ÜNİTE 5. Mikroorganizmaların Üretildiği Ortamlar. Amaçlar. İçindekiler. Öneriler. Bu üniteyi çalıştıktan sonra,

Transkript

1 ÜNİTE 5 Mikroorganizmaların Üretildiği Ortamlar Bu üniteyi çalıştıktan sonra, Amaçlar Mikroorganizmaların üretilme gerekliliklerini, Besiyerlerinin hazırlanma, saklanma ve kullanılma özelliklerini, Ekim tekniklerini öğreneceksiniz. İçindekiler Giriş Mikroorganizmaların beslenme ve üremeleri için gerekli maddeler Mikroorganizmaların üremelerine etkili çevre faktörleri En çok kullanılan besiyerlerinin tanıtılması Besiyerlerinin hazırlanması ve saklanması Çeşitli örneklerin ekileceği besiyerleri ve ekim teknikleri Üremelerin değerlendirilmesi Antibiyotik duyarlılık deneyleri Özet Değerlendirme soruları Sözlük Yararlanılan Kaynaklar Öneriler Klinik uygulamalarda kullanılan besiyerlerini hatırlamaya çalışınız. Çalıştığınız veya yakınınızdaki bir sağlık kuruluşunda bakteriyoloji laboratuvarı varsa besiyerlerini ve nasıl ekim yapıldıklarını izleyiniz.

2 1. GİRİŞ Mikroorganizmaların uygun çevre koşulları sağlanarak çoğaltılmaları işlemine üretme diyoruz. Mikroorganizmaların üretilmeleri için gerekli maddeleri içeren hazırlanmış ortamlar BESİYERİ olarak adlandırılır. Besiyerleri, mikroorganizmaların üretilebilmeleri dışında, benzerlerinden ayırt edilebilmelerinde ve özelliklerinin belirlenmelerinde kullanılır. Mikroorganizmaların canlı ortamlarda üretilebilmeleri için, deney hayvanlarından ve doku kültürlerinden yararlanılır. Bazı mikroorganizmalar basit inorganik maddelerle beslenirler. Organik maddelere ihtiyaç göstermeyen bu mikroorganizmalara OTOTROF mikroorganizmalar adı verilir. Eğer mikroorganizma gerekli enerjiyi inorganik maddelerden oksidasyon yoluyla elde ederse bunlara KEMO OTOTROF mikroorganizmalar adı verilir. Ototrof mikroorganizmalar enerjilerini güneş ışığından sağlarlarsa bunlara da FOTO OTOTROF mikroorganizmalar adı verilir. Beslenmeleri için en az bir organik maddeye ihtiyaç gösteren maddelere HETEROTROF mikroorganizmalar denir. Kemoheterotrof ve fotoheterotrof özellikler burada da söz konusudur. Mikroorganizmalar neden üretilirler Mikroorganizmaların üremeleri, insan sağlığı açısından tanımsal amaç taşır. Hastalık yapıcı etkenlerin ilgili vücut bölgelerinden üretilmeleri sonucunda hastalığın adının belirlenmesi imkanı doğar. Takiben patojen mikroorganizmaların yine besiyerlerinde antimikrobik maddelere duyarlılıkları saptanabilir. Sağlıklı tedavi yaklaşımları gerçekleşir. Ayrıca tedaviye cevap alınıp alınmadığı testlerle belirlenebilir. Çevremizde bulunan ve insan sağlığına etkili su, süt, çeşitli yiyecek maddeleri, bazı ortam, araç ve gereçlerin mikroorganizma taşımaları açısından zaman zaman kontrol edilmeleri toplum ve çevre sağlığı açısından önem taşır. Mikroorganizmalardan aşı, antiserum, antijen gibi gerekli maddelerin elde edilmeleri ve bilimsel araştırma amaçlı olarak üretilmeleri gerekir

3 2. MİKROORGANİZMALARIN BESLEME VE ÜREMELERİ İÇİN GEREKLİ MADDELER 2.1. Su Bakteri hücresinin %70-90'ını su oluşturur. Suyun yeterli olmadığı ortamda bakterilerin üremesi düşünülemez. Metabolizma için gerekli çoğu maddeler suda çözünmüş olmalıdır Karbon Kaynağı Bakteri hücresinin yapı taşlarının sentezi için gereklidir. Polisakkarit, lipid ve proteinlerin yapısında gerekli karbonlar için; CO 2, karbonatlar ve organik kaynaklar kullanılır Azot Kaynağı Bakterilerin protein yapısına girer ve ayrıca nükleik asitlerin bununla ilgili purin, primidin ve çeşitli enzimlerin yapısında bulunur. Azot kaynağı olarak, amonyum tuzları, nitrit, nitrat ve aminoasitlerden yararlanılır Mineraller Mikroorganizmaların ve enzimlerinin yapılarında çeşitli mineraller bulunur. Mikroorganizmalar için gerekli en önemli mineraller, kükürt, fosfor, magnezyum, kalsiyum, demir, potasyumdur Hidrojen Verici ve Hidrojen Alıcı Maddeler Bütün mikroorganizmalar hidrojen verici nitelikteki enerji kaynağı maddelere ihtiyaç gösterirler. Bu nedenle okside olabilen maddeler gerekir. Hidrojen alıcı maddeler ise, aeroplar için oksijen, anaeroplar için inorganik veya organik bileşiklerdir Gelişme Faktörleri ve Vitaminler Bazı bakteriler bu maddeleri kendileri sentez edebildikleri halde bazı bakteriler temel maddeye gereksinim duyabilirler. Mikroorganizmaların gerek duydukları gelişme faktörlerinden bazıları biotin, riboflavin, piridoksin, nikotinik asit... gibi maddelerdir

4 2.7. Oksijen Bakterilerin bir grubu üremeleri için mutlak oksijen varlığına ihtiyaç duyarken, bir kısmı için ortamda hiç oksijen bulunmaması gereklidir. Bazı bakteriler ise ortamda oksijen bulunsun veya bulunmasın rahatlıkla üreyebilirler. Bir grup bakteri ise düşük miktardaki oksijen varlığında üreyebilir Karbondioksit Ototrof ve heterotrof bakteriler için karbondioksit hayati önem taşır. Bazı tıbbi önemi olan bakterilerin % 5-10 CO 2 'li ortamda üremeleri daha kolay olur. Bakterilerin üremeleri için gerekli temel maddeler nelerdir Gelişme faktörleri ve vitaminler tüm bakterilerin üremeleri için gerekli midir 3. MİKROORGANİZMALARIN ÜREMELERİNE ETKİLİ ÇEVRE FAKTÖRLERİ 3.1. Isı Her bakterinin üreyebildiği bir minimum bir de maksimum ısı derecesi bulunmakla birlikte, en iyi üreyebildiği optimal ısı derecesi vardır. Isı değişikliğinden en çok bakteriyel enzimler etkilenir. Bakteriler üreyebildikleri ısılara göre üç guruba ayrılırlar Psikrofil bakteriler Bu grupta daha çok su ve toprakta yaşayabilen saprofit bakteriler yer alır. Genellikle -8 ile 15 C arasında üreyebilirler Mezofil bakteriler İnsanlarda ve hayvanlarda hastalık yapan bakterilerin büyük bir kısmı bu grupta yer alır ve 20 ile 45 C arasındaki ısılarda üreyebililer. Bu bakteriler vücut ısısı olan 37 C'de üretilirler

5 Termofil bakteriler Isıyı seven bakterilerdir. Termofil bakteriler 50 C'nin üzerindeki ısılarda üreyebilirler. Özel protein yapısı ve enzime sahip olduklarından yüksek ısılarda denatüre olmazlar Hidrojen İyon Yoğunluğu Ortamın hidrojen iyon konsantrasyonu (ph) başka bir deyişle ortamın asit veya alkali olması mikroorganizmaların üremesini etkiler. Her bakterinin üreyebildiği minimum ve maksimum ph değerleri vardır. Genelde bakteriler ph 6-8 arasında iyi üremekle birlikte en iyi ph 7,2-7,4 de ürerler Osmotik Basınç Bakterilerin sitoplazmasında 5-10 atmosferi bulan osmotik basınç vardır. Mikroorganizmalar belirli bir mekanizma ile hücre içindeki osmotik basıncı dengede tutarlar. Bu durum potasyum (K + ) iyonunun aktif olarak hücre içerisine alınması ve pozitif yüklü bir organik madde olan putrescine'nin dışarı atılması ile sağlanır. Bazı mikroorganizmalar ise beslenip üreyebilmek için yüksek osmotik basınçlı ortamlara ihtiyaç duyarlar. Bunlara halofil mikroorganizmalar denir Oksidasyon Redüksiyon Potansiyeli Ortamda oksidan yani elektron verebilme gücündeki maddelerle elektron alabilme yeteneğindeki redüktan maddeler bulunur. Oksidan maddelerin fazlalığında oksidasyon-redüksiyon potansiyeli yüksek, redüktan maddelerin fazlalığında ise düşük olur. Bazı bakteri grupları düşük oksidasyon redüksiyon potansiyelinde üreyebilirken, bazıları da yüksek potansiyelde üreyebilirler. Bir ortamda elektron verici (oksidan) veya alıcı (redüktan) güç (oksidasyon redüksiyon potansiyeli) milivolt cinsinden ölçülmekte ve (Eh) simgesi ile ifade edilmektedir. Anaerop mikroorganizmaların üreyebilmesi için besiyerinin Eh derecesi 0.2 milivolt olmalıdır

6 4. BAZI BESİYERLERİNİN TANITILMASI İnsan ve hayvanlarda çeşitli mikroorganizmalar hastalık oluştururlar. Bu mikroorganizmaların izolasyonu, tanımlanması ve üretilmesinde besiyerleri kullanılır. Besiyerleri canlı ve cansız ortamlar olarak ikiye ayrılırlar. Canlı ortamlar olarak sıklıkla hücre kültürleri, embriyonlu yumurta ve deney hayvanlarından yararlanılmaktadır. Cansız ortamlar, genellikle bakterileri izole etme, üretme, çeşitli testleri uygulamak suretiyle ayırıcı tanı yapabilmede kullanılan sıvı veya katı basiyerleridir. Klinik örneklerden ekim yapılırken üretilmesi düşünülen mikroorganizmanın özelliklerine göre uygun olan besiyeri veya besiyerleri seçilmelidir. Besiyerleri kullanım amacı içeriklerine göre gruplara ayrılmaktadır. Besiyerleri aşağıdaki başlıklar altında toplanarak, kısaca anlatılacaktır. Genel Kullanım Besiyerleri Günlük (= rutin) laboratuvar çalışmalarında kullanılan, insan ve hayvanların normal flora üyeleri ile bir çok hastalık etkeni mikroorganizmanın üreyebildiği besiyerleridir. Üreticilik özelliklerine göre temel ya da basit maddeler ile zenginliştirilerek hazırlanmış olmak üzere iki çeşit genel kullanım besiyeri bulunmaktadır. Temel (basit) besiyerleri; et suyu, pepton, tuz gibi maddelerden hazırlanmaktadır. En sık kullanılan sıvı besiyerine buyyon denir. Buyyona agar eklenmek suretiyle elde edilen basit besiyerine ise jeloz denir. Zenginliştirilmiş besiyerleri, temel besiyerlerine kan, serum, glikoz, yumurta gibi maddelerin ilavesi ile hazırlanır. Basit besiyerlerinde üretilemeyen bazı mikroorganizmalar bu ortamlarda üretilebilirler. Özel Besiyerleri Üremeleri güçlük gösteren bazı mikroorganizmaların üretilmeleri için hazırlanan besiyerleridir. Bu tür besiyerleri çalışma amacına göre hazırlanarak kullanılır ve daha kompleks yapıdadırlar. Seçici (selektif) besiyerleri: Bu tür besiyerlerinin içinde üretilmesi istenen mikroorganizmayı baskılamayan ancak, normal flora gibi diğer mikroorganizmaların üremesini inhibe eden seçici antmikrobik maddeler yer almaktadır. Örneğin, kolistin nalidiksik asit agar (CNA) besiyeri; Gram negatif mikroorganizmaların üremesini inhibe ederken, Streptokokların üremesini etkilememektedir

7 Ayırtıcı besiyerleri: Bu besiyerlerine katılan çeşitli indikatörler ve kimyasal maddeler yardımıyla, üreyen kolonilerin aldıkları renge göre mikroorganizmaları tanımlamak mümkündür. Buna örnek olarak, laktoza etkili barsak bakterilerini, birlikte bulundukları laktoza etkisiz olanların oluşturdukları farklı kolonileri ile ayırt etmede kullanılan Endo agar ve Mac Concey gibi besiyerlerini, ayrıca kanlı agarda hemoliz yapan ve yapmayan mikroorganizma kolonilerinin ayrılabildiklerini verebiliriz. Özgül besiyerleri: Yalnız tek veya sınırlı sayıda mikroorganizmanın üretilmesi amacıyla kullanılan besiyerleridir. Örnek olarak Mycobacterium tuberculosis için kullanılan Löweinstein Jensen besiyerini, Corynbacterium diptheriae için, Löffler besiyerini verebiliriz. Ayıraçlı besiyerleri: Sıvı ve katı olarak hazırlanan bu besiyerlerinin bileşimine çeşitli indikatörler (bromtimol mavisi, fenol red,..) ve kimyasal maddeler (karbonhidrat, sitrat, üre...) katılır. Bu maddeler yardımıyla mikroorganizmaların çeşitli biyokimyasal karakterleri belirlenmektedir. Besiyerlerinin Hazırlanmasında Kullanılan Başlıca Maddeler: Su: İdeal olanı saf sentetik besiyerlerinin hazırlanmasında çifte damıtılmış su kullanılmasıdır. Bununla beraber gerektiğinde sert olmayan çeşme suları da sentetik besiyeri hazırlamada kullanılabilir. Agar: Agar agar (kısaca agar) Hindistan ve Japon denizlerinde daha bol bulunan bir deniz yosunudur. Agarın yapısında, temelde, d-galaktopiranoz ünitelerinden yapılmış uzun zincirli polisakkaritler bulunmaktadır. Ayrıca inorganik tuzlar, çok az miktarda protein benzeri maddeler de yapısında yer almaktadır. Agar, parçalayabilen az sayıdaki bakterinin dışında, mikroorganizmaların büyük çoğunluğu tarafından ayrıştırılamaz. Agarın, yalnızca bazı deniz bakterileri tarafından parçalanabildiği bilinmektedir. Mikrobiyolojide kullanılacak iyi bir agarın; sıvıların içerisinde ısıtılınca 95 C de erimesi, sonra soğumaya bırakıldığında C de katılaşma özelliğinde olması gerekir. Agar, sıvı ortamları katılaştırmak amacıyla %1.5-3, yarı katı besiyeri elde etmek için % , yarı sıvı besiyeri için % oranında eklenerek kullanılır. Agar, mikrobiyolojide besiyerlerinin hazırlanmasında en çok kullanılan bir maddedir. Agar, genellikle nötral olduğundan besiyerinin ph'nı etkilemez. Besiyerinin kendi ph'ı düşük olursa agarın katılaşması güçleşir. Pepton: Çeşitli kaynaklı proteinlerin pepsis, tripsin, papain gibi enzimlerle hidrolize edilmeleri sonucu suda kolayca eriyebilen ve ısıtıldığında yeniden koagule olmayan, po

8 lipeptid, dipeptid ve aminoasit gibi maddelerin karışımını içeren ortamlardır. Bakteriler tarafından azot kaynağı olarak kullanılır. Et, kazein, soya küspesi gibi proteinli maddelerin enzimlerle sindirilmeleri yolu ile elde edilir. Peptonlar, elde edildikleri protein kaynağına göre içerikleri yönünden değişiklikler gösterir. Örneğin tripsin ile alkali ortamda sindirilerek hazırlanan peptona proteinler, pepsin etkisine göre daha ileri derecede ayrıştırılarak serbest aminoasitlere dönüştürülürler. Serbest aminoasitler, peptidler ve triptofana kadar parçaladıklarından bir çok bakterinin üremesine elverişli bir ortam yaratılmış olur. Ayırıcı tanıda, bakterilerin triptofandan indol oluşturup oluşturmadıklarının araştırılmasında kullanılırlar. Bakteriyolojide en sık bu tür peptonlar tercih edilmektedir. İdeal bir pepton aşağıdaki özellikleri taşımalıdır. - Suda kolayca erimelidir. - Isıtma ile koagule olan protein içermemelidir. - İndol deneylerini yapmaya imkan verecek nisbette triptofan içermelidir. - Eğer şeker fermentasyon deneyleri yapılacaksa karışıklığa neden olabilecek hiç bir şeker içermemelidir. Et ekstratı: Yağsız etten hazırlanan ham et suyunun su kısmının uçurulması ile elde edilen koyu renkte macun gibi bir maddedir. Bileşiminde, aminoasitler, jelatin, albumoz, vitaminler, minareller gibi maddeler bulunur. Et ekstratından bir litre suya 10 gram kadar katılır. Et ekstratı günümüzde toz halinde ticari olarak satılmaktadır. Kan: Kullanım amacına göre çeşitli hayvanlardan elde edilerek besiyerlerine katılan kanların steril ve pıhtılaşması önlenmiş olmalıdır. Aseptik koşullarda hayvan ve insanlardan alınan kanların fibrinsizleştirilmesi için en iyi yöntem cam boncuklarının bulunduğu steril balonları kullanmaktır. Defibrine kan besiyerlerine %5-10 oranında olacak şekilde eklenir. En sık kanlı agar yapımı için kullanılır. Serum: Koyun, at, tavşan gibi ya da insanlardan steril koşullarda alınıp ayrıştırılan serum besiyerlerine %5-10 oranında eklenerek kullanılır. Serum yerine değişik vücud sıvılarıda steril olarak eklenebilir. Maya özütü: Ekmek veya bira mayasından kendi kendini sindirmesi ile, asit eya proteolitik enzimlerle hidrolizasyon sağlanarak elde edilir. İçeriğinde aminoasitler, üretme faktörleri, inorganik maddeler ve %10 oranında karbonhidratlar bulunur. Besiyerlerine %0.5-1 oranında katılır

9 Sodyum klorür: Besiyerlerine osmotik basıncı ayarlamak için %0.5 oranında katılır. Kanlı agar besiyeri : Jeloz besiyeri ortamına %5-10 oranında kan ilavesi ile hazırlanır. Amaca göre koyun, tavşan, at, insan kanı kullanılabilir. Fibrini parçalanan koyun kanı, hemoliz tipini belirlemede üstündür. (Resim 4-A) Çukulata agar besiyeri : Jeloz (adi agar) besiyerinde üreyemeyen bazı mikroorganizmalar çukulata besiyerinde üreyebilir. Çukulata besiyeri kanlı besiyerinin ısıtılması ile elde edilir. Bu besiyerinin görünümü kaynamış kandan dolayı çukulata rengindedir. Çukulata agar aynı zamanda bazı üreme faktörleri (X, V) taşır. Neisseriae ve hemofil bakterilerin üretilmesinde kullanılır. Thiyoglikolat sıvı besiyeri : Redüktan bir madde olan sodyum thiyoglikolat taşıyan anaerop bakterilerin de üreyebildiği bir ortamdır. Oksidasyon düzeyi için ortama indikatör olarak metilen mavisi eklenir. Oda ısısında ve karanlıkta saklanır. Yara örnekleri için ve anaerop üreme istendiğinde kullanılır. Beyin kalp infüzyonu : BHİ olarak kısaltılarak kullanılır. Sıvı ya da agar katılmış katı şekli vardır. Mikroorganizmaların çoğunu üretebilecek zenginliktedir. Bu nedenle kan kültürleri ile az bakteri içerdiği düşünülen klinik örneklerin ekimleri için kullanılır. EMB Agar : Eozin metilen blue agar, barsak bakterilerinin üreyebildikleri, aynı zamanda laktozu fermante eden ve etmeyenlerin ayırt edilebildiği bir besiyeridir. Selenit F Besiyeri : Koliform basillerin saat süre ile üremelerini engelleyen selenyum tuzları içerir. Bu sayede barsak patojen bakterileri daha iyi ürerler ve üretilme şansları artar. Selenit F besiyerine ekilen dışkı örneklerinin belirli bir süre inkubasyondan sonra EMB veya MacConkey agara pasajları yapılır. SS (Salmonella Shigella) Agar : Barsağın patojen bakterilerinden Salmonella ve Shigellanın izolasyonunu sağlar. Löweistein - Jensen besiyeri : Mycobacterium tuberculosis ve diğer mikobakterileri üretmede, antibiyotik duyarlılık deneylerinin yapılmasında kullanılan bir çok organik madde içeren bir besiyeridir. Üreme maddeleri dışında özellikle Gram (+) bakterilerin üremelerini inhibe eden boya, antibiyotikler ve diğer maddeler içeren değiştirilmiş şekilleri vardır. TSI (Üç şekerli demirli besiyeri) agar, triptofanlı besiyeri, üreli agar, sitrat agar, v.b. ile barsak bakterilerinin farklı enzimatik aktivite ve diğer özelliklerini belirleyen testler vardır. Ayrıca bakterilerin hareketliliklerini gösteren besiyerleri de kullanılmaktadır

10 Agar maddesi besiyerlerinde hangi amaçlarla kullanılır Besiyeri çeşitliliğinin nedenleri nelerdir 5. BESİYERLERİNİN HAZIRLANMASI VE SAKLANMASI Besiyerleri, yapılarında yer alan maddelerin bir araya getirilerek eritilmesi, daha sonra otoklavda sterilize edilmelerini takiben petri kutusu ya da tüplere dökülmesi ile hazırlanır. Hazırlanan besiyerleri soğuduktan sonra, buzdolabına konur ve kullanılıncaya kadar orada saklanır. Yeni hazırlanmış besiyerleri en fazla 15 gün içinde kullanılmalıdır. 6. ÇEŞİTLİ ÖRNEKLERİN EKİLECEKLERİ BAŞLICA BESİYERLERİ VE EKİM TEKNİKLERİ Eğer örnekten özel bir mikroorganizma üretilmesi düşünülüyorsa amaca yönelik ekim yapıl-malıdır. Örnek: M. tuberculosis (tüberküloz basili) için Löweinstein-Jensen besiyeri. Aşağıda bazı vücud örneklerinin ekim yapalabileceği besiyerleri sıralanmıştır. ÖRNEK Boğaz sürüntüsü Dışkı Balgam BOS Kan İdrar Yara BESİYERİ Kanlı agar Kanlı, EMB, Selenit, SS agar Kanlı, EMB, Sabouraud agar Kanlı, Çukulata agar Beyin-Kalp infuzyonlu agar Kanlı, EMB (Eozin Metilen Blue) Kanlı, Thioglikolatlı sıvı Ekim teknikleri besiyerinin katı, sıvı oluşuna göre farklıdır. Sıvı bir ortama ekim, bir öze dolusu ya da bir eküvyon ile tüpün kenarından yapılır. Katı besiyerlerine ekim tüp ya da bir petri kutusunda olabilir. Tüpe, iğne öze ile, petri kutusuna öze ile ekim yapılır. Petri kutusunda besiyerinin bir kenarına sürülen klinik örnek Resim 1-A da görüldüğü gibi öze ile azaltma ekimi biçiminde yayılır

11 Resim1 : Öze aracılığı ile azaltma ekimi yapılması (A) ve kanlı agar besiyerinde hemolitik kolonilerin oluşumu (B) görülmektedir. Kullanılan katı üreme ortamlarının amacı koloni oluşmasını sağlamaktadır. Ekimi, takiben genellikle kullanılan inkubasyon ısısı 37 C'de olup, etüvde saat sonra üreme beklenmelidir. Sıvı besiyerlerinde mikroorganizma üretmek neden yeterli değildir 7. ÜREMELERİN DEĞERLENDİRİLMESİ Sıvı besiyerlerinde ekimi takiben oluşan bulanıklık, tortu ya da zar oluşumu üremeyi gösterir. Üreme, bir öze dolusu alınan sıvının preparat yapılarak boyanması ve mikroskopta x100 büyütmede incelenmesi ile belirlenir. Katı besiyerlerinde üreme, koloni oluşumu ile gözlenir. Her bir mikroorganizmanın bir koloni oluşturduğu kabul edilir. Kolonilerden alınan parçaların bir başka besiyerine ya da deney hayvanına aktarılması işlemine pasaj adı verilir. Koloni özellikleri bakteri türüne göre farklılıklar gösterir. Bu farklılıklar bakterileri tanımlamada bize yardımcı olur. Bununla birlikte bakteriler farklı besiyerlerinde farklı koloniler oluşturabilirler. Bir bakteri kolonisinde, koloninin büyüklüğü, şekli, koloni kenarlarının ve yüzeyinin düzgün olup olmadığı, koloninin mat ve parlaklık durumu, rengi, kokusu, kıvamı ile kanlı besiyerlerinde oluşmuş bir koloni ise, hemoliz yapıp yapmadığı gözlenerek belirlenir. (Resim 2)

12 Bakteriler kanlı besiyerindeki hemoliz durumlarına göre üçe ayrılırlar. Alfa Hemoliz: Bakteri kolonisi etrafında hemoliz sahalarına mikroskobun küçük büyütmesi ile bakıldığında ortamda sağlam eritrositlerin varlığı görülür. Hemoliz bölgesi yeşilimsi renktedir. Beta Hemoliz: Tam hemolizdir. Bakteri kolonileri etrafında tam bir saydam alan görülür. Bu bölgedeki eritrositler tamamen erimiştir. Petri kutusunun arkası görülebilir. (Resim 4-A) Gamma Hemoliz: Kanlı agarda üreyen bakteri kolonisi hiç hemolilz oluşturmamıştır. Bakteri kolonileri şekil bakımından dörde ayrılır. - S tipi koloni: Kenarları düzgün olup yandan bakıldığında tam bir bombelik gösterir. - R tipi koloni: Koloni çevresi zikzaklı ve yüzeyi pürtüklüdür. - M tipi koloni: Koloniler sümüksü görünümdedir. Oldukça iri ve bombe kolo nilerdir. M tipi kolonileri genelde kapsüllü bakteriler oluşturmaktadır. - L tipi Koloni: Hücre duvarı olmayan bakteriler tarafından oluşturulur. Görünüşü şekil olarak sahanda pişmiş yumurtayı andırır. Resim 2 : Çeşitli özelliklerde koloni şekilleri (A, B, C, D) ve kolonilerin yandan ve üstten görünüşleri çizilmiştir (I, II)

13 Besiyerlerinde mikroorganizmaların üremelerinin sağlanması dışında onlara ait çeşitli biyokimyasal özellikler ile enzimatik aktiviteler belirlenebilir. Besiyerine katılan karbonhidratlardan asit ve/veya gaz oluşumu sitratın karbon "C" kaynağı olarak kullanılması, üreli bir ortamda üreaz enziminin varlığı araştırılır. Deneylerin sonuçlarının daha rahat gözlenebilmesi için indikatör madde olarak belirli ph'larda farklı renklere dönüşebilen boyalar besiyerlerine eklenir. Bu nedenle kanlı ve çukulata agar dışındaki pek çok besiyeri çok çeşitli renklerdedir. Günlük mikrobiyolojik değerlendirmeler yapan laboratuvar elemanları besiyerlerini genellikle renkleriyle tanırlar. Örnek olarak, üreli agarda üreaz enzimi olan bir bakteri üremişse besiyerini pembe renge, sitratlı agarda, sitratı "C" kaynağı olarak kullanan bakteri besiyerini yeşilden maviye dönüştürmektedir. Kolonilere ait hangi özellikler biliyorsunuz Üreme sonucunda besiyerlerinde ne gibi değişiklikler gözlenir Resim 3 : SDA da üretilmiş maya = candida (A) ve küf mantarı (B) kolonileri görülmektedir. Mantarlar, Sabouraud dekstroz agar (SDA) denen besiyeri en çok olmak üzere, çeşitli özel ortamlarda üretilebilirler. Genellikle 22 C'de (oda ısısında) bazen hem 22 C hem de 37 C'de (vücut ısısında) ekimi takiben 2-3 günden 7-10 güne kadar değişebilen sürelerde inkübe edilir. Maya ya da küf kolonileri yaparlar. (Resim 3, Resim 4 B) Kolonilerin incelenmesi tanıda değerlidir

14 Viruslar, canlı hücreler içinde üreme zorunluluğundadırlar. Bu amaçla doku kültürleri ve embriyonlu yumurta kullanılır. Sağlam ve düzenli hücrelerden tüp ve şişelerde hazırlanan doku kültürlerine, virus ya da virus taşıdığı düşünülen vücut sıvı veya salgıları ekilerek üremelerin ortaya çıkaracağı değişiklikler incelenir. Alınan örnekler, bazı etkenlerin üretilebilmeleri için embriyonlu yumurtanın farklı bölgelerine ekilir. Oluşturdukları değişiklikler incelenir ya da alınan sıvılarda çeşitli deneyler yapılır. Resim 4 : Kanlı agarda beta hemoliz yapmış bir streptokok (A) ile SDA'da üreyerek tüm petri kutusunu doldurmuş bir mantar kolonisi (B) görülmektedir. Parazitler, tanımlanmaları için besiyerlerine ekimleri kısıtlı grubu oluştururlar. Günlük çalışmalarda laboratuvarlarda parazitlerin üretilmesi işlemleri yapılmaz. Petri kutusundaki katı bir besiyerine neden azaltma ekimi yapılmalıdır nebilir Hemoliz varlığı hangi besiyerinde saptanabilir Viruslar nasıl üretilirler Buyyonlu tüpte zar yaparak üreyen bir bakterinin hangi özelliği belirle

15 8. ANTİBİYOTİK DUYARLILIK DENEYLERİ İnfeksiyon hastalıklarının tedavisinde kemoterapötiklerin, etkene yönelik seçilmesinde duyarlılık deneylerine gerek vardır. Bu deneyler standardize edilmişlerdir. Biri, petri kutusunda hazırlanan besiyerine önce bakteri sulandırımının sürülmesi ve takiben antibiyotik emdirilmiş disklerin yerleştirilmesi esasına dayanan "disk difüzyon yöntemi"dir. İkincisi ise "tüp sulandırım yöntemi"dir. Bu yöntem çok pratik olmaması nedeniyle daha çok araştırma amaçlı kullanılır. Deneyler sonucunda duyarlı ve dirençli antibiyotikler ile minimum inhibisyon konsantrasyon (MİK) larının saptanması mümkündür. Antimikrobiyal aktivite invitro koşullarda 2 yöntemle belirlenir. Dilüsyon metodu Difüzyon metodu Dilüsyon metodu : Genellikle tüpte ya da agar içine antimikrobik katılarak da yapılabilir. Tüp dilüsyon (sulandırım) metodunda, antimikrobiyal maddenin belirli bir bakteriye karşı MİK (Minimum İnhibisyon Konsantrasyonu) değerleri saptanır. Bir dizi tüpte soldan sağa sırasıyla antimikrobik maddenin sulandırımları yapılır. Standart bakteri süspansiyonu eklenerek dirençlilik, duyarlılık ve MİK değerleri belirlenir. Disk difüzyon metodu : Antibiyotik emdirilmiş kağıt diskler kullanılarak, mikroorganizmaların üremelerinin inhibisyonları (önlenmesi) belirlenir. Petri kutusuna dökülen özel agarlı besiyeri üzerine antibiyotik duyarlılık durumu saptanacak bakterinin standart sulandırımı yayılır. Üzerine belirli aralıklarla antibiyotik diskleri yerleştirilir. Her bir diskte bilinen dozda (İ.Ü veya µgr/ml.) antibiyotik bulunur. Değerlendirme, disk etrafında oluşan ürememe alanının çapının mm. olarak ölçülmesiyle yapılır. Her antibiyotik için sözü edilen çapın (zon) milimetrik değerine göre "dirençli", "orta duyarlı" veya "duyarlı" olarak belirtilir. Resim 5 : Disk difüzyon yöntemi kullanılarak petri kutusunda yapılmış bir antibiyotik duyarlılık deneyi (I) ile sonucu (II) şematik olarak görülmektedir. (A, C, E antibiyotikleri dirençli, F orta duyarlı, B, D, G duyarlı bir bakteri örneklenmiştir)

16 Antimikrobiyal duyarlılık saptanmasının önemi nedir Antimikrobik duyarlılık nasıl değerlendirilir Özet Mikroorganizmaların uygun koşullar sağlandığında besiyerleri ya da bazı canlı ortamlarda üretilebilmeleri mümkündür. Sıvı veya katı ortamlarda üremenin gözlenmesi, değerlendirilmesi ve gerektiğinde yapılabilecek yardımcı testler ile mikroorganizma tanımlanmaya çalışılır. Amaç, örnek alınan bölgeye ait etkeni saptamaktır. Bazen bu çalışmalar deneysel (araştırma) olarak da yapılmaktadır. Besiyerleri otoklav adı verilen 121 C'de 1,5 atmosfer basınç altında buharla sterilizasyon yapan aletlerde tutulur. Üretme işlemleri, her aşamada mutlak sterilizasyon kurallarına uymayı gerektirir. Genel kullanım amaçlı olanların dışında bazı mikroorganizmaların üretilmesinde kullanılan özel besiyerleri de vardır. Bir kısmının ekimleri özel yöntemler veya işlemler gerektirebilir. Değerlendirme Soruları 1. Aşağıdakilerden hangisi sıvı besiyeridir A) Buyyon B) Kanlı agar C) Sabouraud agar D) EMB agar C) Hiçbiri 2. Besiyerlerinin sterilizasyonunda kullanılan alet ya da yöntem hangisidir A) Otoklav B) Kaynatma C) Pastörizasyon D) Etüv E) Hepsi 3. Üremeleri için mutlak bir canlı hücre gerektiren mikroorganizma türü hangisidir A) Bakteri B) Protozoon C) Mantar D) Virus E) Hiçbiri

17 4. Aşağıda sıralanan besiyerlerinden birinde bakterinin hemoliz özelliği belirlenebilir A) Buyyon B) Sabouraud Dekstroz Agar C) Jeloz D) Kanlı Agar E) Hepsi 5. Basit inorganik maddelerle beslenen ve enerjisini oksidasyon ile sağlayan mikroorganizmalara ne denir A) Ototrof B) Heterotrof C) Kemoheterotrof D) Mikroaerofil E) Hiçbiri 6. Mezofil bakterilerin üreme ısıları hangisidir A) -8 C / 15 C B) 4 C / 14 C C) 20 C / 45 C D) Yalnız 37 C E) 50 C ve üzerinde 7. Katı besiyerlerinde kullanılan ortak madde hangisidir Belirtiniz. A) NaCl B) Kan C) Et ekstresi D) Agar E) Kazein 8. Kapsüllü bakteriler hangi tip koloni oluştururlar A) M tipi B) S tipi C) R tipi D) L tipi E) K tipi 9. Mikrobiyoloji laboratuvarında en sık kullanılan antibiyotik duyarlılık testi hangisidir A) Tüp dilüsyon B) Agarda tüp dilüsyon C) MİK D) Disk difüzyon E) Hepsi 10. Aşağıdaki besiyerlerinden hangisi anaerop amaçla kullanılır. A) Kanlı agar B) EMB C) Çukulata agar D) Thiyoglikolatlı sıvı E) SS agar

18 Sözlük Salmonella : Tifo hastalığının etkenidir. Etken dışkı ve kandan izole edilebilir. Shigella : Dizanteri hastalığının etkenidir. Etken dışkıdan izole edilebilir. Koliform : Koli benzeri Gram ( ), laktozu fermante eden barsak normal flora bakterileri Pasaj : Bir besiyerinden diğerine veya bir canlı ortamdan diğerine mikroorganizma nakledil mesi işlemi Enterik bakteriler : Barsakta yer alan patojen ve flora bakterilerinin tümü MacConkey : Enterik bakterilerin ekildikleri bir besiyeri Yararlanılan Kaynaklar BAUER, J.D., Clinical Laboratory Methods, C.V. Mosby Company, St. Louis, Toronto, London, 1982 BİLGHAN, H., Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, Barış Yayınları, Fakülteler Kitabevi, İzmir, ÇETİN, E.T., Genel ve Pratik Mikrobiyoloji, Sermet Matbaası, İstanbul, MURRAY, R., Drew, W.L., Kobayashi, G.S., Thompson, J.H., Medical Microbiology, Wolfe Medical Publications Ltd.,