Biyofilm infeksiyonlar ve antibiyotik direnci

DERLEME Hacettepe T p Dergisi 2008; 39:82-88 Biyofilm infeksiyonlar ve antibiyotik direnci Hatice Uluda Altun 1, Burçin fiener 2 1 Araştırma Görevlisi, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara 2 Prof. Dr., Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara ÖZET Biyofilmler; kateterler, eklem ve kalp protezleri gibi kalıcı ya da kalıcı olmayan tıbbi araçları veya kistik fibrozis gibi bazı hastalıklarda solunum yollarını kolonize eden bakterilerin oluşturduğu bir mikroorganizma topluluğudur. Koagülaz-negatif stafilokoklar, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ve Candida türleri tıbbi araçlarla ilişkili infeksiyonlarda en sık görülen ajanlardır. Kalıcı tıbbi araçlar veya hasarlı dokuya yapışan bakteriler, polisakkarid ve proteinden oluşan sulu bir matriks içinde çoğalır ve biyofilm olarak adlandırılan kaygan bir tabaka oluşturur. Biyofilm içindeki bakteriler ayrıca biyofilme özgü bir fenotip oluşturacak şekilde fizyolojik, metabolik ve fenotipik değişikliklere uğrar. Biyofilm içine antibiyotiğin düşük orandaki penetrasyonu, burada besin maddelerinin sınırlı olması, yavaş üreme ve adaptif stres yanıtının oluşu, bakterinin çok aşamalı savunmasını oluşturmaktadır. Biyofilmin oluşturduğu direnç, biyofilm popülasyonu içindeki fenotipik varyantların ortaya çıkması, genel stres cevabının uyarılması, atım pompalarının ve Quorum-sensing sistemlerinin etkin hale gelmesini kapsamaktadır. Bu derlemede biyofilm infeksiyonlarından örnekler verilerek biyofilm yapısı ve biyofilm ortamında gelişen antibiyotik direncinden söz edilecektir. Anahtar Kelimeler: Biyofilm, antibiyotik direnci. ABSTRACT Biofilm infections and antimicrobial resistance Biofilms which are characterized as a population of microorganisms that attach to living or nonliving devices, may develop on indwelling medical devices such as joint prostheses, artificial heart valves, or catheters, besides in the airways of patients with some pulmonary diseases like cystic fibrosis. Coagulase-negative staphylococci (CNS), Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Candida spp. are the most common causative agents of infections associated with medical devices. Bacteria which adhere to implanted medical devices or damaged tissue can multiply in a hydrated matrix of polysaccharide and protein, and form a slimy layer called as a biofilm. Bacteria in the biofilm may undergo physiological, metabolic and phenotypic changes leading to a biofilm-specific phenotype. In biofilms, poor antibiotic penetration, nutrient limitation, slow growth and adaptive stress responses constitute a multi-layered defense. Resistance to antimicrobial agents in the biofilm matrix may be attributed to the emergence of phenotypic variants within the biofilm population, induction of the general stress response, activation of efflux pumps and quorum-sensing systems. In this review biofilm infections, biofilm development and biofilm-antimicrobial resistance concepts have been discussed in the light of current literature. Key Words: Antibiotic resistance, biofilm. 82 H ACETTEPE T IP D ERG S

Biyofilm infeksiyonlar ve antibiyotik direnci Modern tıp her geçen gün biraz daha fazla olarak biyofilmler ve biyofilm infeksiyonları ile karşı karşıya kalmaktadır. Biyofilm, canlı veya cansız bir yüzeye yapışarak kendi ürettikleri organik bir ekzopolisakkarid matriks içine gömülü ve hareketsiz olarak birbirine, bir katı yüzeye veya bir ara yüzeye geri dönüşümsüz olarak tutunmuş halde yaşayan mikroorganizmaların oluşturduğu topluluktur. Biyofilm tabakasına su ile temas eden tüm yüzeylerde, örneğin; endüstriyel veya evsel su sistemlerinde, ısı değiştiricilerde, su ileten borularda, su arıtma, depolama, işleme ve dağıtım tesislerinde, soğutma kulelerinde, kağıt makinelerinde ve diş ünitlerinde rastlanabilir. Bu ortamlarda biyofilm tabakası, bakterileri başta klor olmak üzere dezenfektanlardan, besinsizlikten, kuraklıktan, ph dalgalanmalarından ve toksinlerden korur. Bu cansız yüzeylerin yanı sıra biyofilm canlı organizmada da çeşitli koşullarda, çeşitli dokularda oluşmaktadır. Biyofilmlerin bir kısmı organizma açısından koruyucu bir rol üstlenirken, özellikle immün baskılanmış hastalarda ve kalıcı tıbbi araç veya kateteri olan hastalarda ciddi infeksiyonlara yol açabilmektedir. Biyofilmler insan vücudunda kateterler, kontakt lens, protez kalp kapakçıkları ve kalp pilleri, rahim içi araç, böbrek taşı, akciğer dokusu gibi canlı ve cansız birçok yüzeyde bulunabilir [1]. Yapılan çalışmalar nozokomiyal infeksiyonların yaklaşık %65 inden mikroorganizmaların oluşturduğu biyofilmlerin sorumlu olduğunu ve bu durumun tedavi giderlerini çok yükselttiğini ortaya koymaktadır [2]. B YOF LM NFEKS YONLARI Mikroskobik teknikler ve hücresel düzeyde görüntüleme yöntemlerindeki gelişmelerle birlikte infeksiyonların patogenezini aydınlatmaya yönelik çalışmalar hız kazanmış ve biyofilmlerin infeksiyon patogenezindeki rolleri daha fazla açığa çıkmaya başlamıştır. Tıbbi uygulamalarda girişimsel tekniklerin ve kalıcı tıbbi araçların kullanımının artışı biyofilm infeksiyonlarının da artışına neden olmuştur. Kalıcı tıbbi araçlar üzerinde gelişen biyofilmler gram-pozitif ve/veya gram-negatif bakteriler ve/veya mayalardan oluşur. Biyofilm infeksiyonlarında en sık etken olan mikroorganizmalar ve varsa bunların ilişkili olduğu kalıcı tıbbi araçlar Tablo 1 de sunulmaktadır. Koagülaz-negatif stafilokoklar (KNS) hastane infeksiyon etkenleri arasında önemli bir yer tutmaktadır. Kateter, yapay kalp kapakçıkları ve plastik malzemelerin yaygın olarak kullanımı KNS ye bağlı hastane infeksiyonlarında önemli bir artışa neden olmuştur [3]. Bu mikroorganizmanın etken Tablo 1. Biyofilm infeksiyonlarında etken olan mikroorganizmalar ve ilişkili olan kalıcı tıbbi araçlar* İnfeksiyon veya hastalık Diş çürüğü Otitis media Kronik tonsillit Endokardit Kistik fibrozis pnömoni Safra yolu infeksiyonları İnfeksiyöz böbrek taşları Bakteriyel prostatit Yabancı cisim infeksiyonları Santral venöz kateter Üretral kateter Yapay kalp kapakçıkları Koroner stentler Periton diyaliz kateterleri Ortopedik protezler Endotrakeal tüpler Meme implantları Koklear implantlar * 5 ve 6 no lu kaynaklardan uyarlanmıştır. KNS: Koagülaz-negatif stafilokoklar. Etken mikroorganizma Streptokoklar Tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae Çeşitli aerop ve anaerop bakteriler Viridans grup streptokoklar, stafilokoklar Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia Enterik bakteriler Gram-negatif basiller Escherichia coli ve diğer gram-negatif bakteriler KNS, Staphylococcus aureus, enterokoklar Escherichia coli, Candida spp., KNS KNS, Staphylococcus aureus, streptokoklar Staphylococcus aureus, KNS, Pseudomonas aeruginosa, Candida spp. Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, diğer gram-negatif bakteriler Stafilokoklar, Streptococcus pneumoniae, diğer streptokoklar, Propionibacterium acnes Enterik gram-negatif basiller Stafilokoklar, Escherichia coli, Peptostreptococcus spp., Clostridium perfringens Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, streptokoklar, Neisseria meningitidis, mantarlar Cilt 39 Say 2 2008 83

Uluda Altun ve fiener olduğu infeksiyonlar genellikle biyomateryaller üzerinde biyofilm tabakası oluşumuyla karakterizedir [4]. Biyofilm infeksiyonları ilk dönemde genellikle asemptomatiktir. Konakçı direnci düştüğünde biyofilmden periyodik olarak kopup ayrılan planktonik (serbest formda) mikroorganizmalar akut infeksiyona yol açabilir. Antibiyotiğin koruyucu dozları bu mikroorganizmaları kontrol ettiği halde biyofilmi etkilemez [7]. Kalıcı tıbbi cihazlar üzerinde gelişen biyofilmler sürekli bir infeksiyon odağı oluşturarak infeksiyonun hematojen yolla yayılımı açısından da her zaman için bir risk kaynağı sayılmaktadır. Bu nedenle özellikle yüksek risk grubunda olan hastalarda invaziv dental veya cerrahi girişimler yapılmadan önce profilaksi amacıyla antibiyotik uygulanmaktadır. Santral venöz kateter veya idrar sondaları gibi cerrahi girişimlerle yerleştirilmeyen tıbbi cihazların kolonizasyonu sıklıkla cihazın girdiği yerdeki cilt dokusundan kaynaklanmaktadır. Bu tür cihazların kolonizasyonu ayrıca nozokomiyal kaynaklı da olabilmektedir. Cerrahi yolla yerleştirilen kalıcı cihazlarda doku hasarı ve pıhtı oluşumu biyofilm kolonizasyonunu arttırmaktadır [5]. Biyofilm oluşumu infeksiyon riski taşımasının yanı sıra kalıcı cihazlarda mekanik fonksiyon kaybına da yol açmaktadır. Biyofilm oluşumu ile karakterize infeksiyonlara en iyi örneklerden biri kistik fibroziste görülen Pseudomonas aeruginosa ya bağlı kronik solunum yolu infeksiyonlarıdır. Bu olguların yaşları ilerledikçe solunum yolları biyofilm oluşumu ile karakterize mukoid koloni fenotipinde P. aeruginosa ile kolonize ve infekte olmakta ve bu aşamadan sonra kolonizasyon/infeksiyonun eradikasyonu hemen hemen olanaksız hale gelmektedir. Mukoid koloni fenotipine dönüşüm bu olgularda belli bir süreyi bulmaktadır. Kistik fibroziste kronik inflamasyona bağlı olarak toksik oksijen radikallerinin solunum yollarındaki konsantrasyonu giderek artarak bakterinin genetik yapısında bazı mutasyonlara yol açmakta ve aktif hale gelen algt geni sayesinde bakteri mukoid ekzopolisakkaridleri sentezlemeye başlamaktadır. Diğer yandan kistik fibrozis olgularında solunum yollarında oksijen konsantrasyonu normale göre düşük olduğundan P. aeruginosa daha çok anaerop koşullarda biyofilm içinde canlılığını sürdürmeyi tercih etmekte, bu durum da infeksiyonun kronikleşmesine ve tedavinin güçleşmesine neden olmaktadır [7]. B YOF LM N YAPISI ve OLUfiUMU Bir biyofilmin oluşması için gerekli olan ortak bileşenler mikroorganizma, glikokaliks ve yüzeydir. Bu bileşenlerden biri olmadığı takdirde biyofilm oluşmaz [8]. Bir biyofilmin yapısı %97 su olmak üzere %2-5 mikroorganizma, %1-2 polisakkarid, %1-2 protein, %1-2 DNA ve iyonlardan oluşmaktadır. Biyofilmler tek bir mikroorganizma türü tarafından oluşturulabildiği gibi birden fazla türü de yapısında barındırabilir. Farklı türlerde oluşan biyofilmlerde her tür kendi mikrokolonisini oluşturur. Bu mikrokoloniler birbirlerinden su kanalları aracılığıyla ayrılmıştır. Bu su kanalları içinde devam eden su akışı besin maddelerinin ve oksijenin difüzyonunu sağlar. Sistemin yapısına, mikroorganizmanın türüne ve çevresel faktörlere bağlı olarak olgun bir biyofilmin oluşması birkaç saat ile birkaç hafta zaman alır. Örneğin; P. aeruginosa nın elektrik yüklü bir yüzeye yapışması sadece 30 saniye alır [9]. Biyofilm oluşumu basamaklar halinde gelişen bir olaydır [1,10]: 1. Mikroorganizmanın yüzeye tutunması: Yüzeye organik ve/veya inorganik maddelerin yapışmasını takiben mikroorganizmalar bu yüzeye geri dönüşür özellikte tutunur. Bakterinin hareketi veya bakteri yüzeyi ile tutunulan yüzey arasındaki elektrostatik veya fiziksel etkileşimler bu evrede rol oynamaktadır. 2. Geri dönüşümsüz tutunma: Yüzeye tutunan hücreler bakteri hücre zarındaki proteinlerin uyarımı sonucunda ekzopolisakkarid yapıda materyal sentezlemeye başlar ve bu da hücrelerin birbirine ve yüzeye tutunmasını sağlar. Kistik fibrozis olgularında sık görülen P. aeruginosa biyofilmlerinde bu materyal aljinat yapıdadır. Ekzopolisakkarid aynı zamanda bakterinin olumsuz çevre koşullarından korunmasını da sağlamaktadır. 3. Kolonizasyon: Yüzeye tutunan bakteriler bölünüp çoğalarak biyofilmin en küçük organizasyon birimi olan mikrokolonileri oluşturur. Bu mikrokolonilerin üzerine ortamdaki planktonik bakteriler de yapışarak kolonizasyon sağlanır. 4. Kopma: Biyofilmin üst kısımlarından kopan hücreler yeni odaklarda biyofilm oluşturabilir. Biyofilm oluştuktan sonra bakteride genetik düzenlenme sonrasında hareketi sağlayacak olan flajeller sentezlenir, üst tabakadan kopmalar gerçekleşir ve kopan planktonik hücreler yeni biyofilm odaklarını oluşturmak üzere ayrılır. Bu süreç bir dengeye oturunca süreklileşir [9,11]. Örneğin; Proteus mirabilis idrar sondaları ve kateterlerde oluşturdukları biyofilmler boyunca yayılarak konakçı hücrelerinin invazyonuna yol açabilir [12]. B YOF LM OLUfiUMUNDA BAKTER LER ARASI HABERLEfiME: QUORUM SENSING Bakteri biyofilm oluşumunu hücreden hücreye yollanan iletişim sinyalleri aracılığıyla kontrol etmektedir. Bu sinyal sistemi quorum sensing olarak adlandırılmaktadır. Bir bakteri patogenezi için çevreye uyum sağlar ve çevreden gelen uyarıları algılayarak yanıt geliştirir. Çevredeki bir koşul değişikliğinde metabolizmasında değişiklikler yaparak adapte olmaya çalışır. Quorum sensing sistemi de bakterinin etrafındaki popülasyon yoğunluğunu saptamasına yarayan bir sis- 84 H ACETTEPE T IP D ERG S

Biyofilm infeksiyonlar ve antibiyotik direnci temdir. Bakteri bu bilgiyi birçok genin kontrolünü sağlamakta kullanır [13]. Quorum sensing kavramı minimum popülasyon birimini algılama olarak ifade edilebilir [14]. Quorum sensing sinyalleri sayesinde bir odakta toplanan mikroorganizmalar biyofilmin temelini oluşturur. Doğal ortamda mikroorganizmalar çevresel uyarılara bağlı olarak planktonik veya bir yüzeye tutunmuş durağan fazda bulunur. Durağan faza geçiş genellikle besin kaynaklarındaki bir yetersizliğe bağlı olarak gelişir ve hücreler kendilerini biyofilm içinde korumaya alır [5]. Quorum sensing sisteminin bakteriye getirdiği pek çok avantaj vardır. Bu sistem sayesinde bakteri davranışlarını koordine ederek, besin kaynaklarına adaptasyon geliştirir. Aynı besin için yarışan diğer bakterilere karşı savaşabilir. En önemlisi, infeksiyon sırasında virülans faktörlerinin regülasyonu sonucu konakta immün yanıttan kaçabilir. Quorum sensing sistemi içinde en önemli rolü sinyal molekülleri üstlenir. Bu moleküllere aynı zamanda autoinducer da denilmektedir. Bakterilerdeki sinyal molekülleri gram-negatif bakterilerde asil homoserin lakton (AHL), siklik dipeptidler, gram-pozitif bakterilerde küçük peptidler, hem gram-negatif hem de gram-pozitif bakterilerde autoinducer-2 dir [15]. P. aeruginosa da AHL ye ek olarak Pseudomonas kinolon sinyal molekülü (PQS) bulunur. Bu molekül yapısal olarak kinolonlara benzemekte ve AHL ye bağlı quorum sensing sistemini modüle etmektedir [16]. Cilt 39 Say 2 2008 P. aeruginosa da AHL ailesi üyelerinin yer aldığı las ve rhl olmak üzere iki quorum sensing sistemi bulunmaktadır [17]. Her iki sistemin de kistik fibrozis olgularının balgam örneklerinde aktif oldukları saptanmıştır. Bu olgularda görülen P. aeruginosa izolatlarının ortak özellikleri sıklıkla mukoid fenotipte olmaları, aşırı miktarda aljinat sentezlemeleri ve oluşturdukları infeksiyonların antibiyotik tedavilerine yeterli yanıt vermemesi şeklinde sıralanabilir. Biyofilm içinde üreme sayesinde P. aeruginosa hem antibiyotiklerin etkisinden hem de akciğerlerdeki immün yanıttan korunmaktadır [18]. Aynı tür veya farklı türler arasında sinyal molekülleri ile etkileşim olabildiği gibi farklı cinsler arasında da pozitif veya negatif yönde etkileşim olduğu gözlenmiştir [19]. Kistik fibrozisli hastalarda hastalığın erken dönemlerinde akciğerlerde Staphylococcus aureus kolonize olmakta, ileri dönemde S. aureus kolonizasyonu yerini P. aeruginosa ya bırakmaktadır. S. aureus kültürlerine eklenen P. aeruginosa nın sinyal molekülü S. aureus daki efektör molekül olan RNAIII ün ekspresyonunu inhibe etmekte ve böylece virülans faktörlerinin oluşması engellenmektedir. Buna göre kistik fibrozisli hastaların akciğerlerinden S. aureus un eradikasyonunun bir yerde P. aeruginosa ya bağlı olduğu söylenebilir [20]. Farklı gram-negatif bakterilerin aynı aileye ait sinyal molekülleri sentezlediği bilinmektedir. Bunun bir göstergesi de kistik fibrozisli hastaların akciğerlerinde infeksiyona yol açan ciddi mortalite nedenlerinden olan P. aeruginosa ve Burkholderia cepacia nın aynı sinyal moleküllerinin kullanıldığı quorum sensing sistemine sahip olmaları nedeniyle birbirlerinin virülans faktörlerinin sentezine yardımcı olmasıdır [21]. P. aeruginosa hastane infeksiyonlarında önemli bir fırsatçı patojendir. P. aeruginosa virülans faktörlerinin sunumunu hücre, quorum sensing sayesinde kontrol edebilir. Virülans özelliklerinden olan biyofilm, kronik infeksiyonlara zemin hazırlanır [22]. Shih ve arkadaşları biyofilm- quorum sensing ilişkisini tanımladıkları çalışmalarında, P. aeruginosa doğal standart suş (PA01) ile quorum sensing den yoksun mutantları biyofilm oluşturma yönünden karşılaştırmışlar ve başlangıçta biyofilm yoğunluğu yönünden aralarında farklılık yokken, quorum sensing özelliği taşıyan doğal suşla biyofilm oluşumunun mantarlardan daha hızlı ilerlediğini göstermişlerdir [23]. B YOF LM D RENC Biyofilm infeksiyonlarının artması ile birlikte biyofilm direncini aydınlatmaya yönelik olarak yapılan çalışmalar da ivme kazanmıştır. Biyofilm içinde mikroorganizmaları barındıran korunaklı bir yapıdır. Biyofilmde yer alan mikroorganizmalar antimikrobiyal ajanlara, planktonik şekillerine göre 200-500 kat daha dirençlidir. Tıbbi açıdan biyofilm oluşturan mikroorganizmalar içerisinde en fazla araştırılanlar P. aeruginosa, Staphylococcus epidermidis ve Candida spp. dir. Biyofilmlerin antimikrobiyal ajanlara karşı dirençlerinde, bilinen direnç mekanizmaları, örneğin; enzimatik inaktivasyon, atım pompaları, ilaç hedefinde mutasyon gibi mekanizmalar primer sorumlu faktörler olarak gözükmemektedir. Herhangi bir şekilde antimikrobiyal ajanlara dirençli olmayan bir mikroorganizma biyofilm oluşturunca dirençli hale, biyofilmden ayrıldığında ise tekrar duyarlı hale dönüşebilmektedir [6,18]. Biyofilm ortamı sadece antibiyotiklere karşı değil, dezenfektanlara karşı da direnç gelişmesinde rol oynamaktadır. Biyofilm tabakası içindeki bakteriler sıvı ortamda serbest üreyen bakterilere göre dezenfektanlara 10-100 kat daha dirençlidir. Bu yolla oluşan direncin mekanizması tam olarak açıklığa kavuşmamakla birlikte; glikokaliks bileşimi, hücre dışı enzimler, besin sınırlaması, dezenfektanın hücrelere ulaşmasında zorluk gibi çeşitli faktörlerin ilişkili olduğu varsayılmaktadır. Bakteriler biyofilm tabakasından uzaklaştırılıp sıvı kültür ortamlarında serbestçe üretilirse, dirençli oldukları dezenfektanlara tekrar duyarlı hale gelirler. Biyofilm üreten bakteriler antiseptik solüsyonlar içinde uzun süre canlı kalabilmektedir. Dezenfektanlara dirençli biyofilm üreten kökenlerin yol açtığı salgınlar bildirilmiştir. 85

Uluda Altun ve fiener Ayrıca, endoskop ve bronkoskoplarda psödobiyofilm oluşumuyla ortaya çıkan Mycobacterium chelonae, Mycobacterium tuberculosis ve hepatit C virüsü salgınları rapor edilmiştir [24,25]. Biyofilm direnci gerçekte multifaktöriyel bir olaydır. Direnç nedenleriyle ilgili tezler arasında antimikrobiyal ajanların biyofilm içine düşük penetrasyonları, mikroçevre değişikliği ve biyofilme özgü dirençli bir fenotip oluşumudur [26]. Biyofilm içine düşük penetrasyon Biyofilm fiziksel bir bariyer olarak antibiyotik ve dezenfektanların mikroorganizma hücresine ulaşmasını engelleyebilir. Bu engelleme sıklıkla antibiyotiğin biyofilm komponentlerine bağlanması sonucunda ortaya çıkmaktadır. Örneğin; P. aeruginosa biyofilmlerinde özellikle aminoglikozidlerin penetrasyonu, pozitif yüklü antibiyotiğin negatif yüklü biyofilm polimerlerine bağlanması sonucunda bozulmaktadır [18,23]. Biyofilm içindeki ozmotik çevre değişikleri ozmotik bir strese yol açıp bakterideki porin yapısında veya miktarında değişikliklere neden olabilir. Bu durum da özellikle beta-laktam antibiyotiklerin hücre içine girişini kısıtlayabilir. Genel stres yanıtı bakteride Q faktör olarak bilinen RpoS geninin ekspresyonuna yol açıp bir ozmotik koruyucu olarak fonksiyon gören trehalozun aşırı sentezlenmesine ve biyofilmin kalınlaşmasına neden olur. P. aeruginosa ile kronik kolonize olan kistik fibrozis olgularının balgamlarında rposmrna sının gösterilmesi bu bulguyu desteklemektedir [27]. Biyofilmi oluşturan bakterilerde ompf yerine daha küçük bir porin olan ompc gen ekspresyonunun arttığı, bunun da ozmotik stresin artmasına yol açarak intrensek antibiyotik direncini körüklediği ileri sürülmüştür [6]. Düşük penetrasyon olayı antibiyotiğin enzimatik inaktivasyonu ile birlikte olduğunda ortaya çıkan direnç daha belirgin hale gelmektedir. Kistik fibrozisli hastaların solunum yollarındaki biyofilm tabaka içinde sıklıkla yüksek düzeyde beta-laktamaz enzimi saptanmaktadır. Ekzopolisakkarid tabakadan penetre olan beta-laktam antibiyotiklerin bu enzimler ile hidrolize olması penetre olan ilacın miktarını daha da azaltmakta, infeksiyonun eradikasyonunu güçleştirmektedir [26,28]. Biyofilmi oluşturan mikroçevrede değişiklik 86 Biyofilmi oluşturan bakterilerin biyofilm içindeki yoğunluğu besin maddeleri ve oksijen konsantrasyonuna göre değişkenlik göstermektedir. Biyofilmin en dış kısımlarında lokalize olan bakteriler besin maddelerine ve oksijene derinlerde olanlara göre daha rahat ulaşabilmektedir. Bu durum da bakteri popülasyonu içinde bir heterojenliğe yol açmaktadır. Antimikrobiyal ajanların metabolik olarak aktif hücreleri primer olarak hedefledikleri düşünülürse, biyofilm içindeki bu heterojenliğin antibiyotik duyarlılığında farklılıklara yol açabileceği ortadadır. Düşük üreme hızı özellikle olgun biyofilmlerde izlenmektedir. Sınırlı besin miktarları nedeniyle biyofilmlerin yavaş üreme hızına sahip olmaları direncin bir diğer nedeni olarak ileri sürülmektedir. Biyofilm içinde yavaş üreyen veya üremenin durağan fazında bulunan P. aeruginosa suşlarının beta-laktamlara ve tetrasikline duyarlılığının önemli ölçüde etkilendiği, florokinolon aktivitesinin ise üreme hızıyla etkileşmediği saptanmıştır [28]. Benzer bir sonuç Stenotrophomonas maltophilia biyofilmleriyle yapılan bir çalışmada da elde edilmiş ve seftazidimin hem biyofilm içine düşük difüzyonu hem de yavaş üremekte olan hücrelere karşı düşük etkinliği nedeniyle S. maltophilia biyofilmlerini ortadan kaldıramadığı belirtilmiştir [29]. Biyofilm içindeki oksijen yoğunluğu direnci etkileyen bir diğer faktördür. Oksijenin biyofilmin yüzey katmanlarında tüketildiği ve dip kısımlarda anaerobik ortamın oluştuğu bilinmektedir. Bu nedenle bazı antibiyotiklerin, örneğin; aminoglikozidlerin etkinliği azalmakta ve direnç gelişebilmektedir. P. aeruginosa biyofilmlerinde siprofloksasin ve tobramisin aktivitesinin yüzeye yakın bölgedeki suşlarda daha yüksek olmasının saptanması da oksijen yoğunluğuna bağlanmaktadır [18,26]. Direnci etkileyen diğer bir faktör asidik atık maddelerden dolayı ph nın değişmesi ve bu değişimin bazı antibiyotikler üzerine antagonistik etki yapmasıdır. Biyofilm fenotipi varyantlarının oluşumu Bakteriler bir yüzeye tutunmayı takiben çeşitli fizyolojik, metabolik ve fenotipik değişikliklere uğrar. P. aeruginosa suşlarının yüzeye tutunmasından sonra yaklaşık 15 dakika içinde aljinat sentezini sağlayan algc geninin regülasyonunun arttığı, pili ve flajel sentezini sağlayan genlerin ise represe olduğu gösterilmiştir [30]. Bunların yanı sıra antibiyotik duyarlılığını etkileyen genlerin aktive veya represe olduğu da izlenmiştir. Örneğin; aminoglikozidlerin bakteri dış membranına olan afinitesini azaltan tola geni P. aeruginosa biyofilmlerinde aktive durumdadır [30]. Atım pompalarının P. aeruginosa dahil pek çok mikroorganizmanın antimikrobiyal direncinde rol oynadığı özellikle son yıllarda gösterilmektedir. Çeşitli çalışmalardan elde edilen verilerin ışığında, biyofilm varlığında atım pompalarının ekspresyonunun arttığı sonucuna varılmıştır. P. aeruginosa nın kinolonlara direncinde rol oynadığı gösterilen MexAB-OprM pompasının biyofilm içindeki P. aeruginosa hücrelerinde biyofilm dışında kalanlara oranla daha çok indüklendiği H ACETTEPE T IP D ERG S

Biyofilm infeksiyonlar ve antibiyotik direnci gösterilmiş ve artmış direncin bir nedeni olarak ileri sürülmüştür [31]. Biyofilmi oluşturan hücrelerin önemli bir kısmının antibiyotik etkisi ile ortadan kalktığı, küçük bir kısmının ise canlılığını sürdürdüğü bilinmektedir. Bu fenotipik varyantların yüksek konsantrasyonda antibiyotiklere dirençli olma sıklıkları yaklaşık 10-6 dır. Antibiyotik dirençli bu fenotip varyantlar biyofilm oluşturma yetenekleri ile dirençli biyofilmlerin oluşumunu sağlamaktadır [32]. Bu konu ile ilgili öne sürülen bir hipotez, antibiyotik etkisiyle zarar gören hücrelerden bir kısmının apopitoz yoluyla kendilerini ortadan kaldırdıkları, ancak bir grup varyant hücrenin apopitoz yeteneğinden yoksun oldukları için canlılıklarını koruyarak biyofilmi devam ettirdikleri şeklindedir. Biyofilm direncini etkileyen tüm bu faktörler göz önüne alındığında, biyofilmi oluşturan bakteri türü ve kullanılan antimikrobiyal ajana bağlı olarak farklı direnç mekanizmalarının etkili olabileceği ve bu direncin multifaktöriyel olduğu görülmektedir [33]. Dikkate değer bir diğer konu da biyofilm içindeki bakteri popülasyonunun kronik olarak antibiyotiklerin subinhibitör konsantrasyonlarıyla karşı karşıya kalmasıdır. Bu durum daha dirençli bir popülasyonun seleksiyonunu kolaylaştırmakta ve bu infeksiyonların tedavisini uzun sürede güçleştirmektedir. Antibiyotiklerin subinhibitör konsantrasyonlarının koagülaz-negatif stafilokoklarda icaadbc operonuna olan etkilerinin araştırıldığı bir çalışmada kinupristin/dalfopristin ve tetrasiklin sub-mik konsantrasyonlarının bu genin etkisini artırdığı, dolayısıyla daha fazla adhezin oluşumuna yol açtığı gösterilmiştir [34]. Bunun aksine florokinolonların subinhibitör konsantrasyonlarının ise S. maltophilia nın plastik yüzeylere olan adherensi büyük ölçüde azalttığı gösterilmiştir [29]. Başka bir çalışmada da linezolid ve vankomisinin stafilokokların oluşturduğu biyofilmlerdeki bakteri miktarını %90 a varan oranlarda azalttığı ancak bu antibiyotiklerin yüksek konsantrasyonlarda uygulandığında büyük ölçüde glikokalikse bağlandıkları için biyofilm bakterilerini tamamen öldüremedikleri saptanmıştır [35]. Biyofilm hücrelerinin kendi aralarındaki etkileşimleri sonucunda genetik yapılarında değişiklikler gözükmektedir ve biyofilmler ekstrakromozomal DNA değişimleri için ideal ortamlar oluşturur. Direnç plazmidlerinin aktarılması sayesinde genetik yapısı değişen hücreler antimikrobiyal ajanlara karşı daha fazla direnç geliştirmiş olur. Biyofilmlere klinik açıdan bakıldığında özellikle kalıcı tıbbi araçların varlığında ve immünkompromize hastalarda gelişen infeksiyonlarda önemli rolleri olduğu, tedavi maliyetleri ve mortalitelerinin yüksek olduğu görülmektedir. Diğer yandan biyofilm fenotipinin özellikle antibiyotik direnci açısından planktonik fenotipten çok farklı olması, hem mikrobiyologlar hem de tedaviyi uygulayan klinisyenler açısından ciddi bir problem oluşturmaktadır. Son 10 yılda biyofilm yapısı ve biyofilm fenotipi ile ilgili çalışmalar giderek ivme kazanmıştır ve biyofilm oluşumunun önlenmesi ve biyofilm infeksiyonlarının tedavisinde yakın zamanda yeni ve etkin stratejilerin geliştirilmesine kesin gözüyle bakılmaktadır. Kaynaklar 1. Lindsay D, Von Holy A. Bacterial biofilms within the clinical setting: what healthcare professionals should know? J Hosp Infect 2006; 64:313-25. 2. Potera C. Forging a link between biofilms and disease. Science 1999; 283:1837-9. 3. Monzon M, Oteiza C, Leiva J, Amorena B. Synergy of different antibiotic combinations in biofilms of Staphylococcus epidermidis. J Antimicrob Chemother 2001; 48:151. 4. Vogel L, Sloos JH, Spaargaren J, Suiker I, Dijkshoorn. Biofilm production by Staphylococcus epidermidis isolates associated with catheter related bacteremia. Diagn Microbiol Infect Dis 2000; 36:139. 5. Lynch SA, Robertson TG. Bacterial and fungal biofilm infections. Ann Rev Med 2008; 59:415-28. 6. Fux CA, Costerton JW, Stewart PS, Stoodley P. Survival strategies of infectious biofilms. Trens Microbiol 2005; 13:34-40. 7. Spoering AL, Lewis K. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. Bacteriol 2001; 183:6746-51. 8. Donlan RM. Biofilm: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis 2002; 8:881-90. 9. Jones HC, Roth IL, Saunders WM III. Electron microscopic study of a slime layer. J Bacteriol 1969; 99:316-25. 10. Watnick P, Kolter R. Biofilm, city of microbes. J Bacteriol 2000; 182:2675-9. 11. Marsh PD. Dental plaque. In: Lappin-Scott HM, Costerton JW, eds. Microbial biofilms. Cambridge: Cambridge University Press, 1995; 282-300. 12. Rather PN. Swarmer cell differentiation in Proteus mirabilis. Environ Microbiol 2005; 7:1065-73. 13. Donabedian H. Quorum sensing and its relevance to infectious diases. J Infection 2003; 46:207-14. 14. Fuqua WC. Quorum-sensing in bacteria: LuxR-LuxI family of cell dencity responsive transcriptional regulators. J Bacteriol 1994; 176:269-75. 15. Redfield R. Is quorum sensing a side effect of diffusion sensing? TRENDS Microbiol 2002; 10:365-70. 16. Smith RS, Iglewski BH. Pseudomonas aeruginosa quorumsensing systems and virulence. Curr Opin Microbiol 2003; 6:56-60. 17. Whitehead N, Barnard A, Slater H, Simpson N. Quorumsensing in gram-negative bacteria. FEMS Microbiol Rev 2001; 25:365-404. 18. Drenkard E. Antimicrobial resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbes Infect 2003; 5:1213-9. 19. McDowell P, Affas Z, Reynolds C. Structure, activity and evolution of the group I thiolactone peptides from Staphylococcus aureus. Mol Microbiol 1997; 24:895-904. Cilt 39 Say 2 2008 87

Uluda Altun ve fiener 20. Middleton BJ, Qazi S, Hardman A. N-acylhomoserine lactones produced by Pseudomonas aeruginosa modulate agr-dependent virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Clin Rev Microbiol 2002; 15:194-222. 21. Riedel K, Hentzer M, Geisenberger O. N-acylhomoserine lactone mediated communication between Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia in mixed biofilms. Microbiology 2001; 147:3249-62. 22. Doğan Y, Bayrakal V, Bahar H, Baskın H. Relation of quorum sensing and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa strains in presence of gentamicin. Türk Mikrobiyol Cem Derg 2007; 37:134-7. 23. Shih PC, Huang CT. Effect of quorum-sensing deficiency on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and antibiotic resistance. J Antimicrob Chemother 2002; 49:309-14. 24. Çağlar K. Dezenfektanlara direnç gelişim mekanizmaları? Dezenfektan işlemi ne kadar tehdit etmektedir? Günaydın M, Saniç A, Gürler B, editörler. 4. Ulusal Sterilizasyon Dezenfeksiyon Kongresi Kongre Kitabı. Ankara: Bilimsel Tıp Yayınevi, 2005; 702-14. 25. Russel AD. Bacterial adaption and resistance to antiseptics, disinfectants and preservatives is not a new phenomenon. J Hosp Infect 2004; 57:97-104. 26. Mah TFC, O Toole GA. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. TRENDS Microbiol 2001; 9:34-9. 27. Foley I, Marsh P, Wellington EM, Smth AW, Brown MR. General stres response master regulator rpos is expressed in human infection: a possible rolein chronicity. Antimicrob Chemother 1999; 43:164-5. 28. Drenkard E. Ausubel FM. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature 2002; 740-3. 29. Di Bonaventura G, Spedicato I, D Antonio D, Robuffo I, Piccolomini R. Biofilm formation by Stenotrophomonas maltophilia: modulation by quinolones, trimethoprim-sulfamethoxazole and ceftazidime. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48:151-60. 30. Davies DG, Geesey GG. Regulation of the alginate biosynthesis gene algc in Pseudomonas aeruginosa during biofilm development in continuous culture. Appl Environ Microbiol 1995; 61:860-7. 31. Stewart PS, Costerton JW. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet 2001; 358:135-8. 32. Yassien M, Khardori N. Interaction between biofilms formed by Staphylococcus epidermidis and quinolones. Diagn Microbiol Infect Dis 2001; 40:79. 33. Sauer K, Camper AK, Ehrlich GD, Costerton JW, Davies DG. Pseudomonas aeruginosa displays multiple phenotypes during development as a biofilm. Bacteriol 2002; 184:1140-54. 34. Götz F. Staphylococcus and biofilms. Molecular Microbiol 2002; 43:1367-78. 35. Wicox MH, Kite P, Mills K, Sugden S. In situ measurement of linezolid and vancomycin concentrations in intravascular catheter-associated biofilm. Antimicrob Chemother 2001; 47:171-5. 88 H ACETTEPE T IP D ERG S