GENOMİK E GENEL BAKIŞ

GENOMİK E GENEL BAKIŞ Giriş Rekombinanat DNA devriminin sonucundan köken alıp, günümüze kadar gelen moleküler tıp ve genomiğin beklenen bilimsel ve tıbbi yararları oldukça önemlidir. Şu anda içinde bulunduğumuz durum oldukça umut vericidir. Şu an elimizde, insan genomunun tüm dizisi ve tek bir gen için potansiyel yaklaşımlar mevcuttur. Bu da, sağlık ve hastalık alanında insan biyolojisi çalışmak için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Benzer kaynaklar, önemli bazı patojenleri de içeren çok sayıda diğer organizmalar içinde mevcuttur (tablo 2.1). Tıbbi araştırmaların odağı, şimdi genlerin sistematik fonksiyonel evrimine ve mekanizmaların aydınlatılmasına doğru dönmüştür. İnsanı daha sağlıklı kılmak için, biyolojik aktivitenin koordinasyonunda genlerin nasıl fonksiyon gösterip, etkileşime girdiğinin tamamen anlaşılması, yeni terapilerin gelişmesi için çok büyük bir fırsat sağlamaktadır. Tablo 2.1 Sekanslanan bazı patojen( bakteri ve protozoalar) genomları 1

Gelişmenin Yeniden Gözden Geçirilmesi: İnsan Genom Projesi Genomik (kutu 2.1), 1990 da İnsan Genom Projesi (HGP) resmen başlatıldığı zaman, önemli ve bağımsız bir araştırma alanı haline geldi. Projenin en belirgin amacı 15 yıl içerisinde 3000-Mbç lik tüm insan nüklear genomunu sekanslamaktı. Asıl sekanslama başlamadan önce pekçok başlangıç işin yapılması gerektiği kabul edildi ve yeni teknolojilerin (kutu 2.2) geçerli kılınması için pilot projeler olarak, insan genomuna ek olarak beş model organizmanın genomunun sekanslanmasının gerektiği kabul edildi. İlk iş, DNA klonlarının fiziksel haritasının birleştirilmesi için taslak görevi görecek olan insan genomunun yüksek rezolüsyonlu genetik haritasını kurmaktı. Önce, genetik ve fiziksel haritalama evreleri tamamlandı daha sonra sekanslama başladı. Kutu 2.1 Genomik Nedir? Genom terimi, 1920 yılında Alman botanikçi Hans Winkler tarafından tüm haploid kromozom seti içindeki gen topluluğu olarak tanımlandı. Günümüzde bu terim, sadece genleri değil haploid kromozom setindeki tüm DNA yı ida çine alacak şekilde genişletildi. Çünkü yüksek yapılı ökaryot genleri azınlıktadır. Örneğin; insan genomunun sadece %2-3 ü genler tarafından temsil edilmektedir. Genom kavramı çok eski olmasına rağmen, genomik terimi 1986 ya kadar kullanılmamıştır. Fare genetikçisi Thomas Roderick bu terimi, genomun haritalanması, sekanslanması ve karakterizasyonunu tanımlamak için önermiştir. Son zamanlarda genomiğin özü, geniş ölçekli, baştan başa yüksek bir biyolojik analiz ile ilişkilendirilmiştir. Fonksiyonel genomik; gen fonksiyon analizleri için çeşitli sistematik yaklaşımları içine almaktadır. Transkriptomik, mrna ekspresyonun geniş ölçekli analizidir. Proteomik, proteinlerin geniş kapsamlı analizidir ve ekspresyon profilleri, etkileşimler ve protein yapısının çalışılması şeklinde kısımlara ayrılmaktadır. Proteomik yeni moleküler tıp için çok önemli bir unsurdur. Çünkü birçok ilaç hedefi, proteinlerdir. 2

Kutu 2.2 İnsan Genom Projesinin başlangıç hedefi olan model organizma genomları Esherichia coli (bacteri) Saccharomyces cerevisiae (yeast) Caenorhabditis elegans (nematod) Drosophila melanogaster (meyve sineği) Mus musculis (fare) İnsan genom projesinin belirtilen zaman çerçevesinde, hedeflerinin tamamlanması için, haritalamada, klonlamada, sekanslamada ve bioinformatikde teknolojik ilerlemelere gereksinim duyulmuştur. Başlangıç bütçenin büyük bir kısmı projeden dolayı doğabilecek etik, yasal ve sosyal sorunlar için ayrılmıştır. Örneğin, projeden elde edilen herhangi bir bilginin bireylere veya toplumlara karşı kullanılmasını önlemek gibi.. (kutu 2.3) 3

Kutu 2.3 İnsan Genom Projesinin etik, yasal ve sosyal meseleleri (The ethical, legal, social issues (ELSI) of the Human Genome Project ) İnsan Genom Projesi resmen başlatılmadan önce, projenin gerçekleşmesi ve elde edilen bilginin yeni ve kompleks etik sorunlara neden olabileceği kabul edilmişti. Endişe duyulan belirli konular; örneklerin toplanması, vericilerin gizliliği ve projeden elde edilen genetik bilginin sonraki kullanımı ve geçerliliğine ilişkin konulardı. Bundan dolayı HGP ye sponsor olan iki birleşmiş devletler organizasyonu - The US Department of Energy (DOE) ve National Institutes of Health (NIH)- senelik HGP bütçelerinin (%3-%5) önemli bir kısmını, projenin etik, yasal ve sosyal sorunlarını (ELSI) çalışma amacında olan program serilerine ayırdılar. ELSI programlarının başlıca amacı, geniş oranda ilgili gruplara danışarak eğitimi yükseltmek ve izlenecek yoldaki kararlara rehberlik etmektir. HGP ELSI programlarının en önemli fonksiyonu, geçmişe yönelik olmaktan çok projeyi tamamlayıcı özellikte olmasıdır. Bundan dolayı problemler artmadan önce, yeni teknoloji gelişmelerinin anlamlarını önceden görerek ve önemli sorunlarda açıklama yaparak yardım etmektedir. ELSI programlarının başlıca amaçları şöyledir: İnsan genom sekanslaması ve haritalanmasının toplum ve bireyler için etkilerini göstermek ve tahmin etmek İnsan genom sekanslaması ve haritalamasının etik, yasal ve sosyal sonuçlarını gözden geçirmek Sorunların kamuoyu tartışmalarını teşvik etmek ve Elde edilen bilgilerin, bireylerin ve toplumların yararına kullanılacağını garanti edebilen politika seçeneklerini geliştirmek. ELSI nın amaçları birkaç yılda bir güncellenmektedir son zamandaki amaçları şunlardır: İnsan genetik varyasyon çalışmaları ve insan DNA sekansının tamamlanması gibi konulardaki sorunları gözden geçirmek Genetik teknolojilerin, sağlık tedbiri ve halk sağlığı aktivitelerindeki bilgilerin integrasyonu ile doğacak sorunları incelemek Klinik olmayan durumlarda gen-çevre etkileşimleri ve genomik hakkında bilginin birleşmesiyle artacak sorunların gözden geçirilmesi Yeni genetik bilginin felsefik, tanrı bilimi ve etiksel perspektif ile interaksiyonunun nasıl olabileceğini incelemek Genetik servislerin kullanılması ve politikaların gelişmesinin, ırksal, etnik, sosyoekonomik faktörlerin, genetik bilginin kullanımını, anlaşılmasını ve açıklanmasını nasıl etkileyeceğini incelemek. 4

1980 li yılların ilk ortalarında HGP ilk kez tasarlandığında, günde sadece DNA daki yaklaşık 1000 nükleotidi sekanslamak mümkündü. Bu hızda, bilimadamları hiçbirşey yapamıyordu fakat sekanslama tüm genomun tamamlanması için gerekliydi. Bilgilerin verimini istenilen seviyede arttırmak için tamamen yeni sekanslama metodları tasarlandı. HGP si süresince birçok yeni method ortaya çıkmasına rağmen, yüksek verim hedefine otomasyon ve var olan teknolojinin arttırılması ile ulaşıldı. Günümüzde, bir kerede 96 örneği işleyebilen, ultra hızlı kapiller sekans aletleri kullanılarak bir makine ile günde yarım milyon nükleotid sekansı şeklinde üretimi arttırmak mümkün hale gelmiştir. Daha fazla sayıda makinenin kullanılması verimi çok daha fazla arttırabilecektir. GENETİK HARİTALAMADAKİ ATILIMLAR Genetik haritalar, rekombinasyon frekansına dayanmaktadır ve model organizmalarda farklı mutant suşlar arasında büyük ölçekli melezlemeler gerçekleştirilerek kurulmuşlardır. Genetik haritaların prensibi kromozom üzerindeki (daha muhtemel olarak mayoz sırasında krosover olduğu bölgeden) iki lokusu daha ileri ayırmaktır. Çaprazlanan döllerdeki mutant fenotiplerin yeni kombinasyonlarına bakarak, genetik olarak uygun Drosophila ve maya gibi organizmalarda krosover sonucu oluşan rekombinasyon olayları ölçülebilmektedir. Bu yaklaşım insan populasyonu için kullanılamaz çünkü farklı kalıtsal hastalıklara sahip insanlar arasında büyük oranda eşleşmenin olması gerekmektedir. Onun yerine, insan genetik haritaları, aile pedigrilerinde bulunan DNA sekans polimorfizmi analizine dayanmaktadır (kutu 2.4). HGP den önce, düşük rezolüsyonlu genetik haritalar, RFLPs (restriction fragment lenght polymorphisms) kullanılarak yapılıyordu. Bunlar doğal olarak restriksiyon enzimleri ile kesilen ya da kesim noktası ortadan kalkan bölgeleri oluşturan varyasyonlardan meydana gelmektedir ve bundan dolayı Southern blot da farklı büyüklükte bantlar oluşmaktadır (şekil 2.1). Fakat fiziksel haritalar için iskelet oluşturmakta çok az ve çok geniş aralıklar oluşturması ile RFLP nin kullanımı problem yaratmıştır. İlk olarak RFLP haritaları 400 üzerinde markır ve 10cM lik (yani her 10Mb DNA için bir markıra denk gelmektedir ) rezolüsyona sahipti. Genomda geniş olarak yayılmış ve fazlaca bulunan mikrosatellit olarak bilinen yeni polimorfik 5

markırların keşfedilmesi oldukça önemli bir buluş olmuştur (Şekil 2.2). 1992 de fiziksel haritalama için uygun bir kalıp olan 1cM (her 1Mb DNA için bir markıra denktir) rezolüsyonlu, mikrosatellitlere dayalı genetik harita yapılmıştır. 1996 da daha fazla mikrosatellit markırı içine alan rezolüsyonu 0.5cM olan daha ileri bir harita yapılmıştır. 2002 yılına gelindiğinde İzlanda daki decode adı verilen bir konsorsiyum tarafından en son harita, 0.2 cm rezolüsyonlu ve 5000 nin üzerinde markırı içine alacak şekilde oluşturulmuştur. SNP ve haplotip projeleride aynı zamanda yüksekrezolüsyonlu genetik haritaların örnekleridir (kutu 2.4). Kutu 2.4 İnsan Genomundaki Varyasyon HGP için kullanılan DNA, adı bilinmeyen 12 gönüllüden alınmıştır. Akraba olmayan herhangi iki insanın genom sekansı sadece %99.9 oranında benzerdir, tam bir sekans yoktur. DNA nın 3 milyon baz çiftindeki %0.1 lik fark çok ilginç bir şekilde bizi birbirimizden ayırmaktadır. Kalıtsal hastalıklara yol açan gen mutasyonları bütün olarak populasyonda oldukça nadirdir ve bundan dolayı bu varyasyonların sadece çok az bir kısmından sorumlu olmaktadır. Çok büyük kısmı, çeşitli ve farklı varyantların (allellerin) oldukça yaygın olduğu sekans polimorfizmlerinden oluşmaktadır. Bu varyasyonlar, genetik haritanın oluşturulmasında markır olarak kullanılmaktadır. Çünkü hibridizasyon veya PCR yöntemleri allelleri tanımlamak ve tespit etmek için kullanılmaktadır. Bundan dolayı aile ağacında rekombinasyonların olup olmadığı kanıtlanabilmektedir. Varyasyonların Tipi Polimorfik sekans varyasyonunun yaklaşık %95 i tek nükleotid polimorfizmi (SNP) olarak tanımlanmaktadır. Yani tek nükleotid pozisyonları, bazı insanlarda tek bir baz için diğer insanlarda ona alternatif bazı ifade etmektedir. Genlerdeki ve etrafında bulunan polimorfizmler, belirgin fenotipik etkiler gösterebilmektedir (örneğin; polimorfizm saç rengini etkileyebilmektedir). Bunun yanında birçok insanda, SNP lerin etkisi çok daha karmaşık olabilmektedir. Örneğin, hastalıklara yatkınlığı veya belirli ilaçlara cevap şeklini etkileyebilmektedir. SNP lerin büyük çoğunluğu genlerin dışarısında bulunmaktadır ve belkide etkisi yoktur. Ama, hala genetik markır olarak oldukça yararlıdırlar. Bazı SNP ler restriksiyon enzim kesim bölgeleri oluşturarak ya da ortadan kaldırarak, Southern blotda görülen bant paternlerini değiştirirler. Bu 6

restriksiyon fragment uzunluk polimorfizmleri (RFLP ler) insan genomu için ilk geniş kapsamlı genetik haritanın oluşturulmasında kullanılmıştır. Sekans polimorfizminin kalan %5 i mikrosatellitler olarak bilinen basit sekans tekrar polimorfizmleri (simple sequence repeat polymorphism (SSRPs)) olarak bulunmaktadır. Bunlar çeşitli sayıda kısa tekrar dizileridir. Mikrosatellitlerin en yaygın formu CA ( n ) tekrarıdır. n= tekrar sayısını göstermektedir. Genelde 5-50 arasındadır. SNP lerden farklı olarak, mikrosatellitler çoklu allelleri içerirken (yani 12, 22,31 tekrarlı yaygın varyantlar), SNP ler genellikle iki alternatif formdan biri olarak görülür. Mikrosatellitler nadir olarak genlerde bulunmaktadır ve bulundukları zaman patojenik etkilere neden olurlar (Örneğin, Huntington hastalığı). Fakat geniş oranda yayılmışlardır ve yüksek rezolüsyonlu haritaların oluşturulmasında kullanılmaktadır. HGP nin fiziksel haritalama evresi, mikrosatellit markırlarına dayalı genetik haritanın taslağı olarak kullanılmaktadır. Varyasyonların Çalışılması İnsan varyasyonları uzun yıllardır adli analizlerde kullanılıyordu fakat tüm genomu kaplayan varyasyonlara ilgi, HGP ile büyümeye başladı. İnsan sekans çeşitliliğinin evrensel etkisini çalışmak için, Human Genome Diversity Project (HGDP) 1991 yılında HGP nin yan projesi olarak başlatıldı. Bunun yanında küçük bir kaynak da aldı çünkü projenin başlıca amacı insan orijinleri ve populasyon tarihi çalışmalarında farklı etnik gruplar için uygun markırı bulmaktı. SNP- haritaları projesi için hem genel hem özel çok fazla destek vardı. Çünkü bu tıbbi araştırmalar için somut yarar sağlayacaktı. SNP ler ve hastalık yatkınlığı arasındaki ilişkinin tanımlanabilmesi, bireylerin genoyipine dayalı olarak ilaçların bireylere uygun hale getirildiği, yeni medikal alan farmakogenetiğin temelini oluşturan ilaç yanıtı ve SNP ler arasındaki ilşkiyi ve hastalık genlerinin keşfedilme hızını büyük oranda artıracaktır. Uluslararası SNP konsorsiyum Ltd. 1999 da sistematik SNP haritalama projesine başladı ve 2001 yılı itibari ile neredeyse 1.000.000 SNP yi içeren harita oluşturuldu. Son zamanlarda, haplotip kalıpları ile birlikte kalıtılan SNP gruplarıda gösterildi. Tahmin edilen 10 milyon SNP, 200 bin kadar haplotip tarafından gösterildi ki bu da hastalık ilişkilerini saptayan mekanizmayı daha kolaylaştırdı. Genom aracılığı ile haplotipleri haritalama amacı olan International HapMap Projesi 2001 ocak ayında başlatıldı. 7

Şekil 2.1 RFLP, restriksiyon bölgesini ortadan kaldıran veya oluşturan dizi varyantlarıdır bundan dolayı prob tarafından tespit edilen restriksiyon fragment uzunluğu değişmektedir. Üstteki panel iki alternatif alleli göstermektedir. Burada üç restriksiyon bölgesinden ortadaki bölgenin olup olmamasına bağlı olarak spesifik probun uzunluğunun değişmesiyle restriksiyon fragmentleri tespit edilir. Alleller a ve b, Southern blotda farklı büyüklükte hibrid bant oluşturur. Bu da allellerin aile ağacı aracılığı ile ortaya çıkmasına izin verir. Örneğin çocuk II.2 a allelinden iki kopya (anne ve babadan bir tane) çocuk II.4 bir kopya a allelinden, bir kopya b allelinden taşımaktadır. Fiziksel Haritalamadaki Buluşlar Genetik haritalardan farklı olarak, fiziksel haritalar asıl DNA birimlerine dayanmaktadır ve bundan dolayı sekanslama için uygun temel oluşturmaktadır. HGP nin fiziksel haritalama evresi genomik DNA kütüphanelerinin oluşturulması ve kontigleri oluşturmak için çakışan klonların bir araya getirilip tanımlanmasını 8

içermekteydi. (Kontig, genomdaki bitişik segmentleri temsil eden bütün klon serileri ) HGP başladığı zaman, klonlama için uygun vektörler, maksimum insert büyüklüğü 40 kbç olan kozmid vektörlerdi. Fakat, fiziksel haritaları bir araya getirmek için yüzlerce binlerce kozmid klonun taranması gerekliydi. Bu nedenle daha büyük insert alabilen klonlama vektörlerine ihtiyaç duyuldu. Genomik çatı üzerindeki klon kontiglerini bir araya toplamak ve çakışanları bulmak için aynı zamanda yeni yaklaşımlara gereksinim vardı. Şekil 2.2 Mikrosatellitler, 1-2 nükleotid uzunluğundaki, kısa, birbiri arkasına dizilmiş tekrar dizilerinin kopya sayısına bağlı olarak restriksiyon fragmentlerinin veya PCR ürünlerinin uzunluğunda fark oluşturan sekans varyantlarıdır. Üstteki panel, dört tane alternatif allleli göstermektedir. Burada tandem tekrarların değişken sayısına bağlı olarak spesifik probla saptanan restriksiyon fragment uzunluğu fark göstermektedir. 9

Dört allelin hepsi, Southern blotda, farklı büyüklükte bant ya da farklı büyüklükte PCR ürünü gösterir. RFLP den farklı olarak, mikrosatellitler için çoklu allelizm yaygındır. Böylece tam bir kalıtım paterni takip edilebilir. Örneğin, anne b/d; baba a/c allelini taşımaktadır. İlk çocuk II.1 b allelini annesinden, a allelini ise babasından almıştır. Klonlama vektör teknolojisi olmasına rağmen, gerekli bir buluş, çok daha büyük insertleri alabilen yapay kromozom vektörlerinin gelişmesi ile ortaya çıkmıştı (Şekil 2.3). Bu tür ilk vektör yeast artificial kromozomları (YACs) idi. Bu vektörler 1Mbç nin üzerinde insert taşıyabilmekte ve tüm genom için gerekli olan 10.000 nin üzerindeki klon sayısını azaltmaktadır. YAC larla ilgili bir problem, kimerik insertleride içine alma eğilimiydi, (yani, insertler genomdaki iki ya da daha fazla bitişik olmayan bölgeden DNA segmentlerini içermekteydi). Bundan dolayı, sekanslama için kullanılacak son fiziksel haritayı oluşturmak için yüksek doğrulukta vektörlere gereksinim duyuldu. BACs (Bacterial Artificial Chromosomes ) ve PACs (P1 Artificial Chromosomes) vektörleri, stabil yapıları ve nispeten büyük insert almaları (200-300 kbç) nedeniyle seçildi. Fiziksel klonları kontigler şeklinde bir araya getirmek için, çeşitli stratejiler tasarlanmıştır. Bunların hepsi, bitişik klonlar arasındaki overlap (çakışan) eden bölgelerin tespitini içermekteydi. Bunlar: Kromozom walking: Bu teknikte yaygın olarak pozisyonel klonlama ve birbiri ile overlap eden kısımları tanımlamak için hibridizasyon probları olarak klonların kullanılması basamakları bulunmaktadır. Alternatif olarak, her klonun son sekansı primer çiftlerinin dizaynında kullanılmaktadır ve overlap eden klonlar PCR ile tespit edilmektedir. Restriksiyon enzim fingerprinting: Bu teknik klonların restriksiyon enzimleri ile kesimini kapsamaktadır. Overlap eden iki klon, belirli sayıdaki benzer restriksiyon fragmentlerini paylaşır. Bu paternler komplekstir ve bilgisayarlar tarafından yorumlanmaktadır (şekil 2.4). 10

Şekil 2.4 Restriksiyon fragment fingerprintig temel prensipleri. a) İşaretli restriksiyon fragmentlerinin oluşturulması b) Dört farklı klondan oluşturulmuş paternler c) b de gösterilen bilgilerden oluşturulan kontig haritası Repetetiv DNA fingerprinting: Daha önce belirtildiği gibi, restriksiyon fragmentlerinin Southern blotları Alu gibi genoma yayılmış tekrar dizileri için problanabilir. Genoma yayılmış (her 4kbç de bir) Alu elementlerinin bir milyonun üzerinde kopyası bulunmaktadır. Böylece tipik bir 100- Kbç lik BAC klonu 20-30 tekrar içerecektir. Çakışan klonlar, belirli oranda hibrid bantlarını paylaşacaktır. Repetetiv DNA ya dayanan PCR bazlı fingerprinting testlerde kullanılabilmektedir. STS Haritalaması: STS ler (Sequence tagged site) genomda 100-200 bç uzunluğunda tek olan dizilerdir ve PCR ile kolayca saptanabilmektedir. Eğer iki 11

klon aynı STS i paylaşırsa overlap eden bölge tanımlanarak kontig olarak birleştirilebilmektedir. HGP de kontiglerin oluşturulmasında STS haritalama oldukça değerli bir stratejidir. 1995 de fiziksel referans haritanın 200 kbç uzaklıkta 15.000 STS markır içerdiği yayınlanmıştır. Bundan dolayı, belirli STS markırlarını içeren klonlar, sadece diğer klonlarla olan ilişkilerini değil, kromozomal lokalizasyonları tam olarak gösteren referans haritalar için yerleştirilebilir. Önemli olarak, STS lerin bazıları içerdikleri polimorfik mikrosatellit sekanslar nedeniyle genetik markır olarak kullanılabilmekte ve genetik harita ile bütün oluşturmaktadır. EST ler (Expressed sequence taqs), cdna klonlarından türemiş ve bundan dolayı genlerin pozisyonunu tanımlamaktadır. Şekil 2.3 İnsan genom projesinde çok değerli olan iki yapay kromozom vektörü. a) Yeast artificial kromozom; maksimum insert büyüklüğü 2Mbç kadar, TEL, telomer; TRP, triptofan sentezi seçici markırı; ARS, maya için replikasyon orjini; CEN, sentromer; Leu, lösin sentezi seçici markırı. b) Bakteriyel artificial kromozom, maksimum insert büyüklüğü 200 Kbç kadar. CM R, antibiyotik dirençlilik markırı; oris/ repe, replikasyon için gerekli dizileri, para/parb, regülasyonun kopya sayısı için gerekli diziler; oklar; T3 vet7 RNA polimeraz için gerekli promotorları göstermektedir. Bu polimerazlar insertin son sekanslarına uygun işaretli probların hazırlanmasında kullanılır. 12

SEKANS STRATEJİLERİ Tüm hücresel genom projeleri, şekil 2.5 de açıklanan oldukça önemli zincir sonlandırma sekansı teknolojisine dayanmaktadır. Çok gelişmiş aletler olsa da, reaksiyon başına iyi bir sekans için 600-700 nükleotidden fazlasını okumak zordur. Bundan dolayı BAC veya PAC gibi vektörlerin (200kbç ne kadar) büyük insertlerinin sekanslaması yerine, daha kısa parçalara ayrılarak ayrı ayrı sekanslanmasıdır. Bu da genellikle insertlerin kesilerek 1-2 kb uzunluğundaki fragmentlere ayrılması ile meydana getirilmektedir. Tüm sekans bilgileri bilgisayara girilir ve overlap eden parçalar aranır ve orijinal insertdeki tüm sekans bir araya getirilir. Bu yaklaşım shutgun sekanslama olarak bilinmektedir. Şekil 2.5 Zincir sonlandırıcıları olarak, dideoksinükleozid trifosfatlar ile DNA sekanslaması. Şekilde yıldız işaretleri, 32 P un olduğunu göstermektedir. d öneki dideoksinükleozid varlığına işaret etmektedir. Şeklin en üstündeki sekanslanmış DNA kutu içine alınmıştır. Primer radyoizotop ile işaretlenmedikçe, dizisi CGTAAGGdC olan en küçük bant otoradyografi ile tespit edilemez. 13

Kutu 2.5 İnsan Genomunun STS (sequence tagged sites) Referans Haritası STS ler genomda tek olarak bulunan, 100-200 bç uzunluğundaki DNA dizileridir ve PCR ile kolayca tespit edilebilmektedirler. Averaj mesafesi 200kb olan 15.000 STS markırı içeren insan genomunun fiziksel referans haritası 1995 de yayınlanmıştır. Bu, BAC ve PAC klon kontiglerini biraraya getirmek için taslak olarak ve bitişik klonlar arasındaki çakışan bölgeleri tanımlamak anlamında kullanılmıştır. STS markırları ilk önce nerden geldi ve harita nasıl oluşturuldu? STS markırları üç kaynaktan çıkmıştır. Bazı mikrosatellit markırları genetik haritadan alınmıştır. Mikrosatellitler, tekrar dizilerinin yanında bazı tek DNA dizilerini içerdikleri sürece STS markırlarına benzemektedir. cdna kütüphanesindeki klonların rasgele sekanslanması ile üretilen kısmi cdna sekansları EST olarak bilinmektedir. Bunlar sadece tek olan genlerden geldiği sürece STS markırı olarak kullanılmaktadır (gen aileleri üyelerine zıt olarak). STS markırlarından geriye kalanlar, rasgele genomik klonlardaki tek sekanslardan türemişlerdir. Birbirleriyle ilişkili STS markırlarının haritalanmasında ustalık isteyen bir konu, referans haritayı oluşturmasında, radyasyon hibrid panel tipleyicileri olarak gösterilmiştir. Bu klasik bir fiziksek haritalama tekniğidir. Teknikte, insan hücreleri lethal olarak ışına tabi tutulur ve bireysel kromozom fragmentleri insan hücrelerinin rodent hücrelere fizyonu ile kurtarılır. Farklı insan kromozomlarını içeren hücre panelleri, STS markırlarının bulunması için PCR ile test edilebilir. Genetik haritalama da olduğu gibi, yakın iki markır birbiriyle birliktedir ve çok az ihtimal ayrı bulunur (bu durumda krosoverdan ziyade kromozom fragmentasyonu ile). Bundan dolayı bir çok hibrid hücrenin analizi, hangi markırın aynı kromozom fragmenti üzerinde birlikte bulunduğunu gösterecektir. Bu da markırların düzenli olarak kurulmasına izin verecektir. Bu, YAC kütüphanelerindeki iki ya da daha fazla bitişik STS markırının varlığının testi ile doğrulanmıştır. 14

Şekil B 2.5 a) Radyasyon hibrid haritası. Rodent hücreler ve lethal olarak radyasyona tabi tutulmuş hücreler heterokaryon (iki çekirdekli hücreler) oluşturmak üzere füzyona tabi tutulur. Hasarlı insan kromozomlarından hibrid çekirdek oluşturan bu kombinasyonlar elenir. Sonuçta rodent hücreleri bir veya daha fazla insan kromozom fragmentini içerir. Bu tür hibridlerin paneli tüm insan genomu için oluşturulabilir. STS markırları için bu tür panellerin sistematik testi, referans fiziksel haritayı oluşturur. b) Bu, YAC insertlerinde bu tür markırların varlığını saptamak için testlerle rafine edilmiş ve doğrulanmıştır. 15

HGP, aşamalı (hiyeyarşik) shotgun stratejisini kullanmıştır. Shotgun sekanslama, her bir BAC klonlarının insertlerine teker teker uygulanmıştır. Çünkü her BAC neredeyse bu evrede fiziksel olarak haritalanmıştı, fiziksel referans harita üzerindeki sekans pozisyonu kolaylıkla saptanmıştı. 1999 da özel olarak finanse edilmiş U.S. biyoteknoloji şirketi Celera Genomik tarafından insan genom sekanslaması alternatif tüm genomu kaplayan shotgun stratejisi kullanılarak başlatıldı. Bu yöntemde, shutgun sekanslaması tüm genomik DNA üzerine uygulandı. Haritalama için faydası yoktu. Güçlü bilgisayarlar yerine, tüm genom, kısa 600-700 nükleotidlik okumalar ile biraraya getirilmiştir. Projenin koordinatörü Craig Venter, 1995 de ilk hücresel genomu tanımlamak için tüm genomu kapsayan shotgun tekniğini kullanmıştı ve özel ve kamusal projelerin birleşiminin katılımıyla, Drosphila Melanogaster genomunun ökromatik kısmının sekanslanması için kompleks ökaryotik genom üzerinde kullanımınıda yasalaştırmıştı (tablo 2.2). Klon-by-klon ve tüm genomu kapsayan shotgun metodu şekil 2.6 da karşılaştırılmıştır. Sonuçta, klon-by-klon yaklaşımı başlangıç haritalama ihtiyacından ve klonları toplama safhalarından dolayı daha yavaştı. Fakat bitmesi daha kolaydı çünkü aşamalı olarak sekansın biraraya getirilmesi bilgisayar kaynaklarına nazaran daha az çaba gerektiriyordu. Tersine, tüm genom shotgun methodunda bilgi hızlıca oluşturulmakta, biraraya getirme safhası özellikle insan genomundaki fazla sayıda veya repetetiv DNA dan dolayı daha fazla uğraştırıcıydı. Gerçekten de Celeranın kendi draft sekansını tamamlamasında, HGP tarafından oluşturulan hem sekans bilgisini hem de haritalama bilgisini kullandığı gösterildi (her ikiside internet üzerinden serbest). Kamuya ait HGP ve Celera birlikte 2000 yılında draft sekansın tamanlandığını duyurdular ve sekanslar 2003 yılında bitti (kutu 2.6). 16

Şekil 2.6 Genom sekanslama stratejileri. En üst panel yedi adet fiziksel markır ile 2-3 Mb uzunluğundaki genomik DNA yı göstermektedir. Markırlar dikey çizgilerle gösterilmiş STS dizileridir. Solda gösterilmiş klon-by-klon yaklaşımında genomik DNA, belirleyici overlap bölgeleri tarafından haritalanan ve markırlar kullanarak referans fiziksel haritalar üzerine yerleştirilmiş BAC vektörlerine klonlanır. Genomik bölgenin kaplanması için BAC insertleri biraraya getirilir. Her bir BAC (örneğin; soldaki BAC a ve b markırlarına karşılık gelir) gelişigüzel olarak küçük parçalara bölünerek shotgun sekanslanır. Sekanslar yeniden bilgisayar aracılığı ile tekrar biraraya getirilir ve tamamlanan sekanslar harita üzerine yerleştirilir. Tüm genom shotgun sekanslamasında (sağda gösterilen) genomik DNA shotgun sekanslanır ve bilgisayar ile biraraya getirilir. Küçük genomlar için referans harita gerekli değildir. Fakat insan genomu gibi büyük genomlar için gereklidir. Sekansların düzgün olarak biraraya getirilmesine yardımcı olmak için daha önce var olan haritaların kullanılması gerekliydi. 17

Şekil 2.7 Tekrarlayan DNA nın neden olduğu problemler.yukarıdaki panel, dağılmış ve tandem tekrarlar taşıyan BAC klonundan bir DNA insertünü göstermektedir. Bu insert shotgun sekanslandığında tekrarlar yerleştirilirken hata yapılabilir. Örneğin İki iç tekrar yok sayıldığında, solda iki bitişik klon arasında yanlış bir çakışma meydana gelebilir. Dağılmış tekrarlar olması durumunda, yanlış çakışmalar aynı zamanda genleride içerebilen tek DNA dizilerini yok sayabilir. GENOMUN YORUMLANMASI Genom projesindeki ilk sekans sonrası iş, genomun yorumlanması yani, sekansdaki yararlı biyolojik bilginin türetilmesi idi. Aslında bunun anlamı, genlerin ve genomun fonksiyonel bileşenleri olarak tanımlanan genlerin düzenleyici elementlerini bulmak ve büyük bir medikal ilişkiye sahip olmaktı. HGP nin en başından beri genlerin üzerine, EST lerin büyük koleksiyonlarını oluşturmak için, cdna klonlarının yüksek verili sekanslamasını içeren güçlü bir odaklanma vardı. Yukarıda tartışıldığı gibi, EST ler cdna kütüphanelerinden, tercihen sekansın tamamlanması için 8-10 okuma gerektiren, rasgele seçilmiş klonların sekanslaması ile elde edilen 100-200bç lik cdna fragmentleridir. Bundan dolayı, kısa ve hatalı olmasına rağmen EST ler kendi doğruluklarında fiziksel markırlar olduğu gibi gen sekansının oluşturulmasında hızlı ve ucuz bir yol sağlarlar. Yaklaşık 100.000 ESTs, YACs ve radyasyon hibrid tiplemesi ile genom üstüne haritalanmıştır. Elbette, sadece bütün bu sekanslar bireysel genleri temsil etmez ve overlap eden ESTs lerin kombinasyonu ile gereksiz olmayan gen setlerinin tanımlanması için girişimde bulunulmuştur (örneğin; UniGene Project: http//www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene/). İlk kapsamlı gen haritası 1996 da oluşturulmuştur ve yaklaşık 20.000-30.000 gen için kanıt sağlamıştır. Bu zamanda, insan gen kataloğunun sadece küçük bir kısmı göz önünde tutulmuştur. 18

Yıl 1977 Tablo 2.2 Genom Projesinin Dönüm Noktaları Organizma Bacteriophage φx 174 G.Büyüklüğü 5.38 kb Açıklamalar İlk genom sekanslandı. Gelecek genom projeleri için baskın olacak yeni sekans methodlarının (zincir sonlandırması gibi) onaylanması. 1995 Haemophilus influenzae 1.8 Mb İlk hücresel genom, ilk bakteriyel genom ve ilk insan patojeni sekanslandı. Tüm genomu kapsayan shotgun methodu kullanılarak 3 aydan kısa bir zamanda başarıldı. Mycoplasma genitalium 0.58 Mb Bilinen en küçük hücresel genom 1996 Saccharomyces cerevisiae 12 Mb İlk ökaryotik genom, önemli model organizma,uluslararası işbirliğinin harekete geçmesine sebep olan örnek Methanococcus jannaschii 1.66 Mb İlk achaean genomu 1997 Esherichia coli 4.7 Mb Çok önemli bakteriyel model türleri. İki yarışçı grup tatafından bağımsız olarak sekanslandı. 1998 Caenorhabditis elegans 97 Mb İlk çok hücreli organizmanın genomu ve ilk hayvan genomu sekanslandı. 2000 Drosophila melanogaster 165 Mb Insan biyolojisi için önemli model organizma, Celerayı da içeren özel ve kamusal organizasyonların işbirliği finanse edilerek sekanslandı. Arabidopsis thaliana 125 Mb İlk bitki genomu 2001 Homo sapiens 3000 Mb İnsan genomu, HGP ve Celera tarafından bağımsız olarak sekanslandı. 2002 Fugu rubripies 400 Mb Minimal repetetiv DNA ile en çok bilinen vertebrat genomu, pufferfish genomu, insan genlerinin tanımlanmasına yardım etti. 2003 Mus musculus Plasmodium falciparum, Anopheles gambie 2800 Mb Fare, kapsamlı bir memeli model olarak insan hastalıklarının çalışmasında kullanıldı.insanlara yakın olan organizmalar sekanslandı İlk ökaryotik parazit, malaria parazit (P.falciporum) sekanlandı. Vektörü (sivrisinek A. gambie ) nün yayınlanmsı ile belirgin ir başarı elde edildi. 19

2001 de genom sekansı hazır hale geldiğinde, önemli sayıda yeni genin açığa çıkacağı umut edilmişti. Fakat sürpriz bir şekilde toplam gen sayısı beklenenden daha düşük çıktı. Bugünkü tahminler, 30.000 den daha az gene sahip olduğumuzu önermektedir. Bunlar ise nematod Caenorhabditis elegans dan sadece % 50 fazladır. Tam sayısı güvenli bir şekilde kanıtlanamaz çünkü bazı genlerin tanımlanması veya doğru şekilde tanımlanarak gösterilmesi zor olabilmektedir. Bir gen şöyle tahmin edilmektedir. Sekansın ifade edildiğine dair kanıt vardır. Sekans bilinen bir gene veya ETS ye (ya insan veya başka türden) homologtur. Sekans genin ayırd edici özelliklerini taşır. Örneğin, promotor, splays bölgesi, polyadenilasyon bölgesi veya ekzonun varlığını gösteren baz içeriği gibi... Bilgisayar algoritimleri, hem genlerin ab initio (ilk prensiplerden gen benzeri özellikleri aramak) hem de homoloji temeli üzerine araştırılmasında kullanılmaktadır. Bu da gen sayısının hem beklenenden az hem de beklenenden çok olmasının kavranmasını sağlar. Örneğin, eğer sekans bilinen bir genle güçlü bir homoloji gösteriyorsa fakat gerçekte bir pseudogen ise (fonksiyonel olmayan gen kalıntıları) veya tahmin artifact (kütüphaneler oluşturulurken genomik sekanslar bazen cdna klonlarına katılabilir) cdna sekansına dayalı ise genler yanlış tahmin edilebilir. Diğer yandan, gerçek genler çok düşük seviyede ifade olursa veya cdna kütüphanelerindeki nadiren bulunacağı için hücre populasyonlarında veya genin özellikleri bilgisayar tarafından tespit edilmediğinde (bu özellikle non-coding RNA gibi atipik genlere aittir) gerçek genler kaçırılabilir. İnsan genlerinin tanınması zor olmaktadır. Çünkü genellikle büyüktürler fakat büyük intronlar tarafından belirli sayıda küçük ekzonlara bölünmüştür. Bundan dolayı gen tanımlansa bile, ekzonların kaçırılmış olması veya gen sınırlarına yanlış karar verilmesi olasıdır. Büyük intronlar arasına gizlenmiş küçük insan genlerinin olduğu örnekler bulunmaktadır. Belkide insan gen kataloğunun doğru ve tam olarak oluşturulması çok zaman alacaktır. 20

Sekanslamanın daha ileriki safhasındaki belirgin bir konu, sekans bilgisinin sunulmasıydı ve ilişkili gen yorumları idi. Bu problem, bilgiyi göstermek için front-end grafiksel kullanıcı arayüz kullanan ve kullanıcının genomunu farklı rezolüsyonda gösteren ekranlar arasında geçiş yapmasına izin veren genom browserlarının geliştirilmesi ile çözülmüştür. Örneğin, EnsEMBL browser (http:// www.ensembl.org) tüm genomu kromozom serileri halinde görülmesine izin verir. Kromozom üzerine tıklandığında, kullanıcı, belirli subkromozomal bölgesine odaklanarak rezolüsyonu yavaş yavaş tek nükleotid seviyesine kadar arttırır (şekil 2.8.). Herbir kromozom segmenti, genlerle, markırlarla ve daha fazla kullanılabilir bilginin düzenli olarak yenilenmesi gibi diğer özellikler ile geniş olarak yorumlanmaktadır. Bunlar, genlerin fonksiyonu ve yapısı hakkında ve diğer organizma genomlarındaki ilişkili genler hakkında daha fazla bilgi veren yaygın olarak kullanılan linklerdir. Kutu 2.6 Draft Sekans ve Bitmiş Sekans Şubat 2001 de draft insan genom sekansının tamamlandığı ilan edildiğinde büyük bir bilimsel başarı olarak müjdelendi. Fakat, sekans, genomun %90 ınından fazla değildi ve bilgilerin çoğu hamdı. Draft sekansı, bitmiş sekans haline getirmek için yapılacak neler kalmıştı? Heterokromatin Eksik dizilerin çoğu heterokromatinleri, her kromozomun primer olarak sentomer bölgesinde sıkıca paketlenmiş DNA yı, temsil eder. Bunlar, klonlanması zor olan, büyük tandem repat bölgelerini içerirler. Bazı heteromerik DNA lara belkide ebediyen ulaşamayacağız ve insan genom sekansı asla tam olarak tamamlanamayacaktır. Fakat, çok az bir gen heterokromatinde bulunduğu için genomun medikal uygulamaları üzerine etkisi olmayacaktır. Boşluklar Boşluklar, örnek hatalarından dolayı tüm sekanslamalarda ortaya çıkmaktadır. Örnekleme hataları, kütüphanelerin oluşturulması sırasında (genomun bazı kısımları kütüphanede gösterilmemiştir) ve sekanslama sırasında (bazı sekanslar seçilmemiş olmaktadır ) ortaya çıkmaktadır. Boşlukların kapatılma stratejisi, çoklu genomik kütüphanelerin kullanılmasını ve bilinen kontiglerin uçlarından dışarıya yönelik PCR primerler ile DNA nın çoğatılmasını içermektedir. Draft genom sekansında yaklaşık 50,000 boşluk bulunmaktaydı. 21

Tamamlanmamış Sekans Otomatik sekanslama, bilgiyi farklı bazları gösteren piklerden oluşan sekans izleri şeklinde göstermektedir (şekil B2.6). Beklenen hatalardan korunmak için, tamamlandı demeden önce genomun her bir kısmı bağımsız olarak 8-10 kez sekanslanmıştır. Sekansın niteliği, PHRED gibi her pik için skoru değerlendiren bilgisayar programları kullanılarak değerlendirililmiştir. Eğer sekansın kalitesi yeterli değilse, bu kabul edilmez ve tekrar gerçekleştirilmelidir. Hem HGP hem de Celeranın, draft sekanslarının sadece %25 i bitmiş niteliktedir. Gelecek: Fonksiyonel Genomik Şu anda 30 bin dolayında insan geni olduğunu biliyoruz. Bir sonraki iş ise, bunların ne yaptığını bulmaktır. Biliyoruz ki kalıtsal hastalıklar, gen işlevlerinin bozukluğu nedeniyle oluşmaktadır. İlaçlara, pathojenlere, diğer çevresel etmenlere olan yanıtımız genler tarafından beklirlenmeketedir. Ayrıca genler belirli çevresel bileşenleri içeren astım gibi hastalıklara yatkınlığımızı da etkilemektedir. Geleneksel methodların kullanılmasıyla gen-hastalık veya gen ve yanıt arasındaki ilişkiler açısından sadece 1500 e yakın gen aydınlatılmıştır ve her defasında da bu aydınlatma yolu yavaş ve zahmetli olmuştur. Fonksiyonel genomiğin amacı, yeni ve yüksek kapsamlı teknolojiler kullanarak büyük oranda genlerin fonksiyonunu saptamaktır. Bu teknolojiler bu nedenle tıbbi keşfin yeni araçlarını temsil etmektedir. Tüm hedef, sağlıklı vücut aktivitelerinin koordinasyonu için, genlerimiz arasındaki ilişkiyi veya onların protein ürünlerini tam olarak öğrenmektir. Bu aktiviteler bozulduğu zaman, moleküler düzeyde ne olduğunu anlamamız gerekir bu da daha etkili terapilerin gelişmesine ve sağlanması için bize olanak verecektir. Aynı ilkeler, bizim patojenlerimizin proteinleri ve genleri içinde geçerlidir. Onlar hakkında daha fazla bilgi elde ederek, vücudumuzda proteinlerle nasıl etkileşime girdiğini bilmek, bize enfeksiyon hastalıklarının etkilerini 22

sınırlamamıza yardımcı olur. Fonksiyonel genomikteki platformlar çeşitli anahtar alanlara ayrılmıştır Bunların ilkeleri ve uygulamaları aşağıda tartışılmıştır. Fig. 2.8 EnsEMBL dan bir ekran, kromozom 5, p13.2 bandına genel bakış ve bu banttaki 100kb lık bölgeye detaylı bakış görülmektedir. Sayfanın aşağısında DNA sekans ve translasyon dizileri okunabilmektedir. 23

SEKANS KIYASLAMASI VE KARŞILAŞTIRMALI GENOMİK Herhangi bir deneysel çalışma yapmadan genlerin fonksiyonu hakkında büyük miktarda bilgi elde etmek mümkün değildir. Genomik DNA daki genleri aramak için bilgisayar programları genellikle benzerlik araştırması ilkelerinin sağlanması ile bilinen genlerle eşleşen dizileri bulmak için algoritmleri birleştirir. Bu algoritmler, sekans bilgisi için üniversal olarak zengin bir kaynak olan sekans veri tabanlarına dayanmaktadır. Veritabanlarının genomikteki önemi küçümsenmeyecek derecededir. Veritabanları her çeşit biyolojik bilgi için zengin içerikli elektronik kaynaklardır ve birçoğuna internet üzerinden serbestçe ulaşılabilmektedir. Primer veri tabanları orijinal nükleik asit ve protein dizisini içerirken, sekonder veritabanları ise yüksek oranda korunmuş protein ailelerinin profillerinin sıralanmasında primer veritabanlarındaki bilgiyi kullanır (tablo 2.3). BLAST, FASTA ve onların türevleri gibi arama algoritmleri yeni sekansların daha önce depolanmış tüm sekanslarla karşılaştırılmasına izin verir. Burada önemli olan, sekans veritabanları, sadece sekansı içermez aynı zamanda gen fonksiyonu ile ilişkili olabilecek bilgileri de içermektedir. Eğer insan geninin fonksiyonu bilinmiyorsa, genellikle başka bir türdeki ilişkili gen çalışılır fonksiyonu hakkında bazı bilgiler elde edilir. Bundan dolayı, yeni genlerin fonksiyonunun belirlenmesinde en hızlı yol, veritabanlarını aramak ve tamamen yorumlanmış ilişkili dizileri bulma girişimidir. Tablo 2.3 Primer ve skonder sekans ve yapısal veri tabanları 24

Sekans kıyaslaması aracılığı ile fonksiyonel yorum, tüm genom üzerinde uygulanabilir, fakat tüm genlerin fonksiyonu etkin bir şekilde saptanamaz. Örneğin, 1996 yılında maya genomu sekanslandığında, genlerin %30 u biliniyordu ve fonksiyonu da mevcut deneylerle belirlenmişti. Tahmin edilen genlerin %30 undan daha fazlasının, veritabanında bulunan diğer genlerle homolojisine dayanarak kısmi olarak fonksiyonları belirlenmişti. Kalan %30 un fonksiyonu bilinmezken (orphan genler olarak biliniyor), %10 u ise kesin olmayan tahminlere aitti. İnsan genomunun fonksiyonel olarak yorumlanması, genlerin tam olarak tahmin edilememesinden dolayı oldukça karmaşıktı, fakat genlerin yaklaşık %60 ının fonksiyonu önceden var olan deneysel kanıtlar veya karakterize edilmiş diğer türlerdeki genler veya insan genleri homolojisine dayanarak belirlenebilmişti. Genlerimizin kalan %40 nın fonksiyonu ise bilinmemektedir. Orphan genlerle ile ilgili problem kısmı, ilişkili dizilerin tespitindeki zorluğu ifade etmektedir. Standart arama algoritmleri, %30 u aynı olan protein dizilerini güvenilir şekilde belirlemektedir. Fakat bu seviyenin altında birçok ilişki bulunmamıştır. Büyük protein ailelerine uyan profil ve paternlere dayanan çok daha içerikli arama teknikleri, bazı durumlarda yardımcı olabilmektedir fakat bu methodlar her zaman güvenilir değildir. İlgili yeni yaklaşımlar, fonksiyonel yorumu için dizilerden çok protein yapısının kullanmak içindir. Protein yapıları, sekanslara göre çok daha fazla korunmuştur. Örneğin, sekansları sadece %17 benzerlik göstermesine rağmen hemoglobin ve myoglobin yapısı aslında aynıdır. DALI, VAST, COMPARER gibi yapısal karşılaştırmalı algoritimler kullanılarak, %10 dan daha az benzerlik gösteren protein yapılarını karşılaştırmak mümkündür. Dizilere gelindiğinde, nüklear manyetik rezonans spektroskopi ve/veya X-ray kristallografi aracığı ile protein yapılarının çözüldüğü primer veritabanları vardır. Protein yapılarının sistematik ve yüksek verisel tarzda çözülmesi için çeşitli uluslar arası işbirlikçi girişimler devam etmektedir, onun için her protein ailesi için var olan örnekler veritabanlarında saklanmaktadır. Gelecekte, protein olarak ifade edilmeleri, protein yapılarının çözülmesi, bunları veritabanındaki yapılarla karşılaştırılması yoluyla orphan genlerin fonksiyonlarını tanımlamak belkide mümkün olabilir. Bu durumda protein yapılarının tanımlanması için standart bir dil belirlenmelidir. 25

Fonksiyonel yorumlama için sekansa dayalı diğer bir yöntem karşılaştırmalı genomikdir. Karşılaştırılmalı genomiğin prensibi, türler arasındaki benzerlikleri tek gen seviyesinin ötesinde yaymak ve tüm genomları içermektir. Yakın olarak ilişkili türlerde (örn; fare vb insan) evrimsel olarak korunmuş fonksiyonu ile tek sekanslar her iki genomda bulunabilirken diğerleri belirgin olarak ayrıldığı için, karşılaştırmalı genomik genlerin ve düzenleyici elementlerinin tanımlanmasına yardım edebilir. Birbiriyle uzak ilişkili türler arasında bile moleküler yollar ve iletişim seviyesinde, korunmanın derecesi şaşırtıcıdır. Dikkat çekici bir örnek, nematod Caenorhabditis elegans ve insanlar arasındaki insülin sinyal metabolik yolunun korunmasıdır. Gerçekten, bilinen insan hastalık genlerinin %60 ına yakın bir kısmının eşi, bu solucanda ve/veya diğer omurgasız model organizmalarda, meyve sineği Drosophila melanogaster, bulunmaktadır. Bu da, insan genlerine benzeyenleri ayırmaya yardımcı olabilen daha ileri metabolik yol bileşenlerinin aydınlatılmasında, çalışmaların sorumlu organizmalara taşınmasına izin verir. Hatta hastalık genlerimizin yaklaşık %30 nun akrabaları, hücre bölünmesi ve DNA onarımı gibi yüksek oranda korunmuş fonksiyonları temsil edici mayada bulunmaktadır. Fonksiyonel yorum için araçların sağlanması kadar, bu organizmalar hastalık modelleri olarak kullanılabilirler. Örneğin, C.elegans daki insülin sinyali metabolik yolu tip 2 diabet için mükemmel bir model sağlamak için ayrılabilir. Sekans ve /veya yapısal karşılaştırma, fonksiyonel yorumlama için yararlı ilk yardım kaynağı olabilmesine rağmen, bilginin neden dikkatle işlenmesi ile ilgili çeşitli nedenler vardır. Düşük karışıklıktaki bölgeler, çok çeşitli fonksiyonları ile birçok proteinde bulunurlar. Transmembran domeynleri bu kategoriye girmektedir. Sekans benzerliği, fonksiyonel benzerliği garanti etmez. Bir miktar dizi çok fonksiyonludur ve tamamen birbiriyle ilişkisi olmayan fonksiyonlarla proteinlerde ortaya çıkmaktadır. Örneğin, α/β hidrolaz katlanmış formu,fonksiyonu farklı birçok enzimde katalitik bölgeyi oluşturur aynı zamanda hücre adhesyon moleküllerinde bulunur. Bazı proteinler evrim süresince sonradan kazanılmış ek fonksiyonlar içerirler. İyi bir örnek, olağan metabolik enzimlerin kristalinler olarak güçlendirilmesidir. Proteinler gözdeki lensin ışığı kırmasına izin verir. 26

Fonksiyonun tanımlanmasında tüm araştırmacılar tarafından kullanılan dil aynı değildir, iki anlamlılık yükselebilir. Son zamanlarda, fonksiyonel sınıflandırma için terminolojiyi standardize etmek için düzenlenmiş girişimler bulunmaktadır. Veritabanları hata içermektedir. Bazıları yazım hatası iken bazıları deneysel hata olarak artmaktadır. Sadece veritabanı bilgilerine göre yeni genlerin yorumlanması,diğer insanlarca yapılan hataları destekleyerek, risk oluşturur. Son olarak, sekans benzerliğine dayalı birçok fonksiyonel tahminler, biyokimyasal fonksiyon tahminleridir ve her zaman yardımcı olmayabilir. Örneğin, protein kinazı kodlayan yeni bir genin bulunması mümkündür ama, bu proteinin yaygın rolü hakkında herhangi bir bilgi sağlamaz. Proteinlerin hastalıklardaki rollerini de kapsayan, hücresel veya biyolojik seviyedeki fonksiyonları hakkında daha fazla bilgi gerekmektedir ve bu da sadece diğer tip çalışmalarla sağlanabilir. 27