg/ml) haricindeki diğer kökenler için in vitro aktivitesinin iyi olduğu (MİK90: 0.06-0.5 μg/ml) tespit edilmiştir (Tablo III). Bu bulgularımız, yapılan diğer çalışmalarla 2,12,14 benzerlik göstermektedir. Sonuç olarak, yeni türe özgü CLSI CBP ve ECV ler nedeniyle Candida ların tür düzeyinde tanımlanması daha da önemli hale gelmiştir. Çalışmamızdaki Candida türlerinde 24 saatlik inkübasyonla CLSI BMD metodunda yeterli üreme saptanabilmiştir. Bu da klinik laboratuvarlarda AFDT nin daha pratik ve etkin kullanımını sağlayacaktır. Yeni belirlenen CLSI CBP ye göre, üç C.albicans, bir C.parapsilosis ve bir C.glabrata kökeni flukonazole dirençli; iki C.albicans ve iki C.tropicalis kökeni de itrakonazol için vahşi olmayan tip olarak bulunmuştur. Yeni C.glabrata flukonazol CBP ye göre bir C.glabrata izolatı flukonazole dirençli bulunmuş; aynı köken itrakonazol için de vahşi olmayan tip olarak saptanmıştır. İn vitro olarak dirençli ve vahşi olmayan tip olarak tanımladığımız kökenlerin klinik geçerliliğinin saptanabilmesi için moleküler ve in vivo çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir. KAYNAKLAR 1. Pfaller MA, Andes DR, Diekema DJ, et al. Epidemiology and outcomes of invasive candidiasis due to non-albicans species of Candida in 2,496 patients: data from the Prospective Antifungal Therapy (PATH) Registry 2004-2008. Plos One 2014; 9(7): e101510. 2. Pfaller MA, Messer SA, Woosley LN, Jones RN, Castanheira M. Echinocandin and triazole antifungal susceptibility profiles of opportunistic yeast and mould clinical isolates (2010-2011): application of new CLSI clinical breakpoints and epidemiological cutoff values to characterize geographic and temporal trends of antifungal resistance. J Clin Microbiol 2013; 51(8): 2571-81. 130
Karabıçak N, Alem N. 3. Pappas PG, Kauffman CA, Andes D, et al. Clinical practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update by the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis 2009; 48(5): 503-35. 4. Arendrup MC, Dzajic E, Jensen RH, et al. Epidemiological changes with potential implication for antifungal prescription recommendations for fungaemia: data from a nationwide fungaemia surveillance programme. Clin Microbiol Infect 2013; 19(8): E343-53. 5. Pfaller MA. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med 2012; 125(1 Suppl): S3-13. 6. Johnson EM. Issues in antifungal susceptibility testing. J Antimicrob Chemother 2008; 61 (Suppl 1): i13-8. 7. Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. 4 th Informational Supplement. M27-S4, 2012. CLSI, Wayne, PA. 8. Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved Standard M27-A3. 2008, 3rd ed. CLSI, Wayne, PA. 9. Arendrup MC, Cuenca-Estrella M, Lass-Flörl C, Hope W; EUCAST-AFST. EUCAST technical note on the EU- CAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect 2012; 18(7): E246-7. 10. Pfaller MA, Andes D, Diekema DJ, Espinel-Ingroff A, Sheehan D; CLSI Subcommittee for Antifungal Susceptibility Testing. Wild-type MIC distributions, epidemiological cutoff values and species-specific clinical breakpoints for fluconazole and Candida: time for harmonization of CLSI and EUCAST broth microdilution methods. Drug Resist Updat 2010;13(6): 180-195. 11. Pfaller MA, Espinel-Ingroff A, Boyken L, et al. Comparison of the broth microdilution (BMD) method of the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing with the 24-hour CLSI BMD method for testing susceptibility of Candida species to fluconazole, posaconazole, and voriconazole by use of epidemiological cutoff values. J Clin Microbiol 2011; 49(3): 845-50. 12. Pfaller MA, Diekema DJ. Progress in antifungal susceptibility testing of Candida spp. by use of Clinical and Laboratory Standards Institute broth microdilution methods, 2010 to 2012. J Clin Microbiol 2012; 50(9): 2846-56. 13. Pfaller MA, Espinel-Ingroff A, Canton E, et al. Wild-type MIC distributions and epidemiological cutoff values for amphotericin B, flucytosine, and itraconazole and Candida spp. as determined by CLSI broth microdilution. J Clin Microbiol 2012; 50(6): 2040-6. 14. Fothergill AW, Sutton DA, McCarthy DI, Wiederhold NP. Impact of new antifungal breakpoints on antifungal resistance in Candida species. J Clin Microbiol 2014; 52(3): 994-7. 15. Won EJ, Shin JH, Choi MJ, et al. Antifungal susceptibilities of bloodstream isolates of Candida species from nine hospitals in Korea: application of new antifungal breakpoints and relationship to antifungal usage. Plos One 2015; 10(2): e0118770. 16. Gülmez D, Ayçık ÖD, Akdağlı SA. Kan kültürlerinden izole edilen Candida suşlarında önceki ile karşılaştırmalı olarak yeni CLSI direnç sınır değerlerinin triazol duyarlılık kategorilerinin belirlenmesine etkisi. 1. Ulusal Tıbbi Mikrobiyoloji Kongresi, 24-26 Eylül 2016, Ankara. Kongre Kitabı, s: 78-9. 17. Borman AM, Szekely A, Palmer MD, et. al. Assessment of accuracy of identification of pathogenic yeasts in microbiology laboratories in the United Kingdom. J Clin Microbiol 2012; 50(8): 2639-44. 18. Larone DH. Yeast and yeastlike organisms. Laboratory Technique. Media, pp: 109-143, 325-49. In: Larone DH (ed), Medically Important Fungi: A Guide To Identification. 2002, 4th ed. ASM Press, Washington, DC. 19. Hazen KC, Howell SA. Full Identification of Yeasts, p: 8.8. In: Garcia LS, Isenberg HD, Jorgensen JH, Pfaller M, Landry ML (eds), Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2007, 3rd ed. ASM Press, Washington, DC. 20. Azie N, Neofytos D, Pfaller M, Meier-Kriesche HU, Quan SP, Horn D. The PATH (Prospective Antifungal Therapy) Alliance registry and invasive fungal infections: update 2012. Diagn Microbiol Infect Dis 2012; 73(4): 293-300. 131
Candida Türlerinin Triazol Antifungal Duyarlılık Profi lleri: Antifungal Direncin Belirlenmesinde Yeni CLSI Türe Özgü Klinik Direnç Sınır Değerleri ve Epidemiyolojik Eşik Değerlerinin Uygulanması 21. Cleveland AA, Farley MM, Harrison LH, et al. Changes in incidence and antifungal drug resistance in candidemia: results from population-based laboratory surveillance in Atlanta and Baltimore, 2008-2011. Clin Infect Dis 2012; 55(10): 1352-61. 22. Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. 3rd Informational Supplement. M27-S3, 2008. CLSI, Wayne, PA. 23. Altuncu E, Bilgen H, Cerikçioğlu N ve ark. Neonatal Candida enfeksiyonları ve etkenlerinin antifungal duyarlılıkları. Mikrobiyol Bul 2010; 44(4): 593-603. 24. Aydin F, Bayramoglu G, Guler NC, Kaklikkaya N, Tosun I. Bloodstream yeast infections in a university hospital in Northeast Turkey: a 4-year survey. Med Mycol 2011; 49(3): 316-9. 25. Saracli MA, Gumral R, Gul HC, Gonlum A, Yildiran ST. Species distribution and in vitro susceptibility of Candida bloodstream isolates to six new and current antifungal agents in a Turkish tertiary care military hospital, recovered through 2001 and 2006. Mil Med 2009; 174(8): 860-5. 26. Gurcuoglu E, Ener B, Akalin H, et al. Epidemiology of nosocomial candidaemia in a university hospital: a 12-year study. Epidemiol Infect 2010; 138(9): 1328-35. 27. Tosun I, Akyuz Z, Guler NC, et al. Distribution, virulence attributes and antifungal susceptibility patterns of Candida parapsilosis complex strains isolated from clinical samples. Med Mycol 2013; 51(5): 483-92. 28. Gültekin B, Eyigör M, Tiryaki Y, Kırdar S, Aydın N. Investigation of antifungal susceptibilities and some virulence factors of Candida strains isolated from blood cultures and genotyping by RAPD-PCR. Mikrobiyol Bul 2011; 45(2): 306-17. 132