ARAÞTIRMALAR (Research Reports) Yoðun Sportif Egzersiz ile Ýndüklenen Nükleer Protein Ýçeriðinin Akým Sitometrisi ile Ölçümü Flow Cytomeric Measurement of Nuclear Protein Content induced by Intensive Sporting Exercise Zuhal Hamurcu PhD. Assist. Professor of Medical Biology Erciyes University zhamurcu@erciyes.edu.tr Nazmi Sarýtaþ PhD. Assist. Prof. of College of Physical Education and Sports Erciyes University nsaritas@erciyes.edu.tr Halil Demirtaþ Assist. Professor of Medical Biology Erciyes University demtas@erciyes.edu.tr Özet Amaç: Yoðun sportif egzersiz, bedendeki oksidatif stres oluþumunu tetiklemektedir. Genelde hücre çekirdeðindeki oksidatif baský, DNA hasarýna ve nükleer proteinlerin deðiþimine neden olmaktadýr. Organizmayý mütasyonlardan korumak için, DNA hasarý mümkün olduðu kadar kýsa sürede onarýlmak zorundadýr. Bunun için onarým proteinleri gereklidir. Bu yüzden, çalýþmamýzýn amacý, yoðun egzersizden dolayý nükleer protein içeriðinde bir deðiþikliðin olup olmadýðýný araþtýrmaktýr. Gereç ve Yöntem: Yaþ ortalamasý 21,92±3,34 olan elit düzeyde 12 erkek atlet öðrenciye koþu bandýnda Brouce protokolüne göre egzersiz yaptýrýldý. Sporculardan egzersiz öncesi, egzersizden hemen ve 24 saat sonra periferal kan örnekleri alýndý. Periferal kan mononükleer hücrelerden çekirdek izole edildi ve DNA/protein ölçümü için, sýrasýyla propidium iyodid /floresan izotiyosiyanat ile boyandý; akým sitometride ölçüldü. Bulgular: On sporcunun nükleer protein içeriðinde, egzersiz öncesine göre, egzersizden hemen sonra artýþ bulunurken (p=,1), egzersiz öncesi ile 24 saat sonrasý arasýnda fark bulunamadý. Sonuç: Bulgularýmýza göre, yoðun egzersiz sonucunda hücre çekirdeðindeki oksitlenmeyi/ hasarý önlemek için protein içeriðinde bir artýþ olmakta ve bu proteinler görevlerini yaptýktan kýsa bir süre sonra yeniden sitoplazmaya geçmektedirler. Anahtar kelimeler: Akým Sitometri; Egzersiz; Nükleer Proteinler. The present study was presented at the Xth National Medical Biology and Genetics Congress, 6-9, September, 27, Antalya. Submitted : March 25, 21 Revised : June 15, 21 Accepted : July 6, 21 Abstract Purpose: Intensive exercise induces oxidative stress. Oxidative stress may cause DNA damage and protein modifications. DNA damage should be repaired as soon as possible to avoid mutation to the organism. For this purpose, repair proteins are required. The aim of this study is to test whether or not intensive exercise results in an alteration in nuclear protein content. Material and Methods: Twelve athletes were exposed to exercise on a treadmill. Buruce protocol was used for exercise. Peripheral bloods with heparin samples were obtained from athletes before, immediately after, and 24 hours after the exercise. Nuclei from peripheral blood mononuclear cell were isolated and stained with propidium iodide, and fluorescein isothiocyanate for DNA and proteins measurement respectively, and was measured. Results: While an increase in the nuclear protein content of 1 athletes were increased immediately after exercise compared with that before exercise (p=.1), no difference was found between the pre- and post-exercise. Conclusion: Our findings suggest that intensive exercise induces an increase in the protein content to prevent the oxidation/damage in cell nucleus and these proteins return to cytoplasm after fulfilling their duty. Key words: Exercise; Flow Cytometry; Nuclear Proteins. Corresponding Author: Yard. Doç. Dr. Zuhal Hamurcu Erciyes Üniversitesi Týp Fakültesi Týbbi Biyoloji Anabilim Dalý 3839 Kayseri Turkey. Phone : +9-352 437 49 1 / 23334 e-mail : zhamurcu@erciyes.edu.tr Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 21;32(3):155-16 155
Yoðun Sportif Egzersiz ile Ýndüklenen Nükleer Protein Ýçeriðinin Akým Sitometrisi ile Ölçümü Giriþ Düzenli egzersizin, birçok patolojik hastalýklarýn oluþma riskini azalttýðý, yaþam ömrünü uzattýðý için saðlýk açýsýndan yararlý olduðu bilinmektedir. Bununla birlikte, uzun süreli/yoðun egzersiz sýrasýnda alýnan oksijen miktarýnýn artmasýyla birlikte, reaktif oksijen türlerinin (ROT) aþýrý üretilmesi, oksidatif stresi artýrarak saðlýða zarar verebilmektedir (1-4). Oksijen canlýlarýn yaþamlarýný sürdürebilmeleri için mutlak gerekli bir elementtir. Oksijen, hücre içinde dört elektron gerektiren bir dizi reaksiyon sonucunda indirgenir (H 2O ya dönüþür) ve bu sýrada hücre kendisi için gerekli olan enerjiyi saðlar. Bu süreçte oksijenin az bir kýsmý (%1-3) tam olarak suya dönüþmez ve bu reaksiyonlarda ara ürün olarak serbest radikaller olan süperoksit anyonu (-O 2), hidrojen peroksit (H 2O 2) ve hidroksil radikalleri (-OH) oluþur. Serbest radikaller bir veya daha fazla ortaklanmamýþ elektron ihtiva eden atom veya moleküllerdir. Oksijenin normal metabolizma basamaklarýnda indirgenmesi sonucu açýða çýkan serbest radikaller hücre ve dokularda birçok zarara yol açmaktadýr (5). Oksidatif stresin, çekirdek içerisinde; DNA ve protein gibi nükleer yapýlarda amino-asit oksidasyonu, proteinprotein çapraz baðlarýnýn, DNA-protein çapraz baðlarýnýn oluþmasý, DNA da zincir kýrýklarý ve baz oksidasyonu (8-hiroksideoksiguanozin) gibi birtakým lezyonlar oluþturarak hasarlanmalara yol açtýðý belirtilmiþtir.(6). Çekirdek içerisinde oksidatif stresin; iyonize (iyonlaþtýrýcý) radyasyon, UV radyasyonu, kemoterapi, yoðun egzersiz ve çeþitli kimyasallar olmak üzere farklý kaynaklardan oluþtuðu rapor edilmiþtir (7). Hatta yapýlan yoðun egzersizin DNA da oksidatif hasarlanmalara yol açtýðý birçok çalýþmalarla gösterilmiþtir (3, 8, 9). Ancak, literatürde yoðun egzersizin nükleer protein içeriðine etkisinin olup olmadýðýna dair bir veriye rastlanýlamamýþtýr. Bu yüzden, çalýþmamýzýn amacý, yoðun egzersizden dolayý nükleer protein içeriðinde bir deðiþikliðin olup olmadýðýný araþtýrmaktýr. Gereç ve Yöntem Bireyler ve Egzersiz Protokolü. Tüm bireyler çalýþma hakkýnda bilgilendirildi. Çalýþma protokolü yerel etik kurul tarafýndan onaylandý ve çalýþma Helsinki Bildirgesine göre yürütüldü. Katýlýmcýlardan, yazýlý onam formu alýndýktan sonra çalýþmaya baþlandý. Çalýþma Erciyes Üniversitesi Beden Eðitimi ve Spor Yüksek Okulu nda okuyan yaþ ortalamasý 21,92±3,34 olan, sigara kullanmayan 12 atlet erkek öðrencide yapýldý. Fiziksel egzersiz, koþu bandýnýn hýz ve eðimi üçer dakikalýk aralýklarla artýrýlarak yapýldý (Bruce protokolü, 1) Periferal Kan Mononükleer Hücrelerin (PKMH) Çekirdeklerinin Ýzolasyonu. Bireylerden egzersizden önce (E.Ö.), egzersizden hemen sonra (E.S.) ve 24 saat sonra (24 S.S.) 2 ml heparinli kan örneði alýndý. Çekirdekler izole edildi (12, 13), 2 ml heparinli kan örneði 3 ml fikolhistopak üzerine yayýldý ve oda ýsýnda 13 rpm de 25 dakika santrifüj edildi. Ýzole olan PKMH ler pastör pipeti ile baþka bir tüpe alýndý ve PBS soluyonu (5g FA- Bacto Buffer Difco kat no: 223142, 5 ml distile suda çözüldü) ile oda ýsýsýnda 9 rpm de 1 dakika santrifüj edilerek iki kez yýkandý ve hücrelerin üzerine 5 ml Nukleer Ýzolasyon Solusyonu (NÝS:,661 g Tris-HCl Sigma kat no: T-3253;.97; Tris-base Sigma kat no: T-153;.29 g NaCl Merck kat no: 64;.4 g EDTA- tetra Na Sigma kat no: ED455;.5 ml NP-4 Sigma kat no: 12787-87- 1 ml distile suda çözüldü, ph = 7.53) ilave edildi. Süspansiyonun ml sinde 1x 1 6 çekirdek olacak þekilde NÝS ile sulandýrýldý. Çekirdeklerin Boyanmasý. Hücre süspansiyonun 1 ml si akým sitometresinde ölçüm için kullanýlan tüpe transfer edildi. Üzerine 1 ml 9 ml NaCl-bikarbonat solüsyonu (1,18 g NaCl +,25 g NaHCO 3 1 ml distile suda çözüldü), 1 ml flöresan izotiyosiyanat (FITC) solusyonu (6 mg flöresan izotiyosiyanat Sigma F-725, 2 ml bikarbonat solusyonunda çözüldü ve NaCl-bikarbonat solüsyonu ile 1:1 oranýnda sulandýrýldý.) ve 1 ml propidiyum iyodid (PI) solusyonu (6 mg propidiyum iyodid 6 ml NaCl-bikarbonat solusyonunda çözüldü. NaClbikarbonat solüsyonu 1:14.3 oranýnda sulandýrýldý.) ilave edildi. Bu karýþým akým sitometrisinde ölçülmeden önce 3 dakika 4 o C de inkübe edildi (11, 12). Akým Sitometri. PKMH çekirdeklerinin DNA ve protein içeriklerinin analizi için Becman Coulter Epics XL-MCL flow cytometer kullanýldý ve her bir örnek için 1. çekirdek ölçüldü. PI ve FITC nin uyarýlmasý için tek lazerli 488 nm dalga boyunda argon iyon lambasý kullanýldý. Uyarýlma sonucunda kýrmýzý flöresan emisyonu (PI) (F=62,, F: Flüoresan, : Kýrmýzý Flüoresan) DNA içeriðini ve yeþil flüoresan emisyonu (FITC) (F=525, FL1: Yeþil Flüoresan) protein içeriðini göstermektedir. Deðerlendirme için akým sitometride ölçüm sonucunda elde edilen sonuçlardan FL1 (protein) ve (DNA) ün mean X verileri kullanýldý. 156 Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 21;32(3):155-16
Zuhal Hamurcu, Nazmi Sarýtaþ, Halil Demirtaþ Ýstatistiksel Analiz. Verilerin normal daðýlýma uygunluðunu test edildikten sonra, istatistiksel deðerlendirme Genel Linear Model (GLM) içerisinde yer alan tekrarlanan ölçümlerde varyans analiz kullanýlarak yapýldý. Farklýlýklarý belirlemek için Scheffe testi uygulandý. Anlamlýlýk düzeyi,5 olarak alýndý. Veriler ortalama ± standart sapma olarak verildi. Bulgular Çalýþmaya katýlan öðrencilerin özellikleri ve maksimum oksijen alma kapasiteleri (VO 2 max) Tablo I de verildi. Öðrencilerin egzersiz öncesi, egzersiz sonrasý, 24 saat sonrasý periferal kan mononükleer hücreler in çekirdek protein içerikleri ise tablo II de sunuldu. Yapýlan istatistiksel analiz sonuçlarýna göre verilerin normal daðýlým gösterdikleri bulundu (p=,152). Çalýþmaya katýlan atlet öðrencilerin nükleer protein içerikleri egzersiz öncesine göre, egzersizden hemen sonra artmýþ bulunurken (sýrasýyla 168,49 ± 5,8 ve 18,11 ± 7,58; p=,1, egzersiz öncesi ile 24 saat sonrasý arasýnda fark bulunamadý (sýrasýyla 168,49 ± 5,8 ve 169,12 ±5,45; p=1. Tablo 2). Bir gönüllünün (A.D) örnek ölçüm sonuçlarý ise Þekil 1 de verildi. Tablo I. Öðrencilerin Özellikleri ve Maksimum Oksijen Alma Kapasiteleri Öðrenci Yaþ Boy Vücut Aðýrlýðý Vücut Kitle indeksi Sporcu VO 2 max (n=12) (yýl) (cm) (kg) (kg/cm 2 ) yýlý (ml/kg/dk) EM 18 161, 52, 2,1 6 64,9 TC 26 17, 65, 22,5 1 65,2 AÇ 26 175, 62, 2,2 12 65, EB 19 177, 69, 22, 7 64,4 EI 18 165, 55, 2,2 6 62,1 ÝÖ 23 178, 72, 22,7 2 6, AD 21 183, 76, 22,7 7 63,7 AG 2 176, 72, 23,2 6 45,5 KY 19 17, 54, 18,7 7 62, UM 21 183, 72, 21,5 4 53,8 AY 25 176, 77, 24,9 18 54,8 AK 27 176, 74, 23,9 8 55,1 Ortalama 21,92 174,17 66,67 21,88 7,75 59,71 Standart sapma 3,34 6,62 8,92 1,8 4,11 6,15 VO2 max: maksimum oksijen alma kapasitesi Tablo II. Öðrencilerin Egzersiz Öncesi, Egzersiz Sonrasý, 24 Saat Sonrasý Periferal Kan Mononükleer Hücreler in Çekirdek Protein Ýçerikleri (F 525 mean X). Öðrenci Egzersiz Öncesi Egzersiz Sonrasý 24 Saat Sonrasý (n=12) F 525 mean X F 525 mean X F 525 mean X EM 165,9 177,4 164,7 TC 161,6 174,1 169,6 AÇ 178,4 175,6 168,2 EB 164,9 185,6 166,8 EI 17,1 192,9 177,7 ÝÖ 175,4 185,9 176,4 AD 169,8 182,4 173,6 AG 166,6 18,3 161,1 KY 165,6 165,3 163,6 UM 166,6 181,6 169,5 AY 169,1 173,6 169,2 AK 165,4 177,4 162,6 Ortalama 168,28 179,34 168,58 Standart Sapma 4,69 7,14 5,28 Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 21;32(3):155-16 157
Yoðun Sportif Egzersiz ile Ýndüklenen Nükleer Protein Ýçeriðinin Akým Sitometrisi ile Ölçümü a-) 124 SS 84 488 FL1 124 124 FS FL1 124 124 124 b-) 124 SS 76 492 FL1 124 124 FS FL1 124 124 124 c-) 124 SS 96 436 FL1 124 124 FS FL1 124 124 124 Þekil 1. Bir gönüllünün (A.D) örnek sonuçlarý. a. Egzersiz öncesi (F 525 mean X: 169,3); b. Egzersiz sonrasý (F 525 mean X: 182,4) ve c. Egzersizden 24 saat sonraki (F 525 mean X: 173,6). Tartýþma Egzersiz sýrasýnda enerjiye ihtiyaç duyulmaktadýr (1, 3). Enerji tüketiminin temel ilkesi oksidasyondur. Oksidasyon sýrasýnda hidrojen peroksit gibi oksijen ve türevlerinin oldukça aktif þekilleri üretilmektedir. Radikaller membran peroksidasyonuna neden olmakta, membran geçirgenliðini bozmakta ve hücre hasarý ortaya çýkmaktadýr. Özellikle akut ve aðýr egzersizin oksidatif hasarý tetiklediði ileri sürülmektedir (1, 2, 4). Bu nedenle, egzersiz sýrasýnda yüksek oksijen alýmýnýn oksidatif strese neden olup olmadýðý ve biyolojik sistemler (DNA, lipid, protein metabolizmasý) üzerinde risk oluþturup oluþturmadýðýna dair sorularýn cevaplanmasý için birçok araþtýrmalar yapýlmýþtýr (1, 3, 13). Çünkü oksidatif stres sonucu oluþan ROT çekirdek porlarýndan geçerek çekirdek içerisine yayýlabilir ve DNA, protein gibi nükleer yapýlarý hasarlayabilirler. Oluþan DNA hasarý, olasý mutasyonlardan sakýnabilmek için hýzlýca tamir edilmek zorundadýr. Bunun için onarým proteinleri gereklidir (7). Proteozomal sistem (2S proteozomlardan oluþur.) oksitlenerek hasarlanmýþ proteinlerin indirgenmesinden sorumludur. Proteozomlar hem sitozolde hem de çekirdek içerisinde bulunmaktadýr. Nükleer proteozomlar, oksidatif olarak hasarlanmýþ histon gibi DNA-protein kompleksinin, baðýmsýz olarak bulunan oksitlenmiþ nükleer proteinlerin uzaklaþtýrýlmasýndan sorumludurlar ve proteozomlar onarým iþlevlerini yaptýktan sonra hýzlý bir þekilde çekirdekten uzaklaþýrlar (6, 7). 158 Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 21;32(3):155-16
Zuhal Hamurcu, Nazmi Sarýtaþ, Halil Demirtaþ Yoðun egzersizin DNA üzerine etkileri ile ilgili yapýlan çalýþmalarda, bazýlarýnda egzersizle oksidatif DNA hasarýnýn arttýðý (1, 3, 14, 15), bazýlarýnda azaldýðý (17), bazýlarýnda ise herhangi bir deðiþikliðin olmadýðý (18-21) gösterilmiþtir. Bu çeliþkili sonuçlarýn bireylerin antrenman düzeylerine, uygulanan egzersizin tipine ve süresine baðlý olabilmektedir (3, 2). Çalýþmamýzda yoðun egzersizin DNA, protein gibi nükleer yapýlarda oksidatif hasara yol açýp açmadýðýný bilemiyoruz. Ancak, çalýþmamýzda, egzersizden hemen sonra nükleer protein içeriðinin arttýðý, egzersizden 24 saat sonra ise tekrar eski düzeyine geldiði bulundu. Egzersizden hemen sonra nükleer protein içeriðindeki artýþýn, çekirdek içerisine giren proteozomlara baðlý olabileceðini düþünmekteyiz. Bize göre, egzersiz sýrasýnda oksijene duyulan talep artmakta ve buna baðlý olarak çekirdek içerisinde oksidasyon yükselmekte ve oksidasyondan dolayý da çekirdek içerisinde oluþabilecek olasý oksidatif hasarý önlemek için proteozom giriþi artmaktadýr. Fakat sunulan çalýþma egzersiz ile çekirdek proteinleri arasýndaki iliþkiyi gösteren literatürdeki ilk veriler olup, bundan sonra yapýlacak araþtýrmalarla desteklenmesi gerekmektedir. Teþekkür Yazarlar, Akým sitometri cihazýnýn kullanýlmasýna izin veren Prof. Dr. Türkan Patýroðlu na ve çalýþmanýn yapýlmasýna destek saðlayan Prof. Dr. Bekir Çoksevim e teþekkürlerini sunar. Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 21;32(3):155-16 159
Yoðun Sportif Egzersiz ile Ýndüklenen Nükleer Protein Ýçeriðinin Akým Sitometrisi ile Ölçümü Kaynaklar 1.Rodak Z, Pucsuk J, Boros S, Josfai L, Taylor AW. Changes in ürine 8-hytdroxydeoxyguanozine levels of super-marathon runners during a four-day race period. Life Sci 2; 66:1763 1767. 2.Nakatani K, Komatsu M, Kato T, et al. Habitual exercise induced resistance to oxidative stres. Free Radical Res 25; 39:95 911. 3.Orhan H, Van Holland B, Krab B, et al. Evaluation of a multi-parameter biomarker set for oxidative damage in man: Increased urinary excretion of lipid, protein and DNA oxidation products after one hour of exercise. Free Radical Res 24; 38: 1269 1279. 4.Rodak Z, Kaneko T, Tahara S, et al. The effect of exercise training on oxidative damage of lipids, proteins, and DNA in rat skeletal muscle: evidence for beneficial outcomes. Free Radic Biol Med, 1999; 27:69-74. 5.Mercan U. Toksikolojide Serbest Radikallerin Önemi. Yüzüncü Yýl üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi 24, 15:91-96 6.Ullrich O, Sitte N, Sommerburg O, Sandig V, Davies KJ,ÊGrune T. Influence of DNA binding on the degradation of oxidized histones by the 2S proteasome. Arch Biochem Biophys 1999; 362:211 216. 7.Voss P, Grune T. The nuclear proteasome and the degradation of oxidatively damaged proteins. Amino Acid, 27; 32:527-534. 8.Tsai K, Hsu TG, Hsu KM, et al Oxidative DNA damage in human peripheral leukocytes induced by massive aerobic exercise. Free Radic Biol Med 21; 31:1465-1472. 9.Poulsen HE, Loft S, Vistisen K. Extreme exercise and oxidative DNA modification. J Sports Sci 1996; 14: 343-361. 1.Noonan V, Dean E. Submaximal Exercise Testing: Clinical Application and Interpretation, Phsical Therapy, 2; 8: 782 87. 12.Hamurcu Z, Demirtaþ H, Patýroðlu T, Kumandas S. Nuclear protein contents in peripheral blood mononuclear cells of trisomy 21 infants. Cytometry B Clin Cytometry 28; 74:128-132. 13.Poulsen HE, Loft S, Výstýsen K. Extreme exercise and oxidative DNA modification. J Sports Sci 1996; 14: 343-346. 14.Almar M, Villa JG, Cuevas MJ, Rodríguez-Marroyo JA, Avila C, Gonzalez-Gallego J. Urinary levels of 8-hydroxydeoyguanosine as a marker of oxidative damage in road cycling. Free Radic Res 22.36: 247-253. 15.Tsai K, Hsu TG, Hsu KM, et al. Oxidative DNA damage in human peripheral leukocytes induced by massive aerobic exercise. Free Radic Biol Med, 21, 31: 1465-1472. 16.Hamurcu Z, Sarýtaþ N, Baþkol G, Akpýnar N. Effect of wrestling exercise on oxidative DNA damage, nitric oxide level and paraoxonase activity in adolescent boys. Pediatr Exrc Sci 21; 22: 6-68. 17.Bloomer RJ, Goldfarb AH, Wideman L,.McKenzie MJ, Consitt LA. Effects of acute aerobic and anaerobic exercise on blood markers of oxidative stress. J Strength Cond Res 25, 19:276-285. 18.Hartmann A, Pfuhler S, Dennog C, Germadnik D, Pilger A, Speit G. Exercise-induced DNA effects in human leukocytes are not accompanied by increased formation of 8-hydroxy-2 -deoxyguanosine or induction of micronuclei. Free Radic Biol Med 24: 254-251, 1998. 19.Inoue T, Mu Z, Sumikawa K, Adachi K, Okochi T. Effect of physical exercise on the content of 8- hydroxydeoxyguanosine in nuclear DNA prepared from human lymphocytes. Jpn J Cancer Res 1993 ; 84: 72-725. 2.Nakatani K. Komatsu M, Kato T, et al. Habitual exercise induced resistance to oxidative stress. Free Radic. Res 25; 39:95-911. 11.Robinson JP, Editor. Handbook of Flow Cytometry Methods. Wiley-Liss Inc: New York; 1993 p.19. 16 Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 21;32(3):155-16