Tüberkülozun laboratuvar tan s nda güncel durum

DERLEME REVIEW Hacettepe T p Dergisi 2011; 42:28-33 Tüberkülozun laboratuvar tan s nda güncel durum Alpaslan Alp 1 1 Doç. Dr., Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara ÖZET Tüberküloz dünya genelinde önemli bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Tüberküloz kontrolünde anahtar faktörler hızlı tanı, etkili tedavi ve temaslı taramasının yapılmasıyla bulaşın önlenmesidir. Tanı ve tedavinin hızlı bir şekilde yapılabilmesi sadece hastanın hızlı iyileşmesini sağlamayacak, hastalığın toplumdaki diğer bireylere bulaşmasını da önleyecektir. Bu nedenle tüberkülozun laboratuvar tanısı için hızlı, duyarlı, güvenilir ve ekonomik yöntemlere ihtiyaç vardır. Tüberkülozun laboratuvar tanısında kültür yöntemi altın standart yöntemdir. Kültür ile birlikte mikroskobik inceleme tüberküloz laboratuvar tanısının temelini oluştururken, son 20 yıllık süreçte moleküler tanısal testler gibi yeni yöntemler geliştirilmeye başlanmıştır. Moleküler yöntemlerdeki son gelişmeler hızlı tanı sağlayabilecek yöntemlerin gelişmesini sağlamıştır. Ancak moleküler bir yöntemin rutin tüberküloz tanısında kullanılabilmesi için duyarlılığının en az standart kültür yönteminin duyarlılığı kadar olması gerekir. Mevcut moleküler yöntemler tüberküloz tanısında henüz tatmin edici seviyede olmasalar da, bu koşulu sağlayabilecek yeni adaylar hızla geliştirilmektedir. Anahtar Kelimeler: Tüberküloz, laboratuvar tanısı, kültür, mikroskobik inceleme, moleküler yöntem, PCR. ABSTRACT Current situation in the laboratory diagnosis of tuberculosis Tuberculosis still remains as an important health problem worldwide. Key factors in the control of tuberculosis are rapid detection, adequate therapy and contact tracing to prevent transmission. Early diagnosis of tuberculosis and initiating optimal treatment would not only enable the cure of an individual patient but will also prevent the transmission of disease to others in the community. Therefore there is a need for rapid, sensitive, reliable and cost-effective methods for the laboratory diagnosis of tuberculosis. Culture is the gold standard for the laboratory diagnosis of tuberculosis. While microscopy and culture are still the major backbone for laboratory diagnosis of tuberculosis, new methods including molecular diagnostic tests have evolved over the last two decades. Recent developments in molecular techniques have led to the methods for rapid diagnosis of tuberculosis. However, the sensitivity of a molecular method should be at least as high as of a standard culture method in order to be used in routine tuberculosis laboratory. Although the current molecular methods are not satisfactory for the diagnosis of tuberculosis, new candidates are arising rapidly. Key Words: Tuberculosis, laboratory diagnosis, culture, microscopic examination, molecular method, PCR. 28 H ACETTEPE T IP D ERG S

Tüberkülozun laboratuvar tan s nda güncel durum Günümüzde tüberküloz kontrol programlarının başarısının halen istenen düzeylere çıkamamasının en önemli nedenlerinden biri, yeni olgu saptama oranlarının düşük düzeylerde kalmasıdır. Geç saptanan her olgunun, bulaş kaynağı olma süresi uzamaktadır. Ulusal tüberküloz kontrol programlarının en önemli bileşenleri hızlı tanı, etkili tedavi ve bulaşın önlenmesidir. Hasta kişilerin tüberküloz basilini bulaştırmalarını önleyebilmek için, tüberküloz tanısının kısa sürede konması ve zaman kaybetmeden tedaviye başlanması gerekmektedir. Bu nedenle tüberküloz tanısının hızlı bir şekilde konması, tüberkülozla savaş programının önemli bir parçasını oluşturmaktadır [1-3]. Yeni olguların saptanmasına yönelik olarak yapılan çalışmalarda, hızlı tanı sağlayabilecek çeşitli yöntemler geliştirilmektedir [4-8]. Ancak bu yöntemlerin çoğunun, yüksek insidanslı bölgelerde kullanılması, gerek ekonomik nedenlerle, gerekse altyapı eksikliği nedeniyle mümkün olamamaktadır. Bu nedenle yüksek tüberküloz insidansı bulunan gelişmemiş ve gelişmekte olan ülkelerde en önemli tanı aracı halen mikroskobik incelemedir [9]. M KROSKOB K NCELEME Dünya genelinde, yeni yayma-pozitif olguların %70 inin yakalanabilmesi hedefine henüz ulaşılamamıştır [10]. Yeni yayma-pozitif tüberküloz olgularının saptanmasında mikroskobik incelemenin rolü büyüktür [11]. Balgamın mikroskobik olarak incelenmesi, gelişmemiş ve gelişmekte olan ülkelerde en önemli pulmoner tüberküloz tanı yöntemidir. Bu ülkelerde genellikle konsantre edilmemiş balgam örneği direkt olarak Ziehl-Neelsen boyama yöntemi ile boyandıktan sonra mikroskobik inceleme yapılmaktadır. Mikroskobik inceleme basit, hızlı, ucuz ve özgül bir yöntem olması nedeniyle özellikle tüberkülozun endemik olduğu ülkelerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Yapılan farklı çalışmalar incelendiğinde, mikroskobik inceleme duyarlılığının %20-80 arasında değişebildiği gözlenmektedir [12,13]. Mikroskobik incelemede aside dirençli basilin görülebilmesi için örneğin mililitresinde en az 5000 kadar bakteri bulunması gerekmektedir. Duyarlılık oranlarındaki farklılıklar genel olarak, kullanılan boyama yöntemi ve kullanılan mikroskobun kalitesiyle değişmekle birlikte, örneğin türü, yaymanın kalınlığı, boyama sırasında dekolorizasyon süresi ve incelemeyi yapan kişinin bu konudaki tecrübesi de çok büyük önem taşımaktadır. Mikroskobik inceleme öncesinde uygulanan boyama yöntemleri içinde en sıklıkla kullanılanlar Ehrlich- Ziehl-Neelsen boyama yöntemi, Kinyoun boyama yöntemi ve auramin-rodamin floresan boyama yöntemidir. Ülkemizin büyük merkezlerimiz dışındaki laboratuvar şartları göz önüne alındığında, bu yöntemlerden ilk ikisini oluşturan aside dirençli boyama yöntemlerinden birinin kullanılmasının daha uygun olduğu görülmektedir. Mikroskobik incelemenin duyarlılığı düşük olmakla birlikte, diğer tanı aracı olan kültür sonuçlarının elde edilmesi birkaç haftayı bulabileceğinden, pozitif bir mikroskobik inceleme sonucu çok değerlidir. Duyarlılığı çok yüksek olmayan bir yöntemin, yıllar boyunca gelişen teknoloji karşısında vazgeçilemeyen bir tanı aracı olarak kalabilmesi de bu yorumu desteklemektedir. KÜLTÜR ÖNCES NDE ÖRNEKLER N filenmes Kültür işlemleri öncesinde özellikle balgam örneklerinin işlenmesiyle örneğin homojenizasyonu, konsantrasyonu ve dekontaminasyonu sağlanmaktadır. Bu işlem, steril olduğu düşünülen beyin omurilik sıvısı gibi örneklere uygulanmamaktadır. Örneklerin işlenmesi aşaması, gerek mikroskobik inceleme, gerekse kültür yöntemleri için duyarlılık belirleyici bir aşamadır. Ne kadar duyarlılığı yüksek ve son teknoloji ürünü kültür veya boyama yöntemi kullanırsak kullanalım, bunların öncesinde yapılan örnek işleme aşamasını gereği gibi yapamıyorsak, sonraki işlemlerden elde edeceğimiz sonuçların kalitesi düşecektir. Bu nedenle bu basamakta kullanılabilecek farklı yöntemleri içeren birçok çalışma yapılmıştır [14-16]. Örneklerin işlenmesinde üç temel amaç vardır. Bunlar; örneğin kontaminant normal flora organizmalarından arındırılarak dekontamine edilmesi, örnek içerisinde bulunan olası tüberküloz basillerinin konsantre bir hale getirilmesi ve balgam gibi yoğun kıvamdaki örneklerin homojen bir hale getirilmesidir. Ancak bu üç temel amaca ulaşılırken, bu işlemin örnek içindeki tüberküloz basillerine zarar vermeden gerçekleştirilmesi gerekmektedir. Bir başka deyişle bu üç temel amaca ulaşma süreci, canlı tüberküloz basili sayısı çok azaltılmadan tamamlanmalıdır. Kullanılan örnek işleme yönteminde bu hassas dengenin çok başarılı bir şekilde kurulabilmesi, bunu takip edecek olan mikroskobik inceleme ve kültür yöntemlerinin duyarlılığının artmasına yardımcı olacaktır. Örnek işleme yöntemleri içinde gerek ülkemizde gerekse dünya genelinde en sıklıkla kullanılan yöntem sodyum hidroksit-n-asetil-l-sistein yöntemidir. Bunun yanı sıra sodyum hipoklorid, oksalik asit, setil piridinyum-sodyum hidroksit yöntemi gibi yöntemler de örneklerin işlenmesi amacıyla kullanılabilmektedir [17,18]. Cilt 42 Say 1 2011 29

Alp KÜLTÜR YÖNTEMLER Günümüzde tüberküloz tanısında altın standart olarak kabul edilen yöntemler, kültür yöntemleridir. Bu amaçla yumurta bazlı veya agar içerikli katı besiyerleri kullanılabildiği gibi, sıvı besiyerleri de kullanılabilmektedir. Hızlı tanı sağlayabilmek amacıyla sıvı besiyerlerinin yarı otomatize cihazlarda kullanıldığı çeşitli sistemler mevcuttur. Kültür yöntemlerinin en önemli avantajları, mikobakteri canlılığını doğrudan gösterebilmeleri ve bakteri izolatı ile duyarlılık tespiti, tanımlama, genotiplendirme gibi ek testler yapılabilmesine imkan sağlamalarıdır. Kültür amacıyla günümüzde en yaygın olarak kullanılan katı besiyeri Löwenstein-Jensen besiyeri, sıvı besiyeri sistemi ise BACTEC 460 TB radyometrik sistemidir [19]. Löwenstein-Jensen besiyeri, laboratuvar şartlarında kolayca hazırlanabilmesi ve ucuz olması nedeniyle birçok merkez tarafından tercih edilmektedir. BACTEC 460 TB radyometrik sistemi hızlı ve güvenilir tanı sağlaması nedeniyle altın standart olarak kabul görmüş bir sıvı besiyeri sistemidir. Ancak inokülasyon öncesi şişenin ön okutma işlemi ve haftada üç kez rutin okutma işlemleri nedeniyle iş yükünün fazla olması, kültür şişeleri arasında çapraz kontaminasyon riski, radyoaktif materyallerin kullanımına ve yok edilmesine ilişkin problemler, cihaz içinde okutmalar sırasında aerosol oluşma riski, koloni morfolojisinin belirlenememesi, karışık kültürlerin tanımlanmasında zorluk çekilmesi ve enjektörlerin yoğun kullanımına bağlı olarak laboratuvar çalışanlarının iğne kazaları bakımından sürekli risk altında bulunmaları, en önemli dezavantajlarıdır. Otomatize bir mikobakteri tanı sistemi olan MGIT 960 sistemi, BACTEC 460 TB sisteminin olumsuz yönlerini azaltabilmek amacıyla üretilmiştir. Bu sistem, floresan veren bir indikatörün bulunduğu tüplerde bakterilerin üretilmesi esasına dayanmaktadır [20,21]. Mikobakteriler üredikçe tüpteki oksijenin tüketilmesine bağlı olarak indikatör serbest kalmakta ve floresan açığa çıkmaktadır. Açığa çıkan floresan cihaz tarafından otomatik olarak ölçülmekte ve sonuçlar verilmektedir. MGIT 960 sisteminin kısa sürede sonuç vermesinin yanında en önemli avantajları, iğne veya benzeri riskli gereçlere ihtiyaç duyulmaması ve radyoaktif madde kullanılmamasıdır. Bu nedenle bu sistem günümüzde bazı merkezlerde BACTEC 460 TB radyometrik sisteminin yerini almaya başlamıştır. Middlebrook katı ve sıvı besiyerleri, hazırlanmaları daha zor olduğundan ve hazır satın alınmaları durumunda da daha pahalı olduklarından, daha az sıklıkla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, özellikle duyarlılık testlerinde Löwenstein-Jensen besiyerine göre daha güvenilir ilaç konsantrasyonları sağladıklarından, tercih edilmektedir. Middlebrook katı besiyerleri, mikrokolonilerin erken dönemde saptanabilmesi amacıyla kullanılabilmektedir. Bu amaçla özellikle antibiyotik içeren selektif 7H11 besiyeri tercih edilmektedir. Bu yöntemle besiyerinde koloni oluşumu bir hafta içinde mikroskobik olarak saptanabilmektedir [22]. Ancak rutin tanı laboratuvarlarında çok tercih edilen bir yöntem değildir. Hızlı bir tüberküloz tanı sistemi olan TK kültür sistemi, yeni geliştirilmiş olan bir tanı yöntemidir. Bu sistemde izolasyon için kullanılan TK besiyeri, çoklu renk indikatörleri kimyasından yararlanılarak hazırlanmış, mikobakterilerin üremesini erken saptayan bir besiyeridir [23]. Ekilen örnekte mikobakteri bulunması durumunda, inkübasyon süresince mikobakterilerin ürettiği metabolitlere ve enzimlere bağlı olarak TK besiyerinin orijinal kırmızı rengi sarıya, diğer bakteri veya fungal türlerin varlığında ise yeşile dönmektedir. Bu renk değişimi, kolonilerin görünür hale gelmesinden çok daha önce gerçekleşmektedir. Renk değişimi hem gözle hem de otomatik kültür sistemi MYCOLOR TK ile izlenebilmektedir. TK kültür sistemi tüberküloz tanısında rutin olarak kullanılabilecek pratik, hızlı ve güvenilir bir yöntemdir. MB/BacT ALERT sistemi, besiyerindeki karbondioksit miktarının kolorimetrik olarak saptanması esasına dayanan bilgisayarlı bir sistemdir [24,25]. Her şişenin tabanında bulunan silikona gömülü kolorimetrik algılayıcı, besiyerinde bulunan mikobakterilerin oluşturduğu çözünmüş karbondioksit değişimine ve bunun sonucunda değişen ph ya duyarlıdır. Böylece üremenin gerçekleşmesi durumunda ph değişikliği sonucunda kolorimetrik algılayıcı renk değiştirir. Algılayıcının koyu yeşilden sarıya dönmesi, sonucun pozitif olduğunu gösterir ve bakteriler canlılığını yitirse bile bu renk değişimi geriye dönmez. Bu sistemde radyoaktif madde kullanılmaması bir avantaj olmakla birlikte, kontaminasyon riskinin biraz daha fazla olması ve BACTEC sistemine göre saptama zamanının biraz daha uzun olması gibi dezavantajları vardır. NTERFERON-GAMA SALINIM TESTLER Dünya nüfusunun üçte biri Mycobacterium tuberculosis ile infekte durumdadır. Tanı amacıyla kullanılabilecek immünolojik temelli testler, aktif hastalık ile latent infeksiyonu birbirinden ayırabilmelidir. İmmünolojik temelli testlerde aranan en önemli özellik, BCG aşılı kişiler ve tüberküloz-dışı mikobakteri (TDM) infeksiyonlarında yalancı pozitiflik vermemeleridir. Yıllardan beri kullanılmakta olan tüberküloz deri testinin tanısal kullanımı, bu ayrımın yapılamaması nedeniyle oldukça sınırlı kalmıştır. Son yıllarda kullanım alanı bulmaya başlayan interfe- 30 H ACETTEPE T IP D ERG S

Tüberkülozun laboratuvar tan s nda güncel durum ron-gama (IFN-γ) salınım testleri (İGST), bu açığı kapatabilmek amacıyla geliştirilmiş T hücre temelli yöntemlerdir. Bu yöntemler kullanılarak, önceden duyarlı hale gelmiş lenfositlerin M. tuberculosis e özgü ESAT-6 (early secretory antigenic target protein-6) ve CFP-10 (culture filtrate protein-10) proteinleri ile karşılaştığında ürettiği IFN-γ kantitatif olarak ölçülebilmektedir. Bu iki protein M. tuberculosis in RD1 bölgesi (region of difference 1) tarafından kodlanır ve Mycobacterium bovis BCG suşu ile TDM lerin çoğunda (Mycobacterium marinum, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium flavescens hariç) yoktur. Farklı İGST yöntemlerinin duyarlılık ve özgüllüklerinin kıyaslandığı çeşitli meta-analiz çalışmalarında, bu testlerin duyarlılıklarının TDT ye göre yüksek olduğu (%70-90), ancak rutin uygulamada tek başına kullanılabilecek düzeyde olmadıkları sonucuna varılmıştır [26-28]. Cilt 42 Say 1 2011 MOLEKÜLER YÖNTEMLER Gelişen teknolojiye paralel olarak gerçekleştirilen birçok yönteme rağmen, günümüzde tüberkülozun laboratuvar tanısında altın standart olarak kabul edilen yöntemler halen kültür yöntemidir. Özellikle sıvı bazlı yarı otomatize veya tam otomatize kültür sistemleri, geleneksel kültür yöntemlerine göre daha kısa sürede sonuç verebildikleri için yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Ancak tüberküloz tanısının 1-2 gün gibi kısa bir sürede konabilmesi büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle güvenilir ve hızlı tanı yöntemlerine duyulan ihtiyaç devam etmektedir. Moleküler yöntemler bu ihtiyacı karşılayabilmek amacıyla olası adaylar olarak geliştirilmişlerdir. Herhangi bir testin rutin uygulamada kullanılıp kullanılmayacağının en önemli göstergesi, testin özgüllük ve duyarlılığıdır. Tüberküloz tanısında kullanılan moleküler yöntemlerin özgüllükleri, yapılan birçok çalışmada yüksek bulunmuştur. Duyarlılık konusunda ise, uygulanan teste göre, oldukça değişik sonuçlar elde edilebilmektedir. Farklı duyarlılık sonuçları elde edilmesinde, kullanılan PCR yönteminin yanı sıra, örnek türü ve örnek içindeki basil miktarı da önemli rol oynamaktadır. Teorik açıdan bakıldığında, örnek içinde birkaç basilin bulunması durumunda bile PCR sonucunun pozitif bulunabileceği söylenmektedir. Ancak pratik uygulamada, birçok çalışmada tüberküloz PCR duyarlılığının bu kadar yüksek olmadığı gösterilmiştir. Bunun nedenleri arasında M. tuberculosis DNA sının iyi bir şekilde açığa çıkarılamaması, örneğin işlenmesi sırasında basillerin kaybedilmesi veya örnek içinde inhibitör maddeler bulunması sayılabilir [29,30]. Tüberküloz tanısında kullanılan moleküler yöntemlerin duyarlılıkları değerlendirilirken, çeşitli değişkenlerin sonuca olan etkileri unutulmamalıdır. Örneğin; solunum yolu kökenli örneklerdeki PCR duyarlılığı, solunum yolu dışından elde edilmiş örneklerdeki PCR duyarlılığından farklı çıkmaktadır. Solunum yolu dışındaki örneklerde PCR duyarlılığının daha düşük olduğu bildirilmektedir. Yayma-pozitif örneklerle yayma-negatif örneklerden elde edilen PCR duyarlılıkları da farklılık göstermektedir. Yayma-pozitif örneklerde PCR duyarlılığı kabul edilebilir düzeylerdeyken, yayma-negatif örneklerde duyarlılık oranı çok düşmektedir [31,32]. Yayma-pozitif bir örneğin PCR sonucu da pozitif bulunduğunda, kültür sonucu beklenmeden kesin tanı konmuş olmaktadır. Bir başka ifadeyle, yayma sonucunda elde edilen olası tüberküloz tanısı, PCR sonucuyla doğrulanarak kesin bir tüberküloz tanısı konabilmektedir. Bu durumda, tüberküloz tanısı amacıyla kullanılan moleküler yöntem, tanıyı tamamlayıcı veya doğrulayıcı bir rol üstlenmektedir. Ancak bu rol, olmazsa olmaz bir rol değildir. Birkaç hafta içerisinde kültür yöntemi zaten altın standart yöntem olarak bu rolü üstlenecektir. Bu süreçte de tedavi başlanmış olacağı için bir zaman kaybı söz konusu olmayacaktır. Tüberkülozlu bir hastaya ait ve yayma sonucu negatif olan örnekte ise PCR sonucunun pozitif bulunma olasılığı %50 nin altındadır. Bir başka deyişle yaymanegatif tüberküloz örneklerinde PCR sonucunun kesin tanıya katkısı çok düşüktür. Bu tip örneklerde kesin tanı kültür sonucunun alınmasıyla konmaktadır. Yukarıda anlatılan nedenlerle günümüzde tüberkülozun rutin laboratuvar tanısında moleküler yöntemlerin kullanımı halen tartışmalı bir konudur. Bu konuda yapılan farklı meta-analiz çalışmalarında ortalama PCR duyarlılığı %85, ortalama PCR özgüllüğü ise %95 olarak saptanmıştır [33,34]. Bu değerler bir testin rutin tanıda tek başına güvenle kullanılabilmesi için yeterli değildir. Bu nedenle tüberküloz tanısında moleküler yöntemlerin ancak altın standart kültür yöntemi ile birlikte, destekleyici bir test olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır. Üniversitemiz Erişkin Hastanesi Klinik Patoloji Laboratuvarı bünyesindeki Tüberküloz Laboratuvarında üretilen M. tuberculosis izolatları ile gerçekleştirilen bir çalışmada da benzer sonuçlara ulaşılmıştır [35]. Bu çalışma sonucunda solunum yolu örneklerinde PCR nin ancak kültürü destekleyici bir tanı aracı olabileceği, bununla birlikte solunum yolu dışına ait örnekler için ise PCR kullanımının daha yararlı sonuçlar verebileceği sonucuna varılmıştır. Kesin olan sonuç ise, PCR yönteminin mevcut duyarlılık oranlarıyla rutin laboratuvara önemli katkı sağlamaktan uzak olduğudur. 31

Alp Bugün halen birçok merkezde tüberküloz tanısı amacıyla mikroskobik inceleme ve kültür kombinasyonu kullanılmaktadır. Özellikle dirençli olgu sayısındaki artış nedeniyle, tedaviye bir an önce başlayabilmek ve yeni bulaşları önleyebilmek amacıyla, duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek, hızlı sonuç veren, uygulaması kolay ve pahalı olmayan laboratuvar yöntemlerinin günlük kullanıma girmesi önemli bir gereksinim haline gelmiştir. Yirmi seneyi aşkın süreden beri kullanılmakta olan ve hızla gelişmekte olan moleküler yöntemler özellikle HBV, HCV ve HIV gibi mikroorganizmaların tanısında vazgeçilmez yöntemler haline gelmiş, ancak aynı gelişme tüberküloz tanısında henüz sağlanamamıştır. Bununla birlikte, böyle bir amaç doğrultusunda çalışmalar devam etmektedir. Bu konudaki ümitlerin yeşermesini sağlayan gelişme ise 2010 yılında yayımlanan altı çalışmada ortaya konmuştur. Şimdiye kadar geliştirilmiş olan tüberküloz PCR testleri içinde en ümit vadeden yöntem olarak göze çarpan bu test Xpert MTB/RIF testidir (Cepheid, USA). Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) geçtiğimiz yıllarda, tüberküloz tanısında duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek, hızlı sonuç veren, uygulaması kolay ve pahalı olmayan yöntemlerin geliştirilebilmesi amacıyla FIND (Foundation for Innovative New Diagnostics) isimli bir kuruluşun kurulmasını sağlamıştır. Bu kuruluşun bir üniversite (University of Medicine and Dentistry of New Jersey) ve bir özel şirket (Cepheid) ile iş birliği sonucunda Xpert MTB/RIF isimli test geliştirilmiştir. Bu yöntem ile iki saat içerisinde örnekte M. tuberculosis varlığı ve aynı zamanda rifampin direnci olup olmadığı saptanabilmektedir. Testte kullanılan teknoloji aslında yeni bir teknoloji değildir. Bu test üç primer ve beş prob setinin kullanıldığı bir yarı-nested real-time PCR yöntemidir. Testin en belirgin özelliklerinden biri de, 2 ml üzerindeki yüksek örnek hacimleriyle çalışmaya başlanmasına uygun özel kartuşların kullanılmasıdır. 2010 yılında yayımlanan ve bu yöntemin klasik yöntemlerle kıyaslandığı ilk çalışmalarda tatmin edici sonuçlar elde edilmiştir [36-39]. Bu çalışmalarda testin duyarlılığı yayma-pozitif örneklerde ortalama %99, yayma-negatif örneklerde ise ortalama %90 olarak bulunmuştur. Testin en belirgin olumsuz yönü ise, pahalı bir yöntem olmasıdır. Ancak 2010 yılı sonunda DSÖ, yayımlanan çalışma sonuçlarını da dikkate alarak bir ilke imza atmış ve bu yöntemin tüberkülozun endemik olduğu düşük gelirli ülkelerde (özellikle Afrika ülkeleri) üçte bir fiyatına satılarak rutin tüberküloz kontrol programları kapsamına alınması konusunda tavsiye niteliğinde bir karar almıştır. Bu nedenle moleküler yöntemlerin tüberküloz tanısında kullanımı konusunda önümüzdeki birkaç senenin belirleyici olabileceği düşünülmektedir. Kaynaklar 1. Dinnes J, Deeks J, Kunst H, Gibson A, Cummins E, Waugh N, et al. A systematic review of rapid diagnostic tests for the detection of tuberculosis infection. Health Technol Assess 2007; 11:1-196. 2. Lange C, Mori T. Advances in the diagnosis of tuberculosis. Respirology 2010; 15:220-240. 3. Wallis RS, Pai M, Menzies D, Doherty TM, Walzl G, Perkins MD, et al. Biomarkers and diagnostics for tuberculosis: progress, needs, and translation into practice. Lancet 2010; 375:1920-37. 4. Albay A, Kisa O, Baylan O, Doganci L. Evaluation of FASTPlaqueTB for the rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infections. Diagn Microbiol Infect Dis 2003; 46:211-5. 5. Gil-Setas A, Torroba L, Fernandez JL, Martinez-Artola V, Olite J. Evaluation of the MB/BacT system compared with Middlebrook 7H11 and Lowenstein-Jensen media for detection and recovery of mycobacteria from clinical specimens. Clin Microbiol Infect 2004; 10:224-8. 6. Vincent M, Xu Y, Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. European Mol Biology Org 2004; 5:795-800. 7. An L, Tang W, Ranalli A, Kim HJ, Wytiaz J, Kong H. Characterization of a thermostable UvrD helicase and its participation in helicase-dependent amplification. J Biological Chem 2005; 280:28952-8. 8. Dorman SE. New diagnostic tests for tuberculosis: bench, bedside, and beyond. Clin Infect Dis 2010; 50(Suppl 3):S173-7. 9. Bailey SL, Roper MH, Huayta M, Trejos N, López Alarcon V, Moore DA. Missed opportunities for tuberculosis diagnosis. Int J Tuberc Lung Dis 2011; 15:205-10. 10. Steingart KR, Ng V, Henry M, Hopewell PC, Ramsay A, Cunningham J, et al. Sputum processing methods to improve the sensitivity of smear microscopy for tuberculosis: a systematic review. Lancet Infect Dis 2006; 6:664-74. 11. Perkins MD. New diagnostic tools for tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis 2000; 4(Suppl 2):S182-8. 12. Trebucq A. Revisiting sputum smear microscopy. Int J Tuberc Lung Dis 2004; 8:805. 13. Van Deun A, Maug AK, Cooreman E, Hossain MA, Chambuganj N, Rema V, et al. Bleach sedimentation method for increased sensitivity of sputum smear microscopy: does it work? Int J Tuberc Lung Dis 2000; 4:371-6. 14. Chakravorty S, Dudeja M, Hanif M, Tyagi JS. Utility of universal sample processing methodology, combining smear microscopy, culture, and PCR, for diagnosis of pulmonary tuberculosis. J Clin Microbiol 2005; 43:2703-8. 15. Chakravorty S, Sen MK, Tyagi JS. Diagnosis of extrapulmonary tuberculosis by smear, culture, and PCR using universal sample processing technology. J Clin Microbiol 2005; 43:4357-62. 16. Padilla E, Manterola JM, Gonzalez V, Thornton CG, Quesada MD, Sanchez MD, et al. Comparison of the sodium hydroxide specimen processing method with the C18-carboxypropylbetaine specimen processing method using independent specimens with auramine smear, the MB/BacT liquid culture system, and the Cobas Amplicor MTB Test. J Clin Microbiol 2005; 43:6091-7. 17. Saxena S, Mathur M, Talwar VK. Detection of tubercle bacilli in sputum: application of sodium hypochlorite concentration method. J Commun Dis 2001; 33:241-4. 32 H ACETTEPE T IP D ERG S

Tüberkülozun laboratuvar tan s nda güncel durum 18. Lawson L, Yassin MA, Ramsay A, Olajide I, Thacher TD, Davies PD, et al. Microbiological validation of smear microscopy after sputum digestion with bleach; a step closer to a one-stop diagnosis of pulmonary tuberculosis. Tuberculosis 2006; 86:34-40. 19. Siddiqi SH. Procedure for primary isolation of mycobacteria from clinical specimens. p. II.1-II.13. In BACTEC TB System Product and Procedure Mannual 1989, Becton Dickinson, Maryland. 20. Rishi S, Sinha P, Malhotra B, Pal N. A comparative study for the detection of Mycobacteria by BACTEC MGIT 960, Lowenstein Jensen media and direct AFB smear examination. Indian J Med Microbiol 2007; 25:383-6. 21. Chan DS, Choy MY, Wang S, Sng LH. An evaluation of the recovery of mycobacteria from urine specimens using the automated Mycobacteria Growth Indicator Tube system (BACTEC MGIT 960). J Med Microbiol 2008; 57:1220-2. 22. Esteban J, Jimenez-Arriero M, Soriano F. Observation of microcolonies on Middlebrook 7H11 medium for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and the Mycobacterium avium complex in clinical samples. Clin Microbiol Infect 1996; 2:232-3. 23. Baylan O, Kisa O, Albay A, Doganci L. Evaluation of a new automated, rapid, colorimetric culture system using solid medium for laboratory diagnosis of tuberculosis and determination of anti-tuberculosis drug susceptibility. Int J Tuberc Lung Dis 2004; 8:772-7. 24. Crump JA, Tanner DC, Mirrett S, McKnight CM, Reller RB. Controlled comparison of BACTEC 13A, MYCO/F LYTIC, BacT/ALERT MB, and ISOLATOR 10 systems for detection of mycobacteremia. J Clin Microbiol 2003; 41:1987-90. 25. Piersimoni C, Scarparo C, Callegaro A, Tosi CP, Nista D, Bornigia S, et al. Comparison of MB/Bact alert 3D system with radiometric BACTEC system and Löwenstein-Jensen medium for recovery and identification of mycobacteria from clinical specimens: a multicenter study. J Clin Microbiol 2001; 39:651-7. 26. Erturan Z. Tüberkülozda diğer hızlı tanı testleri. Özkara Ş, Kılıçaslan Z (editörler). Tüberküloz. 1. Baskı. İstanbul: Türk Toraks Derneği, AVES Yayıncılık, 2010; 134-48. 27. Menzies D, Pai M, Comstock G. Meta-analysis: new tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertanity and recommendations for research. Ann Intern Med 2007; 146:340-54. 28. Pai M, Zwerling A, Menzies D. Systematic review: T-cell based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Ann Intern Med 2008; 149:177-84. 29. Cheng VCC, Yew WW, Yuen KY. Molecular diagnostics in tuberculosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005; 24:711-20. 30. Greco S, Girardi E, Navarra A, Saltini C. Current evidence on diagnostic accuracy of commercially based nucleic acid amplification tests for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Thorax 2006; 61:783-90. 31. Sarmiento OL, Weigle KA, Alexander J, Weber DJ, Miller WC. Assessment by meta-analysis of PCR for diagnosis of smear-negative pulmonary tuberculosis. J Clin Microbiol 2003; 41: 3233-40. 32. Pai M, O Brien R. New diagnostics for latent and active tuberculosis: state of the art and future prospects. Semin Respir Crit Care Med 2008; 29:560-8. 33. Flores LL, Pai M, Colford JM, Riley LW. In-house nucleic acid amplification tests for the detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens: meta-analysis and metaregression. BMC Microbiol 2005; 5:55. 34. Greco S, Rulli M, Girardi E, Piersimoni C, Saltini C. Diagnostic accuracy of in-house PCR for pulmonary tuberculosis in smear-positive patients: meta-analysis and metaregression. J Clin Microbiol 2009; 47:569-76. 35. Alp A, Hascelik G. Is PCR an essential method for the diagnosis of tuberculosis in a routine laboratory. American Society for Microbiology 110 th General Meeting, May 23-27, 2010, San Diego, California, USA. Abstracts Book, C-155. 36. Van Rie A, Page-Shipp L, Scott L, Sanne I, Stevens W. Xpert MTB/RIF for point-of-care diagnosis of TB in high-hiv burden, resource-limited countries: hype or hope? Expert Rev Mol Diagn 2010; 10:937-46. 37. Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, Nicol MP, Shenai S, Krapp F, et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N Engl J Med 2010; 363:1005-15. 38. Blakemore R, Story E, Helb D, Kop J, Banada P, Owens MR, et al. Evaluation of the analytical performance of the Xpert MTB/RIF assay. J Clin Microbiol 2010; 48:2495-501. 39. Helb D, Jones M, Story E, Boehme C, Wallace E, Ho K, et al. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampin resistance by use of on-demand, near-patient technology. J Clin Microbiol 2010; 48:229-37. Cilt 42 Say 1 2011 33