T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PERİODONTİTİSLİ HASTALARDA DİŞETİ OLUĞU SIVISI RANKL, IL-1β, IL-10, OPG DÜZEYLERİNİN TEDAVİ ÖNCESİ VE SONRASI KIYASLANMASI; DHA VERİLEN SIÇANLARDA DİŞETİ RANKL mrna DÜZEYLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ Dt. Yağmur Deniz YILDIRIM Periodontoloji Programı DOKTORA TEZİ ANKARA 2013

2

T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PERİODONTİTİSLİ HASTALARDA DİŞETİ OLUĞU SIVISI RANKL, IL-1β, IL-10, OPG DÜZEYLERİNİN TEDAVİ ÖNCESİ VE SONRASI KIYASLANMASI; DHA VERİLEN SIÇANLARDA DİŞETİ RANKL mrna DÜZEYLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ Dt. Yağmur Deniz YILDIRIM Periodontoloji Programı DOKTORA TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Ezel BERKER ANKARA 2013

ONAY SAYFASI iii

iv TEŞEKKÜR Doktora eğitimim boyunca ve tezimin oluşturulmasında fikirleriyle beni aydınlatan, her konuda büyük desteğini hissettiğim değerli danışman hocam Prof. Dr. Ezel Berker e, Çalışmamızın ortaya çıkması için gerekli maddi desteği sağlayan H.Ü.B.A.B a, Bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşarak bu yolda ilerlememi sağlayan değerli hocalarım Prof. Dr. Gürhan Çağlayan, Prof. Dr. Kenan Eratalay, Prof. Dr. Feriha Çağlayan, Prof. Dr. Rahime M. Nohutcu, Prof. Dr. Nermin Yamalık, Prof. Dr. Alev Akalın, Prof. Dr. Hakan Akıncıbay, Prof. Dr. Tolga Tözüm, Prof. Dr. Burak Demiralp e, Çalışma ortamını paylaşmanın yanında, sevgi ve dostluklarıyla birlikte, geçirdiğimiz yıllara keyif ve anlam katan arkadaşlarım Dr. Burak Kutlu, Dr. Sevim Günday, Dr. Erkan Şüküroğlu, Dr. Sezen B. Aşkın, Dt. Ceyda K. Dursun, Dr. Vuslat Ç. Arı, Dt. Tuğba Ataman, Dt. Orkun Topçu, Dt. K. Burak Şahbazoğlu, Dt. Tolga Genç, Dt. Doğukan Yılmaz, Dt. Hatice Alpay, Dt. Ezgi Doğan, Dt. Rahşan A. Şentürk, Dt. Demet Şahin ve Dt. Derya Kutsal a, Stajerlik dönemimden bu yana, bu yolu seçmemde ve ilerlememde büyük rolü olan, Yrd. Doç Dr. Abdullah Akman a, Doktora eğitimim boyunca tecrübe, bilgi ve desteklerini her zaman hissettiğim, bunun yanında dostluklarını ve sevgilerini paylaşmaktan mutluluk duyduğum Doç Dr. Güliz Güncü ve Dr. Erhan Dursun a, Tezimin deneysel kısmındaki büyük katkı ve yardımlarından dolayı Prof. Dr. Engin Yılmaz a, Uzm. Biyolog Yeliz Akkaya ya ve Uzm. Vet. Hekim M. Alper Çetinkaya ya; laboratuar aşamalarındaki katkıları ile verilerimizi somutlaştıran Uzm. Biyolog Baran Erman a; İstatistiksel değerlendirmelerindeki desteği için Doç. Dr. Erdem Karabulut a, Her zaman, her yerde, her koşulda sonsuz destek ve karşılıksız sevgilerini benden esirgemeyen aileme, Sevgiyi paylaştıkça büyüttüğümüz, asfaltta birlikte koşup, patikada elimden tutan, her zaman benimle yürüyen yol arkadaşıma, Bitmez tükenmez sevgisi, fedakârlığı ile beni büyüten, varlığına şükrettiğim can damarım, her zaman yanımda olan ve bugünlere gelmemi sağlayan kıymetlim, anneanneme, Sonsuz teşekkürler

v ÖZET Yıldırım, YD. Periodontitisli Hastalarda Dişeti Oluğu Sıvısı RANKL, IL-1β, IL- 10, OPG Düzeylerinin Tedavi Öncesi Ve Sonrası Kıyaslanması; DHA Verilen Sıçanlarda Dişeti RANKL mrna Düzeylerinin Değerlendirilmesi. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Periodontoloji (Diş) Programı Doktora Tezi, Ankara 2013. Bu çalışmanın amacı: i Periodontitisli hastaların dişeti oluğu sıvısında (DOS) tedavi öncesi ve sonrası RANKL, OPG, İnterlökin-10 (IL-10), IL-1β düzeylerini belirlemek ve klinik parametrelerle sitokin seviyelerinin ilişkisini araştırmak, ii Dokozahekzaenoik asit (DHA) tedavisinin sıçanların dişeti RANKL mrna ifadesine etkisini değerlendirmektir. Yirmialtı agresif periodontitis (AGP), 21 kronik periodontitis (KP) ve 18 periodontal olarak sağlıklı kontrol (K) grubundan oluşan toplam 65 birey çalışmaya dahil edildi. Başlangıçta ve cerrahi periodontal tedavi uygulandıktan 3 ay sonra cep derinliği miktarı (CD), klinik ataçman seviyesi (KAS), plak indeksi (Pİ) ve gingival indeks (Gİ) değerleri, sondlamada kanama (SK) varlığı veya yokluğu kaydedildi. Sitokin düzeyleri ELISA (enzyme linked immünosorbent assay) metoduyla saptandı. Deneysel çalışmaya 18 adet Wistar sıçan dahil edildi. Sıçanların alt birinci molar dişlerinin etrafına 3-0 ipek sütur bağlanmasıyla periodontitis (P) oluşturularak, şu şekilde 6 gruba ayrıldı: 1- sağlıklı kontrol, 2- periodontitis grubu (P), 3- P+DHA, 4-P+aspirin (ASA) 5- P+DHA+aspirin, 6- P+salin. Etkilenen dişin etrafındaki dişeti eksize edilerek, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonuyla (GZ-PZR) mrna ifadesi değerlendirildi. Başlangıçta, RANKL, IL-1β total miktarları ve RANKL/OPG oranı KP ve AGP gruplarında K grubuna göre yüksekken, OPG konsantrasyonu K grubunda P gruplarına göre istatistiksel olarak daha fazlaydı. IL-10 total miktarı AGP grubunda, KP ve K grubuna göre daha yüksek tespit edildi. Cerrahi periodontal tedaviden sonra, RANKL ve IL-1β total miktarları gruplar arasında farklılık göstermedi. OPG total miktarı ise AGP grubunda, K grubuna kıyasla daha yüksekti. RANKL/OPG oranı P gruplarında tedaviden sonra da K grubuna kıyasla daha yüksek tespit edildi. IL-10 total miktarı AGP grubunda KP vek gruplarından daha fazlaydı. Periodontal tedaviden sonra, öncesine kıyasla IL-1β miktarları iki P grubunda da azalırken, diğer sitokinlerin konsantrasyonları artış gösterdi. Deneysel çalışma sonucunda, P grubunda agaroz jelde RANKL mrna bantları izlenirken, tedavi verilen gruplarda izlenmedi. Çalışmamızın sonuçları, RANKL miktarı artışının ve RANKL/OPG oranındaki dengesizliğin periodontal kemik yıkımının mevcudiyetini yansıtabileceği görüşünü desteklemektedir. Anahtar Kelimeler: RANKL, OPG, periodontal tedavi, deneysel periodontitis, DHA, omega 3 Bu çalışma 01001201001 proje numarası ile H.Ü.B.A.B tarafından desteklenmiştir.

vi ABSTRACT Yıldırım, YD. Comparison of RANKL,IL-1β, IL-10, OPG levels in gingival crevicular fluid of periodontitis patients before and after surgical periodontal treatment; evaluation of gingival RANKL mrna levels in DHA treated rats. Hacettepe University Institute of Health Sciences, PhD Thesis in Periodontology (Dentistry) Programme, Ankara 2013. The aims of this study were to: i - determine the RANKL, OPG, IL-10, IL-1β levels in gingival crevicular fluid of periodontitis patients before and after surgical periodontal treatment and search out the relationship of clinical parameters with these cytokine levels, ii examine the effects of docosahexaenoic acid (DHA) treatment on RANKL mrna levels of rat gingival tissue. Total of 65 patients, consisting of; 26 agressive periodontitis (AGP), 21 chronic periodontitis (CP) and a periodontally healthy control (C) group of 18 people were included in this study. Periodontal parameters including plaque index (PI), gingival index (GI), probing pocket depth (PPD), clinical attachment level (CAL) and percentage of bleeding on probing (BOP) were recorded at baseline and 3 months after surgical periodontal therapy. Cytokine levels were determined by ELISA. 18 male wistar rats were included in the experimental study. Periodontitis (P) was induced on mandibular 1. molar teeth of rats using 3-0 silk ligatures. Rats were classified into 6 groups as 1- healthy control, 2- P group (P), 3- P+DHA, 4-P+aspirin (ASA), 5- P+DHA+aspirin, 6-P+saline (placebo). mrna expression of the gingiva on affected teeth was examined using real time(rt-pcr). RANKL, IL-1β total amount (TA) and RANKL/OPG ratio was statistically higher in CP and AGP than C group, while OPG concentration was statistically higher in C group than P groups at baseline. IL-10 TA was higher in AGP than CP and C. After surgical periodontal therapy RANKL and IL-1β TA didn t differ between study groups. OPG TA and was higher in AGP than C group. RANKL/OPG ratio was still higher in P groups than healthy controls. IL-10 TA was higher in AGP than CP and C. IL-1β levels were decreased after periodontal therapy in both P groups, while an increase in concentrations of other cytokines were detected according to baseline. Experimental study results exhibited mrna messages on agaroz gel in P group, but not in treated groups. Study results supported the idea that RANKL increase and imbalance between RANKL/OPG ratio can reflect the periodontal bone resorption. Keywords: RANKL, OPG, periodontal theraphy, experimental periodontitis, DHA, omega 3 This research was supported by H.Ü.B.A.B with project no: 01001201001

vii İÇİNDEKİLER Sayfa ONAY SAYFASI iii TEŞEKKÜR iv ÖZET v ABSTRACT vi İÇİNDEKİLER vii SİMGELER ve KISALTMALAR ix ŞEKİLLER DİZİNİ xi TABLOLAR DİZİNİ xiii 1.GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 6 2.1. Periodontal Hastalıklar: 6 2.1.1 Gingivitis 7 2.1.2 Kronik Periodontitis 8 2.1.3 Agresif Periodontitis 9 2.2. Periodontal Hastalıkların Etiyopatogenez ve İmmünolojisi: 10 2.2.1. Sitokinler 13 2.2.2 İnterlökin 1 ve Periodontal Hastalıklar: 15 2.2.3. IL-10 ve Periodontal Hastalıklar 18 2.3. Osteoimmünoloji: İmmün Sistem ve Kemik İlişkisi 20 2.4. Periodontal Hastalıklar ve RANKL/RANK/OPG 24 2.5. Konak Yanıtını Düzenleyici Tedaviler 28 3. GEREÇLER VE YÖNTEM 38 3.1. Klinik Çalışmalar 38 3.1.1 Hasta Seçimi 38 3.1.2. Çalışma Gruplarının Belirlenmesi 39 3.1.3 Bireylerin Periodontal Durumlarının Belirlenmesi 39 3.1.4 Dişeti Oluğu Sıvısı Örneklerinin Elde Edilmesi 43 3.2 DOS Örneklerinin Laboratuar Çalışmaları 43 3.3. Hayvan Deneyi 48

viii 3.3.1 İpek Ligatürle Oluşturulan Deneysel Periodontitis Modeli 49 3.3.2 mrna Ekspresyonlarının Değerlendirmesi için Laboratuar Çalışmaları 51 3.4 İstatistiksel Analiz 55 4. BULGULAR 57 4.1 Klinik Çalışma Bulguları 57 4.2 Deneysel Çalışma Bulguları 77 5.TARTIŞMA 81 6. SONUÇLAR 97 7. KAYNAKLAR 99

ix SİMGELER ve KISALTMALAR AA Araşidonik asit AGP Agresif periodontitits ASA Asetilsalisilik asit BHR B hücre reseptörü CD Cep derinliği COX Siklooksijenaz DH Dendiritik hücre DHA Dokozahekzaenoik asit DOS Dişeti oluğu sıvısı ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EPA Eikozapentaenoik Asit Gİ Gingival indeks GZ-PZR Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu IFN-γ İnterferon gama IL İnterlökin IL-1β İnterlökin 1 Beta Ig M İmmünglobulin M IL-1ra İnterlökin 1 reseptör antagonisti K Kontrol KAS Klinik ataçman seviyesi KP Kronik periodontitis LAP Lokalize agresif periodontitis LPS Lipopolisakkarit LTB4 Lökotrien B4 µl Mikrolitre MMP Matriks metalloproteinaz OCP Osteoklast prekürsörleri OPG Osteoprotegrin

x P PBS pg Pİ PMNL RANK RANKL SK SOAİ TGF-ß TIMP TNF TRAP Ty Periodontitis Phosphate buffered saline Pikogram Plak indeksi Polimorfonükleer lökosit Receptor activator of nuclear factor k-β Receptor activator of nuclear factor k-β ligand Sondlamada kanama Steroid olmayan antiinflamatuar ilaç Transforming Growth Factor Beta Tissue inhibitor of matrixmetalloproteinases Tümör nekrotizan faktör-alfa Tartrate resistant acid phosphatese T yardımcı hücre

xi ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1. RANKL/RANK/OPG sistemi 23 Şekil 2. 2. İnflamasyonu çözümleyici lipid medyatörleri 30 Şekil 3. 1. Deney grubundaki sıçanların alt 1. Molar dişlerine bağlanmış ipek sütur 49 Şekil 3. 2. Kontrol ve ligatür (periodontitis) gruplarına ait Mikro BT görüntüleri ve ölçüm bölgeleri. 51 Şekil 4. 1. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası tüm ağız cep derinlikleri 67 Şekil 4. 2. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası tüm ağız klinik ataçman seviyeleri 68 Şekil 4. 3. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası tüm ağız gingival indeks değerleri 68 Şekil 4. 4. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası tüm ağız plak indeksi değerleri 69 Şekil 4. 5. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası tüm ağız sondlamada kanama yüzdeleri 69 Şekil 4. 6. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası örnekleme bölgesi cep derinlikleri 70 Şekil 4. 7. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası örnekleme bölgesi klinik ataçman seviyeleri 70 Şekil 4. 8. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası örnekleme bölgesi gingival indeks değerleri 71 Şekil 4. 9. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası örnekleme bölgesi plak indeksi değerleri 71 Şekil 4. 10. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası örnekleme bölgesi sondlamada kanama yüzdeleri 72 Şekil 4. 11. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası RANKL total miktarları 72 Şekil 4. 12. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası OPG total miktarları 73 Şekil 4. 13. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası IL-1β total miktarları 73 Şekil 4. 14. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası IL-10 total miktarları 74

xii Şekil 4. 15. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası RANKL konsantrasyonları 74 Şekil 4. 16. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası OPG konsantrasyonları 75 Şekil 4. 17. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası IL-1β konsantrasyonları 75 Şekil 4. 18. Çalışma gruplarının tedavi öncesi ve sonrası IL-10 konsantrasyonları 76 Şekil 4. 19.β-Aktin Geni Amplifikasyon Eğrisi 77 Şekil 4. 20. β-aktin Geni Erime Eğrisi 78 Şekil 4. 21. Β-aktin PCR, 187 bp, %3 lük Agaroz Jel 78 Şekil 4. 22. RANKL PCR, 251 bp, %3 lük Agaroz Jel 79 Şekil 4. 23. Sıçan çenelerinin mikro BT görüntüleri 79 Şekil 4. 24. Deneysel çalışma gruplarına ait kemik kaybı miktarları (mm) 80

xiii TABLOLAR DİZİNİ Tablo 2.1. Omega-3 Yağ Asitleri 31 Tablo 3. 1. Sıçanlara uygulanan deney protokolü 50 Tablo 3. 2. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonunda kullanılan primerler. 55 Tablo 4. 1. Çalışma gruplarının cinsiyet ve yaş ortalamalarına göre dağılımı 58 Tablo 4. 2. KP, AGP ve K gruplarında başlangıç ve tedavi sonrası klinik ölçüm değerleri ve istatistiksel kıyaslamaları 62 Tablo 4. 3. Tüm gruplara ait sitokin düzeyleri, gruplar arası ve grup içi kıyaslamaları 66 Tablo 4. 4. Sitokin oranları, grup içi ve gruplar arası kıyaslanması 67 Tablo 4. 5. Sıçan çenelerinin mine-sement sınırından alveol kemiğine kadar olan ölçüm değerleri 80

1 1.GİRİŞ Periodontitis, patojen mikroorganizmalar, konak yanıtı, çevresel ve sistemik faktörler gibi birçok etkenin neden olduğu çok faktörlü, kronik inflamatuar bir hastalıktır. Dental biofilmdeki patojen mikroorganizmalar tetiği çeken etken olsa da, bu mikroorganizmalara karşı oluşan konak kaynaklı immün yanıt, hastalığın ilerlemesi ve şiddetinde önemli rol oynar. Konak-bakteri etkileşimiyle tetiklenen immün mekanizmalar, iltihabi medyatörlerin çok miktarda salınımına yol açarak doku yıkımını başlatabilir (1). Bu iltihabi medyatörler arasında IL-1β nın periodontal yıkımda baskın rolü olduğu düşünülmektedir. Lipopolisakkarit, endotoksin gibi mikrobiyal ürünler IL- 1 salınımını stimüle eder. Ayrıca IL-1 in kendisi de makrofajlardan kendi salınımını indükler. Lökositler için kemoatraktan olan IL-1, antijen sunucu hücreler ile T ve B lenfositlerini direkt veya dolaylı olarak uyarabilir (2). Dişeti oluğu sıvısında (DOS) artmış IL-1 seviyesi, gingivitis oluşumu ve şiddetli periodontitis ile ilişkili bulunmuştur (3). Deneysel çalışmalarda, IL- 1, inhibe edildiğinde, ataçman ve kemik kaybı, inflamatuar hücre miktarı anlamlı olarak azalmaktadır (4,5). Dokulardaki kontrolsüz yıkım ve proinflamatuar sitokinlerin biyolojik aktiviteleri IL-1ra (IL-1 reseptör antagonisti), IL-4, IL-10, IL-11 gibi antiinflamatuar sitokinler ile baskılanmaktadır (6). IL-10; IL-1, IL-6, IL-8 ve TNF (tümör nekrotizan faktör) de dahil olmak üzere monosit kaynaklı proinflamatuar sitokinleri inhibe eder ve lipopolisakarit (LPS) ile uyarılmış polimorfonükleer lökositlerde (PMNL) IL-1ra nın üretimini arttırır (7). Hayvan çalışmaları, bağ dokusu yıkımıyla karakterize, kronik iltihabi bir hastalık olan artritin, ilerleme hızının IL-10 un antiinflamatuar etkisiyle yavaşlatılabileceğini göstermiştir (8,9). Bu etkilerinden dolayı IL-10 un

2 akut iltihabi yanıtın başlamasını ve ilerlemesini sınırlayan, düzenleyici bir rolü olduğu düşünülmektedir. Periodontal hastalık sonucu oluşan kemik yıkımının mekanizmasını anlayabilmek için, günümüzde kemik metabolizmasıyla ilgili diğer hastalıklarda olduğu gibi, immün sistem ve kemik metabolizması arasındaki ilişkiler araştırılmaktadır. Osteoklast oluşumunu ve aktivasyonunu düzenleyen mekanizmalar RANKL (receptor activator of nuclear factor k-β ligand)/rank (receptor activator of nuclear factor k-β) ve RANKL ın antagonist reseptörü olan osteoprotegrin (OPG) immün sistem ile kemik metabolizması arasındaki yakın ilişkinin anahtar düzenleyicileri olarak düşünülmektedir (10). RANKL, osteoblastlar ve aktive T hücrelerde membrana bağlı olarak bulunan veya aktive T hücreler dahil olmak üzere başka hücrelerden de salınan homotrimerik bir proteindir (11,12). Salınan protein, proteolitik parçalanma veya alternatif bölünmeyle membran formundan ortaya çıkmaktadır (13). RANK da, RANKL gibi TNF reseptör süperailesinden, homotrimerik bir transmembran proteinidir ve RANKL ın biyolojik olarak aktif reseptörüdür. Osteoklast prekürsörleri (OCP) ve olgun osteoklastlar ile dendritik hücreler üzerinde bulunmaktadır (14). OPG, osteoklastogenezi inhibe edici faktör olarak da bilinen, primer olarak osteoblastlardan salınan bir proteindir. RANKL a bağlanmak için RANK ile yarışan, RANKL ın antagonist reseptörüdür. RANKL, RANK ile bağlandığında, osteoklast farklılaşmasına yol açan sinyal iletimini başlatır. OPG ise, RANKL a bağlandığında osteoklastogenez ve osteoklast aktivasyonları inhibe olmaktadır (15). Osteoimmünoloji kavramının ortaya çıkmasında T lenfosit RANKL ilişkisi rol oynamaktadır (15,16). Makrofajlar ve T lenfositler, IL-1, IL-6, TNF-α, prostoglandin E 2 (PGE 2 ) gibi osteoblastlardan RANKL üretimini uyaran sitokinler salgılamakla birlikte, T lenfositler direkt

3 RANKL salgılayarak da osteoklast farklılaşmasını uyarabilir (17). Romatoid artrit lezyonlarından izole edilen T lenfositlerde RANKL mrna tespit edilmiştir (18). Teng ve ark.(19) A. actinomycetemcomitans ile enfekte agresif periodontitis hastalarından T lenfositleri izole etmişlerdir ve T lenfositlerin A. actinomycetemcomitans a karşı RANKL eksprese ettiğini görmüşlerdir. RANKL ve OPG varlığı periodontal ceplerde ve dokularda da gösterilmiştir. RANKL ın dişetindeki ekspresyonu ve DOS taki miktarları periodontitisli bölgelerde daha yüksek saptanmıştır. Hem RANKL miktarının, hem de RANKL/OPG oranının yüksek saptanması, periodontitislerde bu belirteçlerin, kemik yıkımında rolü olduğunu göstermektedir (20-25). Periodontitislerde, kronik inflamatuar süreç sonucunda oluşan doku ve kemik yıkımının, konağın verdiği yanıtla düzenlendiği konusunda görüş birliği mevcuttur. Buna bağlı olarak da, konvansiyonel tedavilerin yanında konağın savunma mekanizmasını düzenleyebilecek tedavi arayışları artmıştır. Bugüne kadar çalışılan antiinflamatuar tedaviler, direkt olarak proinflamatuar medyatörlerin durdurulmasını amaçlayarak, anahtar enzimlerin ve reseptörlerin inhibisyonuna yönelik olmuştur (örn; anti TNF-α tedavisi). Vücuttaki inflamasyonun ortadan kalkmasının aslında proinflamatuar sinyalin kapatılmasıyla sonlanan pasif bir olay olmadığı, kendi içinde aktif olarak düzenlenen bir süreç olduğu ortaya çıkmıştır (26). İnflamasyon ilerledikçe, eksudada bulunan nötrofillerin, lökotrien B4 gibi kemoatraktanları salgılamayı durdurdukları, doymamış yağ asidi kaynaklı araşidonik asidi koruyucu olan lipoksin ve resolvinlere çevirdikleri gözlenmiştir (27). Böylelikle nötrofil birikiminin durdurulması ve apoptotik nötrofillerin ortamdan kaldırılması ile çift etkili koruyucu bir mekanizma söz konusudur.

4 Akut inflamasyonda rol alan lipoksin, resolvin, protektinler gibi endojenöz medyatörler, inflamasyonu çözümleyici etkileri olan yeni bir lipid medyatör grubudur. Omega-3 yağ asitleri olan eikozapentaenoik asit (EPA) ve dokozahekzoenoik asit (DHA), sırasıyla Resolvin E ve Resolvin D serisine enzimatik dönüşümde substrat olarak kullanılırlar (28). Resolvinler, akut inflamasyonun çözümlenmesi sırasında aktif olarak sentez edilirler ve kemoatraktanların, nötrofillerin birikimini durdurarak antiinflamatuar etki gösterirler. Romatoid artrit, ateroskleroz vb. diğer inflamatuar hastalıklarla birlikte, kemik yıkımıyla karakterize kronik inflamatuar bir hastalık olan periodontitiste, yağ asitlerinin etkisi araştırılmaya başlanmıştır. Deneysel periodontitis çalışmalarında Omega-3 ten zengin beslenen sıçanların alveoler kemik kaybı omega-6 ile zengin beslenen sıçanlara göre daha azdır ve kontrol grubuyla kıyaslanabilir düzeyde bulunmuştur (29). IL-1β ve TNF-α gen ekspresyonlarında düşüş, IFN-γ (interferon- γ) ve antioksidan enzimlerin (katalaz ve süperoksit dismutaz) mrna ekspresyonlarında artış saptanmıştır (30). Omega-3 yağ asitleri DHA ve EPA, RANKL ile uyarılmış RAW264.7 makrofaj hücrelerine uygulandığında, doza bağımlı olarak osteoklast farklılaşmasını inhibe etmişlerdir (31). Kültür plaklarındaki rezorpsiyon alanı ve sayısı da yağ asitleri eklenmesiyle azalmıştır. Günümüzde yağ asitlerinden biyosentez edilen lipoksin, resolvin, protektin gibi moleküllerin inflamasyon çözümleyici etkileri ile özellikle omega-3 alımı ve omega-3 zengin beslenme, önem ve anlam kazanmıştır. Sunulan bu bilgiler ışığında tez çalışmamızın amacı:

5 1) Periodontitisli ve periodontal sağlıklı bireylerde klinik parametrelerle birlikte dişeti oluğu sıvısında RANKL, OPG, IL-10, IL-1β seviyelerinin belirlenmesi, 2) Cerrahi periodontal tedavinin, DOS ta belirlenen bu sitokinler ve klinik duruma 3 aylık takip süreci sonunda etkisi olup olmadığının belirlenmesi, 3) Deneysel periodontitis modeli oluşturarak, klinik tedaviye ek olarak verilebilecek omega-3 yağ asidi olan DHA nın, alveoler kemik yıkımına etkisini mikro bilgisayarlı tomografi (BT) ve sıçan gingival dokusunda RANKL ın mrna ekspresyonu seviyeleriyle değerlendirilmesidir.

6 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Periodontal Hastalıklar: Sement, periodontal ligament, alveol kemiği ve dişetinin oluşturduğu yapıya periodonsiyum denir. Dişi çevreleyen ve destekleyen bu dokuları etkileyen hastalıklara periodontal hastalıklar denmektedir. Amerikan Periodontoloji Akademisi tarafından 1999 da düzenlenen, periodontal hastalıkların sınıflandırılması için yapılan uluslararası çalıştayında, sınıflandırma şu şekilde yapılmıştır: (32) 1. Dişeti Hastalıkları - Plağa bağlı dişeti hastalıkları - Plağa bağlı olmayan dişeti hastalıkları 2. Kronik Peridontitis - Lokalize - Generalize 3. Agresif Periodontitis - Lokalize - Generalize 4. Sistemik Hastalıklarla Birlikte görülen Periodontitis 5. Nekrotizan Periodontal Hastalıklar

7 - Nekrotizan ülseratif gingivitis - Nekrotizan ülseratif periodontitis 6. Apseler - Gingival apse - Periodontal apse - Perikoronal apse 7. Endodontik Lezyonlarla İlişkili Periodontitis - Endodontik-periodontal lezyonlar - Periodontal- endodontik lezyonlar 8. Gelişimsel veya Kazanılmış Deformite ve Durumlar - Gingival veya periodontal hastalığa karşı modifiye veya predispoze eden lokalize dişsel faktörler - Dişler çevresindeki mukogingival deformite ve durumlar - Dişssiz bölgelerdeki mukogingival deformite ve durumlar - Okluzal Travma 2.1.1 Gingivitis Gingivitis, dişte ataçman kaybı görülmeyen, birleşim epitelinin diş üzerindeki seviyesinin değişmediği, dişetinde klinik iltihabi bulgu

8 gösteren bir dişeti hastalığıdır (33).Dişetlerinde kanama, kızarıklık, yüzey pürtüklülüğünde azalma ve ödematöz bir klinik görüntü ile karakterizedir. Dişeti oluğu sıvısında artış ve sondlamada kanama mevcuttur (34). Dişeti kanaması, gingivitiste erken gözlenen ve objektif bir bulgu olduğundan teşhiste önemlidir. Löe ve ark. (35) yaptıkları deneysel çalışmada gingivitisin başlaması ve ilerlemesi ile mikrobiyal dental plağın direkt ilişkisini göstermiştir. İltihabi durumun ilerleyişi, safhalar arasında kesin ayrım yapılamasa da, aşamalar şeklinde rapor edilmiştir (36). Dental plak birikimiyle birlikte, dişetinde kapiller genişlemeler olur ve kan akışı hızlanır. Dişeti oluğu sıvısı miktarı artar. Mikrobiyal uyaran ile lökositler ve endotelyal hücreler uyarılır. Erken lezyonda klinik olarak eritem bulgusu, damar geçirgenliğinde artış, rete peg oluşumu gözlenir. Birleşim epiteline yakın bağ dokusunda baskın olarak lenfosit birikimi ve kollojen yıkımı mevcuttur. Yerleşmiş lezyonda daha çok plasma hücreleri baskındır. Kan damarlarında akış ve venöz dönüş bozulmuştur. Bu da ilerlemiş gingivitisde, dişetlerinde koyu mavimsi bir görüntüye neden olur. Gingivitisde gram pozitif fakültatif ve gram negatif anaerobik bakteriler hemen hemen eşit oranlarda görülmektedir (37). Gram (+) bakteriler arasında S. sanguis, S. mitis, A. viscosus, A. naeslundi ve P. Micros; gram (-) ler arasında ise F. nucleatum, P. intermedia, V. parvula, haemaphilus ve campylobacter türleri yer alır (37). 2.1.2 Kronik Periodontitis Daha önce Erişkin Periodontitis olarak da isimlendirilmiş olan kronik periodontitis, ataçman ve kemik kaybı ile ilerleyen kronik iltihabi bir periodontal hastalıktır. Daha sıklıkla erişkin yaşlarda görülür ancak

9 belirli bir yaş aralığı olmaması, her yaşta görülebilmesi nedeniyle kronik periodontitis daha evrensel bir tanımlamadır. Kronik periodontitisli hastalarda periodontal cep oluşumu, supra ve subgingival plak birikimi, diştaşı birikimi, kemik ve ataçman kaybı ile bazen cepten süpürasyon gelmesi karakteristik özelliklerdir. İleri vakalarda dişlerde mobilite artışı gözlenir. Sondlamada kanama ve dişeti oluğu sıvısı artışı mevcuttur. Dişetleri eritemli, ödemli görünebileceği gibi, bazı durumlarda fibrotik, kalın dişetleri, durumu maskeleyebilir. Lokalize veya generalize olabilir. Genellikle yavaş ilerleyen, ağrısız bir hastalıktır ancak ilerleme hızı, konak yanıtını etkileyen diabet, sigara tüketimi gibi çevresel ve sistemik faktörlerden etkilenmektedir. Hastalığın ilerlemesi çok yavaş ve devamlı bir şekilde olabileceği gibi, zaman zaman duraksayan ve ilerleyen ataklar şeklinde olabilir (38). Periodontal dokularda, kronik iltihabi hücreler artmıştır. Özgül olmayan immün cevaptan, özgül immün cevaba geçiş söz konusudur. İltihabi hücre infiltrasyonu birleşim epitelinin apikalinde ve lateral yönde bağ dokusunda artmıştır. Periodontal dokularda plasma hücreleri dominanttır (39). P. gingivalis, T. forsythia, P. intermedia, C. rectus, E. Corrodens, F. nucletaum, A. actinoycetemcomitans, P. micros ve T. Denticola kronik periodontitiste yüksek oranda kültüre edilen bakterilerdir (40).C. rectus, P. gingivalis, F. nucletaum, P. intermedia ataçman kaybının devam ettiği aktif alanlarda aktif olmayanlara göre daha fazladır (41). 2.1.3 Agresif Periodontitis Agresif periodontitis, daha ileri yaşlarda da rastlansa da, genellikle sistemik olarak sağlıklı 30 yaş altı bireyleri etkileyen, birinci azı/kesici dişleri kapsayan derin cepler ve aşırı kemik yıkımı ile

10 karakterizedir. Birinci azılar ve kesiciler dışında iki daimi dişten fazla etkilenme varsa generalize agresif periodontitis, bir tanesi birinci azı olmak üzere, birinci azı/kesici diş hariç en çok iki diş etkilenmişse lokalize agresif periodontitis olarak tanımlanır (42). Derin periodontal cepler görülmesine rağmen, bu duruma sebep olamayacak kadar az miktarda plak mevcuttur. Radyografta çanak şeklinde vertikal kemik kayıpları gözlenir. Kronik periodontitise göre 3-4 kat daha hızlı ilerlediği rapor edilmiştir (43). Agresif periodontitis hastalarında polimorfonükleer lökositlerde ve/veya monositlerde fonksiyonel defektler gösterilmiştir (44,45). Bunun yanında lokalize agresif periodontitis hastalarında monositlerin aşırı PGE 2 üretimine yol açarak yıkımı artırdığı da rapor edilmiştir (46). Agresif periodontitise ailesel yatkınlık olduğu düşünülmektedir (47-49). Lokalize periodontitiste görülen nötrofil bozukluklarının kalıtsal olabildiği de gösterilmiştir (50). Farklı populasyonlarda C. rectus, P. gingivalis, E. corrodens gibi faklı türlerin yoğunluğu belirtilmişse de A. Actinomycetemcomitans ın lokalize agresif periodontitisle birincil ilişkili patojen olduğu düşünülmektedir (51-53). 2.2. Periodontal Hastalıkların Etiyopatogenez ve İmmünolojisi: Periodontal hastalıklar, patojen mikroorganizmalar, konak yanıtı, çevresel ve sistemik faktörler gibi birçok etkenin neden olduğu çok faktörlü hastalıklardır. Dental biofilmdeki patojen mikroorganizmalar tetiği çeken etken olsa da, bu mikroorganizmalara karşı oluşan konak kaynaklı immün yanıt, hastalığın ilerlemesi ve şiddetinde önemli rol oynar.

11 Oral kavitede yaklaşık 700 farklı bakteri türü tanımlanmıştır ve dental plak örneklerinden yaklaşık 50-60 tür izole edilebilir (54).A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola, P. intermedia, F. nucleatum, E. corrodens, C. rectus, P. micra (daha önce Peptostreptococcus micros) ve S. intermedius bunlardan periodontitiste en sık izole edilen türlerdir. P. gingivalis, T. forsythia ve T. denticola, kırmızı kompleksi oluştururlar ve kronik periodontitiste önemli yer tutarlar (55). Özellikle P. gingivalis in, fimbria, hemaglutinin, kapsül lipopolisakkaritleri, peptidazları ve proteazları gibi kuvvetli virulans faktörleri bulunur ve doku yıkımına neden olur (56). PMNL lerin transepitelyal migrasyonunu engeller ve sitokin yıkımına yol açar (57,58). A. actinomycetemcomitans ın 5 farklı serotip ve çeşitli klonları mevcuttur. Lökotoksin, proteaz, kollojenaz salgılar ve apoptozu indükler (59). Lökotoksin, patojenitesinde önemli rol oynamaktadır. Her iki bakteri de periodontal dokulara invaze olabilmektedir. Biofilmdeki mikroorganizmalar immün sistem mekanizmalarını harekete geçirerek dişeti dokusunda iltihabi yanıtı başlatır. Gingivitiste oluşan doğal bağışık cevap, periodontal hastalıklarda oluşan iltihabi yanıtın başlangıcıdır. Mast hücreleri, yüzeylerinde mevcut olan kompleman reseptörlerinin uyarılmasıyla, histamin, heparin, eosinofil ve nötrofiller için kemotaktik faktör salgılarlar. Lökositlerin transendotelyal göçünü başlatabilmek için, endotel hücrelerine sinyal verirler. Bakteriyel uyaranla endotel aralıklarından dokuya geçen lökositler, bakterinin bulunduğu alana hareket ederek (kemotaksis) fagositoz olayına başlarlar. Hızlı ve akut oluşan iltihabi yanıtla problem çözülemezse, lenfosit ve makrofajların lokal dokulara göçüyle karakterize kronik iltihap safhası başlar. Kronik periodontitis de, kronik inflamatuar bir hastalıktır.

12 Kazanılmış bağışıklıkta (özgül bağışıklık) T ve B hücreleri, dendritik hücreler, monosit/makrofajlar önemli rol oynar. B hücreleri hücre dışı antijenlerin kontrolünden sorumludurlar. B hücreleri kendisine antijen sunulmasına gerek kalmadan, B hücre reseptörleri (BHR) ile doğrudan antijene bağlanır. Antijeni parçalayarak T hücrelerine sunarlar. Antijene maruz kalmadan önce immünglobulin M (IgM) salgılanır. Antijene maruziyetten sonra bazı B hücreler IgM salgılamak üzere plasma hücrelerine dönüşürler. Bazıları ise T hücre varlığında hafıza B hücrelere dönüşürler. Antijenle ikinci karşılaşmada hafıza B hücreleri de uygun antikoru salgılarlar. İmmünoglobulinlerin bilinen bir antijene bağlanmasıyla antikorlar oluşur. T hücreleri taşıdıkları T hücre antijen reseptörleri (THR) ile antijen sunucu hücrelerin yüzeylerinde bulunan MHC sınıf I ve MHC sınıf II molekülleri sayesinde antijeni tanırlar. T hücreleri CD4 ve CD8 koreseptörlerini taşıyıp taşımadıklarına göre sınıflandırılırlar. CD4 koreseptörleri, antijen sunucu hücreler olan dendiritik hücreler (DH), makrofajlar ve B hücreleri üzerinde bulunan MHC sınıf II moleküllerine bağlanırlar. Bunlar yardımcı T hücrelerdir (Ty). CD8 (+) T hücreler ise tüm hücrelerde mevcut olan MHC sınıf I moleküllerini tanırlar. Bunlar sitotoksik T hücrelerdir; bakteri, mantar, virüs gibi hücre içi antijenlerin kontrolünden sorumludurlar. T hücrelerinin aktivasyonu, bunların çoğalma ve farklılaşmalarına neden olur. IL-2 bu süreci destekler. CD4+ T hücreler çeşitli fenotipik alt gruplar oluşturmak için farklılaşırlar. Ty0 fenotipine dönüşen T hücreler, hem B hücreleri, hem de sitotoksik T hücreleri uyarabilen sitokinler salgılarlar. Ty0, makrofajlar, DH ler, doğal öldürücü hücreler gibi ortamdaki diğer hücrelerden gelen uyaranlarla Ty1 ve Ty2 fenotiplerine farklılaşır. Yüksek IL-12, seviyesi Ty1 e, düşük seviyeleri ise Ty2 ye faklılaşmayı uyarır. IFN-γ da Ty1 oluşumunu indükleyerek hücresel

13 bağışık yanıta yol açarken, Ty2 oluşumunu bloke eder. IL-4 ve IL-10 da Ty2 oluşumunu uyararak daha çok humoral bağışık yanıtı destekler, Ty1 i bloke eder (60). T yardımcı hücre alt grupları arasındaki dengenin periodontal hastalığın immün kontrolünde etkili olduğu düşünülmektedir (60,61). Bu hücrelerden salgılanan sitokinlerin dengesi, cevabın yıkıma yönelik mi yoksa koruyucu bir cevap mı olacağını belirleyerek, periodontal dokularda oluşan yıkımı kontrol eder. 2.2.1. Sitokinler Sitokinler, hem doğal hem de kazanılmış bağışık yanıtta rol oynayan hücreler tarafından salgılanan, hücreler arasında sinyal alışverişini sağlayan, çözünmüş yapıdaki proteinlerdir. Hücrelerin çoğalma ve farklılaşması (örneğin T hücre farklılaşması), iltihabi cevabın başlaması ve düzenlenmesi gibi birçok önemli görevleri vardır. Farklı hücreler arasında sinyalizasyonu sağladıkları gibi kendi salgılandıkları hücrelere de etki ederler. Bağışıklık sistem hücrelerinden salgılanmalarının yanında, dokuda yer alan epitel, endotel hücreleri ve fibroblastlardan da salgılanırlar. Periodontal hastalık da dahil olmak üzere, Romatoid Artrit (RA) ve benzeri birçok kronik inflamatuar hastalığın patogenezinde önemli rol oynarlar (1). İnterlökinler, primer olarak lökositlerle, inflamatuar süreçte yer alan epitel, endotel hücreleri ve fibroblastlar arasında iletişimi sağlayan düşük molekül ağırlıklı bir sitokin grubudur. Yirmiden fazla interlökin tanımlanmıştır (62). Bunların bir kısmı proinflamatuar yani inflamasyonu tetikleyici, bir kısmı da, antiinflamatuar yani inflamasyonu baskılayıcı sitokinlerdir. Periodontal dokuların immünolojisinde sıkça çalışılmış olan, başlıca proinflamatuar ve antiinflamatuar sitokinler şunlardır:

14 Proinflamatuar sitokinler: IL-1 TNF-α IL-8 IL-12 IL-6 IL-2 IL-17 IL -18 IFN-γ Antiinflamatuar sitokinler: IL-1ra IL-4 IL-10 IL-13 IL-11 TGF-β (Transforme edici büyüme faktörü - β)

15 Konak cevabının hem dişeti dokusunda, hem de invaziv olmayan bir yöntem olan dişeti oluğu sıvısının elde edilmesiyle incelenmesi periodontal hastalıkların diagnoz ve etiyopatogenezi açısından önemli bilgiler sunmuştur. Dişeti oluğu sıvısında bulunan sitokinler, enzimler, glikoproteinler, antikorlar ve daha birçok biyokimyasal medyatörleri belirleyebilmek için hibridizasyon, akış sitometre, ELISA, GZ-PZR gibi metodlar kullanılarak birçok deneysel yöntem geliştirilmiştir (63).Gingival sağlık durumunda serum menşeyli transüdal sıvı olarak cepten akışı bulunan DOS dişeti iltihabı ile birlikte eksudaya dönmektedir (64). Cep epitelindeki inflamasyon ve damarsal geçirgenliğin artmasıyla, DOS miktarında da artış gözlenmektedir. İçeriği üç ana başlık altında toplanabilir: (65) 1- Konak kaynaklı enzimler ve inhibitörleri (örn; alkalen fosfataz, myeloperoksidazlar, kollojenazlar vb.) 2- Doku yıkım ürünleri (örn; glikozaminoglikanlar, osteokalsin, osteopontin, pridinolin kroslinkleri vb.) 3- İnflamatuar medyatörler ve konak cevabını değiştiriciler (örn; çeşitli sitokinler, antikorlar, PGE 2 vb.) 2.2.2 İnterlökin 1 ve Periodontal Hastalıklar: IL-1 protein ailesi IL-1a, IL-1β, IL-1ra ve IL-18 i de içeren dokuzdan fazla proteinden oluşur (66,67). IL-1a, IL-1β özgül bir reseptöre bağlanarak agonist çalışırlar. IL-1ra ise, aynı reseptöre antagonist bağlanır. Patolojik durumlarda birçok hücre IL-1 üretimi yapsa da, esas olarak monositler ve lenfositler tarafından salgılanmaktadır. Lipopolisakkarit, endotoksin gibi mikrobiyal ürünler IL-1 salınımını stimüle eder. Ayrıca IL-1 in kendisi de makrofajlardan kendi salınımını indükler.

16 Hedef hücreler üzerindeki etkisini, hücre membranındaki IL-1RI ve IL-1RII reseptörleri yoluyla göstermektedir (68). Etkileri, IL-1RI reseptörünün antagonisti olan IL-1ra tarafından bloke edilebilir (69). İnterlökin-1 otoimmün ve inflamatuar hastalıklarla ilişkili genlerin ekspresyonunu stimüle eden çok fonksiyonlu bir sitokindir. Prostoglandin E2, IL-6, TNF-a gibi sitokinler, kemokinler ile nitrik oksit sentetaz, matriks metalloproteinazlar (MMP) gibi birçok effektör proteinin ekspresyonunu uyararak immün regülasyonda önemli rol oynar (70). IL-1 güçlü bir proinflamatuar sitokin olup endotel hücrelerinden selektin ekspresyonunu stimüle ederek PMNL lerin transendotelyal geçişini hızlandırır ve erken inflamatuar yanıtta önemli fonksiyona sahiptir. Lökositler için kemoatraktan olan IL-1, antijen sunucu hücreler ile T ve B lenfositlerini direkt veya dolaylı olarak uyarabilir (2). Kronik inflamatuar hastalıklarda önemli rol oynayan Ty hücreleri aktive eder. (2,71). IL-1 in sahip olduğu biyolojik aktiviteler, romatoid artrit, periodontitis gibi kronik iltihabi hastalıkların patogenezinde sıkça araştırılmasına neden olmuştur. Patalojik durumlarda, MMP aktivasyonu ile hem bağ dokusu yıkımına, hem de osteoklast aktivasyonununa neden olarak kemik yıkımına yol açar (72). Dişeti fibroblastları IL-1 ile stimüle edildiğinde salgıladıkları kollojenaz miktarı artarken, serbest TIMP (matriksmetalloproteinazların doku inhibitörü) miktarının azaldığı gözlenmiştir (73,74). Deneysel ve klinik çalışmalar, IL-1β nın periodontal hastalıkların patogenezindeki önemini ortaya koymuştur. Rekombinant insan IL-1β, ligatürle oluşturulan periodontitis modelinde sıçanlara uygulandığında, 2 hafta sonunda, kemik kaybının kontrol grubuna göre daha fazla

17 olduğu gözlenmiştir (75). Dişeti oluğu sıvısında artmış IL-1 seviyesi, gingivitis oluşumu ve şiddetli periodontitis ile ilişkili bulunmuştur (3). Şiddetli kronik periodontitis hastalarında IL-1β artışıyla birlikte, azalmış IL- 1ra seviyeleri gözlenmiştir (76). Ek olarak, aktif periodontal lezyonlarda, yani ilerleyen kemik ve ataçman kaybının gözlendiği durumlarda, inaktif alanlara göre IL-1β düzeyi yüksek bulunmuştur (76). Periodontal indeksler ve DOS taki IL-1β seviyesinin değerlendirildiği bir çalışmada, IL-1β seviyesi kemik kaybı ve periodontal CD ile ilişkili bulunmuştur (77,78). Benzer sonuç ve ilişkiler dişeti IL-1β değerleri için de gösterilmiştir (78,79). Periodontal hastalıklarda artmış seviyelerde görülmesinin yanısıra, biyofilm uzaklaştırılıp, klinik durum iyileştiğinde IL-1β düzeylerinde azalma gözlenmiştir (80). Deneysel çalışmalarda, IL-1, inhibe edildiğinde, ataçman ve kemik kaybı, inflamatuar hücre miktarı anlamlı olarak azaldığı saptanmıştır (4,5). Dişeti iltihabını ve kanamayı, periodontal cebi, yumuşak doku ve kemik yıkımını ortadan kaldırmaya yönelik cerrahi ve cerrahi olmayan periodontal tedavilerin uygulanmasının DOS ta proinflamatuar sitokin seviyelerini değiştirdiği bilinmektedir (81,82). Sattari ve ark. (83) 20 kronik periodontitisli bölgeye, periodontal flep cerrahisi uygulamışlar ve DOS örneklerinde flep cerrahisi sonrası IL-1β konsantrasyonlarının azaldığını tespit etmişlerdir. Generalize agresif periodontitis hastalarında yapılan diğer bir çalışmada cerrahi olmayan periodontal tedaviler sonrasında DOS ta IL-1β düzeylerinde azalma gözlenirken, IL- 10 seviyesinde artış saptanmıştır (84). Tüm bu çalışmalar ve verileri, IL-1β nın periodontal hastalıkların patogenezindeki rolüne ışık tutmakta ve hastalıkların teşhisinde,

18 şiddetinin saptanmasında ve tedaviye yanıtın değerlendirilmesinde önemli bir parametre olabileceğini göstermektedir. 2.2.3. IL-10 ve Periodontal Hastalıklar İnterlökin-10 immünsüpresif etkileri bulunan pleiotropik bir sitokindir (85). Aktive T ve B lenfositlerden, özellikle de monosit/makrofajlardan salgılanır. IL-1, IL-6, IL-8 ve TNF de dahil olmak üzere monosit kaynaklı proinflamatuar sitokinleri inhibe eder ve LPS ile stimüle edilmiş PMNL lerde IL-1ra nın üretimini arttırır (7). Özellikle de Ty 2 lenfositlerden salgılanırak, Ty 1 hücre klonlarından ve aktive makrofajlardan sitokin üretimini baskıladığı bildirilmiştir (86,87). İnterlökin-10 un antiinflamatuar ve immünsüpresif etkileri farklı hücre tiplerinde in vivo olarak gösterilmiştir (88,89). IL-10 eksikliğinde, bakteri kaynaklı kronik inflamatuar durumlara karşı konağın duyarlılığı artabilir (90). Hayvan çalışmaları, bağ dokusu yıkımıyla karakterize, kronik iltihabi bir hastalık olan artiritin ilerleme hızının, IL-10 un antiinflamatuar etkisiyle yavaşlatılabileceğini göstermiştir (8,9). Bu etkilerinden dolayı IL-10 un akut iltihabi yanıtın başlamasını ve ilerlemesini sınırlayan, düzenleyici bir rolü olduğu düşünülmektedir. Metalloproteinazların üretimini inhibe ederek, ve makrofajlardan metalloproteinazların inhibitörlerinin üretimini arttırarak doku yıkımının engellenmesine de yardımcı olur (91). IL-10 DOS ta sağlıklı ve periodontal hastalıklı bölgelerden izole edilebilmekte, ancak saptanabilme oranı cep derinliğine ve farklı klinik durumlara göre değişkenlik gösterebilmektedir (82,92,93). Toker ve arkadaşlarının (93) agresif periodontitis hastalarında yaptığı çalışmada, IL-10 tespit edilme sıklığı, 4-6 mm arasındaki ceplerde %57.5, 3 mm den

19 küçük olanlarda %26.7, sağlıklı grupta %33.3 olarak bulunmuştur. Başka bir çalışmada, kronik periodontitis hastalarında bu oran %43 bulunurken, sağlıklı grupta hiç tespit edilememiştir (82). Cep derinliğinin 4-6 mm arasında olduğu bölgelerde IL-10 konsantrasyonu, 3 mm den küçük olanlara göre daha fazladır. Bunlara karşılık Goutoudi ve ark. (92) tarafından yapılan bir çalışmada, DOS ta sağlıklı bölgelerde, kronik periodontitisli bölgelere kıyasla IL-10 konsantrasyonu yüksek saptanırken, total IL-10 değerleri benzer bulunmuştur. Dişeti dokusunda yapılan başka bir incelemede, IL-10 mrna ekspresyonları kronik periodontitisli hastaların dişeti dokularında, istatistiksel olarak anlamlı olmasa da, sağlıklı dokulara kıyasla daha yüksek saptanmıştır (94). Tedaviye yanıt değerlendirildiğinde, IL-10 seviyelerindeki değişimler konusunda da yine farklı sonuçlar mevcuttur. Toker ve ark.(93) ile Oliveira ve ark.(84) agresif periodontitis hastalarında cerrahi olan ve olmayan periodontal tedaviler sonucu DOS ta IL-10 düzeylerinde fark gözlememişlerdir. Benzer sonuçlar kronik periodontitis hasta gruplarında da tespit edilmiştir (92). Başka bir çalışmada ise, tek seansta tüm çene derin diştaşı temizliği ve kök düzeltmesinden sonra üçüncü ayda IL-10 seviyelerinde artış saptanmıştır (95). Periodontal patogenezde IL-10 un önemi hayvan çalışmalarıyla da kanıtlanmıştır. IL-10 un, P. gingivalis ile oluşturulmuş periodontal hastalıkta, Ty 1 yolunu baskılayarak, alveoler kemik yıkımını engellediği saptanmıştır (96). Periodontitisle benzer patogeneze sahip artrit modellerinde, IL-10 yoksun farelerde daha şiddetli yıkım potansiyeli gözlenmiştir (97,98). IL-10 un rapor edilmiş, in vitro ve in vivo güçlü antiinflamatuar ve immünolojik etkileri göz önünde bulundurulduğunda, periodontal yıkımı mevcut hastalarda giderek daha fazla araştırılmaktadır.

20 2.3. Osteoimmünoloji: İmmün Sistem ve Kemik İlişkisi Kemik dokusu, kaslara ve organlara yapısal bütünlük sağlamakla birlikte, kırmızı ve beyaz kan hücrelerinin üretimi, kalsiyum ve fosfatın depolanması gibi birçok önemli fonksiyonu olan mineralize bağ dokusudur. Kemik metabolizmasının düzeni, ömür boyu sürmekte olan, olgunlaşmış kemiğin yıkımı ve yeni kemik oluşumuyla karakterize bir dengeyle sağlanır. Bu dengenin çeşitli faktörler nedeniyle bozulmasıyla, osteoporoz, osteopetroz, Paget hastalığı gibi metabolik kemik hastalıkları ortaya çıkmaktadır (15). Günümüzde, anormal kemik metabolizmasıyla ilgili hastalıkları anlayabilmek için artık immün sistem ve kemik metabolizması birlikte değerlendirilmektedir. Kemik ve immün sistem arasındaki temel ilişkiler şu şekilde sayılabilir: (99) 1- Kemiği oluşturan osteoblast hücreleri, tüm kan ve immün sistem hücrelerinin köken aldığı hematopoetik kök hücre nişlerinin kritik bir düzenleyicisidir. 2- Kemiği rezorbe eden hücreler olan osteoklastlar ile immün sistem hücrelerinden monosit/makrofajlar, kemik iliğinde aynı hematopoetik öncü hücreden köken almaktadır. 3- İmmün sistemde rol oynayan sitokin, kemokin, büyüme faktörü gibi birçok medyatör, aynı zamanda osteoblast ve osteoklast aktivitesini de düzenlemektedir. 4- Romatoid artrit, iltihabi bağırsak hastalığı, periodontal hastalık gibi patolojik durumlarda osteoklastlar ve aktive immün sistem hücreleri; sitokinler, reseptörler, transkripsiyon faktörleri gibi düzenleyici molekülleri ortak kullanmaktadırlar.

21 Osteoklast oluşumunu ve aktivasyonunu düzenleyen mekanizmalar RANKL (receptor activator of nuclear factor k-β ligand)/rank (receptor activator of nuclear factor k-β) sinyal sistemi ile daha anlaşılır bir hale gelmiştir ve belirlenenkısaltma bu sitokin için kabul gören terminolojik isim olarak beyan edilmiştir (10). RANKL, osteoblastlar ve aktive T hücrelerde membrana bağlı olarak bulunan veya başta aktive T hücre olmak üzere başka hücrelerden de salınan homotrimerik bir proteindir (11,12). Salınan protein, proteolitik parçalanma veya alternatif bölünmeyle membran formundan ortaya çıkmaktadır (13). Lenf bezlerinden, timustan, akciğerlerden, sinoviyal hücrelerden, az miktarlarda dalak ve kemik iliği gibi farklı dokulardan da salgılanır (12). Hamile farelerde meme bezi lobüllerindeki epitelyal hücrelerden salgılandığı da gösterilmiştir ve laktasyon sırasında süt üretimi için bu hücrelerin hiperplazisinde rol almaktadır (100). Ek olarak RANKL dan genetik olarak yoksun farelerde lenf bezlerinin oluşmadığı gözlenmiştir. Lenfosit farklılaşmasında defektler tespit edilmiştir (101). RANKL ın tümör hücrelerinin migrasyonu ve kemik metastazları üzerine etkileri de mevcuttur (102). RANKL ın hem osteoklast farklılaşmasına olan direkt etkisi hem de T hücreler gibi immün sistem hücrelerinden salınarak immünolojik fonksiyonlarının olması sebebiyle, RANKL/RANK ve antagonist reseptörü olan osteoprotegrin (OPG), immün sistem ile kemik metabolizması arasındaki yakın ilişkinin anahtar düzenleyicileri olarak düşünülmektedir. RANK da, RANKL gibi TNF reseptör süperailesinden, homotrimerik bir transmembran proteinidir ve RANKL ın biyolojik olarak aktif reseptörüdür. Osteoklast prekürsörleri (OCP) ve olgun osteoklastlar ile dendritik hücreler üzerinde bulunmaktadır (14). Meme bezlerindeki epitelyal hücrelerden, metastaz potansiyeli yüksek olan prostat ve meme kanser hücrelerinde de eksprese edilmektedir (103,104). RANK

22 yoksun farelerde de, RANKL yoksun farelerdeki gibi, osteoklast oluşumu gözlenmemesi, RANKL ın osteoklastlar tarafından eksprese edilen RANK a spesifitesini doğrulamaktadır (14). Nadir bir otozomal dominant kemik hastalığı olan ailesel ekspansil osteoliz hastalığı, RANK ta tespit edilen fonksiyonel mutasyonlarla ilişkili görülmüştür (105). OPG, osteoklastogenezi inhibe edici faktör olarak da bilinen, primer olarak osteoblastlardan salınan bir proteindir. RANKL a bağlanmak için RANK ile yarışan, RANKL ın antagonist reseptörüdür. Osteoblastlardan RANKL ekspresyonunu uyaran birçok faktör, aynı zamanda OPG salınımını da düzenlemektedir (106). Karşıt görüşler olsa da, genellikle RANKL ekspresyonu artınca, OPG salınımı azalır veya RANKL kadar artmaz, RANKL/OPG oranı osteoklastogenez yönüne doğru kayar (12,107). Farelerde yapılan bir çalışmada B hücrelerinin, kemik iliğindeki OPG üretiminin %64 ünden sorumlu olduğu ve B hücre defekti olan farelerin osteoporotik olmasının bunu desteklediği düşünülmektedir (108).

23 Şekil 2.1. RANKL/RANK/OPG sistemi RANKL, RANK ile bağlandığında, osteoklast farklılaşmasına yol açan sinyal iletimini başlatır. Olgun osteoklastlarda da RANK yoluyla yine kemik yıkıcı aktiviteyi uyarır. Osteoblast tlar tarafından salgılanan OPG ise, RANKL a bağlandığındaa osteoklastogenezz ve osteoklast aktivasyonları inhibe olmaktadır (Şekil 2.1) (15). İltihabi kronik kemik hastalıklarında, bu b üçlü sistemin dengesi önemli rol oynamaktadır. Ek olarak, çeşitli mekanizm malarla, sitokinler OCP leri ve osteoklastları uyarmaktadır. 1980 lerin başında IL-1β bu faktörlerden biri olarak tanımlanmıştır (109). Vitamin D 3,PGE 2, paratiroid hormon ve IL-1, IL-6, IL-11, IL-17, TNF-α gibi T lenfosit kaynaklı sitokinler de RANKL ekspresyonunu arttırırlar (15,110). İltihabi kemik yıkımı olduğu durumlarda, aktive T lenfositlerin de fazlaca RANKLL salgılamasıyla, kemik yıkımının şiddetlendiği düşünülmektedir (16). Osteoimmünoloji

24 kavramının ortaya çıkmasında T lenfosit RANKL ilişkisi rol oynamaktadır (15,16). İn vitro hücre kültüründe aktive T hücrelerin RANKL yoluyla osteoklastogenezi direkt uyardığı gösterilmiştir (18,111). T hücrelerin sistemik aktivasyonu in vivo olarak RANKL bağımlı osteoklastogenezde artışa neden olmuştur. T hücrelerin in vitro ve in vivo olarak gözlenen bu etkileri OPG uygulamasıyla engellenebilmiştir (111). T hücrelerden genetik olarak yoksun farelerin normal kemik yapıya ve diş sürmesine sahip olması T lenfositlerin fizyolojik normal kemik yapım-yıkım döngüsünde değil, patolojik durumlarda RANKL salgılamasının artmasıyla etkili olduğunu düşündürmektedir (101,112). Osteopetrotik fenotipte RANKL yoksun farelerde, transgenik olarak sadece T/B lenfositlerinden RANKL salınımı sağlandığında, durumun düzeldiği gözlenmiştir (99). Kronik inflamatuar bir yıkımın gözlendiği romatoid artrit lezyonlarından izole edilen T lenfositlerde RANKL mrna tespit edilmiştir (18). Teng ve ark.(19) A. actinomycetemcomitans ile enfekte agresif periodontitis hastalarından T lenfositleri izole etmişlerdir ve T lenfositlerin A. actinomycetemcomitans a karşı RANKL eksprese ettiğini görmüşlerdir. A. actinomycetemcomitans ile oral olarak enfekte edilen sıçanlara, hastalardan alınan T lenfositlerin transferi ile şiddetli kemik yıkımı gözlenmiştir. Kemik yıkımının OPG ile baskılanabilmesi, transfer edilen T hücrelerden salınan RANKL ın yıkımı uyarmış olabileceği görüşünü desteklemiştir (19). 2.4. Periodontal Hastalıklar ve RANKL/RANK/OPG Kronik inflamatuar bir hastalık olan periodontitislerde, patojene karşı konağın verdiği karmaşık bir immün yanıt sonucu kollajen ve alveol kemiği yıkımı görülmektedir. Periodontitisi karakterize eden inflamatuar yanıtla birlikte, bu hastalıkta kemik yıkımı görülmesi,

25 patogenezle ilgili araştırmaların osteoimmünoloji disiplini çatısında yerini almasına neden olmuştur. Periodontitiste, gingival dokularda lenfosit (T ve B lenfositler), makrofaj ve nötrofil infiltrasyonu görülür ve hastalığın patogenezini anlayabilmek için bu inflamatuar hücrelerin stromal hücrelerle (osteoblastlar, periodontal ligament ve gingival fibroblastlar) ilişkisini anlayabilmek önemlidir. Makrofajlar ve T lenfositler, IL-1, IL-6, TNF-α, PGE 2 gibi osteoblastlardan RANKL üretimini uyaran sitokinler salgıladığı gibi, T lenfositler direkt RANKL salgılayarak da osteoklast farklılaşmasını uyarabilir (17). Periodontal hastalıklarda bu sitokinler ve özellikle de IL-1 sıkça çalışılmıştır (3,75,76,82,84,113). Periodontitisli dokularda RANKL mrna ekspresyonu incelendiğinde, RANKL + alanlar, RANKL - alanlara göre daha derin periodontal cebi olan bölgelerdir, yani kemik yıkımının daha fazla olduğu bölgelerdir (16). Liu ve ark. (114) da, ilerlemiş periodontitiste, orta şiddette veya sağlıklı olan gruba göre RANKL mrna ekspresyonunu daha fazla saptamışlardır. Hücresel düzeyde RANKL ın nereden salgılandığını anlayabilmek için in situ hibridizasyon yapılması sonucu, temel olarak lenfositlerden ve makrofajlardan salgılandığını rapor etmişlerdir. Başka bir çalışmada kemik kaybına komşu granülasyon dokusunda, sağlıklı dişeti dokusuna kıyasla daha fazla RANKL proteini tespit edilmiştir (22). OPG proteini daha çok sağlıklı dokuda ve epitel ile ilişkili bulunurken, RANKL T lenfositler ile ilişkili bulunmuştur. Kawai ve ark. (23) kronik periodontitisli ve sağlıklı dokulardan aldıkları örneklerde, doku homojenatları oluşturarak ELISA ile çözünebilir RANKL ve OPG seviyelerini değerlendirdikleri araştırmada, RANKL konsantrasyonu hastalıklı dokuda daha fazla bulunmuştur ve cep derinliği ile pozitif korelasyon saptanmıştır. OPG konsantrasyonu iki grup arasında farklılık göstermemiştir. RANKL ın en