AMİLAZ SELÜLAZ VE KSİLANAZ ÜRETEBİLEN ORTA DÜZEYDE HALOFİL BACILLUS SP. İZOLASYONU VE OPTİMUM ÜREME VE ENZİM SENTEZLERİNİN BELİRLENMESİ

AMİLAZ SELÜLAZ VE KSİLANAZ ÜRETEBİLEN ORTA DÜZEYDE HALOFİL BACILLUS SP. İZOLASYONU VE OPTİMUM ÜREME VE ENZİM SENTEZLERİNİN BELİRLENMESİ Isolation Of Moderately Halofilic Bacillus Sp. Producing Amilase, Cellulase And Xylanase And Determination Of Optimum Growth And Enzyme Production Ashabil AYGAN * Biyoloji Anabilim Dalı Burhan ARIKAN Biyoloji Anabilim Dalı ÖZET Van gölü kıyı şeridinden 20 farklı bölgeden alınan toprak örneklerinde toplam 242 bakteri izolasyonu yapılmış ve bunlardan 76 sı amilaz üreten (%31.66), 35 i selülaz üreten (%14.6), 32 si ksilanaz üreten (%13.2) özellikte suş olduğu belirlenmiştir. Bu suşlar içinden en iyi üreme ve enzim sentezini gösteren suşlar seçilerek identifiye edilmiştir. Amilaz üretimi için seçilen katı besiyerinde Bacillus sp.ab-17 suşu en iyi ph 9.5 de 37 o C de ve %7 tuz konsantrasyonunda üreme ve enzim üretimini gerçekleştirdiği bulunmuştur. Selülaz için seçilen Bacillus sp.c-14 suşu, ph 8.5-9.5 aralığında 37 o C de %3 tuz konsantrasyonunda üreme ve enzim üretimini gerçekleştirdiği saptanmıştır. Ksilanaz enzimi için seçilen Bacillus sp.x-13 suşu ise ph 6.0-7.0 aralığında 40 o C de en iyi üreme ve enzim sentezlediği saptanmıştır. Anahtar Kelimeler : Bacillus, Ilımlı halofil, Amilaz, Selülaz, Ksilanaz ABSTRACT Total 242 bacterial strain were isolated from the soil samples collected from Van Lake shoreline. Of the isolates 76 (31.66%) was amylase producing, 35 (14.6%) sellulase producing and 32 (13.2%) was xylanase producing strains. Among these, the strains were identified showing best growth and enzyme producing. Bacillus sp.ab-17 chosen for amylase production showed optimal growth and enzyme production at ph 9.5; 37 o C and 7% salt concentration. Bacillus sp.c-14 showed optimal growth ans enzyme production between ph 8.5-9.5 at 37 o C and 3% salt concentration. On the other hand, the strain Bacillus sp.x-13 produced xylanase at 40 o C, ph 6.0-7.0 range. Key Words : Bacillus, Moderate Halophile, Amylase, Cellulase, Xylanase Giriş Enzimler, doğal olarak canlılar tarafından sentezlenen protein yapısında ya da bir kısmı protein olan biyo-moleküllerdir. Enzimler, binlerce yıldır içecek, ekmek ve peynir yapımı gibi işlemlerde varlığı ve görevi bilinmeden kullanılmıştır. Tarihsel gelişim açısından bakıldığında enzimlerin çok farklı kaynaklardan elde edildiği görülmektedir. Bunlar bitkisel, hayvansal ya da endüstriyel anlamda ihtiyacı * Doktora Tezi-PhD.Thesis 1

karşılayabilen mikrobiyal kaynaklı enzimlerdir (Gupta ve ark., 2003). Bugüne kadar yaklaşık 2500 farklı enzim tanımlanmış ve bunların ancak % u ticari alanda kullanım için kendilerine yer bulmuşlardır. Bu % içinde 25 tanesi nişasta sanayi ile deterjan katkı maddesi olarak kullanılmış olup, ticari alanda yararlanılan bütün enzimlerin %80 ini oluşturmaktadırlar (Woodley, 2000). Bitkisel ve hayvansal enzimlerin endüstriyel ihtiyacı karşılayamaması, bu alandaki ilginin giderek artan bir şekilde mikrobiyal enzimlere yönelmesini sağlamıştır. Günümüzde endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %90 ı mikroorganizmaların fermentasyonu ile üretilmektedir (Godfrey ve West, 1996). Bacillus cinsi bakteriler, toprakta, hayvan dışkılarında ve bitkisel ürünler üzerinde yaygın olarak bulunurlar. Bu cinsin bireylerinin çoğu zararsız, izolasyonu ve teşhisi kolay, hızlı büyüme oranı ile fermentasyon süresi kısa, genel olarak güvenli olması, sentezledikleri proteinlerin dış ortama salgılama kapasiteleri gibi birçok sebepten dolayı cazip endüstriyel organizmalardır. Çünkü gram negatif bakteriler, insanlara toksik olan endotoksin üretimi ve intrasellüler protein üretimi ile izolasyon ve saflaştırma için ekstra maliyet oluşturmaktadırlar (Schallmey ve ark., 2004). Mantarlardaki aflatoksin gibi toksik ya da alerjen (Sander ve ark., 2000) bileşik üretimi de göz önünde bulundurulduğunda, gram pozitif bakterilerin, özellikle Bacillus türlerinin endüstriyel enzim üretiminde öncelikli olarak tercih edilmesine neden olmaktadır. Amilazlar, glikoz birimlerinden oluşan nişasta ve benzer polimer moleküllerini parçalayan glikozid hidrolaz olarak da bilinen enzimlerdir. Doğada bitkiler, hayvanlar ve mikroorganizmalarda bulunur ve amiloz, amilopektin ve glikojeni oluşturan glikoz birimleri arasındaki glikozidik bağları parçalayabilme yeteneğine sahiptir. Amilazlar, unlu mamüllerde, alkolsüz içecek endüstrisinde, tekstil endüstrisinde, kağıt ve kağıt hamuru endüstrisinde, deterjan endüstrisinde, medikal ve klinik kimya analizleri ile biyoteknoloji uygulamalarında kullanılmaktadır(gupta ve ark., 2003; Aiyer, 2005; Giri ve ark.,1990). Selülazlar, selülozu glikoza parçalayabilme kapasitesindeki hidrolitik enzim grubudurlar. Mikroorganizmalar, bitkiler ve hayvanlar (memeliler hariç) tarafından üretilirler. Endoglukanazlar (endo-1,4- -glucanases, yada 1,4- -D-glucan-4- glucanohydrolases) selülozu meydana getiren polisakkarit zincirinin iç bölgelerinde rastgele hidroliz yaparlar ve değişik uzunlukta oligosakkaritler meydana getirirler. Selülazların ana uygulama alanları gıda, hayvan yemi üretimi, tekstil, biyo yakıt, kimya, kağıt ve kağıt hamuru endüstrisi, atıkların giderimi, tıbbi ve farmasötik endüstrisi, protoplast üretimi, genetik mühendisliği ve kirlilik giderimidir (Bhat ve Bhat, 1997). Ksilanı hidroliz eden enzimlerin tamamına ksilanolitik enzimler adı verilir. Endoksilanazların genel olarak bakteri ve mantarlardan meydana gelen mikroorganizmalar tarafından üretildikleri bulunmuştur. Bununla birlikte, bitkisel kökenli endoksilanazların da bulunduğu ve bazı meyvelerin aşırı olgunlaşma dönemi sonunda üretildikleri saptanmıştır. Su yumuşakçaları dahil bazı gelişmiş hayvanlarda da ksilan üretiminin gerçekleştiği bildirilmiştir. Özellikle mikroorganizmalardan elde edilen ksilanolitik enzimler, birçok endüstriyel işlemlerde biyoteknolojik potansiyellerinden dolayı büyük bir ilgi odağı olmuştur. 2

Bilhassa kağıt ve kağıt hamuru başta olmak üzere gıda ve hayvan yemi endüstrisi gibi alanlarda temel endüstriyel enzim olma yolunda çok büyük öneme sahiptir. Ksilanazların ekonomik önemi yüksek birçok faydalı ürünün istenilen düzeyde üretimi için önemli bir potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. Tek hücre proteini, enzimler, sıvı ya da gaz yakıtların üretimi, çözücüler ve şeker şuruplarının üretimi genel uygulamalar arasındadır (Beg ve ark., 2001). Ksilanazların kullanımı sadece kağıt ve kağıt hamuru endüstrisi ile sınırlı olmayıp aynı zamanda ligno-sellülozik materyallerin dönüşümü, tarımsal atıkların fermentatif ürünlere parçalanması, meyve sularının berraklaştırılması, biranın kıvamının gelişimi, hayvan gıdalarının sindiriminin artırılması alanlarında özel bir öneme sahiptir(viikari ve ark., 1986; Beg ve ark., 2001). Bu çalışmada, amilaz, glukanaz (selülaz) ve ksilanaz enzim üreticisi Bacillus sp. bakterilerinin doğal ortamdan izolasyonu, farklı sıcaklık, ph ve tuz konsantrasyonlarında üreme ve enzim üretme parametrelerinin araştırılması amaçlanmıştır. Materyal ve Metot Materyal Topraktan bakteri izolasyonu için LB agar, katı besiyerinde amilaz pozitif suşların üreme ve enzim üretme yeteneklerinin belirlenmesi için M9-Nişasta Agarı (Shibuya ve ark., 1986),selülaz pozitif suşların üreme ve enzim üretme yeteneklerinin belirlenmesi için CMC-Agar Besiyeri (Kim ve ark., 2005), ksilanaz pozitif suşların üreme ve enzim üretme yeteneklerinin belirlenmesi için de Ksilanlı Besiyeri (Gessesse, 1998) kullanılmıştır. Test edilmek istenen özelliklere göre NaCl ve ph değerleri ayarlanmıştır. Katı besiyerinde amilaz aktivitesinin saptanması için lügol, selülaz ve ksilanaz aktivitesinin gösterilmesi için %0.1 lik kongo kırmızısı kullanılmıştır. Metot Bakteri İzolasyonu: Van gölü çevresinden 20 farklı bölgeden alınan toprak örnekleri, Bacillus sp. suşlarının izolasyonu için 1 g tartılarak 4.5 ml steril distile su içerisine ilave edilip homojen şekilde karıştırıldıktan sonra, 80 o C de dakika sıcaklık uygulamasından sonra (Lennette ve ark., 1985), tek koloni elde edilmesi amacıyla steril su bulunan tüplerde seri sulandırma yapılarak % NaCl içeren ve ph sı.0 olan LB agar besiyerine yayma ekim şeklinde ekim yapılarak 37 o C de inkübasyona bırakılmıştır. Morfolojik görünümlerine dayanılarak seçilen bakteriler stok kültür şeklinde saklanmıştır. Bakteri Teşhisi: Seçilen bakteri örneklerinin teşhisi için Gram boyama, hareketlilik, spor oluşumu gibi mikroskopi testlerinin yanısıra katalaz ve kültür morfolojisinin incelenmesi ile glikoz, ksiloz ve mannitolden asit oluşumu gibi biyokimyasal testler yapılmıştır (Ratanakhanokchai ve ark., 1999). 3

Amilaz Aktivitesinin Saptanması: Topraktan izole edilen suşlar ph.0 da hazırlanmış M9 Nişasta Agar besiyerine (Shibuya ve ark., 1986) çizgi şeklinde ekildikten sonra 37 o C de inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda lügol buharına tutularak enzim aktivite zonları belirlenmiştir. Selülaz ve Ksilanaz Aktivitelerinin Saptanması: Topraktan izole edilen suşlar CMC agar besiyerine(kim ve ark., 2005) çizgi şeklinde ekilerek bir gece 37 o C de inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda petri kutusuna %0.1 lik kongo kırmızısı çözeltisinden dökülerek örnekler 15 dakika süreyle boyanmıştır. 1M lık NaCl çözeltisi ile boyanın fazlası alınarak aktivite zonları belirlenmiştir. Katı Besiyerinde Bakterilerin Optimum Ürediği ve Enzim Sentezinin Gerçekleştiği ph Aralığının Saptanması: 5.0-12.5 arasında ph değerine sahip substrat içeren besiyerleri hazırlanarak, tanımlamaları yapılmış amilaz, selülaz ve ksilanaz pozitif suşlar, katı besiyerlerine çizgi şeklinde ekilmişlerdir.örnekler inkübasyon sonunda üreme ve enzim sentezinin gerçekleştiği ph aralıkları koloni ve aktivite zon çapları ölçülerek belirlenmiştir. Katı Besiyerinde Bakterilerin Optimum Ürediği ve Enzim Sentezinin Gerçekleştiği Sıcaklık Aralığının Saptanması: Besiyerlerinde maksimum üreme ve enzim sentezinin gerçekleştiği ph da hazırlanan besiyerlerine inokülasyon sonrası farklı sıcaklıklarda inkübasyon yapılarak optimum sıcaklık tayini uygun boya ve solüsyonlar ile aktivite zonları belirlenmiştir. Bakterilerin Katı Besiyerinde Optimum Ürediği ve Enzim Sentezinin Gerçekleştiği Tuz Konsantrasyonunun Saptanması: Bakterilerin maksimum üreme ve gösterdiği ph da farklı tuz konsantrasyonları içeren besiyerlerine inokülasyonları yapılarak optimum sıcaklıkta inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası besiyerlerinin uygun boya ve solüsyonlarla aktivite zonları belirlenmiştir. Araştırma Bulguları Van Gölünde suların çekildiği kıyı şeridinin 20 farklı bölgesinden toprak örneklerinin laboratuvarda ısısal ön işlem sonrası yayma şeklinde ekim yapılan besiyerlerinden toplam 242 bakteri suşu izole edilmiştir. Bu izolatlardan 76 sı amilaz pozitif (%31.66), 35 i selülaz pozitif (%14.6), 32 si ksilanaz pozitif (%13.2) özellikte olduğu belirlenmiştir. Bu suşlar içinde en iyi üreme ve enzim sentezini gösteren suşlar seçilerek identifiye edilmiştir. Suşlar gram pozitif, aerob, spor oluşturan, çubuk şekilli ve hareketli bakterilerdir. Glikoz, ksiloz ve mannitolü asit oluşturarak parçalamış ve katalaz pozitif özellik göstermişlerdir.bu sonuçlara göre amilaz pozitif suş Bacillus sp.ab17, Selülaz pozitif suş Bacillus sp.c14 ve Ksilanaz pozitif suş ise Bacillus X13 olarak tanımlanmıştır. AB-17 Suşunun Katı Besiyerinde Üreme ve Enzim Üretimi: AB-17 suşu ph:7.0-12.5 arasında üreme göstermekle birlikte ph 9.0-.0 aralığında optimum değer 4

elde edilmiştir. Analiz edilen ph değerlerinden 7.0-12.0 aralığında enzim sentezi gerçekleştiği bulunmuştur. Özellikle ph 7.5-.0 aralığında 14 mm lik aktivite zon çapına ulaşılırken, ph 11.5-12.0 değerlerinde 2 mm zon çapı elde edilmiştir. Enzim sentezi optimum (18 mm aktivite zon çapı) ph 9.5 de gözlenmiştir. En iyi üreme ve en yüksek enzim sentezinin ph 9.5 de geçekleşmesi, bakterileri izolasyonlarının gerçekleştirildiği ph değeri ile (ph 9.5) uygunluk göstermektedir. Bu sonuçlar seçilen AB-17 suşunun orta düzeyde halofil ve alkali olduğunu göstermektedir. Şekil 1:AB-17 Suşunun 37 o C de Farklı ph larda Üreme ve Enzim Üretimi. Elde edilen verilere göre en iyi üreme 4 mm lik koloni çapı ile 25 ve 37 o C lerde görülürken, 45 o C de 1 mm koloni çapına ulaşılmıştır. Buna karşılık 50 o C de üreme gerçekleşmemiştir. Aynı sıcaklık değerlerindeki enzim sentezleme özelliği araştırıldığında ise sadece 25 ve 37 o C lerde aktivite zonu oluşmuştur. Maksimum zon oluşumu 17 mm ile 37 o C de gerçekleşmiştir. Sıcaklık değerlerinden 45 ve 50 o C ler de ise enzim sentezi gözlenmemiştir. Bu sonuçlar enzim üretimi amacı için seçilen suşun mezofil özellikte olduğunu göstermektedir. Şekil 2: AB-17 Suşunun ph 9.5 da Farklı Sıcaklıklarda Üreme ve Enzim Üretimi. 5

Koloni ve Zon Çapı(mm) Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2008 Cilt:18-2 AB-17 suşu %3-%15 aralığındaki NaCl konsantrasyonlarında üreme gösterirken, %20 NaCl lü ortamda üreme saptanmamıştır. Optimum üreme 4 mm koloni çapı ile % NaCl lü ortamda gerçekleşirken, %3-7 aralığında 3 mm koloni çapı elde edilmiştir. Üreyen kolonilerdeki enzim üretimi ise %3-13 aralığındaki NaCl lü ortamlarda gerçekleşmiştir. Katı besiyerinde optimum enzim üretimi 18 mm zon çapı ile %7 lik NaCl lü ortamda görülürken, %3, %5 ve %7 NaCl bulunan ortamlarda 14 mm, %13 NaCl lü ortamda ise 6 mm zon çapı elde edilmiştir. Bu sonuçlar enzim üretiminde kullanılan suşun orta düzeyde halofil olduğunu göstermektedir (Ventosa ve ark, 1998). Şekil 3: AB-17 Suşunun ph 9.5 da 37 o C de Farklı Tuz Konsantrasyonlarında Üreme ve Enzim Üretimi. C-14 suşunun 37 o C lik inkübasyon ortamında ph 6.5-12.0 aralığında ürediği bulunmuştur. Enzim sentezine ilişkin çalışmalarda ise ph 7.0-11.5 aralığında 16-7 mm arasında aktivite zonu elde edildiği, optimum aktivite zonunun 24 mm ile ph 8.5 ve 9.5 te gerçekleştiği saptanmıştır. ph 7.5-9.5 aralığında ise ortalama 23 mm aktivite zonu gözlenmiştir. En yüksek aktivite zonunun ph 8.5-9.5 aralığında gözlenmesi, bakterinin alkalifil özellikte olduğunu göstermektedir. Horikoshi (1999), ph 8.5 in üzerinde bakteri üremesi ve enzim sentezinin gerçekleşmesinin alkali organizmaların en büyük özellikleri olduğunu bildirmiştir. 30 20 0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 ph Hidroliz Zonu Koloni Büyüklüğü,0,5 11,0 11,5 12,0 12,5 Şekil 4: C-14 Suşunun 37 o C de Farklı ph larda Üreme ve Enzim Üretimi. 6

Koloni ve E nzim Zon Büyüklüğü(mm) Koloni ve Enzim Zon Büyüklüğü(mm) Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2008 Cilt:18-2 C-14 suşu, test edilen sıcaklık aralıklarında 25-50ºC aralığında 9-6 mm koloni çapı oluşturarak üremiştir. Bacillus sp. C-14 suşunun optimum üremesi mm koloni çapı ile 37ºC de gerçekleşirken, 25ºC de 9 mm, 45ºC de ise 8 mm lik koloni çapı elde edilmiştir. Aynı sıcaklık değerlerinin kullanıldığı enzim sentezleme çalışmalarında optimum sentezin 22 mm aktivite zonu ile 37ºC de gerçekleştiği saptanmıştır. Bacillus sp. C-14 suşu, optimum üreme ve enzim sentezleme yeteneği dikkate alındığında mezofil ve alkalin özellik göstermektedir. Bununla birlikte, suşun 25ºC de 9 mm çaplı koloni, 11 mm aktivite zonu, 55ºC de ise 6 mm çaplı koloni 9 mm çapında aktivite zonu oluşturması, psikrotolerant-termotolerant aralığında yüksek düzeyde üreme ve enzim sentezleme yeteneğinde olduğunu göstermektedir. Hidroliz Zonu 40 30 20 0 25ºC 37ºC 45ºC 50ºC Sıcaklık Koloni Büyüklüğü Şekil 5: C-14 Suşunun ph 9.5 da Farklı Sıcaklıklarda Üreme ve Enzim Üretimi. C-14 suşu %3-%13 NaCl içeren katı besiyerinde 9-1 mm koloni oluşturacak şekilde üremiştir. Konsantrasyon arttıkça koloni çapında da azalma meydana gelmiştir. NaCl konsantrasyonu %15-20 düzeylerine çıkarıldığında ise her hangi bir üreme gözlenmemiştir. Maksimum koloni oluşumu 9 mm ile %3 lük konsantrasyonda gerçekleşirken % NaCl içeren ortamda koloni çapı 5 mm olarak gerçekleşmiştir. Optimum enzim sentezi 12 mm ile %5-7 konsantrasyonda gözlenirken, %3 de 11 mm % da ise mm aktivite zonu meydana gelmiştir. Bu sonuçlar C-14 suşunun halofil özellikte olduğunu göstermektedir. Literatür bilgilerinde %3-15 NaCl içeren ortamlarda üreyen organizmaların orta düzeyde halofil özelliğe sahip olduklarını belirtilmektedir (Ventosa ve ark., 1998). 25 Koloni Büyüklüğü Hidroliz Zonu 20 15 5 0 3% 5% 7% % 13% 15% 20% Tuz Kons (%) Şekil 6: C-14 Suşunun ph 9.5 da 37 o C de Farklı Tuz Konsantrasyonlarında Üreme ve Enzim Üretimi. X-13 suşu ph 6.0-11.0 arasında üreme gösterirken en büyük koloni oluşumu mm ile ph 6.0-7.0 değerlerinde gerçekleşmiştir. X-13 suşu oldukça aktif bir enzim üreticisi olup, elde edilen aktivite zon çapları, ph 6.0-7.0 değerlerinde 25 7

Kaloni Büyüklüğü Ve Enzim Zon Çapı( mm ) Koloni Büyüklüğü ve Zon Çapı(mm ) Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2008 Cilt:18-2 mm, ph 8.0-9.0 değerlerinde ortalama 22 mm ve ph.0-11.0 değerlerinde ortalama 17 mm olarak saptanmıştır. ph 11.0 de elde edile aktivite zon çapı, koloni çapının dört katına ulaşmıştır. Bu sonuçlar suşun ve enzimin çok geniş ph aralığında üreme (asidikten-alkaliye) ve enzim sentezleme yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir. Buna karşılık özellikle ph 6.0-7.0 değerlerinde 25 mm gibi oldukça geniş aktivite zonu elde edilmesi, enzimin daha çok asidik ph da aktif olduğunu düşündürmektedir. 40 35 30 25 20 15 5 0 Koloni Büyüklüğü Hidroliz Zonu 6.0 7.0 8.0 9.0.0 11.0 12.0 ph Şekil 7: X-13 Suşunun 37 o C de Farklı ph larda Üreme ve Enzim Üretimi. X-13 suşu inkübasyon gerçekleştirilen bütün sıcaklık değerlerinde oldukça iyi üreme göstermiştir. Özellikle 30 ve 40ºC de gerçekleştirilen inkübasyonlarda mm koloni çapı oluşumu gerçekleşmiştir. İnkübasyon için seçilen 20ºC (4 mm) ve 60ºC (2 mm) sıcaklık aralığında üreme geçekleşmiştir. Bu özellikler dikkate alındığında suşun oldukça geniş bir sıcaklık toleransına sahip olduğu görülmektedir. Diğer taraftan aynı sıcaklıklarda oldukça geniş aktivite zon çapları oluşturacak şekilde enzim üretimi gerçekleşmiştir. İnkübasyon sıcaklığı 20-40ºC seçildiği zaman ortalama 22 mm aktivite zon çapına ulaşmıştır. Bütün sıcaklık değerleri ayrı ayrı değerlendirildiği zaman ise en yüksek enzim üretiminin 25 mm ile 40ºC de gerçekleştiği görülmektedir. Bununla birlikte 20ºC de 24 mm zon çapına ulaşılması, enzimin psikrofil, 60ºC deki zon çapının koloni çapının 8 katı büyüklüğe (16 mm) ulaşması ise aynı zamanda termofil özellikte olduğunu göstermektedir. Bir başka ifade ile X-13 suşu 20-60ºC ler arasında, oldukça iyi üreyebilen ve bu değerlerde yüksek düzeyde enzim sentezleme yeteneğinde olan bir organizmadır. 40 30 Koloni Büyüklüğü Hidroliz Zonu 20 0 20ºC 30ºC 40ºC 50ºC 60ºC Sıcaklık Şekil 8: X-13 Suşunun Optimum ph da Farklı Sıcaklıklarda Üreme ve Enzim Üretimi 8

Sonuçlar ve Tartışma Endüstriyel alanda kullanılan enzimler bitkisel, hayvansal ve mikroorganizma kökenli olmakla birlikte ağırlıklı olarak mikroorganizmalardan izole edilmektedirler. Bunun nedeni, mikroorganizma kaynaklı enzimlerin katalitik aktivitelerinin yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve daha ucuz olmaları, büyük boyutlarda ve yüksek saflıkta elde edilmesi gibi avantajlara sahip olmasıdır. Örneğin mikrobiyal enzimler ekstrem sıcaklık ve ph değerlerinde çok yüksek düzeyde aktivite gösterirler (Wiseman, 1987; Horikoshi, 1999). Endüstriyel öneminin ve kullanımının yaygın olması nedeniyle çalışmamızda Van soda gölünden izole edilen ve mezofil ortamda üreyebilen Bacillus sp. suşları izole edilerek analizleri gerçekleştirilmiştir. Bacillus sp.ab-17 suşu 4 mm lik koloni çapı ile 25 ve 37 o C arasında optimum üreme gösterirken, sadece 25 ve 37 o C lerde aktivite zonu saptanmıştır. Optimum zon oluşumu ise 17 mm ile 37 o C de gerçekleşmiştir. Bacillus sp AB-17 suşu %3-%15 aralığındaki NaCl konsantrasyonlarında üreme gösterirken, %20 NaCl lü ortamda üreme saptanmamıştır. Optimum üreme 4 mm koloni çapı ile % NaCl lü ortamda gerçekleşmiştir. Optimum enzim üretimi 18 mm zon çapı ile %7 lik NaCl lü ortamda görülürken, %3, %5 ve %7 NaCl içeren ortamlarda 14 mm, %13 NaCl lü ortamda ise 6 mm zon çapı elde edilmiştir. Bacillus sp AB-17 suşu ile katı besiyeri çalışmalarından elde edilen bu sonuçlar, bakteri suşunun mezofil, orta düzeyde halofil ve alkali özellik gösterdiğini kanıtlamaktadır. Bacillus sp. C-14 suşunun ph 6.5-12.0 aralığında ürediği, optimum üremenin 16 mm ile ph 8.5 de gerçekleştiği bulunmuştur. Enzim sentezi ph 7.0-11.5 aralığında gerçekleşirken 16-7 mm arasında zon çapı elde edilmiştir. Optimum aktivite zonu ise 24 mm ile ph 8.5 ve 9.5 te gerçekleşirken, ph 7.5-9.5 aralığında ise ortalama 23 mm aktivite zonu gözlenmiştir. Bacillus sp. C-14 suşu, test edilen sıcaklık aralıklarında (25-50ºC aralığında) 9-6 mm koloni çapı oluşturarak üremiştir. Bacillus sp. C-14 suşunun optimum üremesi mm koloni çapı ile 37ºC de gerçekleşirken, 25ºC de 9 mm, 45ºC de ise 8 mm lik koloni oluşumu saptanmıştır. Aynı sıcaklık değerlerinin kullanıldığı enzim sentezleme çalışmalarında optimum sentezin 22 mm aktivite zonu ile 37ºC de gerçekleştiği saptanmıştır. Bacillus sp. C-14 suşu, optimum üreme ve enzim sentezleme yeteneği dikkate alındığında mezofil ve alkalin özellik göstermektedir. Bununla birlikte, suşun 25ºC de 9 mm çapında koloni ve 11 mm aktivite zonu, 55ºC de ise 6 mm çapında koloni ve 9 mm aktivite zonu oluşturması, suşun psikrotolerant-termotolerant aralığında yüksek düzeyde üreme ve enzim sentezleme yeteneğinde olduğunu göstermektedir. Bacillus sp. C-14 suşu %3-%13 NaCl içeren katı besiyerinde 9-1 mm çaplı koloni oluşturacak şekilde üremiştir. Konsantrasyon arttıkça koloni çapında azalma meydana gelmiştir. NaCl konsantrasyonu %15-20 düzeylerine çıkarıldığında her hangi bir üreme gözlenmemiştir. Maksimum koloni oluşumu 9 mm ile %3 lük konsantrasyonda gerçekleşirken % NaCl içeren ortamda koloni çapı 5 mm olarak ölçülmüştür. Optimum enzim 9

sentezi 12 mm ile %5-7 konsantrasyonda gözlenirken, %3 de 11 mm % da ise mm aktivite zonu elde edilmiştir. Bu sonuçlar C-14 suşunun halofil özellikte olduğunu göstermektedir. Literatür bilgilerinde %3-15 NaCl içeren ortamlarda üreyen organizmaların orta düzeyde halofil özelliğe sahip olduklarını belirtilmektedir (Ventosa ve ark, 1998). Bacillus sp. X-13 suşu ph 6.0-11.0 arasında üreme gösterirmiş ph 6.0-7.0 değerleri arasında mm lik koloni çapına ulaşılmıştır. Aynı koşullarda gerçekleştirilen enzim sentezi analizlerinde, ph 6.0-7.0 aralığında 25 mm, ph 8.0-9.0 aralığında ortalama 22 mm ve ph.0-11.0 aralığında ortalama 17 mm aktivite zonu elde edilmiştir. Bu sonuçlar Bacillus sp. X-13 suşunun oldukça aktif bir enzim üreticisi olup, ph 11.0 de elde edile aktivite zon çapının, koloni çapının dört katına ulaştığı bulunmuştur. Üreme ve enzim sentezleme özelliği suşun çok geniş ph aralığında aktif olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, ph 6.0-7.0 aralığında zon çapının 25 mm ye ulaşması, suşun asidik aralıkta daha iyi çalıştığını göstermektedir. Bacillus sp. X-13 suşu inkübasyon gerçekleştirilen bütün sıcaklık değerlerinde 20ºC (4 mm) ve 60ºC (2 mm) üreme göstermiştir. Bakteri suşu, 20-40ºC lik inkübasyon aralığında ortalama 22 mm aktivite zonu oluşturmuştur. Bütün sıcaklık değerleri dikkate alındığında en yüksek enzim üretiminin 25 mm lik zon çapı ile 40ºC de gerçekleştiği görülmektedir. Diğer taraftan 20ºC de 24 mm, 40ºC de 25 ve 60ºC de 16 mm (koloni çapının 8 katı) aktivite zon çapı elde edilmesi suşun psikrofil-termofil aralığında çok yüksek aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar izole edilen bakterilerin endüstriyel amaçlı enzim üretimine uygun olduklarını ve bu enzimlerin büyük boyutlarda üretilmesi ve saflaştırılması durumunda nişastanın sıvılaştırılması, kağıt hamuru üretimi ve ağartılması, deterjan, tekstil, içecek, biyo-etanol ve hayvan yemi üretimi ve prebiyotik eldesinde kullanılabileceğini göstermektedir. Kaynaklar BHAT, M.K., and BHAT, S. 1997. Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications. Biotechnology Advances. 15: 583-620. GESSESSE, A. 1998. Purification and Properties of Two Thermostable Alkaline Xylanases from an Alkaliphilic Bacillus sp. Appl.Environ.Microbiol.64: 3533-3535. WOODLEY, J.M. 2000. Advances in Enzyme Technology-UK Contributions. Th.scheperi (Editör). Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, pp. 94-7. GODFREY, T. and WEST, S. 1996. Introduction to Industrial Enzymology. T.Godfrey and S. West (Editör) Industrial Enzymology,2 nd Edition, Stockton Pres, New York. SCHALLMEY, M., SINGH, A. and WARD, O.P. 2004. Developments in the Use of Bacillus Species for Industrial Production. Canadian Journal of Microbiology, 50:1-17.

SHIBUYA, I., IIMURA, Y., ISHIKAWA, T., OUCKI, K., MATSUYAMA, A., YAMAMOTO,T. 1986. Isolation and characterization of starch utilizing mutants of Escherichia coli. Agric.Biol.Chem.,50: 875-882. SANDER,I., RAULF-HEIMSOTH, M., VAN KAMPEN, V., BAUR,X. 2000. Is fungal amylase in bread an allergen? Clinical and Experimental Allergy, 30: 560-565. AIYER, P.V. 2005. Amylases and their applications. African Journal of Biotechnology. 4: 1525-1529. GIRI, N.Y., MOHAN, A.R., RAO, L.V., RAO, C.P. 1990. Immobilization of - amylase complex in detection of higher oligosaccharides on paper. Curr.Science., 59: 1339-1340. BEG, Q.K., KAPOOR, M., MAHAJAN, L., and HOONDAL, G.S. 2001. Microbial xylanases and their industrial applications: a review. Appl.Microbiol.Biotechnol.,56: 326-338. VIIKARI, L., RANVA, M., KANTELINEN, A., SANDQUİST, J., LINKO,M. 1986. Bleecing with Enzymes. Third International Conference in biotechnology in pulp and paper industry.16-19 June, Stockholm, s67-69. KIM, J-Y., HUR, S-H., HONG, J-H. 2005. Purification and characterization of an alkaline cellulase from a newly isolated alkalophilic Bacillus sp. HSH- 8. Biotechnol. Lett. 27:313-316. LENNETE, E.H., BALLOWS, A., HAUSLER, J.W.Jr.,SHADOMY, J.H. 1985. Manuel of Clinical Microbiology. Vol 4.USA.1149s. RATANAKHANOKCHAI, K., KYU, K.L., TANTICHAROEN, M. 1999. Purification and Properties of a Xylan-Binding Endoxylanase from Alkaliphilic Bacillus sp. Strain K-1. Appl.Environ.Microbiol. 65: 694-697. VENTOSA, A., NIETO, J.J., and OREN, A. 1998. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62:504-544. HORIKOSHI, K., 1999. Alkaliphiles: some Applications of Their Products for Biotechnology. Microbiol. Mol.Biol.Rev. 63:735-750. WISEMAN, A. 1987. Handbook of enzyme biotechnology. Second Edition. The application of enzymes in industry. p.274-373. 11