1 EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (DKTRA TEZİ) ESTRADİL GLUKURNİD TÜREVİ BİR RADYFARMASÖTİĞİN TASARLANMASI, SENTEZİ VE RADYFARMASÖTİK PTANSİYELİNİN İNCELENMESİ Fazilet Zümrüt BİBER Nükleer Bilimler Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu : 622.02.01 Sunuş Tarihi : 09. 03. 2004 Tez Danışmanı: Prof. Dr. Perihan ÜNAK Bornova, İZMİR
2 Sayın Fazilet Zümrüt Biber tarafından DKTRA TEZİ olarak sunulan Estradiol Glukuronid Türevi Bir Radyofarmasötiğin Tasarlanması, Sentezi ve Radyofarmasötik Potansiyelinin İncelenmesi başlıklı bu çalışma E. Ü. Lisansüstü Eğitim ve Öğretim Yönetmeliği ile E. Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Eğitim ve Öğretim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan değerlendirilerek savunmaya değer bulunmuş ve 09-03-2004 tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oybirliği/oyçokluğu ile başarılı bulunmuştur. Jüri Üyeleri İmza Jüri Başkanı :Prof. Dr. Perihan ÜNAK.... Raportör :Prof. Dr. Figen ZİHNİĞLU..... Üye :Prof. Dr. Meral ERAL..... Üye :Prof. Dr. Turan ÜNAK.... Üye :Prof. Dr. Hatice DURAK.
3 ÖZET ESTRADİL GLUKURNİD TÜREVİ BİR RADYFARMASÖTİĞİN TASARLANMASI, SENTEZİ VE RADYFARMASÖTİK PTANSİYELİNİN İNCELENMESİ BİBER, Fazilet Zümrüt Doktora Tezi, Nükleer Bilimler Anabilim Dalı Tez Yöneticisi : Prof. Dr. Perihan Ünak Mart 2004, 143 sayfa Estrojen bileşikleri tıp alanında özellikle estrojen reseptörleri ile ilişkili olan meme, uterus kanseri gibi kanser türlerinde görüntüleme ve tedaviye yönelik radyofarmasötiklerin oluşturulmasında oldukça önemli bir yer teşkil etmektedir. Bazı kanser hücreleri gibi meme kanser hücrelerinin de β- glukuronidaz enzimini daha yüksek oranda içerdiği bilinmektedir. Bu çalışmanın amacı 99m Tc ile işaretlenebilecek estradiol glukuronid türevi bir radyofarmasötik tasarlamaktır. Aynı zamanda bir hayvan modeli üzerinde biyodağılım ve görüntüleme çalışmaları yaparak radyofarmasötik potansiyelini belirlemektir. Deneysel aşamada çıkış maddesi olarak β-estradiol (1,3,5,[10]-estratrien- 3,17β-diol) bileşiğinden başlanarak altı basamaklı reaksiyon sonucunda DTPA ve estradiol türevi bir bileşik olan deoksi demetil homoestradiolil dietilentriamin pentaasetik asit (ESTDTPA) sentezlenmiştir. Sentezlenen bu bileşik daha sonra UDP-glukuronil transferaz (UDPGT) enzimi ile glukuronidasyon reaksiyonuna sokularak estradiol glukuronid türevi bir bileşik
VI olan deoksi demetil homoestradiolil dietilentriamin pentaasetik asit-glukuronid (ESTDTPAG) elde edilmiştir. Sentezi yapılan bileşiklerin saflaştırma işlemleri Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC) tekniği kullanılarak yapılmıştır. Yapı tayinleri Nükleer Magnetik Rezonans (NMR) ve Hızlı Atom Bombardımanlı (FAB - MS) kütle spektroskopi teknikleri kullanılarak yapılmıştır. Sonuçlar teorik NMR spektrumları ile karşılaştırıldığında, beklenen moleküler yapının doğrulandığı görülmüştür. Elde edilen HPLC de saflaştırılmış bileşikler 99m Tc ile işaretlenerek radyokimyasal verimleri ile stabiliteleri İnce Tabaka Radyo Kromatografi (TLRC) metodu kullanılarak belirlenmiştir. İşaretli bileşiğin meme ve uterus kanserini görüntülemede radyofarmasötik potansiyeli saptanmaya çalışılmıştır. Biyodağılım çalışmaları dişi Albino Wistar sıçanları üzerinde yapılmış ve gram doku başına düşen aktivite hesap edilerek aktivitenin zamanla değişimi incelenmiştir. Görüntüleme çalışmaları da Camstar XR/T gama kamera kullanılarak deneysel tümör oluşturulmuş Albino Wistar sıçanları üzerinde yapılmıştır. Anahtar Kelimeler: Estradiol Türevi Radyofarmasötikler, β-estradiol (1,3,5,[10]-estratrien-3,17β-diol), DTPA, 99m Tc-ESTDTPA, 99m Tc-ESTDTPAG, Albino Wistar Sıçan, DMBA, Meme Kanseri.
VII ABSTRACT DESIGN AND SYNTHESIS F A GLUCURNIDE DERIVATIVE F ESTRADIL AND INVESTIGATIN F ITS RADIPHARMACEUTICAL PTENTIAL BİBER, Fazilet Zümrüt PhD Thesis in Nuclear Sciences Supervisor : Prof. Dr. Perihan ÜNAK March 2004, 143 pages Estrogen compounds are important tools in medicine, especially for breast and uterus cancers related to estrogen receptors while preparing radiopharmaceutics for the imaging and treatment of these types of cancers. It is known that breast cancer cells like some other ones have high ratio of beta glucuronidase. The aim of the current study is to synthesis a derivative of estradiol glucuronide as a radiopharmaceutical, which is able to be labeled with 99m Tc and to investigate its radiopharmaceutical potential using imaging and biodistribution studies. An estrogen derivative, β-estradiol (1,3,5,[10]-estratriene-3,17β-diol) attached to diethylenetriamine pentaacetic acid (DTPA) was synthesized at six experimental steps. At the end of these steps a compound of estradiol and DTPA derivative called deoxy demethyl homoestradiolyl diethylenetriamine pentaacetic acid (ESTDTPA) was synthesized. Afterwards, this compound was
VIII reacted with UDP-glucuronyl transferase (UDPGT). Following the glucuronidation reaction, the product called deoxy demethyl homoestradiolyl diethylenetriamine pentaaceticacid-glucuronide (ESTDTPAG) was obtained. Synthesized products were purified using High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The identification of purified products and impurities were also determinated using High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Expected molecular structures were confirmed by the comparison of results obtained with the theoretical NMR spectra. Synthesized compounds were labeled with 99m Tc. Thin Layer Radio Chromatography (TLRC) technique was used to determine their radiochemical yields and stabilities. Radiopharmaceutical potential of the labeled compound was tested to determine in imaging of breast and uterus cancers. The biodistribution studies were performed on female Albino Wistar rats. The activity per gram tissue was calculated and time-activity curves were plotted. The imaging studies were performed on normal and tumor bearing female Albino Wistar rats using Camstar XR/T gamma camera. Key Words: Estradiol Derivative Radiopharmaceuticals, β-estradiol (1,3,5,[10]-estratrien-3,17β-diol), DTPA, 99m Tc-ESTDTPA, 99m Tc-ESTDTPA- GLU, Albino Wistar Rat, DMBA, Breast Cancer.
IX TEŞEKKÜR Doktora çalışmalarım sırasında engin bilgisini, her türlü manevi destek ve yardımlarını esirgemeyen Sayın Hocam Prof. Dr. Perihan ÜNAK a, Enstitü Laboratuvarlarında her türlü çalışma olanağını sağlayan E. Ü. Nükleer Bilimler Enstitüsü Müdürü Sayın Prof. Dr. Meral ERAL a, başta Nükleer Uygulamalar Anabilim dalı personeli olmak üzere, deneysel tümör oluşturduğumuz sıçanların sintigrafik çekimlerinde yardımcı olan D. E. Ü Tıp Fakültesi Nükleer Tıp Anabilim Dalı ndan Kimya Yüksek Mühendisi Türkan Ertay a, organik kimya bilgisinden yararlandığım A. K. Ü öğretim görevlisi Yard. Doç. Dr. Hüseyin Enginar a, glukuronidasyon reaksiyonu esnasında deneysel çalışmalarda zamanını ve bilgisini sunan E. Ü. Fen Fakültesi Biyokimya Bölümü nden Prof. Dr. Figen Zihnioğlu na, her an yanımda hissettiğim, sabır ve anlayışını esirgemeyen aileme en içten duygularımla sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum.
10 İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... ABSTRACT... TEŞEKKÜR... İÇİNDEKİLER... V VII IX XI ŞEKİLLER XVII DİZİNİ ÇİZELGELER DİZİNİ... XXI RESİMLER V XXV DİZİNİ SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... XXV I 1. GİRİŞ... 1 2. GENEL BİLGİLER... 5 2.1 Hormon Nedir?... 5 2.1.1 Estrojenik 5 hormonlar 2.1.2 Estrojen reseptörleri ve reseptöre bağlanma... 6 2.1.3 Estradiol 10 hormonu 2.1.4 Estrojen ve kanser... 11 2.1.5 Estrojen ve meme kanseri... 12 2.1.6 Fitoestrojenler doğal ve sentetik çevresel hormonlar... 13
11 İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 2.1.7 Radyonüklid işaretli estrojenler ile yapılan metabolik çalışmalar... 14 2.1.8 Radyonüklid işaretli halojenli estradiol 15 türevleri... 2.1.9 99m Tc ile işaretli estrojen bileşikleri... 16 2.2 Teknesyum 18 Kimyası 2.2.1 Teknesyum un kimyasal özellikleri... 18 2.2.2 99 Mo 99m Tc jeneratörü... 20 2.2.3 99m Tc-radyofarmasötiklerle klinik 20 uygulamalar 2.2.4 99m Tc ile işaretleme... 21 2.2.5 Teknesyum radyofarmasötiklerinde kullanılan kalite kontrol yöntemleri... 22 2.2.5.1 İnce tabaka kromatografisi 22 (TLC) 2.2.5.2. Kağıt 23 elekroforezi 2.2.5.3 Yüksek performanslı sıvı kromatografisi 24 (HPLC) 2.3 Enzimler ve Genel 25 Özellikleri 2.3.1 Glukuronidler... 26 2.3.2 Glukuronidasyon reaksiyonu... 26 2.3.3 β-glukuronidaz enzimi... 27 2.3.4 UDP-glukuronil transferaz (UDPGT) enzimi... 28
12 İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 2.3.4.1 UDPGT enziminin özellikleri... 28 2.3.4.2 UDPGT enziminin lokalizasyonu... 29 2.3.5 Glukuronidlerle ilgili olarak son yıllarda yapılan 29 çalışmalar 3. MATERYAL VE 32 METD 3.1 Kullanılan Kimyasallar ve Cihazlar.. 32 3.1.1 Kullanılan 32 kimyasallar 3.1.2 Kullanılan cihazlar... 33 3.2 Bio-aktif Bileşenlerin Sentezi... 34 3.2.1 Deoksi demetil homoestradiolil dietilentriamin pentaasetik asit (ESTDTPA) bileşiğinin sentezi... 34 3.2.2 Glukuronidasyon 41 basamağı 3.2.2.1 UDPGT enziminin elde edilmesi... 42 3.2.2.2 Glukuronid 43 reaksiyonu 3.3 İşaretleme Yöntemi... 46 3.3.1 3.3.2 99m Tc-deoksi demetil homoestradiolil dietilentriamin pentaasetik asid ( 99m Tc-ESTDTPA) çözeltisinin hazırlanması... 46 99m Tc-deoksi demetil homoestradiolil dietilentriamin pentaasetik asid-glukuronid ( 99m Tc-ESTDTPAG) çözeltisinin hazırlanması... 47
13 İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 3.3.3 99m Tc-DTPA çözeltisinin hazırlanması... 49 3.4 Çalışmada Kullanılan Kromatografik Yöntemler... 49 3.4.1 Kağıt elektroforezi yöntemi... 49 3.4.2 İnce Tabaka Radyo Kromagrafi (TLRC) yöntemi... 50 3.4.3 Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC) 51 yöntemi 3.5 Yapı Tayini Yöntemleri... 52 3.5.1 Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi yöntemi... 52 3.5.2 Hızlı Atom Bombardımanlı (FAB - MS) kütle spektroskopi yöntemi... 52 3.6 Lipofilite... 53 3.6.1 n-ktanol/ Su oranının bulunması... 53 3.7 In vivo 54 Çalışmalar 3.7.1 Deneysel tümör 54 çalışmaları... 3.7.2 Dişi Albino Wistar sıçanlar üzerinde yapılan biyodağılım çalışmaları... 55 3.8 İstatistik Analizler... 56 3.9 Sıçanlar Üzerinde Yapılan Sintigrafik 56 Çalışmalar 4. BULGULAR VE TARTIŞMA... 57
14 İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 4.1 HPLC yöntemi ile elde edilen kromatogramlar.. 57 4.2 Moleküler Yapının 62 Belirlenmesi 4.2.1 NMR spektrumları... 62 4.2.2 FAB-MS spektrumları. 69 4.3 Kalite Kontrol Çalışmalarının 77 Sonuçları 4.3.1 HPLRC yöntemi ile elde edilen kromatogramlar... 77 4.3.2 TLRC yöntemi ile elde edilen kromatogramlar... 79 4.3.3 Elektroforez yöntemi ile elde edilen kromatogramlar. 86 4.4 In vivo Çalışmaların Sonuçları.. 93 4.4.1 Deneysel tümör çalışmalarının sonuçları. 93 4.4.2 Sıçanlar üzerinde 99m Tc-ESTDTPA ve 99m Tc-ESTDTPAG bileşikleriyle yapılan biyodağılım çalışmalarının sonuçları... 93 4.4.3 Estrojen reseptörleri β-estradiol ile doyurulduktan sonra (Reseptörlü) yapılan 99m Tc-ESTDTPA lı biyodağılım çalışmalarının sonuçları. 97 4.4.4 Estrojen reseptörleri β-estradiol ile doyurulduktan sonra sıçanlar üzerinde yapılan 99m Tc-ESTDTPAG bileşiğine ait biyodağılım çalışmalarının 99
15 İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 4.5 İstatistik Analiz Sonuçları 111 4.6 Tümörlü Sıçanlar Üzerinde Yapılan Sintigrafik Çalışmalar 117 4.7 Lipofilite Sonuçları... 122 5.SNUÇ VE ÖNERİLER... 126 KAYNAKLAR DİZİNİ... 127 ÖZGEÇMİŞ... 143
16 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Sayfa 2.1 Bir estrojen molekülünün hücre içindeki yeri...8 2.2 Estrojen ve estrojen reseptörü etkileşimi...9 2.3 ER α ve ER β reseptörlerinin vücuttaki dağılımı...10 2.4 Estradiol bileşiğinin moleküler yapısı.......11 2.5 99m Tc un bozunma şeması...20 3.1 Birinci sentez basamağı....35 3.2 İkinci sentez basamağı......36 3.3 Üçüncü sentez basamağı...37 3.4 Dördüncü sentez basamağı...38 3.5 Beşinci sentez basamağı...39 3.6 Altıncı sentez basamağı...40 3.7 ESTDTPA bileşiği...41 3.8 ESTDTPAG bileşiğinin elde edildiği glukuronidasyon reaksiyonu....45 3.9 99m Tc-ESTDTPA bileşiği...46 3.10 99m Tc-ESTDTPAG bileşiğinin elde edildiği reaksiyon...48 4.1 Zaman ve % konsantrasyon değişimini içeren ESTDTPA bileşiğine ait HPLC kromatogramı.....58 4.2 ESTDTPA nın RP-C18 kolonu (250 x 4.6 mm I.D.) ile elde edilen HPLC kromatogramı........58 4.3 Saflaştırma işlemi sonucu RP-C18 (250 x 21 mm I.D.) kolonu ile elde edilen ESTDTPA bileşiğinin HPLC kromatogramı...59 4.4 ESTDTPAG bileşiğinin HPLC kromatogramı...59 4.5 İnaktif ESTDTPA ve ESTDTPAG bileşiklerine ait kromatogram...60
17 ŞEKİLLER DİZİNİ (Devam) Şekil Sayfa 4.6 (1,3,5,[10]-Estratrien-3,17β-diol) β-estradiol bileşiğinin HPLC kromatogramı...60 4.7 DTPA bileşiğinin HPLC kromatogramı.... 61 4.8 UDPGA bileşiğinin HPLC kromatogramı...61 4.9 ESTDTPA bileşiğinin teorik 13 C-NMR spektrumu...63 4.10 ESTDTPA bileşiğinin teorik 1 H-NMR spektrumu.....64 4.11 ESTDTPA bileşiğinin 13 C-NMR spektrumu...65 4.12 ESTDTPA bileşiğinin 1 H-NMR Spektrumu...66 4.13 ESTDTPA nın moleküler formülünün 13 C-NMR için numaralanması...67 4.14 ESTDTPA nın moleküler formülünün 1 H-NMR için numaralanması...68 4.15 ESTDTPA bileşiğine ait FAB - MS spektrumu (m/z skala değeri 200-1400 arası)...70 4.16 ESTDTPA bileşiğine ait FAB - MS spektrumu (m/z skala değeri 200-1000 arası)..... 71 4.17 ESTDTPA bileşiğine ait FAB -MS spektrumu (m/z skala değeri 350-1000 arası).......72 4.18 ESTDTPA bileşiğine ait FAB - MS spektrumu (m/z skala değeri 700-1100 arası)....73 4.19 ESTDTPAG bileşiğinin FAB - MS spektrumu (m/z skala değeri 100-1250 arası)...74 4.20 99m Tc ESTDTPA nın HPLRC diyagramı...77 4.21 99m Tc-ESTDTPAG bileşiğinin HPLRC diyagramı...78
18 ŞEKİLLER DİZİNİ (Devam) Şekil Sayfa 4.22 99m Tc-ESTDTPA nın TLRC-5 çözeltisi kullanılarak elde edilen kromatogramı...81 4.23 99m Tc-ESTDTPAG bileşiğinin TLRC-5 çözeltisi kullanılarak elde edilen kromatogramı...81 4.24 99m Tc- DTPA nın TLRC-5 çözeltisi kullanılarak elde edilen kromatogramı...82 4.25 İnd 99m Tc nin TLRC-5 çözeltisi kullanılarak elde edilen kromatogramı...82 4.26 99m Tc nin TLRC-5 çözeltisi kullanılarak elde edilen kromatogramı...83 4.27 99m Tc-ESTDTPA nın TLRC-7 çözeltisi kullanılarak elde edilen kromatogramı...83 4.28 99m Tc-ESTDTPAG bileşiğinin TLRC-7 çözeltisi kullanılarak elde edilen kromatogramı...84 4.29 99m Tc-DTPA nın TLRC-7 çözeltisi kullanılarak elde edilen kromatogramı...84 4.30 İnd 99m Tc nin TLRC-7 çözeltisi kullanılarak elde edilen kromatogramı...85 4.31 99m Tc nin TLRC-7 çözeltisi kullanılarak elde edilen kromatogramı..85 4.32 99m Tc-ESTDTPA nın TLRC-5 çözeltisi kullanılarak elde edilen elektroforez kromatogramı...88 4.33 99m Tc-ESTDTPAG bileşiğinin TLRC-5 çözeltisi kullanılarak elde edilen elektroforez kromatogramı...88 4.34 99m Tc-DTPA nın TLRC-5 çözeltisi kullanılarak elde edilen elektroforez kromatogramı...89
19 ŞEKİLLER DİZİNİ (Devam) Şekil Sayfa 4.35 İnd 99m Tc nin TLRC-5 çözeltisi kullanılarak elde edilen elektroforez kromatogramı...89 4.36 99m Tc nin TLRC-5 çözeltisi kullanılarak elde edilen elektroforez kromatogramı...90 4.37 99m Tc-ESTDTPA nın TLRC-7 çözeltisi kullanılarak elde edilen elektroforez kromatogramı...91 4.38 99m Tc-ESTDTPAG bileşiğinintlrc-7 çözeltisi kullanılarak elde edilen elektroforez kromatogramı...91 4.39 99m Tc-DTPA nın TLRC-7 çözeltisi kullanılarak elde edilen elektroforez kromatogramı...91 4.40 İnd 99m Tcn in TLRC-7 çözeltisi kullanılarak elde edilen elektroforez kromatogramı...92 4.41 99m Tc nin TLRC-7 çözeltisi kullanılarak elde edilen elektroforez kromatogramı...92 4.42 99m Tc-ESTDTPA bileşiğinin dişi Albino Wistar sıçanlardaki biyodağılımı...96 4.43 99m Tc-ESTDTPAG bileşiğinin dişi Albino Wistar sıçanlardaki biyodağılımı...97 4.44 β-estradiol ile reseptör doyurma işleminden sonra dişi Albino Wistar sıçanlardaki 99m Tc-Res-ESTDTPA bileşiğinin biyodağılımı...99 4.45 β-estradiol ile reseptör doyurma işleminden sonra dişi Albino Wistar sıçanlardaki 99m Tc-Res-ESTDTPAG bileşiğinin biyodağılımı...101
20 ŞEKİLLER DİZİNİ (Devam) Şekil Sayfa 4.46 99m Tc -ESTDTPA bileşiğinin seçilmiş bazı organlardaki biyodağılım grafiği...102 4.47 99m Tc-Res-ESTDTPA bileşiğinin seçilmiş bazı organlardaki biyodağılım grafiği...102 4.48 99m Tc-ESTDTPAG bileşiğinin seçilmiş bazı organlardaki biyodağılım grafiği...103 4.49 99m Tc-Res-ESTDTPAG bileşiğinin seçilmiş bazı organlardaki biyodağılım grafiği...103 4.50 Uterusdaki 99m Tc -ESTDTPA ve 99m Tc-Res-ESTDTPA bileşiklerinin zamanla dağılımı...104 4.51 verdeki 99m Tc-ESTDTPA ve 99m Tc-Res-ESTDTPA bileşiklerinin zamanla dağılımı...104 4.52 Memedeki 99m Tc-ESTDTPA ve 99m Tc-Res-ESTDTPA bileşiklerinin zamanla dağılımı...105 4.53 Dalaktaki 99m Tc-ESTDTPA ve 99m Tc-Res-ESTDTPA bileşiklerinin zamanla dağılımı...105 4.54 Pankreasdaki 99m Tc-ESTDTPA ve 99m Tc-Res-ESTDTPA bileşiklerinin zamanla dağılımı...106 4.55 Uterusdaki 99m Tc-ESTDTPAG ve 99m Tc-Res-ESTDTPAG bileşiklerinin zamanla dağılımı...106 4.56 verdeki 99m Tc-ESTDTPAG ve 99m Tc-Res-ESTDTPAG bileşiklerinin zamanla dağılımı...107
21 ŞEKİLLER DİZİNİ (Devam) Şekil Sayfa 4.57 Memedeki 99m Tc-ESTDTPAG ve 99m Tc-Res-ESTDTPAG bileşiklerinin zamanla dağılımı...107 4.58 Dalakdaki 99m Tc-ESTDTPAG ve 99m Tc-Res-ESTDTPAG bileşiklerinin zamanla dağılımı...108 4.59 Pankreasdaki 99m Tc-ESTDTPAG ve 99m Tc-Res-ESTDTPAG bileşiklerinin zamanla dağılımı...108 4.60 rgan / Kas oranı...110 4.61 rgan / Kan oranı...111 4.62 99m Tc-ESTDTPA ve 99m Tc-Res-ESTDTPA bileşiklerine ait Beyin / Kan oranı... 114 4.63 99m Tc-ESTDTPAG ve 99m Tc-Res-ESTDTPAG bileşiklerine ait Beyin / Kan oranı...114 4.64 99m Tc-ESTDTPA bileşiğinin verildiği meme tümörlü sıçana ait sintigrafik görüntüler...118 4.65 99m Tc-ESTDTPAG bileşiğinin verildiği meme tümörlü sıçana ait sintigrafik görüntüler...119 4.66 99m Tc-ESTDTPAG bileşiğinin verildiği kontrol grubu sıçana ait sintigrafik görüntüler...120 4.67 99m Tc-ESTDTPA bileşiğinin tümörlü dokudaki tutulumu...121 4.68 99m Tc-ESTDTPAG bileşiğinin tümörlü dokudaki tutulumu...121
22 ŞEKİLLER DİZİNİ (Devam) Şekil Sayfa 4.69 β-estradiol. DTPA. ESTDTPA ve ESTDTPAG bileşikleri ve homoestradiol halkasına ait molekülün ACD / LogP Algorithm programı ile hesaplanan teorik lipofilite değerlerinin HPLC sisteminde sıralanışı....123
23 ÇİZELGE DİZİNİ Çizelge Sayfa 4.1 HPLC yönteminde uygulanan kromatografik koşullar 57 4.2 ESTDTPA bileşiğine ait 13 C-NMR (DMS) teorik ve deneysel δ (ppm) değerleri. 68 4.3 ESTDTPA bileşiğine ait 1 H-NMR (DMS) teorik ve deneysel δ (ppm) değerleri 69 4.4 ESTDTPA ve ESTDTPAG bileşiklerine ait çeşitli fragmanların FAB MS spektrumlarındaki gözlenen m/z değerleri... 4.5 99m Tc ile işaretli bileşiklerin TLRC yöntemi ile R f değerleri. 4.6 99m Tc ile işaretli bileşiklerin kağıt elektroforezi sonuçları. 4.7 Albino Wistar Sıçanlarda 99m Tc-ESTDTPA ın biyodağılım verileri... 4.8 Albino Wistar sıçanlarda 99m Tc-ESTDTPAG bileşiğinin 75-76 79 87 94 biyodağılım verileri. 95 4.9 Reseptör doyurma işleminden sonra verilen 99m Tc-ESTDTPA bileşiğine ait ( 99m Tc-Res-ESTDTPA) biyodağılım verileri... 98 4.10 Reseptör doyurma işleminden sonra verilen 99m Tc-ESTDTPAG bileşiğine ait ( 99m Tc-Res-ESTDTPAG) biyodağılım verileri... 100 4.11 Varyans analizi sonucuna göre bu organlara ilişkin P değerleri ve korelasyon katsayısı (r) değerleri. 112
24 RESİMLER DİZİNİ Resim Sayfa 4.1 99m Tc ile işaretli ESTDTPAG bileşiğinin verildiği meme tümörlü sıçan görüntüsü...124 4.2 99m Tc ile işaretli ESTDTPA bileşiğinin verildiği meme tümörlü sıçan görüntüsü...125
25 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama 99m Tc-Res-ESTDTPA 99m Tc-Res-ESTDTPAG Reseptör doyurma işlemi sonrası verilen 99m Tc- ESTDTPA bileşiği. Reseptör doyurma işlemi sonrası verilen 99m Tc- ESTDTPA bileşiği. Kısaltmalar ER Estrojen Reseptör. ER α Estrojen Reseptör Alfa. ER β Estrojen Reseptör Beta. 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance. 13 C-NMR Carbon Nuclear Magnetic Resonance. D. E. Ü. Dokuz Eylül Üniversitesi. E. Ü. Ege Üniversitesi.
26 1. GİRİŞ Son yıllarda çeşitli araştırma gruplarınca radyonüklidlerle işaretli estrojen bileşiklerinin meme kanseri hücrelerinin teşhis ve tedavisinde kullanılmasını kapsayan bir çok çalışma yapılmıştır (DeSombre, 1993; Hughes et al., 1993; Katzenellenbogen, 1995; Carmen et al., 1996; Delpassand et al., 1996; Gustafsson, 1998; Jurisson and Lydon, 1999; Kabalka et al., 2000; Skaddan et al., 2000; Sasaki et al., 2000; Silva et al., 2001; Enginar et al., 2002; Lashley et al., 2002; Ünak et al., 2002). Meme kanseri hem dünyada hem de ülkemizde en yaygın kanser çeşitlerinden biridir. Erken teşhis ve tedaviye rağmen ölüm oranı halen çok yüksektir. Gelişmiş ülkelerde her 8 kadından birisi meme kanseri riski taşımaktadır. Meme kanserinin erken teşhisi yapılabildiği takdirde ilk beş yıl içerisinde ölüm yüzdesi % 4, kanser aynı bölge içerisinde yayılmışsa bu oran % 25 ve vücudun diğer organlarına atlamışsa ise bu oran % 80 lere kadar çıkmaktadır (Skaddan et al., 2000). Ancak bu alanda görüntüleme ve tedavi amacıyla geliştirilen radyofarmasötik kullanımı da günden güne artmaktadır. Gerek görüntüleme, gerekse terapi amacıyla uygun radyofarmasötiklerin geliştirilmesi için uygun taşıyıcı moleküllerin tasarlanması, sentez edilmesi ve uygun radyonüklidlerle işaretlenmesi gerekir. Öte yandan, tanı ve tedavi amacıyla kullanılan radyonüklidlerden beklenen özellikler de birbirinden farklıdır. Son yıllarda hormonların insan meme kanseri üzerindeki etkileri hakkında oldukça detaylı bilgiler elde edilmiştir (DeSombre, 1993). Estrojen bileşikleri tıpta çeşitli amaçlarda kullanılmaktadır. Estrojen reseptörü içeren hücreler estrojen reseptor pozitif (ER+), içermeyenler ise estrojen reseptör negatif (ER-) olarak adlandırılır. Kanser hücrelerinin (ER+) veya (ER-) olduğunun bilinmesi tedavi planlaması açısından önemlidir. Ayrıca (ER+) hücrelere yönelebilen ligandlar terapi için uygun radyonüklidlerle işaretlendiğinde terapi radyofarmasötiği olarak, görüntüleme için uygun
27 radyonüklidlerle işaretlendiklerinde de bir radyofarmasötikten beklenen özellikleri gösteriyorlarsa, görüntüleme radyofarmasötiği olarak kullanılabilmektedirler. Meme kanseri tümörlerinin yaklaşık olarak % 60-70 i estrojen reseptörü içermektedir. Bu nedenle, yeni estrojen reseptör spesifik radyofarmasötiklerin geliştirilmesi oldukça önemlidir. Yüksek ER bağlanma oranına sahip estradiol türevleri potansiyel meme görüntüleme ajanı olarak bilinmektedir. Radyonüklidlerle işaretli estrojen bileşikleri ile ilgili literatürde çeşitli çalışmalar mevcuttur. Çoğunlukla, 99m Tc, 123 I, 18 F gibi radyonüklidlerle işaretli bu bileşikler görüntülemede etkindirler (Hughes et al., 1993; Carmen et al., 1996; Mankoff et al., 2000; Van de Wiele et al., 2000; Mortimer et al., 2001). Erken teşhisle birlikte meme tümörünün estrojen reseptörlerinin pozitif veya negatif olduğunun belirlenmesi de ne tür bir tedavinin yapılacağı konusunda fikir verebilmektedir (DeSombre, 1993; Huges et al., 1993; Sasaki, et al., 2000; Skaddan et al., 2000). Çok sayıda araştırmacı, estrojen türevlerinin sentezi ve bunların uygun radyonüklidlerle, örneğin 123 I, 125 I, 131 I, 111 In, 99m Tc, 186 Re, 188 Re, 18 F, 11 C ile, işaretlenmesi ve radyofarmasötik potansiyellerinin incelenmesi üzerinde çalışmalar yapmışlardır (Katzenellenbogen, 1995; Delpassand et al., 1996; Gustaffson, 1998; Jurisson and Lydon, 1999; Van de Wiele et al., 2000; Varagnola et al., 2000; Mortimer et al., 2001; Enginar vd., 2002; Mull et al., 2002; Ünak vd., 2002). Sasaki ve grubu, 16-α(F-18)-floro-17-β-estradiol un meme kanserli sıçanlardaki emilimini ve biyodağılımını araştırmıştır (Sasaki et al., 2000). Radyoiyodlu 16α iodoestradiol bileşiği hormon cevaplı meme tümörlerinde estrojen reseptörü için bir izleyici olarak kullanılmıştır (Jurisson and Lydon, 1999; Van de Wiele, 2000). Benzer çalışmalar 16α-[ 18 F] fluoroestradiol ile de sıçanlar üzerinde yapılmıştır (Adrion, 1992; Sasaki et al, 2000).
28 Radyokimyacılar, 99m Tc ile işaretli steroid reseptör ligantları ile ilgili çalışmalarda ilerleme kaydedildiğini rapor etmişlerdir (Gustafsson, 1998; Hunter et al., 2000; Skaddan et al., 2000; Mease and Lambert, 2001; Enginar et al., 2002; Ünak vd., 2002). Bu şekilde, moleküler nükleer tıp teknikleri kullanılarak yeni görüntüleme prosedürleri ile hastalığın özelliği hakkında daha kesin bilgi elde edilecek ve meme, prostat türü kanserlerin tedavisinde ilerleme kaydetme imkanı olacaktır. Hormon agonist ya da antagonist kökenli ilaçlar meme ve prostat kanserlerinin gelişimini düzenlemede etkindirler (Katzenellenbogen, 1995). Günümüzde farklı disiplinlerdeki bilim adamları ilgilerini, kanser kemoterapisi için yeni anti kanser ilaç çalışmalarına yoğunlaştırmışlardır. İlaç tasarımındaki temel hususlar prodrug kavramını içermektedir. Prodrug bir anti kanser ilaç gibi tek başına aktif olmayan ancak uygulama sonrası aktif bir forma dönüşebilen kimyasal ajan anlamına gelmektedir. Prodruglar çeşitli enzimler vasıtasıyla tümör hücreleri üstünde aktivitelerini gösterebilirler. Bu koşullarda β-glukuronidaz lar ile glukuronid türevi prodrugların aktivasyonu kanser kemoterapisinde oldukça önemli bir uygulama potansiyeline sahiptir. Etkin bir anti kanser prodrug, radyotoksik etkileri olan (Auger ve alfa-yayıcı radyonüklidler gibi) bir radyonüklidle işaretlenebilmelidir. 125 I veya 211 At ile işaretli glukuronid prodruglar ise kanser kemoterapisinin gelecekteki uygulamalarında çok etkili anti kanser ajanların dizayn edilmesinde ümit vaadetmektedir (Ünak, 2000). Estrojen glukuronid ile ilgili bazı çalışmalar olmasına rağmen, radyofarmasötik haline getirilebilecek estrojen türevi radyonüklid işaretli glukuronid bileşikleri ile ilgili çalışmalara literatürde rastlanamamıştır. Glukuronid bileşiklerin radyofarmasötik haline getirilmesi ile ilgili olarak ise, az sayıda çalışma mevcuttur (Ünak ve Ünak, 1996; Ünak vd., 1997; Ünak, 2000; Ünak vd., 2003).
29 Meme kanserinin teşhisi ve tedavisinde radyoaktif olarak işaretli estrojen bileşikleri ile ilgili çeşitli çalışmalara rastlanmakla birlikte, glukuronid bileşiklerine ilişkin çalışmalara rastlanmamıştır (DeSombre, 1993; Hughes et al., 1993; Katzenellenbogen, 1995; Carmen et al., 1996;.Delpassand et al., 1996; Gustafsson, 1998; Enginar et al., 2002; Lashley et al., 2002; Ünak et al., 2002). Bu çalışmada ise, bir estradiol türevi olan deoksi demetil homoestradiolil dietilentriamin pentaasetik asit (ESTDTPA) bileşiği ve bu bileşiğin enzimatik yöntemle sentezlendiği deoksi demetil homoestradiolil dietilentriamin pentaasetik asit glukuronid (ESTDTPAG), 99m Tc ile işaretleyerek biyodağılım ve sintigrafi çalışmaları ile radyofarmasötik potansiyelinin incelenmesi amaçlanmıştır.
30 2. GENEL BİLGİLER 2.1 Hormon Nedir? Canlı organizmasında endokrin sistemde doku hücreleri arasındaki haberleşmeyi ve cevap oluşturulmasını sağlayan, organ ve dokularda fonksiyon düzenleyici bir etki meydana getiren, çok düşük miktarlarıyla görev yapan hareketli maddelere Hormon adı verilmektedir. Bu bileşikler amino asit, polipeptit, protein veya steroid yapıda olabilirler (Bingöl, 1978; Menteş ve Menteş, 1988). Bir hormonun etki ettiği doku hücresine Hedef Hücre, bu hücrelerin bulunduğu dokuya da hormonun Hedef Dokusu denir. Hedef hücre ve dokuda, hormonun bağlanabileceği spesifik moleküllere ise Hormon Reseptörü denmektedir. Hormonlar etki mekanizmalarını hedef hücrelerde bu reseptörlerle birleşerek gerçekleştirirler (Bingöl, 1978; Dündar ve Aslan, 1998). 2.1.1 Estrojenik hormonlar Steroid yapısındaki hormonların en bilineni estrojenik hormonlardır. Dişi üreme hormonu olarak overlarda sentezlendikten sonra salgılanan bu hormonların başlıcaları estradiol, estron ve estriol dür. Estradiol asıl hormon, estron ve estriol ise metabolik ürünler olarak gözükmektedir (Özgüç, 1971; Finar, 1975). Estrojenler karaciğerde glukuronatlar ve sülfatlarla konjugasyona uğrayarak ve diğer organlarda çeşitli etkisiz steroidlere çevrilerek idrarla dışarı atılırlar (Bingöl, 1978; Bilge, 1979).
31 Meme ve uterus estrojenin iki ana hedefi olmakla beraber, vücutta beyin, kemik dokusu, karaciğer, kalp ve merkezi sinir sistemi üzerinde de etkili hormonlardır (Enmark and Gustafsson, 1999; http://press2.nci.nih.gov). 2.1.2 Estrojen reseptörleri ve reseptöre bağlanma Estrojen bileşikleri genelde lipofilitesi yüksek olan yağlarda çözünen bileşiklerdir. Bu bileşiklerin estrojen reseptörlerince zengin olan uterus, over, meme gibi dokulardan başka karaciğer, akciğer, yağ dokusu, pankreas, dalak gibi dokularda yüksek oranda biriktiği rapor edilmiştir (Delpassand et al., 1996; Hunter and Luyd, 2000; Enginar et al., 2002). Estrojen reseptörleri (ER) hücre çekirdeğinde bulunan büyük protein molekülleridir (DeSombre, 1993). ER α ve ER β olmak üzere iki şekli vardır. Her iki estrogen reseptörü de meme, uterus ve over gibi üreme sistemi organlarında, kemik, kardiovasküler sistemde ve çeşitli kanser hücrelerinde farklı oranlarda bulunurlar. Bunun yanısıra ER α, daha çok karaciğerde ER β ise gastrointestinal sistemde mevcuttur (Lashley et al., 2002). Steroid reseptör süper grup üyeleriyle (kortikosteroid, tiroid hormonu, retinoik asit ve vitamin D reseptörleri gibi) benzer yapı ve fonksiyonlara sahip olan estrojenler kan dolaşımı ile hücrelere girerek, estrojen reseptörü aramaya başlarlar (Couse and Korach, 1999; Nuhad and Gabriel, 1999; Klinge, 2000). Estrojenler, hücrede bağlanabilecekleri bir spesifik bölgeye sahip olan estrojen reseptörleri denilen kısmına bağlanarak hedef dokuda etki yapmaktadırlar. Bu moleküller kan dolaşımı içinde ve vücutta baştan başa hareket ettiklerinde, sadece estrojen reseptörü içeren hücrelerde etkilerini gösterirler (Nuhad and Gabriel, 1999; http//press2.nci.nih.gov). Bu etkileşim içinde hormon kilide uygun bir anahtar gibi, bir protein reseptöre bağlanarak "ligand-hormon reseptör kompleks" şeklini alır. Estrojenin
32 estrojen reseptörüne bağlanması sonucu ikili bir yapı oluşur. ER β ER α ya göre farklı ligand bağlanma alanına sahiptir. ER α meme ve beyin de daha çok bulunurken ER β uterus, kemik, karaciğer, damarlarda ve özellikle beyinde mevcuttur. Bağlanma hormon reseptörünü harekete geçirerek spesifik hücresel oluşumlara neden olur. Harekete geçen hormon reseptörü spesifik genlere yönelerek hücresel değişimlere sebep olur (Enmark and Gustafsson, 1999; Nuhad and Gabriel,1999; Savaskan et al., 2001; http://www.tmc.tulane.edu). Estrojen reseptörleri esasen hücrenin çekirdeğinde DNA molekülleri ile birlikte bulunmaktadırlar. Estrojen moleküllerinin yokluğunda estrojen reseptörleri inaktiftir ve DNA üzerinde etkisi yoktur. Fakat bir estrojen molekülü bir hücrenin çekirdeğine girdiği zaman, onun reseptörüne bağlanır ve reseptörün şekli değişir. luşan estrojen-reseptör kompleksi daha sonra spesifik DNA bölümüne bağlanarak Estrogen Response (Estrojen Cevaplı) eleman adını alır. Genlere yakın yerleştikleri için estrojenlerce kontrol edilirler. Estrojen reseptör kompleksinin koaktivator proteinlere bağlandığı zaman ise daha yakın genler aktif hale geçerek, messenger (haberci) RNA moleküller üretilir. RNA molekülleri spesifik proteinlerin sentezine rehberlik ederler (Klinge, 2000; http//press2.nci.nih.gov).
33 Şekil 2.1 Bir estrojen molekülünün hücre içindeki yeri (http//press2.nci.nih.gov). Şekil 2.2 Estrojen ve reseptör etkileşimini, şekil 2.3 ise ER α ve ER β reseptörlerinin vücuttaki dağılımını göstermektedir.
34 Şekil 2.2 Estrojen ve estrojen reseptörü etkileşimi (http//press2.nci.nih.gov).
35 Şekil 2.3 ER α ve ER β reseptörlerinin vücuttaki dağılımı (http//press2.nci.nih.gov). 2.1.3 Estradiol hormonu Estradiol hormonunun kadınlarda ve erkeklerde beyin, deri, mesane gibi birçok doku üzerinde etkili olmasının yanısıra uterus, meme ve endometrium üzerine oldukça olumsuz etkileri vardır. Estrojenin kadınlarda kemik korunumu için gerekli olduğu uzun süredir bilinmektedir. Özelllikle menopoz sonrası dönemde uterus ve meme için istenilmeyen etkileri bir yana bırakılacak olursa, estrojen in agonistik etkisi kemik korunumu ve beyin fonksiyonu için önemli bir gereksinimdir (Gustafsson, 1998). Yapılan bazı deneysel hayvan çalışmaları 17β-estradiol ün kadınlarda hafıza fonksiyonlarını geliştirdiğini göstermiştir (Brinton, 1999). Şekil 2.4 Estradiol ün moleküler yapısını göstermektedir.
36 Şekil 2.4 Estradiol bileşiğinin moleküler yapısı (Khalid et al., 2002). Diğer estrojen türevlerinin yanı sıra, Estradiol en çok bulunan ve fizyolojik bakımdan en etkili estrojen hormonudur. 17β-Estradiol, kolesterol den türemiş olup over tarafından salgılanan en önemli estrojenik steroiddir (Bilge, 1979; Constanti et al., 1998; Couse and Korach, 1999; http://www.tulane.edu). İki tür steroizomerik estradiol (α, β) vardır. Bunlardan biri β-estradiol (Estradiol-17α; erime noktası: 222 0 C), bir diğeri ise α-estradiol (estradiol-17β; erime noktası: 178 0 C) dır. α-izomeri diğerine göre daha kuvvetlidir. Estradiol- 17β ilk olarak estron un indirgenmesiyle elde edilmiş olup daha sonra domuz overlarından izole edilmiştir. Estradiol-17β estron a göre daha aktiftir (Finar, 1975). 2.1.4 Estrojen ve kanser Prostat, endometrial ve meme kanseri gibi kanser türlerinin gelişiminin endokrin kontrolü altında olduğu bilinmektedir (Dickson and Lippman, 1987).
37 Estrojenik hormonların başlıca etkileri: 1. Cinsel gelişim için ergenlik çağında uterus, meme ve vajina nın gelişimini harekete geçirmek, 2. Erişkinlik döneminde menstrual çevrimi düzenlemek (özellikle hamilelik ve emzirme döneminde), 3. Kolesterol üretimini kontrol etmek, 4. Kemik korunumunu sağlamaktır. Estrojenik hormonların meme ve uterus içinde hızlı bir hücre çoğaltma yeteneğine sahip olması en olumsuz etkisi olarak bilinmektedir. Hücre çoğalmayı uyaran bu yeteneği, meme ve uterus kanseri şansını da arttırmaktadır (Constanti et al., 1998; http//press2.nci.nih.gov). 2.1.5 Estrojen ve meme kanseri Meme tümörü için endokrin tedavisine ait ilk doküman 1895 yılına ait olup tedavinin etkinliği açık değildir. Bugün tüm meme kanser hücrelerinin yaklaşık olarak 1/3 nün gelişiminin situmule edilebileceği bilinmektedir. Bu da estrojen reseptörüne (ER) estrojenlerin bağlanmasıyla olmaktadır (Smith et al., 2000). Dünyada her yıl yaklaşık olarak 1 milyon kadın meme kanserine yakalanmakta olup 400.000 kişiden daha fazla sayıda kişi bu hastalıktan ölmektedir (Lebwohl and Canetta, 1999; Nuhad and Gabriel, 1999). Meme kanseri kadınlar arasında görülen en yaygın kanser türüdür. Kanser vakalarının tümünün % 24 ü olarak bilinmektedir. Bu hastalığın metastaza eğiliminden dolayı Avrupa topluluğunda her yıl 184.300 yeni vakaya tekabül etmektedir. Amerika da yaşayan kadınlarda yaklaşık olarak yılda 44.000 ölüm olayı meme kanseri yüzündendir. Bu hastalık ile ilgili araştırmalar üç ana grupta toplanmaktadır:
38 a) Deneysel hayvan çalışmalarında (sıçan, fare) tümör oluşturma, b) Epidemiolojik olarak risk faktörleri almak (veriectomy koruyucu etkisi ve genç kadınlarda düşük önlemede diethylstilbestrol takviyesiyle meme kanseri riski artışı), c) Meme kanseri hücresi oluşumunda estrojenlerin mitojenik etkisi ve meme kanseri tedavisinde anti estrojenlerin etkisi. Ayrıca besinsel faktörlerin de meme kanserine sebep olabileceği ileri sürülmüştür. Meme kanseri tümörlerinin % 60-70 i (ER+) pozitif tümörlerdir (Van de Wiele et al., 2000). İnsan meme kanserlerinin % 65 inde estrojen reseptörleri mevcuttur. Bu reseptörlerin varlığı hormonal ve kimyasal terapatik ölçümlerde önemli bir rol oynamaktadır (Jurisson and Lydon., 1999). 2.1.6 Fitoestrojenler doğal ve sentetik çevresel hormonlar Estrojen hormonu gibi davranan doğal bitki bileşikleri olan fitoestrojenlerin değişik ülkelerde kanser üzerine yapılan birçok çalışmada meme, uterus ve prostat kanserine karşı koruma amaçlı bir potansiyele sahip oldukları ileri sürülmektedir. Özellikle, soya fasulyası ve soya ürünleri tüketiminin yüksek olduğu Asya ülkelerinde meme, uterus kanseri oranının, menopoz semptomları ve osteoporosis dağılımının batıya oranla daha düşük olduğunu ileri süren bir çok araştırma raporu yayınlanmıştır (http://www.som.tulane.edu). Bitki kökenli estrojen bileşikleri (soya fasulyası gibi) ER ye bağlanabilirler ve fitoestrojenler olarak bilinirler. Hem agonist, hem de antagonist e etkiye sahip olduklarından Selective Estrogen Receptor Modulator (SERM) olarak adlandırılırlar. Çünkü ER α ve ER β ya farklı bağlanma etkileri
39 vardır. Klinik potansiyellerine dair kontrollü çalışmalar halen sürdürülmektedir (Nuhad and Gabriel, 1999). 2.1.7 Radyonüklid işaretli estrojenler ile yapılan metabolik çalışmalar Estrojen progestin ve androjenlerin çeşitli analogları reseptör bağlanma eğilimi ve seçiciliği için radyoaktif olarak işaretlenerek in vitro ve in vivo çalışmalarda kullanılmıştır (Katzenellenbogen, 1995). Radyofarmasötik kimya alanı hormon cevaplı meme kanserini görüntülemede Single-Photon ya da Positron Emitting yöntemleri ile estradiol türevlerinin gelişimine ışık tutmuştur. En iyi ajanlar olarak 123 I, 11 C, 18 F olup 3 H, 14 C ile işaretli estrojenler ve 11 C ile işaretli steroidlerle yapılan çalışmaların daha iyi sonuçlar verdiği görülmüştür. Steroidler arasında radyoaktif olarak işaretli türevlere ait çalışmalar dikkat çekmektedir. Steroid hormonları için en önemli proses metabolik transformasyondur. Prosesin 1. safhası indirgeme-yükseltgeme ve hidroliz, 2. safhası konjugasyon reaksiyonlarını kapsar. Metabolik çalışmalar sıçan, köpek, domuz ve insanlar üzerinde denenmekte olup farklı farmakokinetik ve metabolik profiller elde edilmektedir (Adrion, 1992). Hedef dokudaki α-estrojen reseptör ün (ER α ) bağlanma karekteristiğine ilişkin olarak çeşitli radyoaktif olarak işaretli steroidal ve nonsteroidal estradiol türevler sentezlenmiş ve bunların in vivo olarak canlılarda klinik kullanımı ve görüntüleme potansiyeli değerlendirilmiştir (Van de Wiele et al., 2000). Estrojen pozitif lezyonlarını görüntüleme de kullanmak için 111 In-DTPA- Tamoxifen bileşiği üzerine çalışılmış ve bu bileşiğin meme tümörü gelişimini azaltabileceği sonucuna varılmıştır (Delpassand et al., 1996). 4-Hydroxytamoxifen-DTPA ligandı (HTam-DTPA) sentez edilmiştir. Anti estrojen terapisi ER ile zengin dokuları etkilediği bilinmektedir (Lashley et al., 2002).
40 99m Tc-DTPA ve 111 In-DTPA gibi bileşikler böbrek akışı ölçümünde kullanılabilirler (Kowalsky and Perry, 1987; Banerjee et al., 2001; Arano, 2002). DTPA türevlerinin diğer uygulama alanlarından biri de antibody ve peptidlerdir (Bruland, 1995; Liu and Edwards, 1999; Saji, 1999). 2.1.8 Radyoaktif olarak işaretli halojenli türevi estradioller Klinik olarak estradiol için halojenli substitüentlerin kullanımı 16α-bromo, iyodo estradiol ve floroestradiol bileşiklerini içermektedir. Meme kanserindeki estradiol seviyeleri normal meme dokusundaki mevcudiyetine göre daha yüksektir. Meme tümörleri için radyoaktif izleyiciler olarak estradiol (steroidal) ve hexestrol (nonsteroidal) bileşiklerinin halojenürlü türevleri estrojen reseptör kökenli radyofarmasötikler olarak meme tümörlerini görüntülemede kullanılmaktadır (Katzenellenbogen, 1995; Van de Wiele et al., 2000; Mortimer et al., 2001). Estrojen pozitif insan meme tümörleriyle ilgili olarak geçmiş yıllardan beri 17α iyodovinil-estradiol türevleri ile çalışılmıştır (Cummins,1993; Kabalka et. al., 2000; Silva et al., 2001). Tümör reseptörlerinin varlığı tümör görüntüleme ajanı olarak radyoaktif olarak işaretli hormonların selektif tutulumu için bir mekanizma sağlar. Reseptör görüntüleme reseptörün fonksiyonel statüsü ve seviyesini tayin etmede yararlı olmakta ve tümörün lokalizasyonu hakkında bilgi vermektedir. Estrojenlerin çeşitli halojenli türevleri, meme kanserini görüntülemede ER kökenli radyofarmasötikler olarak değerlendirilmişlerdir (Mankoff et al., 2000). 18 F, 123 I ve 125 I steroid reseptör kökenli radyofarmasötiklerin hazırlanmasında çok sıklıkla kullanılan radyonüklidlerdir. Özellikle, yüksek spesifik aktiviteli çeşitli 18 F işaretli estrojenler sentezlenip deneysel hayvanlarda test edilmiştir (Skaddan et al., 2000). Estrojen reseptör pozitif meme tümörlerini
41 görüntülemede 16α-[ 18 F]floroestradiol-17β (FES) kapsamlı olarak kullanılmaktadır. Bunun yanısıra, aynı klinik amaç ile 17α [ 123 I]iyodovinil-11βmetoksiestradiol bileşiği ile de çalışılmıştır (Hughes et al., 1993; Carmen et al., 1996; Mankoff et al., 2000). Hem in vitro hem de in vivo deneysel çalışmaların sonucundan hareketle, tüm enzimlerin estrojenin ER pozitif hücrelerinin kontrolü altında olduğu rapor edilmiştir (Van de Wiele et al., 2000). In vivo olarak ER α konumunun ölçümü ve canlı meme kanserinde radyoaktif olarak işaretli estradiol türevi bileşikler ile yapılan görüntüleme çalışmaları halojenli estradiol-17β ve vinilestradiol türevleriyle sınırlı kalmıştır. Katzenellebogen ve arkadaşlarınca 16α- [ 77 Br]bromoestradiol-17β bileşiğinin sıçanlar üzerine biyodağılım çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca, bir başka çalışmada 16α-[ 125 I]iyodoestradiol-17β ve 123 I ile çalışılmış ve estradiol ün ( 125 I)-işaretli vinil türevleri ilk kez Hanson ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir (Van de Wiele et al., 2000). 2.1.9 99m Tc ile işaretli estrojen bileşikleri Steroid reseptör ligandlarını 99m Tc ile işaretlemek, 99m Tc nin 99 Mo jeneratörlerinden düşük maliyetle elde edilmesi, geleneksel gama kamera sistemleri ve SPECT cihazlarıyla yüksek kalitede görüntü sağlandığı için tercih edilmektedir. Öte yandan şelat yapıcı bir gruba bağlı olan 99m Tc ile işaretli moleküller kararlı bileşiklerdir. Estrojenlerin çeşitli analogları radyoaktif olarak işaretlenebilirler ve reseptör bağlama eğilimi için in vivo ve in vitro olarak değerlendirilmektedirler (Katzenellenbogen,1995; Mortimer et al., 2001). 99m Tc ile işaretli Tamoxifen bileşiği N 2 S 2 bifonksiyonel şelatlayıcı ajan ile konjuge edilerek meme kanseri için bir görüntüleme ajanı üretilmiştir (Hunter, 2000).
42 99m Tc radyonüklidi 6 saatlik yarı ömrü ile ideal bir görüntüleme ajanıdır. Tüm teknesyum izotopları radyoaktif olup renyum un benzer kimyasal ve fiziksel özellikleri nedeniyle de teknesyum ile işaretli bileşikler geniş çalışma alanı bulmaktadır. Meme kanseri tedavisi için yeni birçok radyoterapatik ajanlar üzerinde çalışılmış olup bunlardan biri de cyclopentadienyl tricarbonyl metal [CpMet(C) 3, Met=Re, 99mTc] bileşiğidir (Mull et al., 2002). Bir başka çalışmada ise, 99m Tc-ESTCPTA bileşiği sentezlenerek ER ce zengin doku olan uterus içinde tutulumun yüksek olduğu, (ER-) dokularda ise tutulumun düşük olduğu sonucuna varılmıştır (Enginar vd., 2002). Ünak ve arkadaşları tarafından 3,17-α-estradiolyl propyl 1,4,8,11- tetraazacyclotetradecanyl-1-(4-methylbenzoic acid) ester (ESTCPTA) bileşiğinin Albino Wistar sıçanlardaki biyodağılımı incelenmiş ve 99m Tc-MIBI ile karşılaştırılmıştır (Ünak vd., 2002). 99m Tc ile işaretli ajanlar tümör hücrelerindeki ER statülerinin belirlenmesinde önemlidirler. Estradiol 7α pozisyonunda 99m Tc ile işaretlenerek, sentez sonucu oluşan kompleksin ER için bağlanma eğilimi araştırılmıştır (Skaddan et al., 2000).
43 2.2 Teknesyum Kimyası 2.2.1 Teknesyum un kimyasal özellikleri Teknesyum yunanca technetos yapay anlamına gelmekte olup 1937 yılında, Italya da Carlo Perrier ve Emilio Segre tarafından Molibden in siklotronda hızlandırılmış 5 MeV döteronlarla bombardıman edilmesiyle keşfedilmiş olup 43 numaralı ilk yapay elementtir (Berkem, 1992; http://www.wikipedia.org). 1962 de 99 Tc Afrika da 238 U in spontaneous fisyon ürünü olarak çok küçük miktarda izole edilmiştir. Teknesyum un kimyası renyum ile manganez arasındadır. Gümüş gri metalik görünümündedir. Kristal yapısı hekzagonaldir. Teknesyum hidroklorik asitte çözünmezken nitrik asit ve konsantre sülfürik asitte çözünmektedir. Kararlı izotopu yoktur. Ancak üç tane uzun yarı ömürlü radyoizotopu vardır. Bunlar 97 Tc (T1/2 =2.6 x 10 6 yıl), 98 Tc (T1/2 = 4.2 x 10 6 yıl) ve 99 Tc (T1/2 = 2.1 x 10 5 yıl) dır. Bununla birlikte en fazla kullanılan izotopu ise 99m Tc dir (T1/2 = 6.01 saat). En yaygın oksidasyon düzeyleri +2, +4, +5, +6 ve +7 dir. Temel düzeydeki nötral teknesyumun elektronik yapısı [Kr]4d 6 5s 1 şeklinde olup V. Periyot VII B Grubunda yer almaktadır. En kararlı yapısı ise IV ve VII değerlikleridir. Genel olarak perteknetat ( 99m Tc4 - ) şeklinde bulunur. 99 Mo / 99m Tc jeneratöründe elde edilen sodyum perteknetat 99m Tc nin en basit ve en kararlı bileşiğidir (Sampson, 1999; Enginar, 2002; http://www.wikipedia.org).
44 2.2.2 99 Mo 99m Tc jeneratörü 99 Mo / 99m Tc jeneratörü cam bir kolon içerisinde bulunan alüminyum oksit (Al 2 3 ) üzerine adsorbe edilmiş fisyon ürünü 99 Mo içerir. 99 Mo nun kendiliğinden bozunması sonucunda oluşan 99m Tc, % 0.9 luk NaCl çözeltisinin geçirilmesi ile sodyum perteknetat (Na 99m Tc 4 ) çözeltisi şeklinde elde edilir. 99m Tc - 4 iyonları zayıf bağlandıkları için kolondan kolayca uzaklaştırılmaktadır. Sodyum klorür çözeltisi izotonik, steril, apirojen, parenteral enjeksiyona hazır, berrak ve renksizdir. 99 Mo / 99m Tc jeneratörü bu radyonüklidin rutin analizlerde uygulanabilirliğini sağlamaktadır (Jurisson et al., 1999; Mease and Lambert, 2001; http://monrol.com.tr; http://www.lunis.luc.edu). 99 Mo / 99m Tc jeneratörü, teknesyumu perteknetat formu içinde en yüksek oksidasyon değeri olan +7 şeklinde sağlar. 99m Tc radyofarmasötikleri perteknetatın indirgenmesiyle hazırlanırlar. Hazırlanan teknesyum komplekslerinin kararlılığı radyofarmasötik performansı etkileyebilir (Sampson, 1999; Mease and Lambert, 2001). 99 Mo 99m Tc jeneratörü kalite kontrolü sonunda aşağıdaki koşulların sağlanması gerekmektedir: Radyoaktif saflık: > % 99.9 99m Tc, 99 Mo / 99m Tc < % 0.1 Konsantrasyon : ~ 10-9 M 99m - Tc 4 Radyokimyasal saflık: > % 95 99m Tc - 4 (ITLC ile) Al +3 içeriği: < 10 µg/ml (kolorimetrik test ile) ph : 4.5-7.5 (http://www.3.sympatico.ca) Şekil 2.5 99m Tc un bozunma şeklini içermektedir.
45 Şekil 2.5 99m Tc un bozunma şeması (http://www-nds.iaea.or.at/ndsout/99tc_mird.html). 2.2.3 99m Tc-radyofarmasötiklerle klinik uygulamalar Yeni radyofarmasötiklerin gelişimi in vivo biyokimya komplekslerine oldukça artan, önemli anlayışlar kazandırmıştır (Sampson, 1999). Teknesyum kısa yarı ömrü, düşük maliyeti, mükemmel görüntüleme özellikleri, 140 kev lik γ ışını enerjisi ve yüksek spesifik aktivitesi ile pek çok biyolojik aktivitesi olan bileşiğin işaretlenmesinde sıklıkla kullanılmaktadır.
46 İşaretleme bifonksiyonel şelatlar (DTPA, N 2 S 2, N 3 S gibi) ve direk işaretleme yöntemleriyle gerçekleştirilir (Fishman et al., 1993; Jurisson et al., 1999). Yarılanma süresi 6 saat gibi kısa bir süre olduğu için hastaya yüksek dozlar vermeden rölatif olarak geniş doz miktarları (20-30 mci) uygulanmasına izin verir (Qaim, 2001). Ayrıca bu süre 99m Tc ile işaretli radyofarmasötiklerin sentezi, kalite kontrolü ve görüntüleme çalışmaları için de yeteri kadar uzundur (Mease and Lambert, 2001). Nükleer medikal prosedürlerin % 80 inden SPECT ile elde edilen 99m Tc ile ideal görüntüleme alınır. Jenaratörden elde edilen 99m Tc kolay üretilir ve spesifik aktivite değeri yüksektir. Ürün direkt olarak biyomolekülleri işaretlemede kullanılır (Qaim, 2001). Jenaratörden elde edilen izotonik sodyum perteknetat çözeltisi tiroid, tükrük bezleri ve ektopik gastrik mukoza sintigrafisinde, meckel divertikülü ve Barrett özafagus u incelemelerinde, artrosintigrafi çalışmalarında, göz yaşı yolu sintigrafisinde, indirgeyici ajanlar kullanılarak kırmızı kan hücrelerinin işaretlenmesi sonrasında anjiyokardiyosintigrafide, anjiyosintigrafi uygulamalarında, kan havuzu çalışmalarında, çeşitli kimyasal ve biyolojik ajanlarla işaretlenerek yapılan sintigrafik çalışmalarıda ve 99m Tc ile işaretli radyofarmasötiklerin hazırlanmasında kullanılmaktadır (http://www.monrol.com.tr). 2.2.4 99m Tc ile işaretleme Genellikle 99m Tc komplekslerinin çoğu indirgeyici inorganik bir ajan olan SnCl 2.2H 2 tuzu yardımıyla kompleksleştirici ajan varlığında perteknetatı daha düşük değerliğe indirgemesi ile hazırlanır (Skaddan et al., 2000; Ertay vd., 2001; Zhang et al., 2001; Enginar, 2002; Enginar vd., 2002).
47 Bilinen diğer indirgeyiciler sodyum borhidrat, sodyum bisülfit, hidrazin, hidroklorik asit, metalik çinko, askorbik asit, molibden(iii), tungsten(iii), antimon(iii) tuzlarıdır (Sampson, 1999). 2.2.5. Teknesyum radyofarmasötiklerinde kullanılan kalite kontrol yöntemleri 2.2.5.1 İnce tabaka kromatografisi (TLC) Teknesyum radyofarmasötiklerinin kalite kontrolü için çeşitli kontrol prosedürleri geliştirilmiştir. Bu prosedürlerden biri hidrofilik kompleksler için genellikle kağıt ya da ince tabaka kromatografisi (Thin Layer Chromatography) (TLC) dir. Bunun yanısıra, kolon kromatografisi ve yüksek performanslı likit kromatografisi (HPLC), teknesyum radyofarmasötikleri için kullanılan diğer kalite kontrol yöntemleridir. İnce tabaka kağıt kromatografisi (TLC) basit, kolay uygulanabilir, çok kullanışlı olup ancak uzun sürmesi kısa yarı ömürlü radyonüklidler içeren radyofarmasötikler için dezavantaj teşkil edebilmektedir (Sampson, 1999). TLC plakaları, destek maddesi (alüminyum, plastik, cam gibi) üzerine bir adsorbanın (selüloz, silikajel ve alüminyum oksit gibi maddeler) kaplanmasıyla oluşmuştur. İnce tabaka şeridi orijinine mikrolitre düzeyindeki örnek uygulanarak içinde uygun bir çözgen bulunan tank içerisine batırılır. Çözgen çözünebilen radyofarmasötiklerin adsorban boyunca taşınmasını sağlarken durgun fazın elektrostatik çekim kuvvetleri safsızlıkların taşınmasını geciktirir. Bu etki kimyasal özelliklerin hareketli fazla farklı çözünebilirliğe sahip olmasından dolayı farklı hızlarda taşınmasına sebep olur. Böylece, adsorban boyunca radyofarmasötik ve radyokimyasal safsızlıklar ayrılmış olur. Bu radyokimyasalların farklı özelliklere sahip olmaları nedeniyle durgun ve
48 hareketli fazlar arasındaki ilişkiye göre farklı dağılım gösterirler. Çoğunlukla kullanılan çözgenler; hekzan, kloroform, dietil eter, etil asetat, n-bütanol, aseton, izopropil alkol gibi organik maddelerdir. Bu çözgenler bir veya birkaç çözgenin bileşiminden oluşan sistemler de olabilir. İstenilen mesafeye TLC şeritinde çözgen taşındıktan sonra, şerit tanktan çıkarılarak oda sıcaklığında kurutulup orijinden itibaren 5 mm parçalar halinde kesilir ve her bir parça sintilasyon detektörü ile sayılır. Her bir radyokimyasal bileşenin taşınım mesafesi R f (relative front) değeriyle ifade edilir. Bu mesafeler orijinden çözücünün gittiği nokta ve radyokimyasal bileşenlerin konsantre olduğu mesafe orijinden ölçülerek gerekli şekilde tespit edilir. Radyokimyasal bileşenin ilerlediği uzaklık Rf = ----------------------------------------------------------------- Çözgenin ilerlediği uzaklık Tespit edilen Rf değerleri radyofarmasötiğin radyokimyasal saflığının hesaplanmasında önem taşırlar (Yurt, 1998). 2.2.5.2. Kağıt elekroforezi Elektroforez yöntemi bir karışımı oluşturan bileşenlerden birinin iyonize olduğu, diğerinin olmadığı durumda iyonizasyon yükü ve kütlelerine göre elektriksel bir alanda çözelti içinde basit bir şekilde ayrılmaları ilkesine dayanan ve yaygın bir şekilde kullanılan bir ayırma tekniğidir. Elektrik alanında her bir iyon yüküne bağlı olarak iki kutuptan birine taşınacaktır. Negatif yüklü iyonlar pozitif yüklü 'anoda' taşınırken, pozitif yüklü iyonlar da negatif yüklü 'katot' a doğru taşınacak demektir. Herhangi bir kutba taşınmayanlar ise yüksüz