GENETĐK 111-503 Hafta VIII Rekombinant DNA Teknolojileri Doç.Dr. Hilâl Özdağ Rekombinant DNA Teknolojisi Amaç Spesifik DNA dizilerinin yerlerinin belirlenmesi. DNA nın belirli noktalardan kesilmesi Belirli bir DNA parçasının milyarlarca kopyasının çıkarılarılarak müteakip işlemlerin mümkün kılınması. DNA parçalarının mutasyona uğratılıp biraraya getirilmesi suretiyle istenen dizilimlerin oluşturulması. Oluşturulan DNA diziliminin transferi. 1
Rekombinant DNA Teknolojisi Aşamaları Doku veya hücrelerden DNA izolasyonu. DNA nın belirlenen restriksiyon endonükleazlarla kesilmesi. Restriksiyon enzimleri ile oluşturulan DNA parçalarının vektörlerle birleştirilmesi. Rekombinant DNA molekülünün oluşturulması. Rekombinant DNA nın konakçı hücreye aktarılması. Konakçı hücre içinde çoğalarak klonlarını oluşturması. Konakçı hücrenin çoğalarak rekombinant DNA molekülünü oğul hücrelere aktarması. Klonlanmış DNA nın konakçı hücrelerden izole edilip incelenmesi. Klonlanmış DNA nın gerekirse konakçı hücrede ifadelenmesi. İlgili proteinin tayin ve analizi. Restriksiyon Endonükleazlar HindIII Yapışkan Uç PvuII Küt Uç 2
Restriksiyon Endonükleazlar Palindrom Kes Yapıştır Küt uç oluşturan enzimlerle yapılan kesimler sonrası oluşan fragmentleri biraraya getirebilmek için önce terminil deoksinükleotidil transferaz enzimi ile polyt ve/veya polya kuyruğu takılır sonrasında DNA ligaz ile fragmentler birleştirilir. 3
Kendisini ve taşıdığı DNA molekülünü bağımsız olarak replike edebilmelidir. Vektör üzerinde pekçok restriksiyon enzimin sadece bir kesilme bölgesi olmalıdır. Bu bölge restriksiyon enzimi ile kesilerek aynı enzimle kesilen başka bir DNA parçasının bu bölgeye sokulması için kullanılır. Üzerinde seçilebilir bir belirteç (marker) taşımalıdır bir antibiyotik direnç geni veya konakçı hücreden olmayan bir enzime ait gen). Bu belirteç vektör içeren konakçı hücreleri vektör içermeye konakçı hücrelerden ayırmak için kullanılır. Vektör konakçıdan kolayca izole edilebilir olmalıdır. Plazmid vektörler Bakteriyofaj vektörler Kozmit ve mekik vektörler Bakteriyel yapay vektörler (BAC) Maya yapay vektörler (YAC) 4
Plazmid vektörler Küçüktürler. Mesela puc19 konakçısında 500 kopya olacak şekilde çoğalabilir. Çoklu klonlama bölgesi barındırırlar. Belirteç olarak lacz genini taşır puc19. Bakteriyofaj vektörler Lambda fajı genlerinin hepsi tanımlanmış bütün genomu çıkarılmış bir bakteriyofajdır. Genomunun 1/3 lük kısmı çok hayati olmadığı için fajın hücreleri enfekte etmesini ve plak oluşturmasını engellemeden yabancı bir DNA ile değiştirilebilir. M13 ise tek zincirli bir fajdır. Bakteri hücresini enfekte ettiğinde çift zincirli, replikatif formu(rf) alır. 5
Bakteriyofaj vektörler http://bioweb.wku.edu/courses/biol566/images/lambdagenome.jpg Kozmit vektörler Kozmit vektörler lambda kromozomunun bir kısmı ile plazmit DNA nın birleştirilmesiyle oluşturulmuştur. Lambdanın protein kılıfının paketlenmesi için gerekli olan cos dizileri ile plazmitin replikasyonu için gerekli dizileri taşır. Belirteç olarak antibiyotik direnç geni taşır. Hemen bütün faj genomu çıkarıldığı için 50 kb büyüklüğünde fragmentleri taşır (fajlar 15 kb, plazmitler ise 5-10 kb taşıyabilir). 6
Mekik vektörler Değişik kaynaklardan türetilen ve kendi replikasyon başlama bölgelerini içeren diğer hibrit vektörler birden fazla konakçı hücrede replike olabilirler. İki konakçı sistemde de seçilebilen belirteçler taşırlar. Genellikle gen ifadesi çalışmalarında kullanılırlar. 7
Bakteriyel yapay vektörler (BAC) Ökaryotik genomların analiz ve haritalanmasında ihtiyaç duyulan büyük DNA parçalarının klonlanabilmesi için geliştirilmiş vektörlerdir. Bakterilerdeki üreme plazmitleri (F plazmit) kendi kendine eşleyebilme özelliğine sahiptir. BAC lar yaklaşık 300 kb DNA taşıyabilir. Replikasyon için F faktör genlerini, belirteç olarak antibiyotik direnç genlerini ve çoklu klonlama bölgesini taşırlar. Maya yapay kromozomları (YAC) Bir YAC her iki uçta telomer yapısı, bir replikasyon odağı (otonom olarak replike olan diziler, ARS) ve mayaya ait bir sentromer içerir. İki adet belirteç (TRP1 ve URA3) bulunur. Çoklu klonlama bölgesi mevcuttur. 2 megabaz (2 milyon bç) uzunluğunda DNA parçaları YAC ların içine girebilir. 8
Maya yapay kromozomları (YAC) Hartl Jones, Genetics Prokaryotlar Bakteriler Konakçı Hücreler Ökaryotlar: Özellikle YAC gibi vektörler ökaryotik hücrelere DNA aktarımında kullanılır. Vektör plazmit ise hücre içine DNA girişi transformasyon olarak eğer vektör virus ise transfeksiyon olarak adlandırılır. Bitki hücreleri Memeli hücreleri 9
Konakçı Hücreler Bitki Hücreleri Konakçı Hücreler Memeli Hücreleri Hartl Jones, Genetics 10
Mutajenez Genomik Kütüphaneler Bir genomik kütüphane genomdaki tüm dizilerden en az bir kopya içerir. DNA izolasyonu Restriksiyon endonükleazlarla muamele Uygun vektörün seçilmesi 11
Genomik Kütüphaneler N = ln( 1 ln( 1 P) f) N: Gerekli klonların sayısı P: Verilen DNA parçasını alma olasılığı f: Her bir klondaki genom fraksiyonu Genomik Kütüphaneler 12
Kromozoma Özgül Kütüphaneler Flow cytometry www.chrombios.com/service/flowkar.jpg Pulsed Field Gel Electrophoresis cdna Kütüphaneleri mrna üzerinden reverse transcriptase ile cdna sentezi Sentezlenen cdna nın her iki ucuna bir restriksiyon enziminin tanıma dizisini içeren kısa çift zincirli DNA takılıp klonlanması cdna kütüphaneleri hücre/doku spesifik olarak hazırlanır 13
cdna Kütüphaneleri Genom ve Transkriptom Kütüphanelerinden Yararlanmak DNA probları Kütüphanenin taranması: plak hibridizasyonu Komşu genlerin tanımlanması: Kromozomda yürüme 14
Genom ve Transkriptom Kütüphanelerinden Yararlanmak DNA probları Genom ve Transkriptom Kütüphanelerinden Yararlanmak Plak hibridizasyonu 15
Genom ve Transkriptom Kütüphanelerinden Yararlanmak Kromozomda Yürüme Bağlantı analizi sonrası belirlenen bağlantılı bölgelerden başlayıp hedef gene ulaşmayı hedefleyen bir yaklaşımdır. Her aşamada DNA dizi analizini ve açık okuma çerçevesini bulmayı hedefler. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 16
Southern Blot Restriksiyon Haritalama faculty.plattsburgh.edu/.../restmap/figure6.gif 17
DNA Dizi Analizi Hartl Jones, Genetics 18