MİKRO ORGANİZMALARIN ÜRETİLMESİ İÇİN BESİYERLERİ Mikroorganizmaları izole etmek ve saf kültür olarak üretebilmek için birçok ortamlar geliştirilmiştir (Besiyerleri, vasatlar). Besi yerleri başlıca iki ana bölüme ayrılırlar. A- Canlı Ortamlar: Riketsia, Bedsonia, Klamidya ve virüsler canlı ortamlarda ürerler. Canlı ortamlar üç kısma ayrılır. 1- Doku Kültürü: İnsan ve hayvanların çeşitli organ ve dokularında hazırlanan, invitro olarak üretilen hücrelerdir. 2- Embiryolu Yumurta: Tavuk, ördek v.b. embiryolu yumurtalardır. 3- Deney Hayvanları: Fare, kobay, hamster, tavşan, tavuk ve diğer hayvanlar kullanılır. B-Cansız Ortamlar: Mikroorganizmaları laboratuar koşullarında üretmek için birçok besi maddesine ihtiyaç vardır. Besiyeri mikroorganizmanın gelişmişi ve çoğalması için lüzumlu sentetik maddeleri ihtiva eder. Besi yerleri genelde sentetik olarak hazırlanır. Besiyerinde canlının üreme ve gelişmesi için; besi yerinin elverişli olmasından başka, besi yerinin belli ph, belli miktarda suyu olması, organik, inorganik maddeler içermesi ve sterilize edilmesi gerekir. Kültürün yapılacağı ısının uygun olması lazımdır. Ayrıca fiziksel birtakım özelliklere sahip olmalıdır (belli saydamlık ve belli yoğunluk gibi). Her cins mikroorganizmanın kendine göre değişik besinlere ihtiyacı vardır. Patojen bakteriler, organik maddeleri sentez yetenekleri az olduğundan, üremeleri için kompleks besiyerlerine ihtiyaç gösterirler. Besiyerlerinde genelde azot kaynağı olarak, polipeptit, dipeptit ve aminoasit ihtiva eden pepton kullanılır. Karbon kaynağı olarak, karbonhidrat gibi parçalanabilen organik bileşiklerden veya havadaki CO 2 ten yararlanılır. Besiyerinde canlıların üreyebilmesi için diğer kompleks koşulların tam olmasının yanında, fosfor, kükürt, sodyum gibi maddelere ve bazı amino asitlere ihtiyaç gösterirler. Besi yerleri daha çok ticari amaçla hazırlanmaktadır.
Besiyerleri yapılış tarzı, kullanma amacı ve bileşimlerine göre birçok gruplara ayrılır: 1- Genel Besiyerleri: Laboratuarda her zaman hazırlanabilir ve bileşimine giren maddeler kolay bulunur. Çok çabuk üreyen mikroorganizmaları üretmek için bir ya da birkaç nutrient bir arada kullanılarak yapılır. Mikroorganizmaları yeterince üretecek karbon ve enerji kaynaklan (aminoasit, mineraller v.b.) bulunur. Aynı zamanda ucuzdur. Laboratuarlarda bu amaçlar için buyyon ve agar kullanılır. Genel besi ortamları görünüşlerine göre sıvı ve katı olmak üzere iki türlüdür. Kati ortamlar petri kutularında ise plak olarak adlandırılır. Tüpde dondurulmuş ise yatık agar, dik agar olarak isimlendirilir. Sıvı besiyerlerine agar ilavesi ile yarı katı ve yarı sıvı besiyerleri elde edilir. a) Sıvı Besiyerleri: Bazı besiyerleri sıvıdır. Sıvı besiyerinde bulunan bir bakteri çoğalma özelliğine göre ve ortam şartlarına bağlı olarak uzunca bir zaman ölmeden kalır. Sıvı besiyerlerinde üreyen bir bakteri buradaki lüzumlu maddeleri kullanır. Ortama metabolizma ürünlerini bırakır. Besiyerinde daha önce bulunmayan bu ürünlerin gösterilmesi bakterinin teşhisine yarar (indol, H 2 S teşkili, karbonhidratlardan gaz ve asit oluşumu gibi). Bakteri sıvı besiyerinde homojen bir bulanıklık meydana getirerek üreyebileceği gibi, dipte çöküntü veya yüzeyde zar oluşturarak da üreyebilir. Sıvı besiyerlerine Buyyonlu besi yerleri adı da verilir. b) Katı Besiyerleri: Katı besiyerlerine ekilen bakteri ancak ekildiği yerde ürer ve koloni oluşturur. Meydana gelen koloniler, bakterinin türüne göre özellik gösterirler. Katı besiyerine yaymak suretiyle bakteri hücrelerini ayırmak ve meydana getirdikleri kolonileri ayrı ayrı elde etmek = izole etmek (yani saf kültürlerini) mümkündür. Katı besiyeri, besi yerine besin değerini değiştirmeyen bir madde ilavesiyle elde edilir. Bunun için en fazla jeloz (agar) kullanılır. Bundan dolayı katı besiyerine jelozlu besiyerleri de denir. Agar; "Agar " adındaki bir deniz yosunundan elde edilir. Jelatin ilavesi ile de katı besiyerleri elde edilir. 2-Özel Besiyerleri: Bu tür ortamlar çalışma amacına göre hazırlanarak kullanılırlar. Yapıları daha komplikedir. a) Selektif Besiyeri: Bu tür besi yerlerinin bileşimine bazı kimyasal maddeler (boyalar, antibiyotikler, safra tuzlan, inhibitörler v.b.) konarak selektif hale getirilir. Bazı mikroorganizmalar öldürülür. Üremesi istenen mikroorganizma grubu teşvik edilir.
Örnek: Gr (-) mikroorganizmaları karışık kültürlerden izole etmek için ortama gr (+) üremesini inhibe eden kristal violet katılır. Gr (+) ' leri izole etmek için ortama gr (-)' leri inhibe eden potasyum tellürit, Thallium asetat, Sodyum azid katılır. Salmonellalan inhibe etmek için ortama safra tuzu katılır. Safra tuzu koliformları bir süre sonra inhibe eder. b) Difrensiyel Besiyeri (Ayırt Edici Besi Ortamı): Bu besi yerine katılan çeşitli indikatör ve kimyasal maddelerin yardımıyla, üreyen bakterilerin oluşturduğu kolonilerin aldıkları renge göre organizmaları ayırt etmek (tanımak) mümkündür. Örnek: Mac Conkey agar, SS agar; salmonellaları tanımak için, EMB agar E coli' yi ayıtmak için kullanılır. Kanlı agar da hemolitik bakterileri, hemolitik olmayanlardan ayırmada önemli difrensiyel rol oynar. Diferensiyel besi ortamları genellikle katı olarak hazırlanır. c) Zenginleştirilmiş Besiyerleri: Çok zor üreyen mikroorganizmaları üretmek için kullanılır. Katı Nutrientlere kan, serum, glikoz v.b. konulabilir. d) Biyokimyasal Özelliklerin Tesbiti İçin Besiyerleri: Sıvı ve katı olarak hazırlanan bu tür besi yerlerinin bileşimine çeşitli indikatörler (Brom timol mavisi,litmus,fenol kırmızısı v.b.) ve kimyasal maddeler (karbonhidrat, nitrat, sitrat, üre v.b.) katılır. Bu maddeler yardımıyla mikroorganizmaların çeşitli biyokimyasal karakterleri tespit edilir. e) Özel Amaçlı Besiyerleri: Bunlar çok özel amaçlar için kullanılır. Örnek: tolesin, antibiyotik, enzim elde etmede kullanılır. f) Sentetik Besi Yerleri: Bu besi yerlerinin' bileşimine giren maddelerin kimyasal yapılan bellidir ve özel amaçlar için kullanılırlar. Bileşime giren maddeler mikroorganizmanın ihtiyaçlarını tam sağlayacak durumdadır. Karbon ve enerji kaynağı olarak glikoz veya laktoz, inorganik nitrojen kaynağı olarak amonyum tuzlan, çeşitli inorganik maddeler kullanılır. BESİYERLERİNİN BİLEŞİMİNE GİREN BAŞLICA MADDELER Agar (jeloz): Agar, Gelidium, Euchheuma ve Pterocladia türlerine ait deniz yosunlarından ekstre edilen kuru, müsilaginöz karakterde bir maddedir. Agar sıvı ortamları katılaştırmak amacı ile %2-3 oranında kullanılır. Sıvı besiyerlerinin ph' sını etkilemez. 95-98 C'de erir ve 40-42 C' de katılaşır. Yarı katı ortamlar için %O.3-0.5 miktarlarında sıvı besi yerlerine ilave edilir. Agar kendi hacminin 100-200 misli suyu katılaştırma özelliğine sahiptir.
Et Ekstraktı: Yağsız etten hazırlanan ham et suyunun su kısmının uçurulması sonucunda elde edilen koyu renkte macun gibi bir maddedir. Et Ekstraktı bir litreye 10 gr. Kadar katılır. Son yıllarda et ekstrastı toz halinde hazırlanmaktadır. Jelatin: Sıvı ortamı katılaştırmak (% 12-15) ve mikroorganizmaların proteolitik etkilerini ölçmede kullanılan jelatin, protein tabiatında bir madde olup, kollagenin sıcak su ile hidrolizasyonundan elde edilir. Jelatinli besiyerleri 100 C' de sterilize edilmelidir. Kazein Hidrolizat: Kazeinin (süt proteini) hidrolizasyonundan elde edilir. Bileşiminde fazla miktarda amino asit bulunur. Bunun dışında fosfatlar, tuzlar, üreme faktörleri ve mineral maddeler de vardır. Maya Ekstraktı: Ekmek veya bira mayasından otolizasyonla yada asit veya proteolitik enzimlerle hidrolizasyonu ile elde edilir. Amino asitler üreme faktörleri ve inorganik maddeler bulunur. Besiyerlerine % 1-0.5 oranında katılır. Kan: Çeşitli hayvanlardan steril olarak alınan defibrine kan, katı besi yerlerine %5-l5 oranında ilave edilir. İyi bir üreme ortamı yarattığından hemen bütün organizmalar kanlı besiyerlerinde gelişebilirler. Kan, agar 45-50 C'ye kadar soğutulduktan sonra katılır. Pepton: Peptonlar kazein, fibrin ve kalp kasının proteolitik enzimlerle (Tripsin, pepsin veya papain) hidrolizasyonundan elde edilir. San renkli granüller halinde olup besiyerlerine %l-2 oranında katılır. Serum: Sıvı veya katı ortamlara %5-10 oranında ilave edilir. Bileşiminde organik ve inorganik maddelerle üretme faktörleri vardır. Güç üreyen mikroorganizmaların gelişimini kolaylaştırılır. Su: Su besiyeri erinin esasını teşkil eder. Eğer besi yerlerinin içinde çok miktarda mineral maddeler veya diğer bileşikler varsa distile su kullanılmalıdır. Sodyum Klorür: Besiyerine ozmotik basıncı ayarlamak amacı ile %0.5 oranında katılır. Karbon Kaynakları: Fermante olabilen karbonhidratlar mikroorganizmalar için enerji ve karbon kaynağı oldukları gibi, ayrışmaları sonunda meydana gelen organik asitler, besi yerinin ph'sını düşürdüklerinden zararlı etkiye sahiptir. Karbonhidratlar mikroorganizmaları fermantasyon özelliklerinin tayini için besiyerlerine %1 ve üremeyi tembih gayesi ile %0.1 oranında katılır. İnorganik Maddeler: Bilhassa sentetik besiyerlerine, mikroorganizmaların ihtiyacına göre bileşikler halinde mineral maddeler ilave edilebilir. Sentetik olmayan vasatlara konan pepton,
buyyon, maya ekstraktı, et ekstraktı ve diğer maddelerin bileşiminde yeterli derecede inorganik maddeler bulunmaktadır. NOT: Bazı besi yerlerinin hazırlanması EK1 de verilmiştir.