TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMU TEKNİK RAPOR. TUNCELİ SARIMSAĞININ (Allium tuncelianum (Kollman)) IN VITRO ÇOĞALTMA OLANAKLARININ ARAŞTIRILMASI

TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMU TEKNİK RAPOR TUNCELİ SARIMSAĞININ (Allium tuncelianum (Kollman)) IN VITRO ÇOĞALTMA OLANAKLARININ ARAŞTIRILMASI 2011

TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMU 2690 sayılı kanun ile kurulmuş olan Türkiye Atom Enerjisi Kurumunun ana görevi; atom enerjisinin barışçıl amaçlarla ülke yararına kullanılmasında izlenecek ulusal politikanın esaslarını ve bu konudaki plan ve programlan belirlemek; ülkenin bilimsel, teknik ve ekonomik kalkınmasında atom enerjisinden yararlanılmasını mümkün kılacak her türlü araştırma, geliştirme, inceleme ve çalışmayı yapmak ve yaptırmak, bu alanda yapılacak çalışmaları koordine ve teşvik etmektir. Bu çal ışmataek personeli tarafından gerçekleştirilmiş araştırma, geliştirmeye inceleme sonuçlarının paylaşımı amacıyla Teknik Rapor olarak hazırlanmış ve basılmıştır. Teknik Rapor 2011/13 Türkiye Atom Enerjisi Kurumu yayınıdır, izin alınmaksızın çoğaltılabilir. Referans verilerek kullanılabilir. TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMU Adres : Eskişehir Yolu 9. km 06530 Ankara/Türkiye Tel :+90 (312) 295 87 00 Fax :+90 (312)287 87 61 Web : www.taek.gov.tr

ÖNSÖZ Ülkemizde, Tunceli ve Sivas çevreleri için endemik bir yabani sarımsak türü olarak tanımlanan Allium tuncelianum [31], doğadan toplanarak tüketilmekte ve toplanma sonucu nesli tehlikede olan endemik türler arasında yer almaktadır. Tunceli sarımsağı tek dişli, üzerindeki kabukların arasında küçük diş benzeri oluşumlar bulunan, bilinen sarımsak tat ve aromasına sahip, diğerinden farklı olarak çiçeklenip tohum verebilen bir türdür [30]. Tek dişli olması, kabuk sayısının kültür sarımsağından az (1-2 adet) olması ve başların 18-20 C'de uzun süre saklanabilmesi gibi özellikleri nedeniyle tüketim amacıyla olduğu gibi, endüstride de kullanım şansı bulunmaktadır. Yörede de dağlardan toplanarak 'Kaya sarımsağı' adı altında satılmakta ve ticari mal olarak kullanılmaktadır [32]. Endemik ve koruma altında olması gerektiği belirtilen bir bitki olmasına rağmen Tunceli sarımsağının korunmasına ve kültüre alınmasına ilişkin bir çalışmaya rastlanmamıştır. Tunceli sarımsağının çoğalmasıyla ilgili olarak, doğal ortamında tek dişli başlar ürettiği ve yöreden temin edilen örneklerde yapılan gözlemlere göre başlar üzerinde henüz.fonksiyonları tam olarak anlaşılmamış minik diş benzeri yapılar bulunduğu dışında bir bilgi bulunmamaktadır. Özhatay ve Şiraneci (1992) yaptıkları çalışmada 25-60 cm uzunluğunda çiçek sapı oluşturan, çiçek/enen ve kapsül şeklinde meyveye sahip olan, 1-2 mm çapında 3 köşeli ve üzeri buruşuk tohumlara sahip olduğunu belirtmişlerdir. Burada sonuçları sunulan çalışma, endemik ve kaybolmak üzere olan bir sarımsak türünün kültüre alınma koşullarını belirlemek, böylece hem yöre halkına bir gelir kapısı açmak hem de bitkiyi koruma altına almak amacıyla TAEK ve Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü'ni'm vermiş olduğu destek kapsamında yürütülmüştür.

İÇİNDEKİLER Tablolar Dizini Şekiller Dizini Yönetici Özeti Executive Summary Kısaltmalar ve Terimler ii v v viı 1. GİRİŞ 1 2. KONU 3 2.1 Yöntem 3 2.2 Çalışma Takvimi 9 2.3 Bulgular 10 3. SONUÇ 21 4. KAYNAKÇA 22

TABLOLAR DİZİNİ Tablo 1. Tunceli Sarımsağında (A. Tuncelianum) Kök ve Yaprak Kültürü Denemelerinde Kullanılan Temel Besin Ortamı ve Hormon Kombinasyonları 7 Tablo 2. Tunceli Sarımsağında (A. Tuncelianum) Sürgün Ucu Kültürü Denemelerinde Kullanılan Ortam ve Hormon Kombinasyonları 8 Tablo 3. Tunceli Sarımsağında BA+Oksin Kombinasyonlarının 4. Alt Kültür Sonucunda Toplam ve Bitki Başına Kardeş Sayısı ile Kardeşlenme Oranına Etkisi (%) 12 Tablo 4. Tunceli Sarımsağında Hormon Kombinasyonlarının 1. Alt Kültür Sonucunda Toplam Kardeş Sayısı, Bitki Başına Düşen Kardeş Sayısı ve Kardeşlenme Oranına Etkisi (%) 15 Tablo 5. Tunceli Sarımsağında BA+Oksin Kombinasyonlarının Baş Oluşumuna Etkisi 16 Tablo 6. Tunceli Sarımsağına (Allium Tuncelianum) Ait Sürgünlerde Baş Oluşturma Ortamlarında Elde Edilen Sonuçlar 17 Tablo 7. Tunceli Sarımsağına (A. Tuncelianum) Ait Başların Köklenmesi Üzerine NAA Dozlarının Etkileri 18 Tablo 8. Tunceli Sarımsağına Ait Embriyoların Oksin ve Sitokinin Kombinasyonlarına Göre Kardeş Sayısı ve Kardeşlenme Oranı 19 i

Tablo 9. Embriyo Kültüründen Elde Edilen Sürgünlerin Baş Kök Oluşturma Ortamlarındaki Durumu

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1. Tunceli Sarımsağının (Allium Tuncelianum) Munzur Dağları'nda Arazideki Görünümü 1 Şekil 2. Tunceli Sarımsağında (Allium Tuncelianum) Baş, Baş Üzerindeki Dişçikler, Çiçeklenme ve Çiçekler, Tohum Taşıyan Saplar ve Tohumların Görünümü 2 Şekil 3. Tunceli Sarımsağına (A. Tuncelianum) Ait Baş ve Dişçiklerin Görünümü 4 Şekil 4. Sarımsaklarda Görülen Enfeksiyon ve Saf Su + Sodyum Hipoklorit Uygulaması 5 Şekil 5. Sarımsakların Sürgün Uçlarının Dikim için Hazırlanması 6 Şekil 6. Tunceli Sarımsağına (A. Tuncelianum) Ait 18 Gün Yaşlı Bitkiler ve Bu Bitkilerden Alınan Kök Uçları 7 Şekil 7. Sürgün Ucu Kültürü Denemelerinde Tüplere Dikilmiş Tunceli Sarımsağı Sürgün Uçları 8 Şekil 8. a) Tunceli Sarımsağında (A. Tuncelianum) Ana Sürgünden Oluşan Sürgünün Görünümü b) 0.05 mg/l BA + 0.5 mg/l IAA Kombinasyonunda Kardeşlenmenin Görünümü 13 Şekil 9. Tunceli Sarımsağına (A. Tuncelianum) Ait Sürgünlerde 6. Haftadan Sonra Baş Oluşumu 14 Şekil 10. Tunceli Sarımsağında Alt Kültürlerde Baş Oluşumu 17

Şekil 11. Tunceli Sarımsağında (A. Tuncelianum) Ait Başlı Sürgünlerde Köklenme 18 Şekil 12. Tunceli Sarımsağında Dış Koşullara Aktarılmış İn Vitro Bitkilerin 1 Ay Sonraki Görünümü 19 iv

YÖNETİCİ ÖZETİ Bu araştırma 2004-2006 yılları arasında, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü ve Türkiye Atom Enerjisi Kurumu Sarayköy Nükleer Araştırma ve Eğitim Merkezi, Tarım Birimi Bitki Islahı Laboratuarlarında yürütülmüştür. Çalışma TAEK ve Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Araştırmada endemik bir tür olan Tunceli sarımsağının, in vitro koşullarda kök, yaprak ve sürgün ucu kültürü yöntemleriyle hızlı çoğaltabilme olanaklarını belirlemek hedeflenmiştir. Bu araştırmada yaprak, kök ve sürgün ucu kültürlerinde kullanılacak en uygun oksin (2,4D ve NAA 0, 1.0, 2.0 mgl 1 ) ve sitokinin (BA 0, 0.1 ve 1.0 mgl 1 ) kombinasyonları belirlenmeye çalışılmıştır. Yaprak ve kök kültürlerinde sürgün oluşumu tespit edilmemiştir. Sadece kallus oluşumu 0.1 mgl 1 +1.0 mgl 1 NAA kombinasyonundan elde edilmiştir. Sürgün kültürlerinde hem oksin hem de sitokinin beraberce kullanımı Tunceli sarımsağı için sürgün oluşumunu artırmada etkili olmamıştır. Buna karşılık 0.5 mg/l BA+0.1 mg/iiaa, 0.1 mg/l BAveO.1 mg/l BA+0.1 mg/l NAA, 0.05 mg/l BA+0.5 mg/l IAA ve 0.05 mg/l BA kombinasyonlarında tek sürgün oluşumu gerçekleşmiştir. laa'nın daha düşük konsantrasyonlarının sürgün proliferasyonunu tetiklediği belirlenmiştir. Yumru oluşumunun artırılmasında alt kültür sayısının artırılması etkili olmuştur. Oksin içermeyen, 0.1 mgl 1 NAA+0.1 mgl 1 BA içeren ortamlarda yumru oluşum oranı %100 olarak belirlenmiştir. Oksin içermeyen ya da 0.1 mgl 1 NAA içeren ortamlarda kültüre alınan sürgünlerde yumru oluşumu tespit edilememiştir. Yumru oluşturma ortamında dördüncü alt kültürden itibaren oksin içermeyen ya da sadece 0,1 mgl 1 NAA içeren ortamlarda köklenmenin düşük oranda başladığı ve bu oranların sırasıyla %37 ve %40 olduğu saptanmıştır. Oksinsiz veya 0,5 mgl 1 NAA içeren ortamlara transfer edilen köksüz sürgünlerde köklenme artmıştır. En yüksek oran %33 ile 2 mgl 1 NAA uygulamasında gerçekleşmiş olup bunu %17 ile 0,5 mgl 1 NAA izlemiştir. Saksıya transfer edilen köklenmiş ve köklenmemiş yumrular 2-3 gerçek yaprak oluşturduktan sonra yaşama yeteneklerini yitirmişlerdir. Ancak üretimde kullanılan küçük yumrular bu ana yumrulardan elde edilmiş olup bu Tunceli sarımsağı için olağan bir durum olarak karşımıza çıkmıştır. v

EXECUTIVE SUMMARY This research was conducted at University of Ankara, Faculty of Agriculture, Department of Horticulture and Turkish Atomic Energy Authority Sarayköy Nuclear Research and Training Center, Plant Breeding Lab's at Agriculture Division within the period of 2004-2006. The scope of this research is to determine the effective in vitro micropropagation methods as shoot and root culture for Tunceli garlic. In this research to determine the best combinations of growth regulators for shoot and root cultures, 2.4-D and NAA (0, 1.0, 2.0 mgl" 1 ) were used as auxin and BA (0, 0.1, 1.0 mgl" 1 ) as cytocinin. No shoots obtained from the leave and root tip culture experiment. Only callus formation was seen in 0.1 mgl" 1 BA+1.0 mgl" 1 NAA combination. Both auxins and cytokinin failed to induce shoot proliferation in Tunceli garlic via shoot culture experiment. Only one shoot was obtained from the 0.05 mg/l BA+0.1 mgl" 1 IAA, 0.1 mgl" 1 BA and 0.1 mgl" 1 BA + 0.1 mgl" 1 NAA, 0.05 mgl" 1 BA+0.5 mgl" 1 IAA and 0.05 mgl" 1 BA combinations. Proliferation frequency increased with lower concentration of IAA with 0.05 mg/l BA. In vitro bulblet formation of garlic shoots started from second suultures. When the suulture number was increased, also bulbing ratio increased too. Bulb formation ratio was 100% in medium without auxin and 0.1 mgl-naa+0.1 mgl" 1 BA combination. Shoots do not formed bulblet planted again on medium without auxin or with 0.1 mgl 1 NAA. Although shoots were started rooting (37%) in without auxin and 40% in 0.1 mgl" 1 NAA from fourth suulture in bulblet formation medium, rooting ratio was found as low level. When unrooted shoots transferred to the medium without auxin and with NAA medium, rooting ratio increased. The highest rooting ratio was 33% in 2 mgl" 1 NAA, and 17% in 0.5 mgl" 1 NAA. When rooted and unrooted garlic bulblets transferred pots, plants died after produced 2-3 leaves but small bulblets were obtained from main bulblets. This is an expected case for Tunceli garlic. vi

KISALTMALAR ve TERİMLER KISALTMALAR mg/l mgl 1 IAA N NaOH Miligram/litre Miligram/litre lndole-3-acetic Acid Normal Sodyum Hidroksit 2,4D 2,4-Dichlorophenoxy Acetic Acid NAA HCI Naftalen Asetik Asit Hidroklorik Asit C Derece Santigrat ml BAP UYD g g/ı Ms mililitre Benzylaminopurine Ulaşılabilir Yaşam Derneği gram gram/litre Murashige & Stoog Besin Ortamı TERİMLER In Vitro : Tamamen aseptik koşullarda ve yapay besin ortamlarında canlı materyalle yürütülen kültürel işlemler. vii

1. GİRİŞ Tunceli sarımsağı olarak adlandırılan Allium tuncelianum endemik bir bitki türüdür ve dünyada sadece Tunceli ve Elazığ illeri sınırlarında bulunan Munzur dağları eteklerinde yayılma alanı bulmaktadır [29]. Tunceli sarımsağı, tek bir başa sahiptir. Bilinen sarımsak aramasında ve yörede dağlardan toplanarak sarımsak olarak tüketilen ve pazarlanan bir türdür. Tunceli sarımsağının tek dişli olması, kabuk sayısının bilinen kültür sarımsağından az (1-2 adet) olması ve başların 18-20 C'de uzun süre saklanabilmesi gibi özellikleri nedeniyle tüketim amacıyla olduğu gibi endüstride de kullanım şansı bulunmaktadır (Şekil 1). Şekil 1. Tunceli Sarımsağının (Allium Tuncelianum) Munzur Dağları'nda Arazideki Görünümü Tunceli sarımsağı (Allium tuncelianum) üzerinde yürüttüğümüz çalışmalarda, iriliği 20-70 g arasında değişen tek bir başa sahip olduğu ve baş üzerinde küçük, sayıları 1-4 arasında olan diş benzeri yapılar bulunduğu belirlenmiştir (Şekil 2). Ayrıca kültür sarımsağı olarak kabul edilen Allium sativum'dan farklı olarak çiçeklenebilmekte ve tohum oluşturabilmektedir. Çiçek sapı Ankara koşullarında yetiştirildiğinde 60-130 cm uzunluğa ulaşabilmektedir. Çiçekleri açık mor renklidir. Meyveleri kapsül şeklindedir ve 1-2 mm çapında 3 köşeli ve üzeri buruşuk tohumları vardır [31]. Tunceli sarımsağı endemik ve koruma altına alınması gereken bir tür olmasına rağmen doğadan toplanarak tüketilmekte ve hatta yurt 1

dışına pazarlanmaktadır. Ülkemizde bulunan endemik türlerin doğadan sökümünü önleyici yasal düzenlemeler bulunmasına rağmen kontrol mekanizması çalışmamaktadır. Bu durum diğer bir çok türde olduğu gibi Tunceli sarımsağının da kısa süre içinde yok olmasına neden olacaktır. Tunceli sarımsağını kültüre almak amacıyla yürüttüğümüz bu çalışmada kültüre alma koşulları ortaya konmaya çalışılmıştır [32, 33]. Tunceli sarımsağı tohumlarıyla çoğaltılabilen bir tür olmasına rağmen yeni başların elde edilmesi 2-4 yılı alabilmektedir. Bilindiği gibi in vitro teknikler bitkilerin hızlı çoğaltılabilmesine yardımcı olmaktadır. Bu çalışmanın da amacı bir yandan bitkinin kültüre alma çalışmalarını yaparken bir yandan da bitkinin in vitro koşullarda daha kısa sürede ve yoğun çoğalabilme şansını belirlemektir. Şekil 2. Tunceli Sarımsağında (Allium Tuncelianum) a) Baş b) Baş Üzerindeki Dişçikler, c) Çiçeklenme ve Çiçekler, d) Tohum Taşıyan Saplar ve Tohumların Görünümü 2

2. KONU Ülkemizde, Tunceli ve Sivas çevreleri için endemik bir yabani sarımsak olarak tanımlanan Allium tuncelianum [1], doğadan toplanarak tüketilmektedir. Toplanma sonucu nesli tehlikede olan endemik türler arasında yer almaktadır. Tunceli sarımsağı tek dişli, üzerindeki kabukların arasında küçük diş benzeri oluşumlar bulunan, bilinen sarımsak tat ve aramasına sahip, diğerinden farklı olarak çiçeklenip tohum verebilen bir türdür [31]. Tek dişli olması, kabuk sayısının kültür sarımsağından az (1-2 adet) olması ve başların 18-20 C'de uzun süre saklanabilmesi gibi özellikleri nedeniyle tüketim amacıyla olduğu gibi, endüstride de kullanım şansı bulunmaktadır. Yörede de dağlardan toplanarak 'Kaya sarımsağı' adı altında satılmakta ve ticari mal olarak kullanılmaktadır [32], Endemik bir bitki ve koruma altında olması gerektiği belirtilen bir bitki olmasına rağmen Tunceli sarımsağının korunmasına ve kültüre alınmasına ilişkin bir çalışmaya rastlanmamıştır. Tunceli sarımsağının çoğalmasıyla ilgili olarak, doğal ortamında tek dişli başlar ürettiği ve yöreden temin edilen örneklerde yapılan gözlemlere göre başlar üzerinde henüz fonksiyonları tam olarak anlaşılmamış minik diş benzeri yapılar bulunduğu dışında bir bilgi bulunmamaktadır. Özhatay ve Şiraneci (1992) yaptıkları çalışmada bitkiyi 25-60 cm uzunluğunda çiçek sapı oluşturan, çiçeklenen ve kapsül şeklinde meyveye sahip olan, 1-2 mm çapında 3 köşeli ve üzeri buruşuk tohumlara sahip olduğunu belirtmişlerdir [1], Burada sunulan çalışma endemik ve kaybolmak üzere olan bir sarımsak türünün kültüre alınma koşullarını belirlemek, böylece hem yöre halkına bir gelir kapısı açmak hem de bitkiyi koruma altına almak amacıyla Birleşmiş Milletler Kalkınma Programı tarafından desteklenen bir proje kapsamında yürütülmüştür. 2.1 Yöntem Araştırma Kasım 2004-Mayıs 2006 tarihleri arasında yapılmıştır. Çalışmanın dezenfeksiyon ile ilgili kısımları Türkiye Atom Enerjisi Kurumu Sarayköy Nükleer Araştırma ve Eğitim Merkezi Tarım Birimi Doku kültürü laboratuarlarında, çoğaltma çalışmaları ise Ankara Üniversitesi 3

Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü sebze bahçesi ile bölüm doku kültürü laboratuarında yürütülmüştür. Araştırmada materyal olarak Tunceli-Ovacık ilçesi sınırları içinde bulunan Munzur Dağı eteklerinde yayılan sarımsak başları ile, bu bölgeden getirilip Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü deneme arazilerinde yetiştirilen başlar kullanılmıştır (Şekil 3). Tunceli'den başların temininde ortak proje yürütülen Ulaşılabilir Yaşam Derneği'nden (UYD) yardım alınmıştır. Şekil 3. Tunceli Sarımsağına (A. Tuncelianum) Ait Baş ve Dişçiklerin Görünümü Yapılan kaynak taramalarında A. tuncelianum'a özgü bir yayına rastlanmadığı için doku kültürü ile çoğaltma çalışmalarında son yıllarda kültür sarımsağında (A. sativum) başarılı olduğu belirtilen kök ucu kültürü, yaprak kültürü ve sürgün ucu kültüründen yararlanılmıştır. Bitki Parçalarının Hazırlanması: Doğadan toplanan Tunceli sarımsağı başlarında irilik yönünden bir örneklik görülmediğinden denemede orta irilikteki başlar kullanılmıştır [35]. Yapılan ön denemelerde materyalin bulaşık olmasının belirlenmesi nedeniyle (Şekil 4) bir seri dezenfeksiyon denemesi yapılmıştır. Dezenfeksiyon Denemeleri: Öncelikle 3 farklı dezenfeksiyon denemesi yapılmıştır. Bu denemelerde 7g/l agar, 30g/l sakkaroz katılmış ve ortam ph'sı 5.6'ya ayarlanmış MS besin ortamı kullanılmıştır. Her deneme için 25'er baş veya sürgün kullanılmasına özen gösterilmiştir. 4

Deneme 1: Materyal içinden temiz başlar seçildikten sonra kabuklu olarak tween 20 katılmış %10'luk sodyum hipoklorit solüsyonunda 10 dakika dezenfeksiyon yapılmış ve dezenfeksiyon sonrası başlar 3 defa steril suyla 5'er dakika süreyle çalkalanarak yıkanmıştır. Başların kabukları soyulduktan sonra %70'lik alkolde 30 saniye tutulan başlar saf su ile yıkanıp %25'lik sodyum hipokloritte 25 dakika süreyle dezenfeksiyon yapılmış ve 3 defa yıkanmıştır. Daha sonra her tüpe bir baş dikilecek şekilde dikilmiştir. Deneme 2: Temiz başlar kabukları soyulduktan sonra % 25'lik sodyum hipokloritte 15 dakika dezenfeksiyona tabi tutulmuştur. Deneme 3: Başlar % 1'lik sodyum hipoklorit içeren saf su üzerinde köklendirilmeye bırakılmıştır (Şekil 4). Şekil 4. Sarımsaklarda Görülen Enfeksiyon ve Saf Su + Sodyum Hipoklorit Uygulaması Denemelerde toplam 71 adet (Deneme 1: 24, Deneme 2: 25, Deneme 3: 22) baş kullanılmıştır. Bu denemelerin başarılı olmaması ve yapılan gözlemlerde başın depo yapraklarından salgılanan bir bileşiğin ortamı bulandırdığı, dolayısıyla enfeksiyonu uyardığının görülmesi üzerine yeni bir deneme serisi kurulmuştur. 5

Deneme 1: Enfeksiyon kaynağı olarak düşünülen başın etli depo yaprakları çıkartılmış sürgün gövdesi ortama dikilmiştir. Bu amaçla 40 adet temiz, yarasız beresiz baş seçilip kabuklu olarak % 10'luk sodyum hipokloritte 10 dakika, daha sonra yıkanıp kabukları çıkarıldıktan sonra % 25'lik sodyum hipokloritte 15 dakika olmak üzere 2 kez dezenfeksiyon yapılmıştır. Sürgün gövdeleri 6 g/l agar +30 g/l sakkaroz katılmış ve ph'sı 5.6'ya ayarlanmış olan MS ortamına dikilmiştir (Şekil 5). Deneme 5: Enfeksiyonun başın ortamla temas ettikten ve köklenme başladıktan hemen sonra başlaması nedeniyle hava köklendirme denemeleri ile enfeksiyonun engellenip engellenemeyeceğini ortaya koyabilmek amacıyla planlanan 5. denemede Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Deneme Bahçesi'nde yetiştirilen ve Tunceli'den getirilen temiz başlar seçildikten sonra kabuklu olarak %10'luk sodyum hipoklorit solüsyonunda 10 dakika dezenfeksiyon yapılmış, dezenfeksiyondan sonra başlar 3 defa steril suyla 5'er dakika çalkalanmış, başların kabukları soyulduktan sonra %70'lik alkolde 30 saniye tutulmuştur. Daha sonra saf su ile yıkanıp tween 20 katılan %25'lik sodyum hipokloritte 25 dakika dezenfeksiyon yapılmıştır. Dezenfeksiyondan sonra başlar 3 defa steril suyla yıkanmış ve 30 g/l sakkaroz, 6 g/l agar, ve antibiyotikli (1.5 mg/l) ve antibiyotiksiz ve ph'sı 5.6 'y a ayarlanmış MS ortamına 25'er tane depo yaprakları çıkarılmış sürgün gövdesi ters olarak dikilmiştir. Şekil 5. Sarımsakların Sürgün Uçlarının Dikim için Hazırlanması 6

Deneme 1: İki kez dezenfeksiyon uygulamasından sonra sürgünler 250, 350 ve 450 mg/l penicilin ve streptomisin antibiyotiklerini bulunduran ortamlara her biri 30'ar tüp olacak şekilde dikilmiştir. Kök Ucu Kültürü Denemeleri Kallusların Elde Edilmesi: 18 gün yaşlı bitkilerden alınan yaklaşık 5 mm uzunluğundaki kök uçları besin ortamına dikilmiştir [36]. Kök ucu dokularından hazırlanan kök parçaları her petride 4-5'er kök ucu olacak şekilde dikilmiş ve 25±1 C 'de karanlık koşullarda kültüre alınıp 1 ay sonra floresan ışığı altında 16 saat aydınlık/8 saat karanlık olacak şekilde kültüre alınmıştır. Kök ucu kültürü çalışmaları iki kez tekrar edilmiştir (Şekil 6). Şekil 6. Tunceli Sarımsağına (A. Tuncelianum) Ait 18 Gün Yaşlı Bitkiler ve Bu Bitkilerden Alınan Kök Uçları Besin Ortamı ve Kültür Koşulları: Kök ucu kültürü denemelerinde farklı oksin ve sitokinin dozlarının etkilerini belirlemek amacıyla Haque et al. 1997, Myers and Simon 1999'dan yararlanılmıştır [35, 36]. Tablo 1'de kök kültürü çalışmalarında kullanılan BA+2,4-D ve BÂ+NAA kombinasyonları verilmiştir. Tablo 1. Tunceli Sarımsağında (A. Tuncelianum) Kök ve Yaprak Kültürü Denemelerinde Kullanılan Temel Besin Ortamı ve Hormon Kombinasyonları BA (mg/l) 2,4-D (mg/l) NAA (mg/l) 0.0 0.0 0.0 0.1 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 MS (Murashige and Skoog 1962) temel besin ortamı, 30 g/l sakkaroz, 6 g/l agar, 500 mg/l antibiyotik (250 mg/l penicilin ve 250 mg/l streptomisin), ph 5.6 7

Yaprak Kültürü Denemeleri Başlar sürdürüldükten sonra 18 günlük bitkilerin yaprak parçaları Tablo 1'de verilen ortamlara dikilmiştir. Her kombinasyon için 5 petri ve her petriye 5'er yaprak dikilmiş ve petriler karanlık koşullarda kültüre alınmıştır. Dikimde kullanılan yaprakların sürgünün dip kısmına yakın kısımlarından alınmasına özen gösterilmiştir. Yaprak kültürleri dikimden 1 ay sonra ışık koşullarında ve 24 C'de alt kültüre alınmıştır. Yaprak kültürü denemeleri de 3 kez tekrarlanmıştır. Sürgün Ucu Kültürü Denemeleri Sürgün Ucu Kültürlerinin Kurulması: Dezenfeksiyonu yapılan başlar, binoküler mikroskop altında açılarak baş üzerindeki kabuk ve depo yaprakları kesilerek uzaklaştırılmış (Şekil 6), daha sonra 0.5-1.0 cm uzunluğunda 1-2 yaprak taslağı taşıyan büyüme konisi ile birlikte Tablo 2'de belirtilen ortamlara dikilmiştir [3, 4, 33, 10, 12, 34] (Şekil 7). Şekil 7. Sürgün Ucu Kültürü Denemelerinde Tüplere Dikilmiş Tunceli Sarımsağı Sürgün Uçları Tablo 2. Tunceli Sarımsağında (A. Tuncelianum) Sürgün Ucu Kültürü Denemelerinde Kullanılan Ortam ve Hormon Kombinasyonları 1. Deneme 2. Deneme BA (mg/l) NAA(mg/l) IAA(ma/l) BA(ma/l) NAA(mg/l) IAA(mg/l) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.05 0.1 0.1 0.01 0.1 0.1 0.1 0.5 0.5 0.025 0.5 0.5 MS (Murashige and Skoog 1962) temel besin ortamı, 30 g/l sakaroz, 6 g/l agar 500 mg/l antibiyotik (250 mg/l penicilin ve 250 mg/l streptomisin), ph 5.6 8

Her kombinasyon için kullanılan 8 tüpten 5 tanesine antibiyotik olarak 250 mg/l penicilin ve 250 mg/l streptomisin ilave edilmiş, 3'er tüpe de antibiyotikkatılmamıştır. Böylece başlangıçortamınakatılan antibiyotiğin, sürgün dikiminden sonra da etkisini devam ettirip ettirmeyeceği ortaya konulmaya çalışılmıştır. Dikimden 1 ay sonra elde edilen kardeşlerle 1. alt kültür denemeleri kurulmuştur. Daha sonra 2'şer hafta arayla 4 alt kültür yapılmıştır. Baş Oluşturma: Sürgünler, NAA (0, 0.1 mg/l), 30 g/l sakkaroz, 6 g/l agar katılmış ve ph'sı 5.6'ya ayarlamış MS (Murashige and Skoog 1962) besin ortamına dikilmiş ve daha önce belirtilen kültür koşullarına alınmıştır [4, 12]. Dikimden 1 ay sonra baş oluşturma oranı belirlenip baş oluşumu görülen sürgünler köklenme ortamına alınmıştır. Köklendirme: Baş oluşturmuş sürgünler ayrılarak NAA (0, 0.5, 1.0, 2.0 mg/l), 30 g/l sakkaroz, 6 g/l agar katılmış ve ph'sı 5.6'ya ayarlamış MS besin ortamı içeren tüplere dikilerek iklim odasına alınmıştır. Köklenme sonrası bitkiler torf doldurulmuş viyollere transfer edilip, aydınlatmalı, sıcaklığı 25 C'ye ayarlanmış iklim odasına aktarılmıştır. Dış Koşullara Alıştırma: Köklenme denemeleri sonunda elde edilen köklü bitkiler torf doldurulmuş viyollere dikilip, 1 ay iklim odasında bekletildikten sonra iklim odasından çıkartılarak açık havada yarı gölge ortama konulmuştur. 2.2 Çalışma Takvimi Kasım 2004 Materyalin Toplanması 2005 in vitro kültürlerin kurulması, tarla denemeleri 2006 in vitro kültürlerin kurulması, tarla denemeleri, sonuçların değerlendirilmesi 9

2.3 Bulgular Tüm denemeler 'Tesadüf Parselleri Deneme Deseni'ne göre kurulmuştur. Elde edilen veriler, SPSS istatistik paket programında analiz edilmiş ve elde edilen varyans analizlerine ait bulgular p=0.01 hata sınırları içinde değerlendirilmiştir. Buradan elde edilen bulgulara göre SPSS istatistik paket programından yararlanarak Duncan testi yapılmıştır. Ölçüm ve Değerlendirme Şekli Tüm denemelerde aşağıda belirtilen ölçüm ve değerlendirmeler yapılmıştır. Kardeşlenen Sürgün Sayısı (KSS): Ortamlara dikilen sürgünlerden kardeş verenlerin sayısı Kardeşlenme Oranı (KO%): Kardeşlenen sürgün sayısının dikilen sürgün sayısına oranı Toplam Kardeş Sayısı (KS): Kardeşlenen sürgünlerde meydana gelen kardeşlerin sayısı Ortalama Kardeş Sayısı (OKS): Kardeş sayısının dikilen sürgün sayısına oranı Baş Oluşturan Sürgün Sayısı (BOSS): Ortama dikilen sürgünlerde baş görülenlerin sayısı Baş Oluşum Oranı (BO %): Baş oluşumu görülen sürgünlerin dikilen sürgünlere oranı Köklü Bitkilerin Sayısı (KBS): Ortama dikilen başlı sürgünlerde köklenen bitkilerin sayısı Köklü Bitkilerin Oranı (KBO %): Köklenen bitkilerin dikilen başlı bitkilere oranı Köklenme Düzeyi: Kökler gelişme durumlarına ve kök sayısına göre derecelendirilmiştir [6]. Buna göre Kök sayısı 1-4 adet: zayıf (1), 5-7 adet: orta (2), 8 ve üzeri: iyi (3) olarak değerlendirilmiştir. 10

Sürgün Ucu Kültürü Denemeleri - Kardeşlenme Oranı Tunceli sarımsağında sürgün ucu kültürlerinde MS temel besin ortamında, NAA ve laa'in BA ile olan kombinasyonlarının kardeş oluşumuna etkisi ile ilgili varyans analizi sonuçlarına göre kardeşlenme oranı ve ortalama kardeş sayısı üzerine bitki büyüme düzenleyicilerin etkisi 0.01 hata sınırları içinde istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. Bu bakımdan BA+Oksin kombinasyonunda alt kültürlere göre elde edilen sonuçlar Tablo 3'de verilmiştir. Tablo 3'deki değerler incelendiğinde, 4 alt kültür sonunda tüm BA+NAA kombinasyonları için dikilen ve enfeksiyonsuz olan 55 sürgünden toplam 34 kardeş elde edilirken BA+IAA kombinasyonunda 56 sürgünden toplam 62 adet kardeş elde edilmiştir. En yüksek kardeşlenme oranı %76 ile 0.05 mg/l BA+0.1 mg/l IAA, %67 ile 0.1 mg/l BA ve 0.1 mg/l BA+0.1 mg/l NAA bulunan ortamlardan, %65 ile 0.05 mg/l BA+0.5 mg/l IAA, %56 ile 0.05 mg/l BA bulunan ortamdan alınmıştır. Bu kombinasyonlar arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmamıştır. Ortalama kardeş sayısı ise en fazla (1.0 adet) 0.05 mg/l BA+0.5 mg/l IAA bulunan ortam ile, (0.9 adet) 0.05 mg/l BA ile 0.05 mg/l BA+0.1 mg/l IAA bulunan ortam, 0.1 mg/l BA ve 0.1 mg/l BA+0.1 mg/l NAA bulunan ortamlardan elde edilmiştir (0.7 adet) (Şekil 3). İstatistiksel değerlendirme sonucunda bu ortamlar arasındaki fark önemli bulunmamıştır. 11

Tablo 3. Tunceli Sarımsağında BA+Oksin Kombinasyonlarının 4 Alt Kültür Sonucunda Toplam ve Bitki Başına Kardeş Sayısı ile Kardeşlenme Oranına Etkisi (%) AKS 1 2 3 4 Genel Toplam BA (mg/l) 0.0 0.05 0.1 0.0 0.05 0.1 0.0 0.05 0.1 0.0 0.05 0.1 0.0 0.05 0.1 DSS 8 8 8 6 14 7 4 16 5 4 16 6 6* 7* 6* 4* 10* 3* 4* 16* 5* 4* 16* 6* 4* 16* 6* KSS 0 4 1 0 3 2 0 0 1 0 2 0 0 9 4 0.0 NAA (mg/i) KO 0 57 17de 0 30 67 0 0 20de 0 13de 0 0 56 67 ab ab ab ab KS 0 7 1 0 6 2 0 0 1 0 2 0 0 15 4 OKS 0 1.0 a 0.2de 0 0.6 ab 0.7 ab 0 0 0.2de 0 0.1de 0 0 0.9 a 0.7 ab DSS 8 8 8 5 9 10 5 11 8 5 11 9 5* 6* 8* 5* 9* 6* 5* 11* 8* 5* 11* 9* 5* 11* 9* KSS 0 2 2 0 2 2 0 0 1 0 0 1 0 4 6 01 NAA (mgl) KO 0 33 25 0 22 33 0 0 13de 0 0 11de 0 36 67 cd cd ab KS 0 3 2 0 2 2 0 0 1 0 0 1 0 5 6 OKS 0 0.5 0.3 cd 0 0.2de 0.3cd 0 0 0.1de 0 0 0.1de 0 0.5 0.7 ab DSS 8 8 8 7 5 7 5 5 6 5 5 7 6* 5* 6* 5* 4* 6* 5* 5* 6* 4* 5* 7* 4* 5* 7* KSS 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 2 05 NAA (mgl) KO 17 de 0 17de 0 25 0 0 0 17de 0 0 0 25 20de 12de cd cd KS 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 2 OKS 0.2de 0 0.2de 0 0.3 cd 0 0 0 0.2de 0 0 0 0.3 cd DSS 8 8 8 2 8 10 1 12 10 1 17 11 2* 6* 8* 1* 8* 10* 1* 12* 10* 1* 17* 11* KSS 0 2 2 0 3 0 0 4 1 0 4 0 0 13 3 0.1 IAA (mgl) KO 0 33 25 0 38 0 0 33 10de 0 24de 0 0 76 27 cd a cd 0.2de 0.1de 1* 17* 11* KSS 0 2 2 0 4 0 0 5 1 0 5 0 0 16 3 OKS 0 0.3 0.3 cd 0 0.5 0 0 0.4 0.1de 0 0.3 cd 0 0 0.9 a 0.3 cd DSS 8 8 8 8 12 8 8 16 8 8 26 7 7* 7* 7* 6* 9* 7* 8* 16* 7* 8* 26* 7* 8* 26* 7* KSS 1 2 1 2 5 1 0 7 0 0 3 0 3 17 2 05 IAA (mgl) KO 14de 29 14de 33 56 14de 0 44 0 0 12de 0 38 65 29 cd ab ab ab cd KS 1 5 1 2 7 1 0 10 0 0 4 0 3 26 2 OKS 0.1de 0.7 ab 0.1de 0.3 0.8 ab 0.1de 0 0.6 ab 0 0 0.2de 0 0.4 DSS: Dikilen Sür. S,* Enfeksiyonsuz S, KSS: Kardeşlenen Sürgün S, KS: Kardeş S, KO: Kardeşlenme Or., OKS: Ortalama Kardeş Sayısı 1.0 a 0.3 cd 12

Şekil 8. a)tunceli Sarımsağında (A. Tuncelianum) Ana Sürgünden Oluşan Sürgünün Görünümü b) 0.05 mg/l BA + 0.5 mg/l IAA Kombinasyonunda Kardeşlenmenin Görünümü BA+Oksin kombinasyonları ve oksinsiz BA bulunan ortamlardan daha iyi sonuç alınmasına rağmen laa'in yüksek dozlarında bile (0.5 mg/l) BA'sız ortamlarda %38 oranında kardeşlenme rastlandığı ancak 0.05 mg/l BA+0.5 mg/l IAA kombinasyonunda bu oranın %65'e çıktığı görülmektedir. Sonuçlardan alt kültür sayısının artışıyla sürgün veriminin düştüğü görülmektedir. Yine BA içermeyen ortamlarda 0.0 ve 0.1 mg/l NAA'ın kardeş oluşumunu uyarmadığı görülmektedir. Sürgün ucu kültürlerinde altıncı haftadan itibaren sürgünlerde baş oluşumu meydana gelmiştir (Şekil 7). BA'in bulunduğu ortamlarda NAA'ın özellikle 0.0 ve 0.1 mg/l düzeylerinde sürgün oluşumu artmıştır. IAA bulunan ortamlarda ise aynı şekilde alt kültür sayısı arttıkça kardeşlenme oranı azalmış buna rağmen 3. alt kültürde bile %44 oranında (0.05 mg/l BA+0.5 mg/l IAA) kardeşlenme sağlanabilmiştir (Tablo 4). Sürgün ucu kültürü denemelerinde düşük oksin ve BA kombinasyonlarının daha etkili görünmesi nedeniyle düşük oksin ve BA kombinasyonları ile Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü deneme arazisinde yetiştirilen Tunceli sarımsağına ait başlar ile ikinci bir deneme kurulmuştur. Bu denemelerden alınan sonuçlar da Tablo 5'de verilmiştir. 13

Tablo 5'de görüldüğü gibi düşük oksin ve BA kombinasyonlarından da başarılı sonuçlar alınamamıştır. BA+Oksin kombinasyonları içinde en iyi sonuç % 29 ile 0.05 mg/l BA+0.1 mg/l IAA kombinasyonundan alınmıştır. Ancak diğer kombinasyonlarla arasında istatistiksel açıdan bir fark bulunmamıştır. Kardeşlenme görülen ortamlarda bitki başına kardeş sayısı 1 adet olarak belirlenmiştir. Mevcut sürgünlerle kurulan 1. alt kültür denemelerinde de sürgünlerde beyazlaşmaya rastlanmış, dolayısıyla sürgünler gelişememiştir. Şekil 9. Tunceli Sarımsağına (A. Tuncelianum) Ait Sürgünlerde 6. Haftadan Sonra Baş Oluşumu Baş Oluşumu Denemeler sırasında 2. alt kültürden itibaren sürgünlerin baş oluşturdukları görülmüştür (Şekil 5 ve Tablo 6). Alt kültür sayısı arttıkça bitkilerde baş oluşum oranı da artmıştır. Baş oluşum oranı bakımından hormonsuz ortam (%100) ile 0.1 mg/l NAA (%80) ve 0.1 mg/l BA+0.5 mg/l NAA, 0.1 mg/l BA+0.5 mg/l IAA (%71) bulunduran ortamlar iyi sonuç vermiştir. Bu ortamlar istatistiksel değerlendirmede aynı grup içerisinde yer almıştır. 4. alt kültür sonunda 146 bitkinin 48'inde baş oluşumu meydana gelmiştir (%30). Çalışmada BA+Oksin kombinasyonlarının sürgünlerde baş oluşumuna etkileri 0.01 hata sınırları içinde istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. 4 alt kültür sonunda baş oluşumu görülmeyen 101 adet sürgün baş oluşumu için hormonsuz ve 0.1 mg/l NAA bulunan ortamlarda kültüre alınmıştır (Tablo 7). 14

Tablo 4. Tunceli Sarımsağında Hormon Kombinasyonlarının 1. Alt Kültür Sonucunda Toplam Kardeş Sayısı, Bitki Başına Düşen Kardeş Sayısı ve Kardeşlenme Oranına Etkisi (%) Oksin BA (mg/l) 0.0 0.01 0.025 0.05 0.1 DSS 10 10 10 10 10 9* 9* 9* 9* 9* 0.0 KSS 0 0 0 1 1 KO % 0 0 0 11 ab 11 ab KS 0 0 0 1 1 DSS 10 10 10 10 10 8 7 7 7 9 0.1 KSS 0 0 0 0 0 KO % 0 0 0 0 0 NAA KS 0 0 0 0 0 (mg/l) 10 10 10 10 10 DSS 10 9 4 4 3 0.25 KSS 0 0 0 0 0 KO % 0 0 0 0 0 KS 0 0 0 0 0 DSS 10 10 10 10 10 7 6 5 8 5 0.5 KSS 0 0 0 0 0 KO % 0 0 0 0 0 KSS 0 0 0 0 0 DSS 10 10 10 10 10 8 7 9 7 8 0.1 KSS 0 0 0 2 0 KO % 0 0 0 29a 0 KS 0 0 0 2 0 10 10 10 10 10 DSS 7 7 8 4 3 IAA 0.25 KSS 1 0 0 0 0 (mg/l) KO % 14ab 0 0 0 0 KS 1 0 0 0 0 DSS 10 10 10 10 10 10 7 8 8 7 0.5 KSS 2 0 0 0 0 KO % 20a 0 0 0 0 KS 2 0 0 0 0 "Enfeksiyon Sonucu Kalan Bitki Sayısı, DSS: Dikilen Sürgün Sayısı, KSS: Kardeşlenen Sürgün Sayısı, TKS: Toplam Kardeş Sayısı, KO: Kardeşlenme Oranı 15

Tablo 5. Tunceli Sarımsağında BA+Oksin Kombinasyonlarının Baş Oluşumuna Etkisi AKS 1 2 3 4 Genel Toplam BA (mg/l) 0.0 0.05 0.1 0.0 0.05 0.1 0.0 0.05 0.1 0.0 0.05 0.1 0.0 0.05 0.1 0.0 NAA (mg/l) DSS 8 8 8 6 14 7 4 16 5 4 16 6 6* 7 6 4 10 3 4 16 5 4 16 6??4 16 6 BSS 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 3 4 0 3 BO % 0 0 0 100 a 0 0 0 0 0 0 0 50 100 a 0 50 0.1 NAA (mg/l) 0.5 NAA (mg/l) DSS BSS BO % DSS BSS 8 8 8 5 9 10 5 11 8 5 11 9 5 6 8 5 9 6 5 11 8 5 11 9 5 11 9 0 0 0 3 0 0 1 0 0 0 5 0 4 5 0 0 0 0 60 b 0 0 20 d 0 0 0 45 8 8 8 7 5 7 5 5 6 5 5 7 6 5 6 5 4 6 5 5 6 4 5 7 0 80 ab 45 0 4 5 7 0 0 0 0 0 2 0 0 0 2 2 3 2 2 5 BO % 0 0 0 0 0 33 cd 0 0 0 50 40 29 d 50 40 71 ab 0.1 IAA (mg/l) 0.5 IAA (mg/l) DSS BSS BO % DSS BSS 8 8 8 2 8 10 1 12 10 1 17 11 2 6 8 1 8 10 1 12 10 1 17 11 1 17 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 5 0 2 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 ef 8 8 8 8 12 8 8 16 8 8 26 7 7 7 7 6 9 7 8 16 7 8 26 7 45 0 12 ef 45 8 26 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 3 2 0 3 5 BO % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 13 ef 14 ef 0 12 ef 71 ab (DSS: Dikilen Sürgün Sayısı, BSS: Başlı Sürgün Sayısı, BO: Baş Oluşumu) "Enfeksiyon Sonucu Kalan Sürgün Sayısı 16

Şekil 10. Tunceli Sarımsağında Alt Kültürlerde Baş Oluşumu Kültüre alındıktan yaklaşık 1 ay sonra bütün bitkilerde baş oluşumu görülmüştür. Baş oluşturma ortamlarından hormonsuz ortam ile 0.1 mgl 1 NAA bulunan ortamlarda %100 baş oluşumu görülmüştür. Hormonsuz ortam ile 0.1 mg/l NAA bulunan ortamlar arasında baş oluşumu açısından bir fark görülmediği için hormonsuz ortamın sürgünlerde baş oluşumu için kullanılması tarafımızca önerilmektedir. Tablo 6. Tunceli Sarımsağına (Allium Tuncelianum) Ait Sürgünlerde Baş Oluşturma Ortamlarında Elde Edilen Sonuçlar DSS BOSS BOO (%) Baş oluşturma ortamı 0 0.1 mg/l NAA KBS KBO (%) DBS BOSS BOO (%) KBS 51 51 100a 19 37 50 50 100a 20 40 KBO (%) DSS: Dikilen Sürgün Sayısı, BOSS: Baş Oluşturan Sürgün Sayısı, BOO: Baş Oluşturma Oranı, KBS: Köklü Baş Sayısı, KBO: Köklü Baş Oranı) Köklenme Tablo 7'de Tunceli sarımsağında başların (48 adet) köklenmesi üzerine NAA dozlarının (0.0, 0.5, 1.0 ve 2.0 mg/l) etkileri görülmektedir. En 17

yüksek köklenme oranı %33 ile 2.0 mg/l NAA bulunan ortamdan alınmıştır (Şekil 8). Bunu %17 ile 0.5 mg/l NAA bulunan ortam izlemiştir. Bu ortamlar istatistiksel değerlendirmede aynı grupta yer almıştır. Hormonsuz ortamdaki sürgünlerde köklenme görülmemiştir. Köklenme ortamları birbirleriyle karşılaştırıldığında beklenen köklenmenin sağlanamadığı görülmüştür. Şekil 11. Tunceli Sarımsağında (A. Tuncelianum) Ait Başlı Sürgünlerde Köklenme Tablo 7. Tunceli Sarımsağına (A. Tuncelianum) Ait Başların Köklenmesi Üzerine NAA Dozlarının Etkileri NAA 0.0 0.5 mg/l 1.0 mg/l 2.0 mg/l DBS KBS KÖO DBS KBS KÖO DBS KBS KÖO DBS KBS KÖO 12 0 0 12 2 17ab 12 1 8b 12 4 33a DBS:Dikilen Baş Sayısı, KBS: Köklü Baş Sayısı, KÖ: Köklenme Oranı) Dış koşullara alıştırma Köklendirme denemeleri sonunda elde edilen köklü ve köksüz toplam 135 bitki torf doldurulmuş plastik kaplara dikildikten 1 ay sonra 33 bitkide kuruma görülmüştür. Kalan 119 bitki iklim odasından çıkarılıp açık havada yarı gölge ortama transfer edilmiştir. Dış ortama konulduktan 2 hafta sonra 34 bitkide kuruma görülmüştür. Geriye kalan 68 bitki ise gelişimini zayıf bir şekilde sürdürmüştür (Şekil 6). 18

Şekil 12. Tunceli Sarımsağında Dış Koşullara Aktarılmış In Vitro Bitkilerin 1 Ay Sonraki Görünümü Embriyo Kültürü Denemesi 7.02.2005 tarihinde başlatılan embriyo kültürü denemelerinde Tunceli sarımsağı tohumlarından çıkarılan 300 adet embriyo oksinsiz agar ortamına ekilmiş, ancak bunlardan sadece 18 adet yaşayan embriyo elde edilebilmiştir. Bu embriyolar 0.05 mgl" 1 BA ve 0.1 mgl" 1 IAA kombinasyonunda hazırlanmış ve 30 g/l sakkaroz, 6 g/l agar ve 250 mg/l antibiyotik katılmış ve ph'sı 5.6'ya ayarlanmış MS ortamına dikilmiştir. Dikimden 1 ay sonra elde edilen sonuçlar Tablo 8'de verilmiştir. Tablo 8'deki veriler incelendiğinde oksinsiz, 0.05 mg/l BA katılmış ortamlardaki sürgün sayısının, dolayısıyla da bitki başına sürgün sayısının daha yüksek olduğu görülmektedir. Sürgün denemelerinde olduğu gibi alt kültür sayısının artışıyla sürgün sayısı da azalma göstermiştir. Tablo 8. Tunceli Sarımsağına Ait Embriyoların Oksin ve Sitokinin Kombinasyonlarına Göre Kardeş Sayısı ve Kardeşlenme Oranı 0.05 mg/l BA 0.1 mg/l BA+0.1 mg/l IAA KS DES KS KS/B KO BSS KS KS/B KO 1 8 5 5/4 63 10 2 2/2 20 2 13 10 10/7 77 12 5 5/4 42 3 23 2 2/2 9 17 3 3/1 18 (KS: Kültür Sayısı DSS: Dikilen Sürgün Sayısı, TKS: Toplam Kardeş Sayısı, KO: Kardeşlenme Oranı) 19

Toplam 3 alt kültür sonucunda elde edilen sürgünler 3.05.2005 tarihinde Tablo 9'da belirtilen baş ve kök oluşturma ortamına aktarılmıştır. Tablo 9. Embriyo Kültüründen Elde Edilen Sürgünlerin Baş ve Kök Oluşturma Ortamlarındaki Durumu NAA (mg/l) Dikilen sürgün sayısı Baş oluşturma ortamı Baş oluşturan sürgün sayısı 0 12 12 0.1 16 16 NAA (mg/l) Köklenme ortamı Dikilen sürgün sayısı Köklenen sürgün sayısı 0 7 3 0.5 7 2 1.0 7 3 2.0 7 2 Tablo 9'da da görüldüğü gibi; ortama oksin katılmasa da dikilen sürgünlerin 3 hafta içinde baş oluşturabildikleri, baş oluşumu yönünden bir sorunun bulunmadığı belirlenmiştir. Ancak köklenme için aynı şeyleri söylemek mümkün olmamaktadır. 4 hafta süreyle yapılan köklendirme denemeleri sonucunda oksin olarak köklendirme ortamına katılan NAA'nın etkili olmadığı ve köklenme oranının % 43 civarında kaldığı anlaşılmaktadır. Köklendirme denemelerinden alınan köklü sürgünler dış koşullara alıştırmak amacıyla torf ile doldurulmuş kaplara dikilip 1.07.2005 tarihinde iklim odasına alınmıştır. Dış koşullara alıştırılan bitkilerin gelişiminin ise zayıf olduğu gözlenmiştir. 20

3. SONUÇ Araştırma sürecinde kök ucu kültürü çalışmalarından olumlu sonuç alınamamıştır. Sürgün ucu denemelerinde ise toplam 4 alt kültür sonucunda, ayrıca NAA uygulamalarında ise en yüksek kardeşlenme oranı %67 ile 0.1 mg/l BA ve 0.1 mg/l BA+0.1 mg/l NAA bulunan ortamlardan ve %56 ile 0.05 mg/l BA bulunan ortamdan alınmıştır (Tablo 3). Ortalama kardeş sayısının 1 olduğu belirlenmiştir. Hormonsuz ortamlarla 0.1 mg/l NAA bulunduran ortamda kardeş oluşumu görülmezken altıncı haftadan itibaren sürgünlerde baş oluşumu meydana gelmiştir. laa'lı ortamlarda da en yüksek kardeşlenme oranı % 76 ile 0.1 mgl -1 BA+0.1 mgl 1 IAA kombinasyonundan alınmış, oksinin hiç bulunmadığı ortamlar daha iyi sonuç vermiştir. Ortalama kardeş sayısı yönünden oksinler arasında fark görülmemekle birlikte, laa'lı ortamlarda gelişmenin daha sağlıklı olduğu görülmüştür. Deneme sonuçlarımıza göre Tunceli sarımsağının çoğaltma katsayısının düşük olduğu (ortalama 1 sürgün), düşük oksin dozlarının düşük BA dozlarıyla birlikte daha iyi sonuç verdiği, baş oluşturma yönünden bir sorun bulunmadığı, oksinsiz ortamların köklenme için yeterli olduğu, ancak çok az köklenen sürgünlerin bile toprağa şaşırtılma durumunda adaptasyon güçlerinin yüksek olduğu, bununla birlikte BA ve laa'nın düşük dozlarının önerilebileceği sonucuna varılmıştır. 21

KAYNAKÇA 1- Özhatay, N., Şiraneci, Ş. (1992) Comperative morphological, anatomical and priliminary chemical studies on two subspecies of Allium macrochaetum Boiss. et a Houssin in Turkey. İstanbul eczacılık Fakültesi Mec. 26-28, 31 (1990-1992). 2- Özhatay, N.Mathew, B., Şiraneci, Ş. (1995). Kew Bull. 50(4): 723. 3- Abo El Nil. (1977). Organogenesis and embryogenesis in callus cultures of garlic (Allium sativum L.). Plant Science Letters, 9: 259-264. 4- Bhojwani, S. S. (1980). In vitro propagation of garlic by shoot proliferation. Scientia Horticulturae, 13:47-52. 5- Martin-Urdiroz, N., Garrido-Gala, J., Martin, J. and Barandiaran, X. (2004) Effect of light on the organogenic ability of garlic roots using a one- step in vitro system. Plant Cell Report. 22: 721-724. 6- Gülşen, Y. ve Yanmaz, R. (1995). Allium sativum (sarımsak) ve Allium longicuspis (yabani sarımsak) türlerinin doku kültürü yöntemi ile çoğaltılması. Ankara Üniversitesi Araştırma Fonu Projeleri Sonuç Raporu, Proje No:87-11-01-02 7- Matsuda, Y. and Adachi, T. (1996). Plant regeneration via embryogenesis in commercial cultivars of Chinese Chive (Allium tuberosum Rottl.). Plant Science, 119:149-156. 8- Haque, M. A., Nath, U. K Ahmad, Q. N. and Alam, S. (2003) Effect of 2,4-D and BAP on in vitro regeneration of garlic. Online Journal of Biological Sciences. 2(12):771-774. 9- Myers, J.M. and Simon, P.W.(1998). Continuous callus production and regeneration of garlic (Allium sativum L.) using root segments from shoot tip-derived plantlets. Plant Cell Reports, 17:726-730. 10-Garcia, E. and Vargas, T. (2000). Micropropagation clonal masivade variedades de ajo (Allium sativum) con fines comerciales. Memorias del X. Congreso Halo Latinoamericano de Etnomedicina, 217-218. 22

11-Fereol, L., Chovelon, V., Causse, S., Michaux-Ferriere, N. and Kahane, R. (2002). Evidence of a somatic embryogenesis process for plant regeneration in garlic (Allium sativum L.). Plant Cell Report, 21(3), 197-203. 12-Roksana, R., Alam, M. F., Islam, R. and Hossain, M. M. (2002). In vitro bulblet formation from shoot apex in garlic (Allium sativum L.). Plant Tissue Culture, 12(1): 11-17. 13-Humberto, I. O., Yovany, Q. O., Rosalina, D. C., Dolores, P. A., Maria, C. G., Sergio, G. S.and Olimpia, G. C. (2004). Micropropagation Del Ajo (Allium sativum L.). Alimentaria, 65. 14-Martin-Urdiroz, N., Garrido-Gala, J., Martin, J. And Barandiaran, X. (2004). Effect of light on the organogenic ability of garlic roots using a one-step in vitro system. Plant Cell Report. 22: 721-724. 15-Xue, H. M., Araki, H. and Yakuwa, T. (1991). Varietal difference of embryogenic callus induction and plant regeneration in garlic (Allium sativum L.). Plant Tissue Culture Letters, 8(3): 166-170. 16-Ayabe, M. and Sumi, S. (1998). Establishment of a novel tissue culture method, stem-disc culture and its practical application to micropropagation of garlic (Allium sativum L.). Plant Cell Reports, 17: 773-779. 17-Sata, S. J., Bagatharia, S. B. and Thaker, V. S. (2001). Induction of direct somatic embryogenesis in garlic (Allium sativum). Methods in Cell Science, 22:229-304. 18-Kim, S. S., Guo, D. P., Jung, D. C. and Kwon, S. T. (2003). Multiple shoots regeneration and in vitro bulblet formation from garlic callus. Journal plant Biotechnology, 5(2): 95-99. 19-Kim, E. K Hahn, E. J., Murthy, H. N. and Paek, K. Y. (2003). High frequency of shoot multiplication and bulblet formation of garlic in liquid cultures. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 73:231-236. 20-Song, P. and Peffley, E. B. (1994). Plant regeneration from suspension cultures of Allium fistulosum and an Allium fistulosum x Allium cepa interspecific hybrid. Plant Science, 98:63-68. 21-Saker, M. M. (1997). In vitro regeneration of onion through repetitive somatic embryogenesis. Biologia Plantarum, 40(4):449-506. 23

22-Buiteveld, J., Fransz, P. F. and Creemers-Molenaar, J. (1994). Induction and characterization of embryogenic callus types for the initiation of suspension cultures of leek (Allium ampeloprasum L.). Plant Science 100: 195-202. 23-Park, S. S. and Guen, H. (1994). Effect of temperature pretreatment, growth regulators and antibiotic treatments on anter cultures of various cultivars of garlic (Allium sativum L.). J. Kor. Soc. Hort. Sci, 35(4): 337-344. 24-Yanmaz, R., Beşirli G., Uzun Y., yazar E, Kantoğlu Y, Alper A, Ermiş S. (2006). Tunceli sarımsağını (Allium tuncelianum (Kollman) özhatay, matthew, Şiraneci) kültüre alınma çalışmaları. VI. Sebze tarımı Sempozyumu, Kahramanmaraş, 29-33. 25-Baktır, İ. (2005). Tunceli sarımsağı (Allium tuncelianum)'nın In Vitro koşullarında çoğaltılması. GAP IV. Tarım Kongresi, 21-23 Eylül 2005, 26-Murashige, T. and F.Skoog. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plantarum 15: 473-497. 27-Özhatay, N. (2002). Diversity of bulbous monocots in Turkey with special reference chromosome numbers. Pure apple chem., Vol 74, No: 4, pp 547-555. 28-Mukhopadhyay, J., Sengupta, P., Mukhopadhyay, S., Sen, S. (2005). In vitro stable regeneration of onion and garlic from suspension culture and chromosomal instability in solid callus culture. Scientia Horticulturae, 104:1-9 29-Koyuncu, M., Güvenç A. (1994) Türkiye'nin endemik Allium L. (soğan) türleri. TÜBİTAK Projesi (Proje No: TBAG-1089), Sonuç Raporu, Ankara. 30-Alper, A. (2005) Tunceli sarımsağının (Allium tuncelianum Kollman, Özhatay, Marhew, Şiraneci) bitkisel özelliklerinin belirlenmesi. Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, Ankara. (Tezsiz Yüksek Lisans Tezi), 16 s. 31-Anonim, (2003) Tunceli sarımsağının (Allium tuncelianum) kültüre alınması, www. Undp.org./sgp/cty/EUROPA/TURKEY/ov.htm. 24

32-Yanmaz, R ve Ermiş, S. (2005) Tunceli sarımsağı (Allium tuncelianum Kollman, Özhatay,. Matthew, Şiraneci)) tohumlarındaki çimlenme probleminin çözülmesi üzerinde araştırma. Türkiye II. Tohumculuk Kongresi Bildiri ve Poster Kitabı, 101-106. 33-Gülşen, Y. ve Yanmaz, R. (1995) Allium sativum (sarımsak) ve Allium longicuspis (Yabani sarımsak) türlerinin doku kültürü yöntemi ile çoğaltılması, (yayınlanmamış). 34-Haque, M. A., Nath, U. K Ahmad, Q. N. and Alam, S. (2003). Effect of 2,4-D and BAP on in vitro regeneration of garlic. Online Journal of Biological Sciences, 2(12):771-774. 35-Myers, J.M., Simon, P.W. (1999) Regeneration of garlic callus as affected by clonal variation, plant growth regulators and culture conditions over time. Plant Cell Reports 19: 32-36. 25

YAYIN BİLGİ FORMU Rapor Bilgileri 2.Rapor Başlığı TUNCELİ SARIMSAĞININ (Allium tuncelianum (Kollman)) I ÇOĞALTMA OLANAKLARININ ARAŞTIRILMASI 4. Yazarlar I VITRO Dr. Yaprak KANTOĞLU, Prof. Dr. Ruhsar YANMAZ, Ezgi YAZAR, Aslı ALPER 6. Çalışmayı Yapan Birim SANAEM Uygulama Bölümü, Tarım Birimi 7. Destekleyen veya Ortak Çalışılan Kuruluşlar Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi 8. Özet 1.Yayın Yılı/No 2011/13 3.Yayın Kurulu Tarih (Gün/Ay/Yıl)-No 21.07.2009-3 5-Yayın Türü Teknik Rapor Bu araştırma 2004-2006 yılları arasında, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü ve Türkiye Atom Enerjisi Kurumu Sarayköy Nükleer Araştırma ve Eğitim Merkezi, Tarım Birimi laboratuarlarında yürütülmüştür. Araştırmada endemik bir tür olan Tunceli sarımsağının, in vitro koşullarda kök, yaprak ve sürgün ucu kültürü yöntemleriyle hızlı çoğaltabilme olanaklarını belirlemek hedeflenmiştir. Denemelerde, MS besin ortamı kullanılmış, kök ve yaprak kültürlerinde BA'nın 0, 1.0 ve 2.0 mg 1 ), 2,4 D ve NAA'nın 0, 1.0 v2 2.0 mg 1 'lik dozları ile olan kombinasyonları kullanılmıştır. Sürgün ucu kültürlerinde ise BA'nın 0, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1 mg 1 dozları ile NAA ve laa'nın 0, 0.1 ve 0.5 mg 1 'lik dozları denenmiştir. Kök ucu ve yaprak kültürü çalışmalarında köklerden ve yapraklardan kallus oluşumu sağlanamamıştır. 0.1 mg/l BA ile 1.0 mg/l NAA bulunan ortamda hatif kallus başlangıcı görülse de daha sonra hiçbir gelişme görülmemiştir. Gerek kök ucu kültürü ve gerekse yaprak kültürü yoluyla Tunceli sarımsağı'nda sürgün çoğaltma başarısız olmuştur. Sürgün ucu kültürü çalışmasında sürgün uçlarının dikiminden yaklaşık 1 ay sonra kardeş oluşumu başlamış, 1. alt kültür sonunda en fazla kardeş oluşumu (% 100) 0.05 mg/l BA bulunan ortamdan alınmıştır. Bunu (% 71) 0.05 mg/l BA+0.5 mg/l IAA bulunan ortam izlemiştir. Dört alt kültür sonunda ise en yüksek kardeşlenme oranı (% 57) 0.05 mg/l BA+0.5 mg/l IAA bulunan ortam ile (% 43) 0.05 mg/l BA bulunan ortamdan alınmıştır. Kardeşlenme yönünden laa'in NAA'e göre daha başarılı olduğu NAA'in ise sürgünlerde baş oluşumunda daha etkili olduğu bulunmuştur. Alt kültür sayısı artıkça sürgünlerde baş oluşumu artmıştır. Sürgün başına ortalama 2-3 adet kardeş elde edilmiştir. Araştırma sonucunda en etkili ortamın 0,01 mgl 1 BA ve 0,01 mgl 1 IAA içeren besin ortamı olduğu belirtilmiştir. 9. Anahtar Kelimeler Sarımsak, Tunceli Sarımsağı, In Vitro Çoğaltma 10. Gizlilik Derecesi Tasnif Dışı GİZLİLİK DERECELERİ TASNİF DIŞI (UNCLASSIFIED): içerdiği konu itibarıyla, gizlilik dereceli bilgi taşımayan, ancak devlet hizmetiyle ilgili bilgileri içeren evrak, belge ve mesajlara verilen en düşük gizlilik derecesidir. HİZMETE ÖZEL (RESTRICTED): içerdiği konu itibarıyla, gizlilik dereceli konular dışında olan, ancak güvenlik işlemine ihtiyaç gösteren ve devlet hizmetine özel bilgileri içeren evrak, belge ve mesajlara verilen gizlilik derecesidir. ÖZEL (CONFIDENTIAL): içerdiği konu itibarıyla, izinsiz olarak açıklandığı takdirde, milli menfaatleri olumsuz yönde etkileyecek evrak, belge ve mesajlara verilen gizlilik derecesidir. GİZLİ (SECRET): izinsiz açıklandığı takdirde, milli güvenliği, milli prestij ve menfaatleri ciddi ve önemli bir şekilde zedeleyecek olan evrak, belge ve mesajlara verilen gizlilik derecesidir.