Rutinde Mantar Enfeksiyonlarına Laboratuvar Yaklaşımı; Serolojik ve Moleküler Yöntemler Dr. M. Ali SARAÇLI ARALIK 2012
Serolojik tanı Moleküler tanı Annelerin hayali 2/29
MİKOLOJİDE SEROLOJİ Kültür tanımlamasının doğrulaması Ekzoantijen testleri İnvitro serolojik tanı EIA, LA, KF, Kart test Antijen testleri: Çapraz reaksiyonlar Klirens Antikor testleri: İmmün baskılanmış/ yetmezlik durumları, flora, kolonizasyon Cins/türler arası antifungal duyarlılık farkı Epidemiyolojik bilgi kaynağıdır 3/29
Ekzoantijen testi İmmünodifüzyon testidir; Kültürü yapılan hücrelerinden elde edilen antijenler Mantar türüne özgün saflaştırılmış antikorlar Presipitin bandı oluşumu araştırılır Sınıf II güvenlik kabini içinde gerçekleştirilmelidir (Coccidioides!!!!) Yorumlama - presipitin bandlarının; Tam olarak karşılaşıp uç uca birleşmesi: Tam uyum Biri diğerini çaprazlayacak şekilde karşılaşması: Çapraz reaksiyon 4/29
Ekzoantijen testi R: Antikor A: Antijen EX: Kültür ekstresi Histoplasma, Blastomyces ve Coccidioides üçlü test http://www.mycology.adelaide.edu.au/virtual/2006/id2-may06.html 5/29
Ticari Ekzoantijen test sağlayıcıları Immunomycologics: Exo Antigen identification system Histoplasma, Coccidioides, Blastomyces Meridian Diagnostics: İmmünodifüzyon plakları 6/29
IN VITRO SEROLOJİK TANI Kriptokokkoz Aspergilloz Kandidoz Histoplazmoz Koksidioidomikoz Blastomikoz Parakoksidioidomikoz Sporotrikoz 7/29
KRİPTOKOKKOZ Antijen saptama (polisakkarit) EIA, lateks aglutinasyon, kart test kitleri Serum/BOS; >%90 duyarlılık ve özgüllük BOS(+) ise EORTC/MSG proven İnvaziv Fungal Hastalık Tanıda kullanılışlı, ancak tedaviye yanıt saptamada güvenilmez Yalancı pozitif/negatif durumlarda: Tekrar test, kültür yapılması Antikor saptama EIA Serum Sadece epidemiyolojik açıdan önemli Pastorex Crypto plus (BioRad) 8/28
ASPERGİLLOZ Antijen saptama (Galaktomannan) Galaktomannan 1 5-β-d-galactofuranose yan zincirine karşı mab Yalancı pozitiflik: Bifidobacterium,, küfler (Penicillium Penicillium, Fusarium, Alternaria, Mucorales, Paecilomyces, Geotrichum, Histoplasma) Piperasilin-tazobaktam vb. beta laktam/kombinasyonlar (tek doz kesilince 2h, çok dozda 1-5 günde negatifleşir) Gıdalar (makarna, tahıllar Barsak hasarı Erişkin %2.5, çocuk %10, yeni doğan %83 Aspergillus türlerinin antijen saçmalrı birbirinden farklı İnvaziv aspergilloz riskinde haftada 2 test BAL: Kolonizasyona bağlı olarak %3-19 yalancı pozitiflik Antikor saptama İmmunodifüzyon ve KF (IMMY Diagnostics) 9/28
Galaktomannan antijen testi EORTC/MSG probable IFH kriteri BAL/Serum: CI 0.5 BAL (Invaziv Pulmoner Aspergilloz): CI =?; CI=1.1 özgüllük %98.1 98.1, duyarlılık %100* Negatif prediktif değeri >PPV (%92-99/ %17-59; çocuklarda ) >200 Aspegillus türü, A.terreus!! GMI 5-9 günde normale dönenler GMI pozitif kalan ve artanlar (eşik üzerine + 1.0) Platelia Aspergillus Ag, BioRad * Li Yang Hsu et al. BMC Infectious Diseases 2010, 10:44 10/29
Antijen saptama Muhtelif antijenler KANDİDOZ Mannan, 230-250 250 kda luk germ tüp duvar mannoproteini, Blastospor duvarı, Miçelyum duvarı, 54 kda luk sitoplazmik antijen, 52 kda luk metalloprotein, Sekrete edilen aspartil proteinaz, Enolaz, Isı labil antijen Transient antijenemi sorun ~180 Candida türü / C.glabrata, Ckrusei, C.lusitaniae, Platelia Candida Ag plus (BioRad) Duyarlılık %50-94 << Özgüllük %76-96 (9 makale) Antikor saptama İmmunodifüzyon (IMMY Diagnostics) EIA-Platelia Candida Ab plus (Bio-Rad) Rad) 11/28
Antijen saptama HİSTOPLAZMOZ İnvaziv histoplazmozda idrarda >%90, serumda >%75 pozitif EORTC/MSG Probable İFH (BOS, idrar, kan) blastomikoz, koksidiyoidomikoz, penisilloz, parakoksidiyoidomikoz ile çapraz reaksiyonlar Duyarlılık %75-90, özgüllük %98 * Antikor saptama H (akut faz) ve M (tüm fazlar) antijenlerine karşı EIA, ID, KF * Wheat, L.J. 2003. Trends Microbiol. 11:488-94 12/28
KOKSİDİOİDOMİKOZ Antijen saptama EIA Ticari değil P.brasiliensis ile çapraz reaksiyon Serum ve idrar örnekleri Antikor saptama EIA, KF, ID, LA kitleri mevcut EORTC/MSG Proven İFH; BOS veya 2x serum EIA duyarlılık%95.5, özgüllük %98.5* Premier EIA, Meridian Diagnostics Coccidioides DxSelect, Focus Diagnostics * J Clin Microbiol. 1995, 33:940 3 13/29
Antijen saptama Serum ve idrar BLASTOMİKOZ ARUP reference laboratories (Utah/ABD) MiraVista Blastomyces antigen EIA EIA duyarlılık idrar(%93.5*, %92.9**), serum (%87*, %79.3**) Antikor saptama A ve WI-1 antijenlerine karşı antikor aranması: EIA, immunodifüzyon, KF (IMMY Diagnostics) Duyarlılık %90-100, özgüllük %98 8-15 µm * Spector D. et al. J Vet Intern Med 2008;22:839 843 ** Durkin, M. et al. 2004. J. Clin. Microbiol. 42:4873-4875 14/29
PARAKOKSİDİOİDOMİKOZ Antijen saptama Gp43 ve gp70 antijen testleri Antikor saptama İmmünodifüzyon (IMMY Diagnostics) EORTC/MSG Proven İFH, 2x serum 15/29
SPOROTRİKOZ Antikor testi Lateks aglutinasyon (IMMY Diagnostics) 16/29
BETA-D GLUKAN TESTİ ß-D glukan, zigomiçetler ve kriptokoklar hariç mantar duvarının bileşeni EORTC/MSG Probable İFH kriteri Limulus testi (koaglütinasyon) prensibi ile çalışır <60 pg/ml negatif; 80 pg/ml pozitif Duyarlılık %52-100, özgüllük %45-100*, NPV>%95** Ig infüzyonu, hemodiyaliz, gram pozitif bakteremi, kandida kolonizasyonu, pip/tazobak. vb. yalancı pozitiflik nedeni Tür tanısına olanak vermez!!! horseshoe crab beyaz kan hücreleri * Clin Infect Dis. (2011) 52 (6): 750-770. * * J Clin Microbiol (2005) 43 (12): 5957-62 17/28
MOLEKÜLER TANI Sekans tabanlı moleküler tanımlama ITS büyük alt birim rdna dizileme mtdna Hibridizasyon tabanlı moleküler tanımlama DNA array Accu-probe (Kültur tanımlamanın doğrulaması) PCR tabanlı moleküler tanımlama Henüz ticari değil 18/29
Sekans tabanlı tanımlama MicroSEQ D2 LSU rdna Fungal Identification Kit rrna büyük alt birim D2 bölgesi >1000 türü içeren veri tabanı 24 saatten kısa sürede sonuç alma Ticari olmayan ITS, SSU ve LSU rdna ve mtdna dizi analiz çalışmaları ÇOK SAYIDA 5 3 1.3 kb 0.7 kb 3.4 kb 3.2 kb SSU LSU IGS 18 S rrna ITS1 5.8 S ITS2 28 S rrna ETS2 ETS1 IGS: Intergenic spacer ITS: Internal Transcribed Spacer ETS: External Transcribed Spacer Iwen PC et al. Medical Mycology, 2002, 40:87-109. 19/29
DNA array Hibridizasyon Tabanlı Fungi 2.1 (Chipron) Tanımlama Nanochip (Savyon Diagnostics) DNA ekstraksiyonu PCR - hibridizasyon Accuprobe (Gen-probe) Kültürden rrna ekstraksiyonu - Hibridizasyon 20/29
CHIPRON FUNGI 2.1 Aspergillus fumigatus, flavus, niger, nidulans, terreus, versicolor Candida albicans, dubliniensis, glabrata, guilliermondii, kefyr, krusei, lambica, lusitaniae, parapsilosis, tropicalis, pelliculosa Mucor circinelloides, Rhizomucor pusillus, Absidia corymbifera Rhizopus microsporus, oryzae, stolonifer Cryptococcus neoformans Paecilomyces variotii Scedosporium prolificans 30 test spotu x 2 2012 Maliyetleri 32 test 2.850 TL Test Sistemi: 14.000 TL. Okuyucu. Yazılım. Santrifüj ATQ Biyoteknoloji Tel : 0312 4964319 21/29
NanoChip Savyon Fungal paneli henüz YOK Savyon Diagnostics Bakteri/parazit paneli genişliyor Mikrobiyoloji paneli 2013 de Türkiye de 22/29
Gen-probe e (Accuprobe) testi Sadece kültür doğrulama testi (C. immitis, H. capsulatum ve B. dermatitidis) Hücrelerde yüksek miktarda bulunan rrna nın saptanması temeline dayanmaktadır Floroflor ile işaretlenmiş özgün DNA probu test izolatının rrna sı ile türe spesifik olarak hibridize olur Erken ve zayıf üremede, kontamine üremede kullanılabilir AccuProbe (Gen-Probe Inc., San Diego, CA) adı altında kit olarak pazarlanmaktadır. 23/29
PCR TABANLI MOLEKÜLER TANI 24/29
Aspergillus PCR 200 den fazla tür barındıran Aspergilus cinsi/60 tür önemli PCR testleri 20 yılı aşkın süredir kullanımda-ticari ürün YOK Standardize değil [European Organization for Research and Treatment of Cancer and the Mycoses Study Group (EORTC/MSG) un invasiv fungal hastalık tanı kriteri değil] International Society for Human and Animal Mycoses (ISHAM) ın European Aspergillus PCR Initiative (EAPCRI) çalışma grubu standardizasyon için uğraşıyor. DNA ekstraksiyon safhasında sorunlar mevcut. Yüksek kan hacmi kullanımı, DNA nın küçük hacimde çözülmesi öneriliyor * Konidiya eklenmiş serum gerçeği yansıtmıyor (hifal angioinvazyon-multinükleer!!!) * J CLIN MICROBIOL (2010), 48(4):1231 40 25/29
Candida PCR 170 den fazla tür barındıran Candida cinsinde 20 kadar tür sıklıkla izole edilmektedir Ticari ürün veya üzerinde uzlaşı sağlanmış PCR protokolu YOK Real-time PCR, multipleks PCR, erime eğrisi analizleri ve PCR-RFLP RFLP gibi yöntemler ile tür tanımlaması yapılıyor 26/29
PCR ÇALIŞMALARI DNA ekstraksiyonunda sorunlar Etkinlik Standardizasyon Çok kopya genlerin kullanılması duyarlılığı Tür çeşitliliği- multipleks yaklaşımlar sınırlı katkı Kolonizan/enfekte eden/kontaminan ayırımı zor 27/29
KÜTLE SPEKTROMETRİ Matrix Assisted TOF tüpü Laser Matriks Desorbtion Ionisation I Time Dedektör Spektrum analizi Of Flight 28/28
Mantarlarda MALDI-TOF Kalın hücre duvarı sorun oluşturabilir Küflerde doğrudan kültürden çalışma yerine; sıvı besiyeri kültürü 95 o C de inkübasyon cam boncuklarla parçalama Sıcaklık ve besiyeri içeriği gibi kültür şartları protein ekspresyon profilini etkiler 29/29