BHV-1 ile Doğal Enfekte Sığırlardan Doğan Buzağılarda Maternal Antikor Düzeyi

Veteriner Hekimleri Mikrobiyoloji Dergisi Elektronik Versiyonu Yıl 2002 Cilt 02 Sayı 2 Sayfa 6-12 (orijinal dergide sayfa7-12) www.mikrobiyoloji.org/pdf/703020202.pdf BHV-1 ile Doğal Enfekte Sığırlardan Doğan Buzağılarda Maternal Antikor Düzeyi Kezban CAN ŞAHNA*, Seval BİLGE DAĞALP** *Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Viroloji Bilim Dalı, Kayseri **Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Viroloji Anabilim Dalı, Ankara. ÖZET Bu araştırmada, bir kamu işletmesinde bulunan, BHV 1 aşısı uygulanmamış 20 gebe sığırdan doğum öncesi 21.günden itibaren birer haftalık periyotlar ile doğum sonrası 21. güne kadar kan, doğum sonrası 1,3,7,14 ve 21 günlerde kolostrum/süt örneklendi. Kan ve kolostrum/süt örnekleri BHV-1 spesifik antikorlar yönünden kontrol edilerek, veriler enfeksiyonun prevalansı ve kolostral bağışıklık yönünden değerlendirildi. Ayrıca buzağılardan 1, 7, 14 ve 21. günlerde alınan kan örnekleri, BHV-1 spesifik maternal bağışıklığın düzeyinin belirlenmesi için serolojik kontrole tabi tutuldu. Elde edilen verilere göre, BHV-1 ile doğal enfekte olan sığırların kolostrumda kan örneklerine oranla yaklaşık 3 kat fazla antikor bulunduğu ve kolostrum alımına bağlı olarak yenidoğan buzağıların postnatal yaşamın ilk gününden itibaren erişkin sığırlara benzer düzeyde pasif bağışıklığa sahip olabildikleri saptandı. Anahtar Kelimeler: Bovine Herpesvirus 1, maternal immunite, sığır. SUMMARY Maternal Antibody Levels in Calves Born from Naturally Infected Cattle with BHV1 In this research, blood samples had been collected from 20 pregnant cattle nonvaccinated with BHV1 beginning at the date 21 before birth and till the 21st day after the birth with a period of one week, also milk and colostrum sampled at the dates 1, 3, 7, 14 and 21 after birth. Blood and colostrum/milk samples checked out in the means of BHV1 spesific antibodies, data were evaluated against prevalence of the infection and colostral immunity. In addition blood samples taken from calves at the dates 1, 7, 14 and 21 were serologically tested in order to find out the levels of BHV1 spesific maternal immunity. According to the gained data, it is detected that in the colostrum of naturally BHV1 infected cattle there were 3 times more antibodies than in their blood also it is found 6

that due to the colostrum intake newborn calves would achieve an passive immunity like adult cattle starting at the first day of postnatal period. Key words: Bovine Herpesvirus 1, maternal immunity, cattle GİRİŞ Sığırların önemli bir patojeni olan BHV1, başta üst solunum yolu (IBR) ile genital kanal enfeksiyonu (IPV,IBP) olmak üzere yerleştiği dokuya göre değişen farklı klinik tablolar sonucunda süt veriminde azalma, abortlar, yemden yararlanma gücünün azalması ve ölümler nedeniyle önemli ekonomik kayıplara yol açabilmektedir (3, 14, 15). Diğer herpesviruslarda olduğu gibi BHV 1 de primer enfeksiyonun ardından organizmadan tamamen elimine edilememekte, viral genom bölgesel ganglion hücrelerinde latent durumda kalabilmektedir. Çeşitli stres faktörlerinin etkisi (gebelik, hastalık, transport vb. gibi) ve kortikostreoidlerin uygulanması sırasında latent virus reaktive olarak, replikasyonun gerçekleşeceği mukozal yüzeylere ulaşmakta ve buradan saçılmaya devam etmektedir (1). Enfeksiyonu bir kez geçiren hayvan yaşam boyu virus taşıyıcısı ve saçıcısı olarak kabul edilmekte; sürüde varlığı enfeksiyonun yayılması açısından tehlike yaratmaktadır (1, 15, 16). Yapılan çalışmalarda (10, 11, 16) IBR enfeksiyonu sonrasında gelişen antikorların, viral genomun latentliğini ve saçılımını tamamen önleyemediği ancak hastalığın klinik görünümünün şiddetinin indirgendiği ve buna bağlı olarak oluşan ekonomik kayıpların önüne geçilebildiği bildirilmiştir. Yeni doğanlarda meydana gelen fatal sistemik enfeksiyonlar BHV-1 kaynaklı ekonomik kayıpların en önemli nedenlerindendir (12). Bu nedenle yeni doğan buzağıların yaşamlarının ilk günlerinde enfeksiyonlardan korunmasında ve dolayısıyla ekonomik kayıpların indirgenmesinde, kolostrum yoluyla yeterli düzeyde ve erken dönemde BHV-1 spesifik maternal antikorların alınımı büyük öneme sahiptir. Ayrıca maternal bağışıklığın düzeyi ve süresi IBR hastalığının kontrolü için uygulanacak programların (aşı uygulanması ya da uygulanmamasına dayanan programların tercihi, ilk aşılama yaşının belirlenmesi, vb) belirlenmesi yönünden de birçok araştırıcının (9, 10, 13) üzerinde durduğu bir konudur. Bu araştırmada, araştırma planına uygun olarak gebe sığırlardan sağlanan kan, kolostrum/süt örnekleri ile bunların buzağılarından alınan kan örneklerinin BHV-1 spesifik antikorlar yönünden kontrolü yapılarak, erişkin sığırların kolostral antikor seviyesi ve buzağılarda maternal bağışıklığın düzeyi değerlendirilmiştir. GEREÇ VE YÖNTEM Gereç Hücre kültürü: BHV1'in üretilmesi, enfeksiyözite gücünün belirlenmesi ve mikronötralizasyon testinde Madin Darby Bovine Kidney (MDBK) hücre kültüründen yararlanıldı. Hücrelerin üretilmesinde %10 dana serumu içeren Dulbecco's Modified Minimal Essential Medium (DMEM) (Biochrom,T-041-10,Almanya) kullanıldı. 7

Virus: Araştırmada, BHV1'in Colorado referenz suşu (DKID 50 /0.1ml=10-6 ) kullanıldı. Kan ve süt örnekleri: Bu araştırmada bir kamu işletmesine ait, BHV1 e karşı aşı uygulanmamış 20 adet gebe sığırdan doğum öncesi 21. günden doğum sonrası 21. güne kadar birer hafta ara ile alınan kan örnekleri (138 adet) ve doğum sonrası 1,3,7,14 ve 21. günlerde alınan kolostrum/süt örnekleri (100 adet) ile bunların buzağılarından 1,7,14,21 gün yaşlarda alınan kan örnekleri (80 adet) kullanıldı. Yöntem Kan örneklerinin hazırlanışı: Steril polystren tüplere (Greiner, Almanya, katalog no:187246) alınan kan örnekleri 3000 rpm'de 10 dakika santrifüj edilerek kan serumları ayrıldı. Serum örnekleri 56 C'de 30 dakika inaktivasyon işlemine tabi tutulduktan sonra kullanılıncaya kadar -20 C'lik derin dondurucuda saklandı. Süt örneklerinin hazırlanışı: Steril kapaklı cam tüplere alınan süt örnekleri 3000 rpm'de 20 dakika santrifüj edildikten sonra steril bir pastör pipeti yardımıyla yağ tabakasının altındaki sıvı kısım alındı. Kan serumu örneklerinde olduğu gibi inaktivasyon işleminin ardından süt serumu örnekleri -20 C'lik derin dondurucuda saklandı. Mikronötralizasyon testi: Kan ve süt örnekleri, BHV1 spesifik antikorlar yönünden Frey ve Liess (8) tarafından bildirilen yönteme göre test edildi. Testte sulandırılmamış süt/kan serum örneklerinde antikor varlığı pozitif sonuç olarak değerlendirildi. BHV1 spesifik antikor varlığı saptanan süt/kan serumlarının serum nötralizasyon değeri (SN 50 ), serum örneklerinin 2 katlı (1/2, 1/4, 1/8,...,1/256) sulandırmalarına uygulanan mikronötralizasyon testi sonucunda belirlendi. BULGULAR Araştırmada kullanılan gebe sığırların doğum öncesi 21. günde alınan kan örneklerinin kontrolü sonucunda BHV-1 seropozitiflik oranı %83.3 (15/18) olarak belirlendi. Bu örnekleme zamanındaki antikor titreleri ise 1/3-1/96 arasında değişkenlik gösterdi. Erişkin sığırların kan örneklerinde örnekleme zamanına göre BHV-1 varlığı/düzeyi Tablo 1'de gösterildi. Annelere ait bireysel süt ve kan serumu antikor titreleri karşılaştırmalı olarak değerlendirildiğinde, doğumu takiben alınan (1.gün) kolostrum örneklerindeki antikor titrelerinin kan serumu antikor titresine göre 3-5 kat yüksek olduğu belirlendi. 3. gün ve sonrasında alınan süt örneklerinde ise antikor seviyesinin belirgin olarak azalma gösterdiği saptandı. Bireysel verilerden yararlanarak hesaplanan erişkin sığırların süt/kan serumu örneklerindeki BHV1 spesifik antikorların geometrik ortalamaları Tablo 2'de sunuldu. Buzağılarının kan örneklerinde BHV-1 spesifik antikorlar, kolostrum alımına bağlı olarak 1. günden itibaren tespit edildi. Buzağılardaki maternal bağışıklık 1. hafta sonunda erişkinlere benzer düzeyde olduğu halde, ilerleyen örneklemelerde kısmen azalma gösterdi (Tablo 2, Grafik 1). 8

Tablo 1. Erişkin sığırların örnekleme zamanlarına göre BHV-1 spesifik antikor düzeyleri Table 1. Levels of BHV-1 antibodies in cattle according sampling time. Doğum öncesi Doğum sonrası Hayvan No 21 14 7 1 7 14 21 01 t.e 1/12 1/2 1/6 1/12 1/12 1/24 02 t.e 1/3 1/6 1/4 1/6 1/6 1/16 03 - - - - - - - 04 1/6 1/6 1/12 1/3-1/6 1/6 05 1/2 - - 1/1 - - - 06 1/48 1/64 1/16 1/48 1/32 1/32 1/24 07 1/24 1/24 1/24 1/32 1/48 1/32 1/16 08 - - 1/1 1/2 1/2-1/2 09 1/48 1/32 1/24 1/24 1/24 1/12 1/12 10 - - - - - - - 11 1/12 1/24 1/32 1/12-1/8 1/8 12 1/24 1/48 1/48 1/24 1/48 1/24 1/32 13 1/48 1/96 1/48 1/8 1/96 1/96 1/64 14 1/128 1/48 1/24 1/48 1/64 1/16 1/16 15 1/12 1/12 1/4 1/4 1/6 1/8 1/4 16 1/24 1/32 1/12 1/16 1/32 1/6 1/12 17 1/96 1/96 1/128 1/96 1/64 1/96 1/64 18 1/6 1/3-1/3 1/3 1/4 1/6 19 1/6 1/4 1/6 1/3 1/6 1/4 1/4 20-1/4 1/4 1/6 1/3 1/12 1/12 GEOMETRİK ORTALAMA 10,086 9.998 8.239 7.319 7.958 8.073 8.602 t.e. Test edilemedi Tablo 2. Anne ve buzağılarına ait materyallerde BHV-1 spesik antikorların örnekleme zamanlarına göre geometrik ortalamaları Table 2. Geometrik mean antibody titer against BHV-1 of materials from cattle and their calves according sampling time. Doğum Öncesi Doğum Sonrası 21.Gün 14.Gün 7.Gün 1.Gün 3.Gün 5.Gün 7:gün 14.Gün 21.Gün Anne Kan 10.08 9.99 8.23 7.31 7.95 8.07 8.60 Anne Süt 19.48 3.37 2.25 1.62 1.05 1.05 Yavru Kan 5.04 8.95 6.92 6.55 Grafik 1. Anne ve buzağılarına ait materyallerde BHV-1 spesik antikorların örnekleme zamanlarına göre geometrik ortalamaları. Figure 1. Geometrik mean of antibody titer against BHV-1 of materials from cattle and their calves according sampling time. Antikor titresi 25 20 15 10 Anne süt Anne kan Yavru kan 5 0 1:Gün 3.Gün 5.Gün 7.Gün 14.Gün 21.Gün 9

TARTIŞMA VE SONUÇ Dünyada yaygın olarak gözlenen ve büyük ekonomik kayıplara neden olan BHV1 enfeksiyonunun Türkiye'de de yaygın düzeyde varlığı yapılan birçok çalışma (2, 4, 5) ile ortaya konulmuştur. Nitekim bu araştırmada da örneklenen populasyon için ilk örnekleme zamanında seropozitiflik oranı %83.3 olarak belirlenmiştir. Araştırmada ileri gebe sığırların örneklendiği düşünüldüğünde, belirlenen yüksek seropozitifliğin oluşumunda BHV1 ile latent enfekte hayvanlarda gebeliğin stres etkisiyle gelişen rekurrent enfeksiyonların da etkili olması muhtemeldir. Buna karşılık doğum öncesi 21. günden başlayarak doğum sonrası 21. güne kadar izlenen annelerin örnekleme dönemlerine göre kan örneklerinin bireysel verileri ve geometrik ortalama değerleri, doğuma bağlı etken rekurrensini işaret edecek belirgin bir farklılık ortaya koymamıştır. BHV-1 özellikle kolostrum almamış ve immun sistemi henüz gelişimini tamamlamamış olan yeni doğanlarda şiddetli klinik belirtilerin ardından ölüme neden olabilmektedir (3, 12, 15, 16). Bu nedenle immun annelerden doğan buzağılarda maternal bağışıklık, özellikle postnatal yaşamın ilk haftalarında enfeksiyondan korunmada önem taşımaktadır. Bilindiği gibi immun annelerin kan serumunda ne kadar fazla antikor varsa kolostrum ile aktarılan antikorların oranı da o kadar fazla olacaktır. Kolostrumdaki antikor seviyesi kadar, kolostrumun doğum sonrasında alınma zamanı ile miktarı da buzağılarda maternal bağışıklığın seviyesini etkiler. Bu çalışmada Tablo 2'de bildirilen örnekleme zamanlarına göre annelerin kan ve kolostrum/süt örneklerindeki BHV1 spesifik antikor miktarları incelendiğinde, kolostrumda (1.gün örneklemesi) antikor miktarının kan serumu antikor düzeyinden yaklaşık 3 kat fazla olduğu görülmektedir. İlerleyen örnekleme zamanlarında ise kolostrumun süte dönüşmesi nedeniyle antikor düzeyi belirgin bir azalma göstermektedir. Yeni doğanların barsak epitel hücrelerinin henüz gelişmediği ve absorbtif yeteneklerinin bu nedenle yüksek olduğu zamanın doğumu takiben ilk birkaç saat (6 saat) olduğu ve daha sonra antikorların emiliminin önemli ölçüde azalarak, en fazla 40 saat sonra ortadan kalktığı düşünüldüğünde, yüksek düzeyde antikor içeren kolostrumun zamanında ve sıkça alınmasının önemi ortaya çıkmaktadır. Buzağıların kan örneklerinde pasif olarak edinilen BHV-1 spesifik antikorlar 1.gün yaşta saptanmış ve 7. günde erişkin sığırların ortalama antikor titrelerine eşdeğer bulunmuştur. Ancak sonraki örneklemelerde antikorların normal katabolizma sonucu ayrışmasına bağlı olarak, ortalama antikor seviyelerinde kısmen azalma görülmüştür. Bu çalışmada 21. günden sonra pasif bağışıklığın takibi yapılmamış ise de, antikor seviyesindeki azalmanın süreceği açıktır. Genel olarak buzağılarda 6 ay yaşa kadar kadar tespit edilen antikorların maternal orijinli olduğu düşünülse de, BHV1 enfeksiyonunda kolostrum yoluyla alınan antikorların devamlılığı konusunda farklı bildirimler söz konusudur (5, 6, 7, 15, 16). Brar ve ark. (6) ile Cho ve ark. (7) maternal antikorların 9. aya kadar tespit edilebildiğini bildirken, Bilge Dağalp ve ark.(5) ise 1 yaşından küçük ve büyük hayvanların örneklendiği aşılanmamış 4 ayrı sürü genelinde antikor varlığının 3. aydan sonra tespit edilemediği belirtmişlerdir. BHV1 enfeksiyonunda koruyucu bir antikor titresinden bahsetmek mümkün olamasa da, antikor titresi yüksek olan hayvanlarda enfeksiyonun klinik görünümünün şiddeti azalmakta ve buna bağlı olarak ekonomik kayıpların önüne geçilebilmektedir (10, 16). Bu noktada yenidoğan buzağılarda pasif bağışıklığın düzeyi ve etkinliğinde, annelerin bağışıklık düzeyi en önemli belirleyici faktördür. Bu araştırmada doğum 10

zamanında erişkinlerde tespit edilen titrelerin (1/3-1/96) genellikle çok yüksek olmadığı saptanmıştır. Yavrularda gelişen pasif bağışıklığın da buna parelel olarak genellikle yenidoğanları enfeksiyondan koruyacak düzeyde olmadığı (21.günde bireysel titreler saf-1/48 arasında, geometrik ortalama 1/6.55) belirlenmiştir. Benzer olarak Bilge-Dağalp ve ark.(5), örneklenen buzağılarda pasif bağışıklık düzeyinin 3. ayda çok düşük (SN50:saf-1/50) bulunduğunu bildirmişlerdir. BHV1'e karşı pasif bağışık bireylerde doğal enfeksiyon ve aşıya yanıt ile ilgili farklı bildirimler bulunmaktadır. Lemaire ve ark. (10) da yaptıkları deneysel çalışmada, maternal antikorların varlığında nasal mukozada viral replikasyonun engellenemediğini ortaya koymuşlardır. Menanteau-Horta ve ark. (13) ise, 1/16'dan daha düşük antikor seviyesine sahip buzağılarda canlı IBR aşısı uygulaması sonrasında aktif bağışıklık oluşumunun bloke edildiğini bildirmiştir. Van Drunen Littel ve ark. (17) ise tgd (sekretorik glikoprotein D) kodlayan plazmid DNA aşısının subcutan yolla 3 günlük kuzulara verilmesiyle spesifik maternal antikorların varlığında yada yokluğunda antikor ve T hücre yanıtının geliştiğini bildirmişlerdir. Ayrıca, maternal bağışıklık altındaki buzağılarda canlı aşı yada doğal enfeksiyon sonucunda latent enfeksiyonların geliştiğini bildiren birçok çalışma (9, 11) bulunmakta olup, BHV- 1 enfeksiyonunun kontrolünde maternal bağışıklık konusu önemle irdelenmektedir. Bu araştırmadan elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde, BHV-1 ile doğal enfekte annelerden doğan yavrulara kolostrum/süt ile aktarılan antikorlar ile yaşamın ilk gününden itibaren pasif bağışıklığın oluştuğu; bununla birlikte buzağılarda oluşan pasif bağışıklığın enfeksiyondan korunmada her zaman yeterli olamayacağı sonucuna varılmıştır. Kolostral antikorların önemi ihmal edilmese de, kolostral antikor seviyesinin annenin enfeksiyon zamanı, enfekte eden virusun dozu, annede antikor oluşumuna etki eden bireysel nedenler gibi birçok faktöre bağlı olarak değişkenlik gösterdiği gözden uzak tutulmamalıdır. KAYNAKLAR 1. Ackermann M, Wyler R (1984): The DNA of an IPV strain of Bovine Herpesvirus-1 in sacral ganglia durinf latency after intravaginal infection. Vet Microbiol., 9:53-63 2. Alkan F, Özkul A, Karaoğlu T, Bilge S, Akça Y, Burgu İ, Yeşilbağ K, Oğuzoğlu Ç (1997): Sığırlarda viral nedenli solunum sistemi enfeksiyonlarının seroepidemiyolojisi. A.Ü.Vet.Fak.Derg., 44:73-80 3. Baker JA, McEntee K, Gillespie JM (1960): Effects of infectious bovine rhinotracheitis /infectious pustular vulvovaginitis virus on newborn calves. Cornell Vet., 50:156-170 4. Bilge S (1996): Kan ve süt serumlarında IBR-IPV antikorlarının nötralizasyon testi ile saptanması ve süt örneklerinden virus izolasyonu. Doktora Tezi. AÜ Sağlık Bilimleri Enstitüsü 5. Bilge-Dağalp S, Yıldırım Y, Alkan F (2000): Buzağılarda maternal BHV-1 antikor düzeylerinin belirlenmesi. A.Ü. Vet Fak Derg., 48(2): 117-122 6. Brar JS, Johnson DW, Muscoplat CC, Shope RE, Meiske JC. (1978) : Maternal immunity to infectious bovine rhinotracheitis and bovine viral diarrhea viruses: Duration and effect on vaccination in young calves. Am J Vet Res, 39: 241-244. 11

7. Cho,HJ., Entz SC., Green GT., Jordan,LT. (2002). A blocking ELISA with improved sensitivity for the detection of passive acquired maternal antibodies to BHV-1. Can Vet J 43(1);43-45. 8. Frey HR, Liess B (1971): Vermehrungskinetik und vermendbarkeit eines stark zytopatogenen VD-MD virusstammes für disgnostische untersuchungen mit der mikrotiter-methode. Zbl Vet Med B, 18:61-71 9. Lemaire M., Meyer,G., Baranowski,E., Schynts F., Wellemans G., Kerkhofs P., Thiry E (2000 a): Production of BHV type 1-seronegative latent carriers by administration of a live-attenuated vaccine in passively immunized calves. J Clin Microbiol, 38(11): 4233-4238. 10. Lemaire M., Schynts F., Meyer,G, Thiry E (1999) Antibody response to glycoprotein E after bovine herpesvirus type 1 infection in passively immunised, glycoprotein E-negative calves. Vet Rec 144(7): 172-176. 11. Lemaire M., Weynants V., Godfroid J., Schynts F., Meyer,G,Letesson JJ., Thiry E (2000 b). Effect of bovine herpesvirus type 1 infection in calves with maternal antibodies on immun response and virus latency. J Clin Microbiol, 38(5):1885-1894. 12. Mechor LA, Petrie L (1987): Protection of newborn calves against fatal multisystemic infectious bovine rhinotracheitis by feeding colostrum from vaccinated cows. Can J Vet Res., 51: 452-459 13. Menanteau-Horta AM, Ames TR, Johnson DW, Meiske JC (1985): Effect of maternal antibody upon vaccination with infectious bovine rhinotracheitis and bovine viral diarrhea vaccines. Can J Comp Med, 49, 10-14. 14. Pierson RE, Vair CA (1965): The Economic Loss Associated with Infectious Bovine Rhinotracheitis in a Dairy herd. JAVMA, 147(4):350-352 15. Straub OC (1990): Infectious Bovine Rhinotracheitis. 71-108. In:Z Dinter and B Morein (Eds), Virus Infections of Ruminants. Elsevier of Publishers. 16. Straub OC (1991): BHV-1 infections: relevance and spread in Europe. Comp.Immun. Microbiol. Infect.Dis., 14:175-186 17. Van Drunen Littel-VanDen Hurk S, Braun RP, Lewis PJ, Karvonen BC, Babiuk LA, Griebel PJ (1999): Immunization of neonates with DNA encoding a bovine herpesvirus glycoprotein is effective in the presence of maternal antibodies. Viral Immunology, 12 (1) : 67-77. 12