1 GIDALARDA ASKORBİK ASİT TAYİNİ Genel Bilgi Vitaminler bilinen besin değerlerinden ayrı yapıda, normal büyüme ve yaşamın sürdürülebilmesi için önemli organik maddelerdir. Vitaminlerden herhangi biri vücuda alınmazsa, o vitaminin yardımcı olduğu kimyasal reaksiyon yürümeyeceğinden dolayı büyümede ve vücut çalışmalarında aksamalar olabilir. Vitaminlerin vücut çalışmasındaki etkileri, biyokimyasal reaksiyonların düzenlenmesiyle ilgilidir. Vitaminlerin insan sağlığına etkisini üç grupta toplayabiliriz; Büyümeye yardım Sağlıklı nesillerin oluşmasına yardım Sinir ve sindirim sistemlerinin normal çalışması, besin öğelerinin elverişli olarak kullanılması ve vücut direncine yardım. Vitaminlere, tüm metabolik faaliyetlerde çok düşük miktarlarda gerek duyulur. Bugün vitamin olarak tanımlanmış 15 bileşik bulunmaktadır. Bu bileşikler: Gıdalardan aktif vitamin yapısında vücuda alınabildiği Provitaminler (vitamin öncüsü) halinde vücuda alındıktan sonra bir dizi kimyasal değişikliğe uğrayarak bir ya da daha fazla vitamin aktivitesi gösteren bileşiğe dönüşür. Vitaminler gıdalarda farklı miktarlarda bulunur ve farklı dağılımlar gösterir. Bazı gıdalar bir veya birkaç vitamince oldukça zengin olmalarına rağmen bazı vitaminleri eser düzeyde içerir. Gıdalarda vitamin analizleri: Gıdadaki vitamin değerini belirlemek Mevzuata uygunluğunu araştırmak Etiket bilgilerine uygunluğunu araştırmak üzere yapılabilir. Gıdalardaki vitamin analizleri; volumetrik titrasyon ve enstrümental analiz yöntemle tayin edilebilir. Çoğu gıda maddesindeki vitamin analizleri spektroskopik yöntemlerle yapılabilmektedir. Bunun için gıda maddesindeki vitamin uygun çözücülerle (çoğunlukla asidik ortamda) özütlenip çözeltiye alınır. Çözelti özel bir kromotografik kolondan geçirilerek vitaminler ayrılır ve fluometri veya başka optik yöntemler kullanılarak miktarları bulunur. Doğruluk açısından en geçerli olan yöntem HPLC yöntemidir. Fakat çok pahalı olduğu için pek tercih edilmemektedir. Gıdalarda en çok yapılan vitamin analizleri; Meyve ve sebze ürünlerinde, gazozda A vitamini (beta karoten) tayini Bitkisel margarinlerde A ve D vitamini tayini Meyve ve sebze ürünlerinde C vitamini tayinidir. Erime noktası 192 ºC ve molekül ağırlığı 176 olan, renksiz kristallerden oluşan C vitamini, bir antiskorbüt faktörüdür. Hem indirgen gücü olan hem de asidik özellik veren bir dienol grup ihtiva eder. Benzen, eter, petrol eter, kloroform ve yağda çözünmez. C vitamini (Askorbikasit) vitaminler arasında en dayanıksız olanıdır. Alkalilere ve oksidasyona karşı ve özellikle Cu ve Fe gibi katalizörler bulunduğu zaman çok hassastır. Kuru kristaller halinde iken dayanıklıdır. Asit çözeltilerinde de ( ph 4 den aşağıda) oldukça dayanıklıdır.
2 Askorbik asit havanın oksijeni ile de okside olur. Bu oksidasyon sonucu molekül vitamin aktivitesini kaybeder. Doğada indirgenmiş (C6H8O6) ve yükseltgenmiş (C6H6O6) şeklinde bulunur. Eksikliği; Kılcal damar çeperlerinin zayıf bir yapı kazanmasına, Diş etlerinin kolaylıkla kanamasına, dişlerin gevşemesine, Eklem hastalıklarına neden olmaktadır. Ayrıca cildin ve bağ dokuların önemli bir unsuru olan kollagen ile proteinin normal oluşumu için gereklidir Askorbik asit tayini 1. Ekstraksiyon Askorbik asit analizine geçmeden önce, analiz yapılacak olan örnek durumuna gör bir dizi işlemden geçirilerek analize hazırlanmalıdır. Eğer örnek katı ise, 200-300 g örnek aynı miktar %6 lık okzalik asit ile blender da iyice homojeniz edilir ve karışımdan 10-4 g tartılarak %3 lük okzalik asit ile 100 ml lik balona aktarılarak çizgisine kadar tamamlanır ve filtre edilir. Eğer örnek sıvı ise, doğrudan 20 g veya 20 ml alınarak 100 ml lik balona aktarılır. %3 lük okzalik asit ile hacmine tamamlanır. Daha sonra filtre edilir. 2. Deneyin prensibi Kuvvetli indirgeyici olan askorbik asidin 2,6 diklorofenolindofenol boya çözeltisi ile yapılan titrasyon sonucu oluşan dehidro askorbik asidin pembe renk oluşturmasıdır. 3. Askorbik asidin titrimetrik olarak belirlenmesi Örneğin limon püresinde askorbik asit analizi yapılmak istensin. Bu amaçla 10 g örnek 90 ml okzalik asit çözeltisi ile karıştırılıp süzülür ve süzüntüden 10 ml bir erlenmayere aktarılır. Daha sonra büretteki boya (diklorofenolindofenol) çözeltisi ile kalıcı pembe renk oluşana kadar titre edilir ve sarfiyat kaydedilir. Aynı işlem bir de standart askorbik asit çözeltisi ile tekrarlanır. Bu kez erlene alınan örnek yerine standart askorbik asit çözeltisinden alınır (5mL). Daha sonra 5 ml okzalik asit çözeltisi eklenir ve işlem sonunda standart askorbik asit çözeltisi için harcanan boya çözeltisinin miktarı da kaydedilir ve hesaplamaya geçilir. Not: Standart askorbik asit çözeltisi için 10 mg askorbik asit 50 ml okzalik asit çözeltisi içinde çözündürülür.(0.2 mg/1 ml) Sonucun hesaplanması: Bir örnekte askorbik asit analizi yapıldığını varsayalım. Standart için harcanan boya çözeltisinin 8 ml, örmek için harcanan boya çözeltisinin ise 1.5 ml olduğu kabul edilirse; 8.0 ml boya çözeltisi 5 ml standart askorbik asit çözletisi tarafından indirgenmiştir. 5 ml çözeltide 1 mg Askorbik asit vardır (5 mlx0.2mg/1 ml) O halde;
3 8.0 ml boya 1mg Askorbik aside eşdeğer 1.5 ml boya 0.188 mg askorbik aside eşdeğerdir. Örnek çözeltisi 10 ml olarak alındığı için 10 ml örnek çözeltisinde 0.188 mg Askorbik asit varsa 100 ml çözeltide x X=0.188x100/10=1.88 mg/100 Ml çözelti olacaktır. Çözelti hazırlanırken 10 g örnek tartılıp 100 ml ye tamamlandığı için de bu miktar 10 g örnek için geçerli olacaktır 10 g örnekte 1.88 mg askorbik asit varsa 100 g örnekte x X=100x1.88/10= 18.8 mg/100 g örnek
4 GIDALARDA ŞEKER TAYİNİ (LANE EYNON) Karbonhidratlar, bitkiler tarafından sentezlenen temel besin öğelerinden biridir. Sebze ve meyveler ile bunlardan üretilmiş gıdalar daima karbonhidrat içerir.bunlar; başlıca glikoz, fruktoz ve sakkaroz olmak üzere üç tip karbonhidrat içerir. Bu karbonhidratlardan glukoz, galaktoz ve fruktoz monosakkarit; sakkaroz, laktoz ve maltoz ise disakkarittir. Gıdalarda şeker tayinleri, aşağıdaki nedenlerden dolayı yapılmaktadır: Gıdaların bileşiminde bulunan toplam şeker ve invert şeker miktarını tespit etmek Prosese (üretimin işlemlerine) yön vermek İçeriklerinde sahip oldukları enerji miktarını bulabilmek Standarda uygun olup olmadığını saptamak Şeker tayin yöntemlerinin ilkesi, karbonhidratların indirgen özelliğinden yararlanmaya dayanmaktadır. Tüm monosakkaritler indirgen özelliktedir. Bunun yanı sıra disakkaritler kendilerini oluşturan monosakkaritlerin bağlanma şekline göre laktoz ve maltozda olduğu gibi indirgen özelliği gösterir ya da sakkarozda olduğu gibi göstermez. Polisakkaritlerin indirgeme özelliği, sadece zincirin en ucundaki gruptan kaynaklandığı ve bunların indirgeme gücü çok büyük moleküllerine göre düşük düzeyde kaldığından çoğu kez, bunların indirgeme özelliğinin olmadığı varsayılır. Şeker tayininde karbonhidratların indirgen özelliğinden yararlanıldığı için buna dayalı metotlarda indirgen şekerlerin toplu tayin edilebildiği, ayrı ayrı miktarlarının belirlenemeyeceği açıktır (glukoz ve fruktozun ayrı ayrı değil, invert şeker adı altında beraber saptanması gibi). Sakkaroz miktarı, önce sakkaroz invert şekere dönüştürülmekte, sonra oluşan invert şekerin indirgen özelliğinden yararlanılarak tayin edilmektedir (toplam şeker tayini). Ekstraksiyon İncelenecek materyal taze bir meyve veya sebze ise; Şeker tayini yapılacak örnek, doğrudan bir blenderde parçalanır. Gerekirse belli miktarda örnek tartıldıktan sonra üzerine yine tartılarak belli miktarda su konup bir blenderda homojen hâle getirilir. Daha sonra bu homojenize edilmiş örnekten analiz yönteminde belirtilen miktarda analiz örneği tartılır ve eklenen su miktarı göz önünde bulundurularak alınmış bulunan örneğin gerçek miktarı hesaplanır. Konserve, reçel ve marmelat gibi gıdalarda da aynı yol izlenir. İncelenecek materyal toz bir gıda ise; Doğrudan doğruya bir ölçüm balonuna tartım yapılır. Üzerine 65 ºC ye kadar ısıtılmış saf su konduktan sonra bir çalkalama makinesinde 30 dk kadar çalkalanır. Daha sonra soğutulup diğer işlemlere geçilir. İncelenecek materyal kuru bir meyve veya sebze ise; Tartılan örnek belli ağırlıktaki ılık su ile ıslatılıp suyu çektirildikten sonra bir blenderda homojen hâle getirilir. Daha sonra homojenize edilmiş örnekten analiz yönteminde belirtilen miktarda analiz örneği tartılır ve yine analiz yönteminde belirtilen miktarda saf su ile seyreltilir. Sıvı gıdalar istenilen miktarda doğrudan alınır. Prensibi Bu yöntemde invert şekerin Fehling çözeltisinde bulunan bakır-2 oksidi, suda çözünmeyen bakır-1 okside indirgemesi reaksiyonu ilkesine dayanır.
5 Bakır oksit suda çözünmediğinden tayinde, bakırın suda çözünen kompleks tuzu (senyet tuzu) kullanılır. Ortamın bazikliği NaOH sağlar. Çözünebilir bakır tartarat iyonu bu çözeltide mavidir. Bakırın indirgenmesi ile oluşan bakır iyonları, tartaratla kompleks iyon oluşturmadığından bakır-1 oksit hâlinde ayrılıp çöker. İndikatör olarak kullanılan metilen mavisi bazik ortamda mavi, şeker olduğunda ise renksizdir. Bu nedenle titrasyonun bitiş noktasında renksiz hâle gelir ve ortam bakır kırmızısı olur. Durultma Şeker tayininde, karbonhidratların indirgen özelliğinden faydalanıldığından, ortamda şeker gibi indirgen özellik gösteren diğer maddelerin olmaması ve şekerin indirgen özelliğine dayalı reaksiyonu engelleyecek maddelerin ortamdan uzaklaştırılması gerekir. Bu nedenle şeker tayininde daima bir durultma işlemi uygulanmalıdır. Bu amaçla Carez çözeltilerinden faydalanılır. Şeker tayini için gerekli olan çözeltiler Fehling A çözeltisi: 69.278 g bakır sülfat (CuSO4.5H2O) 250 ml saf suda çözündürülerek 1 litrelik balon jojeye aktarılır ve hacim çizgisine kadar saf su ile tamamlanır. Bu çözelti en fazla 24 saat dayanacağından taze hazırlanmalıdır. Fehling B çözeltisi: 346,09 g potasyum sodyum tartarat (KNa-tartarat.4H2O) bir miktar saf suda çözülür. 100 g sodyum hidroksit tartılır ve bir miktar saf suda çözülür. İki çözelti birbiri ile karıştırılıp 1 litrelik hacme saf su ile tamamlanır. 4 gün dinlendirildikten sonra süzülerek renkli bir şişede saklanır. % 1 lik sulu metilen mavisi çözeltisi: 1 g metilen mavisi saf suda çözdürülür ve saf su ile 100 ml ye tamamlanır. Standart glukoz çözeltisi: 500 mg glukoz tartılıp 100 ml ye saf su ile tamamlanır. %25 lik HCl:337 ml %3 lik HCl 500 ml2ye saf su ile tamamlanır. 4 N NaOH: 16 g NaOH tartılır ve 100 ml ye tamamlanır. Örnek çözeltileri: Elma suyu örneğinde şeker analizi yapılmak istendiğinde, Toplam 50 ml elma suyu 100 ml hacimli balona alınır ve üzeri saf su ile tamamlanır. Invert şeker tayini Glikoz, sahip olduğu aldehit grubuyla bazı maddeleri indirgeyebilmektedir. İndirgeme özelliği bulunan şekerlere indirgen şekerler denir. Sakkaroz oluşurken yapısında glikoz ve fruktozun reaktif grupları birbirleri ile birleştiğinden serbest reaktif grup kalmamaktadır. Bu nedenle sakkarozun indirgen özelliği yoktur. Eğer sakkaroz herhangi bir yolla kendini oluşturan glikoz ve fruktoza parçalanırsa yeniden indirgen özellik kazanır.
6 Sakkaroz, enziminin veya asitlerin etkisiyle hidrolize olur; yani 1 mol su alarak glikoz ve fruktoza parçalanır. Böylece 1 mol sakkaroz (342g) 1 mol su kazanarak (18 g), 1 mol glikoz ( 180 g) ve 1mol fruktoz ( 180 g). Yani toplam 360 g invert şeker oluşmaktadır. Bu durumda invert şeker dendiği zaman, hangi yolla oluşmuş olursa olsun glikoz ve fruktozdan ibaret kısım anlaşılmalıdır. Klasik yöntemlerle glikoz ve fruktoz ayrı ayrı tayin edilmediğinden daima invert şeker olarak toplamı bulunur. Toplam Indirgen şeker tayini için; Önceden hazırlanmış olan numune çözeltisi bürete doldurulur. Daha sonra bir erlene 5 ml fehling A, 5 ml Fehling B çözeltisi konur ve bir hotplate üzerinde kaynaması sağlanır. Kaynamaya yakın 2-3 damla metilen mavisi damlatılır ve kaynamaya başladığında erlendeki karışım bürette bulunan örnek çözeltisi ile titre edilir. Kiremit kırmızısı renk oluşumu titrasyonun bitirileceği dönüm noktasıdır. İşlem sonunda sarfiyat kaydedilir. Aynı işlemler standart glukoz çözeltisi ile tekrarlanır ve glukoz çözeltisi içinde sarfiyat kaydedilir. Daha sonra hesaplamaya geçilir. Toplam şeker tayini için; Örnekte bulunan sakaroz, Fehling çözeltileri ile tepkime vermediği için önce uygulanacak bir inversiyon işlemi ile sakarozun glukoz ve fruktoza parçalanması sağlanacaktır. Örnek (50 ml) bir balon jojeye (100 ml hacimli) aktarılır ve üzerine 6 ml %25 HCl ilave edilir. Örnek 70 ºC de ki suda 7.5 dk süreyle tutulur ve daha sonra soğutularak fenolftaleyn indikatörlüğünde 4 N NaOH ile nötürlenir ve 100 ml ye saf su ile tamamlanır. Hazırlanan bu çözelti, aynen indirgen şeker tayininde olduğu işleme alınır Bu amaçla, en son nötürlenerek 100 ml ye tamamlanan çözelti bürete doldurulur ve ardından bir erlene 5 ml fehling A, 5 ml Fehling B çözeltisi konur ve bir hotplate üzerinde kaynaması sağlanır. Kaynamaya yakın 2-3 damla metilen mavisi damlatılır ve kaynamaya başladığında erlendeki karışım bürette bulunan örnek çözeltisi ile titre edilir. Kiremit kırmızısı renk oluşumu titrasyonun bitirileceği dönüm noktasıdır. İşlem sonunda sarfiyat kaydedilir. HESAPLAMA Bir örnekte şeker analizi yapıldığını ve toplam indirgen şeker miktarı için yapılan sarfiyatın 1 ml, toplam şeker için 0.9 ml, standart glukoz çözeltisi için yapılan sarfiyatın ise 11.1 ml olduğunu varsayalım. Toplam indirgen şeker, toplam şeker ve sakkaroz miktarını hesaplamak için ; Toplam indirgen şeker için: 11.1 ml glukoz standardı 10 ml Fehling indirgemiştir. 1 ml örnek çözeltisi 10 ml Fehling indirgemiştir.
7 O halde, 1 ml örnek çözeltisi 11.1 ml glukoz standart çözeltisine eşdeğer oranda şeker içerir. 11.1 ml glukoz çözeltisinde 55.5 mg glukoz vardır (5000 ppm=5000 mg/1000 L=5 mg/1 ml) Çünkü hazırlanan glukoz standart çözeltisinin 1 ml sinde 5 mg glukoz vardır. O halde 1 ml örnek çözeltisinde 55.5 mg glukoz vardır. 100 ml de ise 5550 mg glukoz bulunur. Başlangıçta 100 ml lik çözelti içinde sadece 50 ml örnek çözeltisi olduğundan, örneğin kendisinde 5550x2=11100 mg glukoz bulunacaktır. Seyreltme faktör =2 11100 mg=11.1 g glukoz eşdeğer şeker Sonuç olarak %11.1 toplam indirgen şeker mevcuttur. Toplam şeker için ise; Sarfiyatın 0.9 ml olduğu bulunmuştur. 11.1 ml glukoz standardı 10 ml Fehling indirgemiştir. 0.9 ml örnek çözeltisi 10 ml Fehling indirgemiştir. O halde, 0.9 ml örnek çözeltisi 11.1 ml glukoz standart çözeltisine eşdeğer oranda şeker içerir. 11.1 ml glukoz çözeltisinde 55.5 mg glukoz vardır (5000 ppm=5000 mg/1000 L=5 mg/1 ml) Çünkü hazırlanan glukoz standart çözeltisinin 1 ml sinde 5 mg glukoz vardır. O halde 0.9 ml örnek çözeltisinde 55.5 mg glukoz vardır. 100 ml de ise 6166 mg glukoz bulunur. Başlangıçta 100 ml lik çözelti içinde sadece 50 ml örnek çözeltisi olduğundan, örneğin kendisinde 6166x2=12332 mg glukoz bulunacaktır. Seyreltme faktör =2 12332 mg=12.33 g glukoz eşdeğer şeker Sonuç olarak %12.33 toplam şeker mevcuttur. Sakaroz miktarı %sakkaroz=(toplam şeker-indirgen şeker) x0.95 (0.95=342/360) =(6166-5550)x0.95 =585.2 mg/100 ml