T. C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BALON ANJİYOPLASTİ UYGULANAN TAVŞANLARDA TAURİNİN LOX-1 RESEPTÖR EKSPRESYONU ÜZERİNE ETKİLERİ Farmakoloji Programı DOKTORA TEZİ Uzman Eczacı Göksel GÖKÇE İZMİR 2008
T. C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BALON ANJİYOPLASTİ UYGULANAN TAVŞANLARDA TAURİNİN LOX-1 RESEPTÖR EKSPRESYONU ÜZERİNE ETKİLERİ Farmakoloji Programı DOKTORA TEZİ Uzman Eczacı Göksel GÖKÇE Danışman Öğretim Üyesi Prof. Dr. Zeliha KERRY İZMİR - 2008 İİI
İİİ II
İV
ÖNSÖZ Çalışmamın her aşamasında değerli bilgi ve yardımlarıyla beni yönlendiren ve destekleyen tez danışmanım değerli hocam, sayın Prof. Dr. Zeliha KERRY ye, Araştırmamın gerçekleşmesi için gerekli olanakları sağlayan değerli hocam, sayın Prof. Dr. Aslı ÖZER e, Çalışmamda kullandığım girişimsel yöntemi öğreten ve ilerleyen süreçte her açıdan desteğini aldığım değerli hocam, sayın Prof. Dr. İsmail ORAN a, Roma Üniversitesi Tıp Fakültesi Genetik Departmanı nda çalışma olanağını bana sağlayan ve çalışmadaki katkısı tartışma götürmez olan sayın Prof. Dr. Giuseppe NOVELLI ye ve Patoloji Departmanı ndaki çalışmalarımı bizzat yönlendiren sayın Prof. Dr. Augusto ORLANDI ye, Socrates/Erasmus Programı sürecindeki katkısı ve motive edici desteği için değerli hocam, sayın Doç. Dr. Metiner TOSUN a ve E.Ü. Rektörlüğü Uluslararası İlişkiler Ofisi ne, Projeyi destekleyen E.Ü. Rektörlüğü Araştırma Fonu na (05-ECZ-017), EBİLTEM e (2007-BİL-006) ve TÜBİTAK a (SBAG-K-70), Yararlandığım yurtdışı bilimsel araştırma bursu için Türk Farmakoloji Derneği ne, Laboratuvar çalışmalarımda bana yardımcı olan Yrd. Doç. Dr. Gülnur SEVİN e ve Araş. Gör. Dr. Gönen Ö. SÖZER e, teşekkürlerimi sunarım. İzmir 2008 Göksel GÖKÇE V
İÇİNDEKİLER 1 GİRİŞ VE GENEL BİLGİLER... 1 1.1 GİRİŞ...1 1.2 GENEL BİLGİLER...3 1.2.1 Oksijen Toksisitesi ve Serbest Radikaller (261)...3 1.2.1.1 Oksijen Molekülünün Radikal Özellikleri...3 1.2.1.2 Reaktif Oksijen Türlerinin Temel Özellikleri...5 1.2.1.3 Hücrede ROT Oluşumunun Gerçekleştiği Temel Bölgeler...7 1.2.1.4 Hücresel Yapılar ve Oksijen Radikalleri Arasındaki Reaksiyonlar...8 1.2.1.5 Membran Hasarı: Lipid ve Lipid Peroksi Radikallerinin Oluşumu...9 1.2.1.6 Protein ve Peptidler...10 1.2.1.7 DNA...11 1.2.2 Nitrojen Toksisitesi ve Nitrik Oksid...11 1.2.2.1 Nitrik Oksidin Oluşturduğu Direkt Toksik Etkiler...12 1.2.2.2 RNOT Toksisitesi...13 1.2.2.3 Fagositoz ve İnflamasyon Sırasında Serbest Radikallerin Oluşumu...14 1.2.2.4 NADPH oksidaz...15 1.2.2.5 Myeloperoksidaz ve HOCl...16 1.2.2.6 RNOT ve İnflamasyon...16 1.2.3 Oksijen Toksisitesine Karşı Savunma Mekanizmaları...17 1.2.3.1 Süperoksid Dismutaz...17 1.2.3.2 Katalaz...18 1.2.3.3 Glutatiyon Peroksidaz ve Glutatiyon Redüktaz...18 1.2.3.4 Glutatiyon...19 1.2.3.4.1.1 Hücre ve Plazmada Glutatiyon...20 1.2.3.4.1.2 Glutatiyon Biyosentezi...21 1.2.3.4.1.3 GSS ile GSH Sentezinin Düzenlenmesi...23 1.2.3.4.1.4 GSH Sentezinin Amino Asidler ile Düzenlenmesi...23 1.2.3.4.1.5 GSH nin Organlara Taşınması...25 1.2.4 Düşük Yoğunluklu Lipoproteinlerin Oksidasyonu...26 1.2.4.1 Okside LDL nin Aterojenik Özellikleri...27 1.2.4.2 LDL Oksidasyonun İn Vivo Kanıtları...28 1.2.4.3 Klinik Yaklaşım...29 1.2.4.4 Evrimsel Olarak Süpürücü Reseptörlerin Varolma Nedenleri...30 1.2.5 Süpürücü Reseptörler...31 1.2.5.1 SR-AI/II...33 1.2.5.2 Kolajen Yapılı Makrofaj Reseptörü...35 1.2.5.3 CD36...35 1.2.5.4 SR-BI/CLA-1...36 1.2.5.5 SR-CI...37 1.2.5.6 MAKROSİALİN/CD68...37 1.2.5.7 EHESR...37 1.2.5.8 LOX-1...38 1.2.5.8.1 Oks-LDL Reseptörü LOX-1'in Tanımlanması...38 1.2.5.8.2 İnsan LOX-1 Geninin Yapı, Düzenleniş ve Promoter Analizi...40 1.2.5.8.3 LOX-1 Proteininin Yapısı ve Fonksiyonu...42 1.2.5.8.4 LOX-1 Polimorfizmleri...44 1.2.5.8.5 LOX-1 Gen Ekspresyonunun Düzenlenmesi ve Mekanizmaları...45 1.2.5.8.6 Renin-anjiyotensin sistemi, dislipidemi ve LOX-1 ekspresyonu...46 1.2.5.8.7 Oksidatif Stres ve LOX-1 Ekspresyonu...47 Vİ
1.2.5.8.8 LOX-1'e bağlı hücre içi sinyal yolakları...48 1.2.5.8.9 LOX-1 in patolojik durumlarla ile ilişkisi...48 1.2.5.8.9.1 Ateroskleroz...48 1.2.5.8.9.2 Hipertansiyon...50 1.2.5.8.9.3 Tromboz ve Myokard İskemi Reperfüzyon Hasarı...501 1.2.5.8.9.4 Diabetes Mellitus...51 1.2.5.8.9.5 İnflamasyon ve İmmun Yanıt...522 1.2.6 Perkütanöz Transluminal Balon Anjiyoplasti (PTCA) ve Balon Hasarı...523 1.2.7 Bütiyonin Sülfoksimin ile in vivo Oksidatif Stres Oluşturulması...55 1.2.8 Taurin...556 2 DENEYSEL BÖLÜM... 589 2.1 DENEY HAYVANLARI...58 2.1.1 Deney Hayvanlarının Gruplandırılması...589 2.2 GEREÇ VE YÖNTEM...60 2.2.1 Balon Hasarının Oluşturulması...60 2.2.2 Kan Basıncı Ölçümleri...61 2.2.3 Kan Örneklerinin Alınması...62 2.2.3.1 İndirgenmiş Glutatiyon (GSH) Ölçümleri...62 2.2.3.2 Okside Glutatiyon (GSSG) Ölçümleri...64 2.2.3.3 Glutatiyon Peroksidaz Ölçümleri...656 2.2.3.4 Katalaz Ölçümleri...678 2.2.3.5 Malondialdehid (MDA) Düzeylerinin Ölçülmesi...689 2.2.4 Damar Dokularının İzolasyonu ve Fiksasyonu...70 2.2.4.1 İmmunohistokimyasal Boyamalar...701 2.2.4.2 Dokuların Parçalanması/Homojenizasyonu ve Protein İzolasyonu...712 2.2.4.3 Western Blot...723 2.2.4.4 Elektroforez ve SDS-PAGE...734 2.2.4.5 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)...789 2.2.4.6 RNA izolasyonu...81 2.2.4.7 Reverse Transkriptaz (RT)-PCR...81 2.2.4.8 Real-Time PCR (Kantitatif PCR)...81 2.2.5 Verilerin analizi...82 3 BULGULAR... 84 3.1 KAN BASINCI...845 3.1.1 Sistolik Kan Basıncı...845 3.1.2 Diastolik Kan Basıncı...856 3.1.3 Ortalama Arteriyel Basınç...867 3.1.4 Kalp Hızı...878 3.2 BİYOKİMYASAL PARAMETRELER...889 3.2.1 İndirgenmiş Glutatiyon (GSH)...889 3.2.2 Okside Glutatiyon (GSSG)...901 3.2.3 İndirgenmiş Glutatiyon (GSH) / Okside Glutatiyon (GSSG) Oranı...91 3.2.4 Glutatiyon Peroksidaz (GP)...92 3.2.5 Katalaz...923 3.2.6 Malondialdehid (MDA)...945 3.3 MORFOMETRİK ANALİZLER...956 3.3.1 Bağıl İntimal Yoğunluk ve Stenoz Yüzdesi...967 3.4 İMMUNOHİSTOKİMYASAL BOYAMALAR...100 3.4.1 Alfa-aktin Ekspresyonu...100 3.4.2 LOX-1 Ekspresyonu...100 Vİİ
3.5 LOX-1 EKSPRESYONU...105 4 TARTIŞMA... 1089 5 SONUÇ VE ÖNERİLER... 122 ÖZET... 126 ABSTRACT... 128 KAYNAKLAR... 130 ÖZGEÇMİŞ... 152 Vİİİ
TABLO LİSTESİ Tablo 1-1. Oksidatif stres ile ilişkilendirilen hastalıklar ve patofizyolojik değişimler... 4 Tablo 1-2. Reaktif oksijen türleri (ROT) ve reaktif nitrojen-oksijen türleri (RNOT)... 6 Tablo 1-3. Ateroskleroz tedavisinde olası hedefler... 30 Tablo 1-4. Süpürücü reseptörler... 33 Tablo 1-5. LOX-1 gen ekspresyonunda artışa neden olan in vivo ve in vitro uyaranlar... 46 Tablo 2-1. Çalışmada kullanılan ilaçlar ve üretici firmalar... 60 İX
ŞEKİL LİSTESİ Şekil 1-1. Oksijenin dört elektron indirgenmesi sonucu oluşan ürünler...5 Şekil 1-2. Serbest radikallerin neden olduğu hücresel hasar....9 Şekil 1-3. Lipid peroksidasyonu...10 Şekil 1-4. Nitrik oksid sentetaz (NOS) ve bir serbest radikal NO nun oluşumu...12 Şekil 1-5. NO dan reaktif nitrojen-oksijen türlerinin (RNOT) oluşumu...14 Şekil 1-6. Aktive nötrofillerin fagositoz sonrasında oluşturduğu solunumsal yıkım...15 Şekil 1-7. Serbest radikallere karşı hücresel savunmanın kompartmentalizasyonu....18 Şekil 1-8. Glutatiyon redüktaz...19 Şekil 1-9. Glutatiyon molekünün yapısı...20 Şekil 1-10. Glutatiyonun sentez edilişi ve kullanılışı...22 Şekil 1-11. Normal ve oksidatif olarak modifiye edilmiş LDL...28 Şekil 1-12. Ateroskleroz süreci....40 Şekil 1-13. LOX-1 mrna sı tarafından kodlanan LOX-1 proteininin domain yapısı....41 Şekil 1-14. İnsan LOX-1 inin temel yapısı....43 Şekil 2-1. Deney hayvanları ve uygulanan ilaçlar....60 Şekil 3-1.Tavşanlarda kronik BSO ve/veya taurin uygulamasının sistolik kan basıncı üzerine etkileri...85 Şekil 3-2. Tavşanlarda kronik BSO ve/veya taurin uygulamasının diastolik kan basıncı üzerine etkileri...86 Şekil 3-3. Tavşanlarda kronik BSO ve/veya taurin uygulamasının ortalama arteriyel basınç üzerine etkileri...87 Şekil 3-4. Tavşanlarda kronik BSO ve/veya taurin uygulamasının kalp hızı üzerine etkileri..88 Şekil 3-5. Tavşanlarda kronik BSO ve/veya taurin uygulamasının plazma GSH düzeyinde oluşturduğu etkiler...90 Şekil 3-6. Tavşanlarda kronik BSO ve/veya taurin uygulamasının plazma GSSG düzeyinde oluşturduğu etkiler...91 X
Şekil 3-7. Tavşanlarda kronik BSO ve/veya taurin uygulamasının plazma GSH/GSSG oranında oluşturduğu etkiler...92 Şekil 3-8. Tavşanlarda kronik BSO ve/veya taurin uygulamasının eritrosit GP düzeylerinde oluşturduğu etkiler...93 Şekil 3-9. Tavşanlarda kronik BSO ve/veya taurin uygulamasının kan katalaz düzeylerinde oluşturduğu etkiler...94 Şekil 3-10. Tavşanlarda kronik BSO ve/veya taurin uygulamasının MDA düzeylerinde oluşturduğu etkiler...95 Şekil 3-11. Tavşanlarda ilyak arterde balon hasarı oluşturulması sonrasında kronik BSO ve/veya taurin uygulamasının bağıl intimal yoğunluk üzerine etkileri...98 Şekil 3-12. Tavşanlarda ilyak arterde balon hasarı oluşturulması sonrasında kronik BSO ve/veya taurin uygulamasının stenoz yüzdesi üzerine etkileri...100 Şekil 3-13. LOX-1 mrna ekspresyonundaki artış...106 Şekil 3-14. LOX-1 protein düzeylerindeki artış....107 Xİ
RESİM LİSTESİ Resim 2-1. Tavşan ilyak arter (A) ve femoral arter (B) anjiyogramı...60 Resim 2-2. Branül yardımı ile femoral artere girilmesi...61 Resim 2-3. Balon kateterinin damar içerisinde kılavuz tel yardımı ile ilerletilmesi...61 Resim 3-1. Eozin ve hematoksilin ile boyanmış tavşan ilyak arter kesitleri....97 Resim 3-2. Neointimal hiperplazide α-aktin....100 Resim 3-3. İmmun olmayan keçi serumu (A) ve poliklonal LOX-1 antibody (B) ile boyanmış ilyak arter kesitleri (orijinal büyütme x4/0,1)....101 Resim 3-4. İmmun olmayan keçi serumu (A) ve poliklonal LOX-1 antibody (B) ile boyanmış ilyak arter kesitleri (orijinal büyütme x10/0,25)....102 Resim 3-5. LOX-1 e özgül antibody ile boyanmış balon hasarı oluşturulmamış (kontrol) ilyak arter kesiti...103 Resim 3-6. Plasebo grubuna ait ilyak arter kesitinde LOX-1 konumlanışı....103 Resim 3-7. Taurin grubuna ait ilyak arter kesitinde LOX-1 konumlanışı....104 Resim 3-8. BSO grubuna ait ilyak arter kesitinde LOX-1 konumlanışı...104 Resim 3-9. BSO+taurin grubuna ait ilyak arter kesitinde LOX-1 konumlanışı....105 Xİİ
1 GİRİŞ VE GENEL BİLGİLER 1.1 GİRİŞ Okside düşük-yoğunluklu lipoproteinlerin (Oks-LDL), endotelde oluşturduğu aktivasyon, disfonksiyon ve hasar ateroskleroz patojenezinin anahtar basamaklarıdır (248). Oluşumuyla ilgili bilgiler sınırlı olmakla birlikte, Oks-LDL nin insan plazmasında, az miktarda olsa da, bulunduğu görüşü kabul görmektedir (125). Endotel hücrelerinin, makrofaj süpürücü reseptörlerinden bağımsız olarak, Oks-LDL yi aldığı, internalize ettiği ve metabolize ettiği bilinmektedir. Bununla ilgili olarak endotel hücrelerinin farklı bir reseptör aracılığıyla bu sürece katılabileceği düşüncesi ortaya atılmıştır. 1997 de, Sawamura ve grubu sığır aort endotel hücrelerinde lektin benzeri okside LDL reseptörü (lectin-like oxidized LDL receptor, LOX-1) adını verdikleri yeni bir reseptör tanımlamıştır (255). Anılan çalışmada Oks- LDL nin endotel hücrelerine bağlanmasından sorumlu olan temel reseptörün LOX-1 olduğu görüşü vurgulanmaktadır. Ardıl çalışmalarda ateroskleroz, hipertansiyon, myokard iskemisi, iskemi-reperfüzyon hasarı ve diabet gibi hastalıklarda LOX-1 ekpresyonunun mrna ve protein düzeyinde arttığı bildirilmiştir (53, 195). Çeşitli araştırmacılar LOX-1 in kardiyovasküler hastalıkların patojenezinde, özellikle de aterosklerozda çok önemli bir role sahip olduğu noktasında birleşmektedir (7, 53, 195, 286). Perkütanöz transluminal koroner anjiyoplasti (PTKA) kateteri kullanılarak damar endotelinde hasar oluşturulması, ilaçların antiaterosklerotik etkilerinin değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılan bir deneysel modeldir. Balon hasarı sonrasında oluşan neointimal hiperplazi düz kas hücresi proliferasyonu ve migrasyonuna bağlı olup, aterosklerotik
dokularda rastlanan temel özellikleri yansıtmaktadır. Çalışmamızda, tavşan ilyak arterinde oluşturulan balon hasarı sonrasında, oksidatif stresin ve bir antioksidan olan taurinin neointimal hiperplazi ve LOX-1 ekspresyonu üzerine etkileri incelenmiştir. İn vivo oksidatif stres şartları, glutatiyon (GSH) sentezinin selektif bir inhibitörü olan bütiyonin sülfoksimin (BSO) kullanılarak oluşturulmuştur. 2
1.2 GENEL BİLGİLER 1.2.1 Oksijen Toksisitesi ve Serbest Radikaller (261) Oksijen (O 2 ) insan ve pek çok canlı türü için yaşamın sürdürülmesinde zorunlu olan, bununla birlikte toksik özellikler taşıyan bir moleküldür. Adenozin trifosfat (ATP) üretimi, detoksifikasyon ve biyosentez yolaklarındaki oksidasyon reaksiyonları O 2 varlığına bağlıdır. Ancak O 2 nin tek elektron alarak indigenmesi hücredeki lipid ve protein molekülleri ile DNA da hasar oluşmasına neden olan yüksek oranda reaktif moleküllerin oluşmasına neden olur. Reaktif oksijen türleri (ROT) hücrelerde çoğunlukla enzimatik reaksiyonlar aracılığıyla sürekli olarak üretilen moleküllerdir. Normal fizyolojik koşullarda hücresel etkinliğin doğal bir sonucu olararak oluşan ROT un düzeyleri, endojen antioksidan savunma mekanizmaları aracılığıyla organizmada zararlı etkiler oluşmasını engelleyecek şekilde sınırlandırılmaktadır. Bununla birlikte ROT oluşumu ve antioksidan savunma arasındaki dengenin bozulmasının pek çok hastalığın patojeneziyle ilişkili olduğu bilinmektedir (Tablo 1-1). Özellikle, ateroskleroz, hipertansiyon ve diabet gibi kalp-damar sistemi hastalıklarında, oksidatif stres olarak tanımlanan ROT oluşumundaki artışın rolünün bulunduğu (12, 22, 210, 273), örneklendirilemeyecek sayıda ve çeşitlilikteki deneysel ve klinik çalışmaların ortak bir sonucu olarak genel-geçer bir kabul edilirlik taşımaktadır. 1.2.1.1 Oksijen Molekülünün Radikal Özellikleri Kimyasal açıdan radikaller, yörüngelerinde eşlenmemiş bir elektron taşıyan moleküllerdir. Bununla birlikte serbest radikal terimi bağımsız olarak varolma yetisine sahip radikal molekülleri ifade eder. Bir reaksiyon sırasında enzim aktif bölgesinde oluşan radikaller, diğer moleküllerle etkileşmek üzere bağlı oldukları proteinden ayrılmadıkça (dissosiasyon) serbest radikal olarak kabul edilmezler. Radikaller yüksek oranda reaktif
moleküller olup, komşu moleküllerden elektron alarak eksik yörüngelerini tamamlar ve zincir reaksiyonların başlamasına neden olurlar. Her ne kadar demir (Fe), bakır (Cu) ve molibden (Mo) gibi geçiş metalleri yörüngelerinde tek elektron taşısalar da, görece kararlı olmaları, zincir reaksiyonlar başlatamamaları ve hücrede proteinlere bağlı halde bulunmaları nedeniyle serbest radikal olarak adlandırılmazlar. Tablo 1-1. Oksidatif stres ile ilişkilendirilen hastalıklar ve patofizyolojik değişimler Aterojenez Emfizem bronşit Duchenne tipi kas distrofisi Gebelik pre-eklampsi Serviks kanseri Alkole bağlı karaciğer hastalığı Hemodiyaliz Diabet Akut böbrek yetmezliği Yaşlanma Retrolental fibroplazi Serebrovasküler hastalıklar İskemi - reperfüzyon hasarı Nörodejeneratif hastalıklar Amyotrofik lateral skleroz Alzheimer Down sendromu Mitokondriyal DNA hasarı Multipl skleroz Parkinson hastalığı Hipertansiyon Oksijen atomu farklı yörüngelerde iki tek elektron taşıması nedeniyle bir biradikaldir. Bu elektronlar aynı yönde dönmekte olduklarından (paralel spin) aynı yörüngede bulunamazlar. Oksijenin termodinamik açıdan çok reaktif olması, taşıdığı bu iki eşlenmemiş elektronun organik moleküllerin kovalent bağlarında bulunan eşlenmiş elektronlar ile hızlı bir şekilde reaksiyona girmesini engeller. Bu nedenle O 2, enzim gerektiren reaksiyonlar aracılığıyla başka moleküllerden yavaş bir şekilde elektron alabilir. O 2, toplamda dört elektron alarak suya (H 2 O) indirgenebilir (Şekil 1-1). O 2 nin tek elektron alması süperoksid (O 2 - ) oluşumuna neden olur. O 2 - eşlenmemiş bir elektron taşıdığından hala bir radikaldir. O 2 - oluşumu, elektron sağlayabilecek koenzim Q-H (KoQ-H) gibi indirgen bir ajanın varlığını gerektirdiğinden termodinamik açıdan gerçekleşme olasılığı düşük olan bir reaksiyondur. Süperoksidin bir elektron daha alması ise bir radikal olmayan 4
hidrojen peroksidin (H 2 O 2 ) oluşmasına neden olur. Bir sonraki tek elektronluk indirgenme basamağının ürünü hidroksil radikalidir (OH ). Son olarak, dördüncü elektronun da alınması OH nin H 2 O ya indirgenmesiyle sonuçlanır. Şekil 1-1. Oksijenin dört elektron indirgenmesi sonucu oluşan ürünler ve bu ürünlerin neden olabileceği reaksiyonlar (261). 1.2.1.2 Reaktif Oksijen Türlerinin Temel Özellikleri Reaktif oksijen türleri (ROT), oksijen taşıyan serbest radikalleri ve bu serbest radikallere dönüşebilen bileşikleri kapsamaktadır. Oksijenin elektron alarak indigenmesi sonucu oluşan ana metabolitler olan O - 2, H 2 O 2 ve OH, ROT içinde sınıflandırılır (Tablo 1-2). 5
Tablo 1-2. Reaktif oksijen türleri (ROT) ve reaktif nitrojen-oksijen türleri (RNOT). Reaktif Türler O 2 - Süperoksid H 2 O 2 Hidrojen peroksid OH Hidroksil radikali RO, R ve R-S Organik radikaller RCOO Peroksil radikali HOCl Hipokloröz asid O 2 Singlet oksijen NO Nitrik oksid ONOO - Peroksinitrit Özellikler Elektron transport zinciri reaksiyonlarıyla oluşur. Oluşma alanından daha uzak yerlere diffüze olamaz. Diğer reaktif türlerin oluşmasına neden olur. Bir serbest radikal olmamakla birlikte geçiş metalleri aracılığıyla serbest radikal oluşumuna neden olur. Hücre membranından geçebilir. Biyolojik moleküller için en saldırgan reaktif türdür. Fe +2 ve Cu + varlığında Fenton reaksiyonu aracılığıyla H 2 O 2 den üretilir. Alkol, alkil ya da tiol yapılarına OH atağı sonucu oluşurlar. Lipid metabolizması sırasında oluşur. Özelikle nötrofillerde, mikroorganizmaların oksidatif yıkım ile yok edilmesi sırasında oluşur. Toksisitesinin nedeni halojenlenme ve oksidasyon reaksiyonlarıdır. Atak grup OCl - dir. Oksijenin yörüngelerindeki iki elektron zıt spinlere sahiptir. Mor ötesi (UV) ışığın absorbsiyonu sonucu oluşan yüksek oksijen gerilimiyle ortaya çıkmaktadır. Hızla metabolize edildiğinden in vivo toksisite açısından önem taşımaz. Bir reaktif nitrojen-oksijen türüdür (RNOT). Endojen olarak nitrik oksit sentetaz enzimi araclığıyla üretilir. Metal iyonlarına bağlanır. O 2 ve oksijen taşıyan radikaller ile birleşerek diğer RNOT un oluşmasına neden olur. Bir reaktif nitrojen-oksijen türüdür (RNOT). Serbest radikal olmamakla birlikte güçlü bir oksidandır. Bir radikal olan nitrojen dioksidin (NO 2 ) oluşmasına neden olur. Serbest radikaller diğer bileşiklerden elektron kopararak (genellikle hidrojen atomlarını) kendi yörüngelerini tamamlarlar ve böylelikle serbest radikal zincir reaksiyonları oluştururlar. Lipid peroksidleri ve organik radikallerin oluşmasına neden olabilen OH, ROT içinde en potent molekül olarak göze çarpmaktadır. O - 2 de yüksek oranda reaktif bir molekül olmakla birlikte yağdaki çözünürlüğünün düşük olması nedeniyle oluşum alanından uzağa diffüze olamaz (140). Bununla birlikte O - 2 Haber-Weiss reaksiyonu ile OH oluşmasına (69) neden olabilir (Şekil 1-1). Gerçek bir radikal olmayan H 2 O 2 zayıf bir oksidan olmasına rağmen, OH oluşumuna neden olduğu için reaktif türler içinde sınıflandırılmaktadır (69). Fe +2 ve Cu + gibi geçiş metalleri, Fenton reaksiyonuyla H 2 O 2 den, OH oluşmasında katalizör olarak görev yaparlar (Şekil 1-1). H 2 O 2 yağda çözünen bir molekül olduğundan membranlardan geçerek, mitokondri gibi Fe +2 ve Cu + içeren bölgelerde OH oluşumuna neden 6
olabilir. H 2 O 2 ayrıca, fagositoz yapan hücrelerde endojen ve enzimatik olarak üretilen güçlü bir oksidan olan hipokloröz asidin (HOCl) prekürsörüdür (70). Organik radikaller, O 2 - ve OH radikalinin diğer moleküllerden çok sayıda ve raslantısal olarak elektron koparmasıyla oluşur. Organik peroksi radikalleri (RCOO ), lipid peroksidasyonu gibi zincir reaksiyonlara neden olan moleküllerdir. Oksijen yanısıra nitrojen de taşıyan reaktif türler (RNOT), endojen olarak nitrik oksit sentetaz aracılığıyla üretilen bir serbest radikal olan nitrik oksidin (NO) türevleridir. NO, oksijen ve O - 2 ile birleşerek diğer RNOT un oluşmasına neden olur (273). 1.2.1.3 Hücrede ROT Oluşumunun Gerçekleştiği Temel Bölgeler Tükettiğimiz oksijenin yaklaşık olarak % 3-5 i serbest radikallere dönüşmektedir. Bu radikallerin bir kısmını, normal enzimatik reaksiyonlar sırasında metal içeren enzimlerin aktif bölgelerinden raslantısal olarak kaçan moleküller oluşturmaktadır. H 2 O 2 gibi bazı reaktif türler ise, peroksizomlardaki oksidazların fizyolojik ürünleridir. İnflamasyon, iyonize edici radyasyon ve çeşitli kimyasallar hücrelerdeki serbest radikal üretimini artırabilmektedir (287, 292). - Mitokondriyal elektron transport sisteminde yer alan koenzim Q (KoQ), O 2 oluşumunun gerçekleştiği temel bölgelerdendir. KoQ nun indigenmiş formu olan KoQ-H membran içinde serbest olarak bulunduğundan, çözünmüş haldeki O 2 ye bir elektron transfer ederek O - 2 oluşmasına neden olabilir. Hücredeki oksidaz, peroksidaz ve oksijenazların büyük bir kısmı O 2 ye bağlanarak, geçiş metalleri aracığıyla O 2 ye elektron transfer ederler. Bu tip reaksiyonlar sonucu oluşan serbest radikaller bazan indirgenme henüz tamamlanmadan salıverilebilirler. Sitokrom P450 enzimleri serbest radikallerin bu reaksiyonlardan kaçabilmesinin temel nedenidir. Anılan enzimler O 2 ya da organik bir substrata elektron transferine aracılık ettiklerinden, serbest radikallerin oluşma ve oluşma bölgesinden başka bölgelere sızma olasılığı daha yüksektir 7
(22). P450 enzimlerinin alkol, ilaçlar ya da toksik kimyasallar tarafından uyarılması hücresel hasara neden olmaktadır. P450 enzimlerinin miktarının normal substratlar ortamda olmadığı halde artması, ilgili genlerin baskılanmasına ve sonuçta serbest radikallerin inaktif metabolitlere indirgenememesine neden olmaktadır. H 2 O 2 ve lipid peroksidleri, peroksizom, mitokondri ve endoplazmik retikulumdaki çeşitli oksidazların katalizörlüğünde ana reaksiyon ürünleri olarak oluşmaktadır. Dopaminin oksidatif olarak yıkılmasında rol alan monoamin oksidaz, nöronların mitokondriyal membranında H 2 O 2 oluşmasına neden olmaktadır. Çok uzun yağ asidi zincirlerinin oksidasyonu sırasında peroksizomlardaki oksidazlar, oluşturdukları FAD(2H) den daha fazla H 2 O 2 oluşturmaktadırlar. Diğer yandan, purin metabolizmasından sorumlu bir enzim olan ksantin oksidaz, sitozollerde O 2 yi O 2 - ve H 2 O 2 ye dönüştürerek iskemi-reperfüzyon hasarında rol oynamaktadır. Lipid peroksidleri ayrıca lökotrienler ve prostaglandinler gibi pek çok eikozanoidin sentezlenmesinde enzimatik olarak oluşabilmektedir (113, 137). Dünyaya ulaşan kozmik ışınlar, radyoaktif kimyasallar ve X ışınları oluşturdukları iyonize edici radyasyon nedeniyle ROT oluşumunu artırabilmektedir. İyonize edici radyasyon, su molekülünü OH ve hidrojen radikaline çevirebilecek enerji düzeyine sahip olduğundan, mutasyonlar, kanser ve hücre ölümü gibi etkilere neden olabilmektedir. İyonize edici radyasyon ayrıca, hücresel yapıları direkt olarak etkileyerek organik radikallerin oluşmasını da tetikleyebilmektedir. 1.2.1.4 Hücresel Yapılar ve Oksijen Radikalleri Arasındaki Reaksiyonlar Oksijen radikalleri lipidler, proteinler, karbohidratlar ve DNA ile etkileşerek onlardan elektron koparması hücrede fonksiyon bozukluklarına ve hatta hücre ölümüne neden olabilmektedir (Şekil 1-2). Sayıca yüzden fazla farklı hastalıkta hücresel radikal hasarının oluştuğu bilinmektedir. Bu hastalıkların bazılarında serbest radikal hasarı hastalığın temel nedenini oluştururken, bazılarında hastalığın komplikasyonlarını şiddetlendirmektedir. 8
Protein hasarı Membran hasarı Mitokondri hasarı DNA hasarı Nukleus DNA Lipid peroksidasyonu Hücrenin su alarak şişmesi Membran geçirgenliğinde artış Ca 2+ girişinde artış Şekil 1-2. Serbest radikallerin neden olduğu hücresel hasar. Süperoksid ve hidroksil radikali hücre, mitokondri, nukleus ve endoplazmik retikulum membranlarında lipid peroksidasyonunu başlatmaktadır. Hücre membanının geçirgenliğinin artması, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu artırarak mitokondrilerde oluşan hasarı şiddetlendirebilir. Proteinlerdeki sistein sülfhidril grupları ve diğer amino asitler oksidatif hasar sonucu yıkıma uğramaktadır. Oksidatif hasar sonucu nukleus ve mitokondri DNA zincirinde kırılmalar oluşabilmektedir. Reaktif nitrojen-oksijen türleri de benzer nitelikte etkiler oluşturmaktadır (261). 1.2.1.5 Membran Hasarı: Lipid ve Lipid Peroksi Radikallerinin Oluşumu Membranlarda lipid serbest radikallerinin ve lipid peroksidlerinin oluşmasına (145, 259, 271) neden olan zincir reaksiyonlar ROT ile tetiklenen oksidatif hasarda çok önemli rol oynar (Şekil 1-3). Fenton Reaksiyonu yoluyla lokal olarak oluşan OH gibi bir radikal özellikle çoklu-doymamışlık taşıyan yağ asitlerinin çifte bağlarından bir hidrojen kopararak zincir reaksiyonunu başlatabilir. O 2 nin gruba bağlanarak peroksil radikallerini ve lipid peroksidlerini oluşturması reaksiyonun ilerlemesine neden olur. Sonuç olarak, lipid yıkımı gerçekleşir ve malondialdehid (MDA), etan ve pentan molekülleri oluşur. Kan ve idrardaki MDA düzeyi, serbest radikal hasarı sonucu gerçekleşen lipid peroksidasyonunun bir belirteci 9
olarak kullanılmaktadır. Lipid moleküllerinin peroksidasyonu, moleküler yapıda çeşitlilikler gösteren hasarlara neden olur. Bunun yanısıra reaksiyon sırasında oluşan aldehidler proteinler ile çapraz bağlar oluşturabilmektedir. Hasar görmüş lipidlerin biyolojik membranların yapısında yer alması, çift tabakalı lipid membranın kohesiv özelliklerini ve kararlı yapısını bozmaktadır. Mitokondri membranında oluşabilecek bozulmalar daha fazla serbest radikal üretimine neden olabilir. (A) (B) (C) Şekil 1-3. Lipid peroksidasyonu: Bir serbest radikal zincir reaksiyonu. (A) OH radikalinin çoklu doymamışlık taşıyan bir yağ asidinden (LH) elektron koparmasıyla lipid peroksidasyonunun başlatılması ve lipid radikalinin oluşumu (L ). (B) Oksijenin katılmasıyla lipid peroksil radikali (LOO ) ve lipid peroksidin oluşumu (LOOH). (C) Lipid degradasyonu ve malondialdehid oluşumu (261). 1.2.1.6 Protein ve Peptidler Proteinlerde, prolin, histidin, arjinin, sistein ve metiyonin gibi amino asidler oksidatif hasara en fazla uğrayan yapılardır. Serbest radikaller proteinlerin parçalanmasına ya da amino asidlerin başka amino asidlerle çapraz bağlar yapmalarına neden olabilir. Proteinlerdeki sistein gruplarına serbest radikal atağı, oluşan çapraz bağlar sonucu degradasyonu çok güç olan protein agregatlarının oluşmasına neden olabilir. Bununla birlikte oksidatif hasar diğer proteinlerin proteolitik yıkımını kolaylaştırmaktadır. Bir tripeptid olan glutatiyon molekülündeki sistein sülfhidril grubunun oksidasyonu hücrelerdeki oksidatif hasarı 10
artırmaktadır (133, 182, 258). Glutatiyon, serbest radikal hasarına karşı hücresel savunma mekanizmasının ana öğesidir. 1.2.1.7 DNA ROT un neden olduğu hasardan etkilenen bir diğer biyolojik molekül DNA dır (155). DNA da oksidatif hasarın neden olduğu yaklaşık 20 tip değişim kaydedilmiştir. Fe +2 iyonunun DNA ya gelişigüzel bağlanması, lokal OH üretimini artırarak DNA yapısında baz değişmelerine neden olmaktadır (155). Bu durum deoksiriboz yapısında zincir kırılmalarına yol açabilmektedir. Hücre oluşan DNA hasarını bir noktaya kadar tamir edebilmekte, ya da apoptoza uğramaktadır. 1.2.2 Nitrojen Toksisitesi ve Nitrik Oksid Oksijen taşıyan bir serbest radikal olan nitrik oksid (NO), O 2 gibi yaşamsal öneme sahip olaması yanısıra toksik bir moleküldür (69). Bir serbest elektronu olduğundan, eşlenmemiş elektron içeren diğer bileşiklere bağlanabilir (Fe +3 taşıyan proteinler gibi). Bir gaz molekülü olarak sitozol ve lipid membranlardan hücre içine girebilmektedir. Düşük konsantrasyonlarda, bir nörotransmiter olararak endotele bağlı gevşeme yanıtları oluşturur. Bununla birlikte yüksek konsantrasyonlarda O 2 veya O - 2 ile birleşerek nitrojen ve oksijen taşıyan reaktif türlerin (RNOT) oluşmasına neden olabilmektedir. RNOT un Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıklarda ve romatoid artrit gibi kronik inflamatuvar hastalıklarda rolü olduğu bilinmektedir. NO, nitrik oksid sentetazlar tarafından arjininden sentez edilmektedir (Şekil 1-4). NO, hedef hücrelerdeki fizyolojik etkilerini guanil siklaz enzimindeki Fe-hem grubuna bağlanarak ve bunun sonucu olarak sinyal iletim kaskadını etkinleştirerek oluşturur (69). Bununla birlikte, NO in seçimsiz olarak farklı moleküllere bağlanarak etkinsizleşmesi, NO üreten hücrelerin hedef hücrelere yakın konumda bulunmasını gerektirmektedir. 11
Vücudumuzda her biri farklı genler tarafından kodlanan, dokuya-özgün üç farklı NO sentaz bulunmaktadır (31): nöronal NO sentaz (nnos, izoform I), indüklenebilir NO sentaz (inos, izoform II) ve endotelyal NO sentaz (enos, izoform III). nnos ve enos etkinliği hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ile düzenlenir. Bununla birlikte makrofajlar gibi immun sistem hücreleri ve beyindeki glial hücrelerde bulunan inos un etkinliği transkripsiyonel olarak düzenlenmektedir. Mikroorganizmalar gibi etmenlere karşı savunma mekanizmasının bir öğesi olarak, inos gen ekspresyonu ve sonuç olarak NO üretimi artmaktadır NO konsantrasyonunu artıran bu gibi faktörler RNOT oluşumunu tetiklemekte ve NO toksisitesinin neden olmaktadır. Nitrojenin toksik etkileri iki ana başlık altında incelenebilir: 1) Nitrik oksidin (NO) demir taşıyan proteinlere bağlanması sonucu oluşan direkt etkiler 2) NO nun O 2 ya da O - 2 ile birleşerek reaktif nitrojen-oksijen türlerini (RNOT) oluşturmasından kaynaklanan indirekt etkiler. Şekil 1-4. Nitrik oksid sentetaz (NOS) ve bir serbest radikal NO nun oluşumu. NOS, serbest elektronların NADPH den O 2 ye taşınmasında Fe-hem, FAD ve FMN moleküllerini kullanmaktadır (261). 1.2.2.1 Nitrik Oksidin Oluşturduğu Direkt Toksik Etkiler Bir serbest radikal olarak NO direkt toksik etkilerini, serbest elektron bulunduran yapılar olan Fe grubu içeren yapılarla birleşerek gösterir. Atağa uğrayan temel bölgeler arasında Fe-S grupları (elektron transport zincir kompleksleri I-III ve akonitaz) ve Fe-hem proteinleri 12
(hemoglobin ve elektron transport zincirindeki sitokromlar) bulunmaktadır. Bununla birlikte oluşan hasar minimal düzeydedir, çünkü ortamda bulunan NO konsantrasyonu, Fe-hem gruplarıyla karşılaştırıldığında çok düşük miktardadır. Ancak, oksidatif fosforilasyondaki bozukluklar ve iskemi gibi patofizyolojik durumlarda, NO hücre solunumunu direkt olarak inhibe ederek ciddi hasarlara neden olabilir. 1.2.2.2 RNOT Toksisitesi İnflamasyon gibi çok yüksek konsantrasyonlarda olduğu durumlarda, NO, O - 2 veya O 2 ile enzim aracısız birleşerek sirasıyla peroksinitrit (ONOO - ) ve azot trioksid (N 2 O 3 ) oluşmasına neden olur (Şekil 1-5). Bir serbest radikal olmamakla birlikte, ONOO - kararlı bir oksidan ajandır (17). Lipid membranlardan geçebildiği için proteinlerdeki metiyonin ve tiyol (-SH) grupları gibi pek çok hedef molekül ile etkileşebilir. Peroksinitritin degradasyon ürünleri arasında lipid peroksidayonunun güçlü bir başlatıcısı olan serbest radikal nitrojen dioksid (NO 2 ) bulunmaktadır. Peroksinitritin degradasyon ürünleri ayrıca aromatik halkaları nitratlayarak, nitrotirozin ve nitroguanozin gib yapıların oluşmasına neden olmaktadır. NO 2 veya nitritten türeyebilen N 2 O 3, hücrede sülfhidril gruplarının nitrozillenmesinden sorumlu olduğu için nitrojen stresi ya da nitrozatif stres olarak adlandırılan patofizyolojik duruma neden olan temel ajandır. Nitrozillenme, protein ve lipidlerin normal fonsiyonlarını sürdürmelerini engelleyen bir reaksiyondur. Bu nedenle, RNOT, biyolojik moleküllerin nitratlanması ve nitrozillenmesi aracılığıyla en az ROT kadar hücresel hasara neden olmaktadır (273). Özetlenecek olursa, RNOT oluşumu, çok sayıda enzimin inhibe olmasını, mitokondride lipid peroksidasyonunu, elektron transport zincirinin inhibisyonunu ve DNA zincirinde kırılmaları ile baz değişmelerini beraberinde getirmektedir. 13
1.2.2.3 Fagositoz ve İnflamasyon Sırasında Serbest Radikallerin Oluşumu Enfeksiyöz ajanlar ve antijenler gibi etkilere karşı immun sistemde yer alan fagositöz özelliğine sahip hücreler (nötrofiller, eozinofiller ve monosit/makrofajlar) solunumsal yıkım adı verilen hızlı bir O 2 tüketimi sergilerler. Solunumsal yıkım, hücrede O - 2, H 2 O 2, OH, HOCl radikalleri (35, 70, 190, 275) ve RNOT un oluştuğu ana reaksiyonlardır. Serbest radikaller insan antimikrobiyal savunma sisteminin bir parçası olup, mikroorganizmalar ve tümör hücreleri gibi yabancı hedeflerin yok edilmesi amacına yönelik hareket ederler. Şekil 1-5. NO dan reaktif nitrojen-oksijen türlerinin (RNOT) oluşumu. Gösterilen nitrojen-oksijen içeren bileşiklerden sadece nitrat (NO 3 ) toksik özellikler taşımaz (261). 14
1.2.2.4 NADPH oksidaz Solunumsal yıkım, indirgenmiş nikotinamid adenin dinükleotid fosfattaki (NADPH) bir elektronu O 2 ye aktararak O 2 - oluşmasına neden olan NADPH oksidaz enziminin aktivitesinden kaynaklanmaktadır (Şekil 1-6). NADPH oksidaz, mikroorganizmaları hapseden fagolizozom membranı içindeki sitozol ve membran proteinlerinden sağlanır (120). NADPH oksidaz katalizörlüğünde oluşan O - 2, fagolizozomun iç membran aralığına salıverilir, ve burada H 2 O 2 ve diğer reaktif türlere dönüştürülür. H 2 O 2 oluşmasından sorumlu olan süperoksid dismutazın (SOD), fagositoz yapan hücreden geldiği ya da işgalci mikroorganizma tarafından salgılanabileceği düşünülmektedir. Nötrofil sitoplazmik membranı Şekil 1-6. Aktive nötrofillerin fagositoz sonrasında oluşturduğu solunumsal yıkım sırasında reaktif oksijen türlerinin oluşumu. (1) NADPH oksidazın plazma membranın dış tarafında aktive olarak solunumsal yıkımı ve süperoksid oluşumunu başlatması. Fagositoz sırasında plazma membranı kıvrımlar oluşturarak süperoksidin vakuol boşluğu içine salıverilmesini sağlar. (2) Spontan olarak ya da SOD aracılığıyla H 2 O 2 nin oluşması (3) Fagolizozom içine myeloperoksidaz içeren granüller salıverilir, HOCl ve diğer halojenli türevler oluşur. (4) H 2 O 2, Fenton reaksiyonu ile OH oluşmasına neden olabilir. (5) inos un aktive olarak NO oluşumunu artırması. (6) NO nun süperoksidle birleşerek peroksinitrit (ONOO - ) ve diğer reaktif nitrojen-oksijen türlerini oluşturması. Sonuç olarak fagositozla alınan hücrenin membranında ve diğer yapılarında oksidatif hasar oluşması ve hücrenin lizise uğraması (261). 15
1.2.2.5 Myeloperoksidaz ve HOCl Hidrojen peroksidden, hipokloröz asid (HOCl) oluşması myeloperoksidaz enzimi katalizörlüğünde gerçekleşmektedir (22, 70, 186, 275, 291). Myeloperoksidaz hem grubu içeren bir enzim olup sadece immun sistem hücrelerinde (özellikle nötrofillere) bulunmaktadır. HOCl, bakterileri halojenleme ve oksidasyon reaksiyonları sonucu birkaç saniye içinde etkisiz hale getiren potent bir oksidandır. Fe ve S içeren grupların (sülfhidril grupları, demir-sülfür merkezleri, ferredoksin, hem proteinleri, metiyonin) oksidasyonu, proteinlerin oksidatif dekarboksilasyonu ve deaminasyonu ve peptid bağlarının yıkılması gibi önemli etkiler oluşturur. Aerob bakteriler HOCl varlığında, olasılıkla ATP sentetaz ya da elektron transport zincirinde oluşan hasar sonucu, mebran transportu yeteneklerini kaybederler. 1.2.2.6 RNOT ve İnflamasyon Nötrofiller aktive olarak NO üretmeye başladıklarında NADPH oksidaz enzimi de aktive olmaktadır (186, 190, 291). Oluşan NO nun süperoksidle reaksiyona girmesi peroksinitrit ve diğer reaktif nitrojen-oksijen türlerinin oluşmasını tetiklemektedir. NO ayrıca çevreleyen dokuya salıverilebilmekte ve hedef hücrelerde süperoksid ile birleşebilmektedir. Pek çok hastalıkta, inflamasyon sırasında nötrofil ve makrofajlardan salıverilen serbest radikallerin komşu bölgelerde hasar oluşumuna neden olduğu bilinmektedir. İnme ve myokard infarktüsünde, ölen hücreleri ortadan kaldırmak üzere iskemik bölgeye göç eden fagositoz özelliği taşıyan hücreler, infarkt alanı ve oluşan hasarın büyüklüğünü artırmaktadır. 16
1.2.3 Oksijen Toksisitesine Karşı Savunma Mekanizmaları Oksidatif hasara karşı savunma mekanizmalarını; antioksidan enzimler, diyetle alınan ya da endojen olarak üretilen serbest radikal süpürücüleri, hücresel kompartmentalizasyon, metallerin sekestre edilmesi ve hasar görmüş hücresel yapıların onarılması oluşturmaktadır (261). Antioksidan enzimler, ROT ve serbest radikallerin neden olduğu zincir reaksiyonlarda oluşan hücresel ürünler ile etkileşerek toksik olmayan metabolitler oluşmasını sağlarlar. Vitamin E ve flavonoidler gibi diyetle alınan antioksidanlar ve ürik asit tuzları gibi endojen antioksidanlar ise serbest radikal zincir reaksiyonlarının oluşmasını engellemektedirler. Antioksidan savunma içinde hücresel kompartmentalizasyon, ROT üretimi ile bağlantılı bölge ve moleküllerin hücrenin diğer kısımlarından izole edilmesini ifade etmektedir (Şekil 1-7). Buna örnek olarak H 2 O 2 üreten enzimlerin, antioksidan enzimler ile birlikte peroksizomlar içine sekestre edilmesi verilebilir. Metallerin kan ve hücreler içindeki proteinlere bağlanmış halde bulunması, onların Fenton reaksiyonuna girmesini engellemektedir. Ayrıca, DNA da oluşan hasarın onarılması ve membrandaki okside yağ asitlerinin ortmadan uzaklaştırılması hücrenin oksidatif hasara karşı korunma mekanizmaları içinde yer almaktadır. Proteinlerdeki okside amino asidler protein degradasyonu içinde devamlı olarak onarılmakta ve yeni proteinler sentezlenmektedir. 1.2.3.1 Süperoksid Dismutaz Süperoksid anyonun (O 2 - ), süperoksid dismutaz (SOD) tarafından hidrojen peroksid ve O 2 ye dönüştürülmesi, oksidatif strese karşı birincil savunma mekanizması olarak görülmektedir. Çünkü O 2 - zincir reaksiyonların başlamasına neden olan güçlü bir aktivatördür. SOD üç izoenzim şeklinde bulunur (22). Sitozolde Cu + -Zn 2+ formu, mitokondride Mn 2+ formu, hücre dışı alanda Cu + -Zn 2+ formu bulunmaktadır. Cu + -Zn 2+ SOD un aktivitesi süperoksid anyon üretimini artıran kimyasallar ya da şartlar ile artmaktadır. 17
Şekil 1-7. Serbest radikallere karşı hücresel savunmanın kompartmentalizasyonu. Mitokondri ve peroksizom yapıları açısından zengin olan karaciğer, adrenal bezler ve böbrek antioksidan enzimlerin en yoğun olarak bulundukları organlardır. Süperoksid dismutaz (SOD) ve glutatiyon peroksidaz farklı kompartmanlarda izozimler olarak bulunabilmektedir (261). 1.2.3.2 Katalaz Hidrojen peroksid, Fenton ya da Haber-Weiss reaksiyonlarına girerek OH radikali oluşturmadan H 2 O ya indirgenmesi gereken önemli bir reaktif türdür (Şekil 1-1). Bu indirgenme reaksiyonunu gerçekleştirebilen enzimlerden biri katalazdır (84). Katalaz hücrede yoğun olarak peroksizomlarda bulunmakla birlikte, daha düşük miktarlarda sitozol ve mikrozomal fraksiyonda bulunabilmektedir. Yüksek katalaz aktivitesine sahip olan dokuların böbrek ve karaciğer olması, bu organların sahip oldukları yoğun peroksizom yapısından kaynaklanmaktadır. İmmun sistem hücreleri olan nötrofil ve makrofajlarda, katalaz anılan hücreleri kendi oluşturdukları solunumsal yıkımın etkilerine karşı korumaktadır. 1.2.3.3 Glutatiyon Peroksidaz ve Glutatiyon Redüktaz Glutatiyon peroksidazların (GP) katalizörlüğünde gerçekleşen reaksiyonlarda, glutatiyon (GSH) molekülündeki reaktif sülfhidril grupları hidrojen peroksidi H 2 O ya, lipid peroksidleri ise toksik olmayan alkollere indirgemektedir (22, 84). Bu reaksiyonlarda iki GSH 18
molekülü okside olarak glutatiyon disülfidi (GSSG) oluşturmaktadır. Sülfhidril grupları ayrıca organik radikallerle etkileşerek, enzim katalizörlüğü gerekmeksizin, zincir reaksiyonlarının oluşmasını engelleyebilmektedir. GP selenyum taşıyan enzimler ailesinden olup, farklı dokularda ve özelliklerde bulunmaktadır. Hücre içinde temel olarak sitozol ve mitokondrilerde yer alan GP, peroksizomların dışında oluşan H 2 O 2 nin indirgenmesinde ana rolü üstlenmektedir. Yapısında taşıdığı selenyum atomu nedeniyle, GP, diyetle alınması gerekli olan selenyum miktarına katkıda bulunmakta, bu bağlamda selenyumun serbest radikal hasarı üzerine olan koruyucu etkisini açıklamaktadır. GSSG oluşumunun ardından, redoks döngüsü içinde, glutatiyonun sülfhidril formuna dönüştürülmesi, glutatiyon redüktaz (GR) katalizörlüğünde gerçekleşmektedir (Şekil 1-8). GR, flavin adenin dinukleotid (FAD) molekülünü kullanarak, NADPH deki elektronu GSSG deki disülfid bağına taşır. Bu nedenle NADPH, serbest radikal hasarına karşı savunma mekanizmaları içinde serbest elektron sağlayarak çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu reaksiyondaki NADPH nin kaynağı pentoz fosfat yolağıdır. Şekil 1-8. Glutatiyon redüktaz katalizörlüğünde okside glutatiyondan (GSSG), indirgenmiş glutatiyon oluşması (261). 1.2.3.4 Glutatiyon Glutatiyon (γ-glutamil-sisteinil-glisin, GSH) vücudun oksidatif hasara karşı korunmasında temel moleküldür (98, 133, 181, 182). Glutamat, sistein ve glisinden oluşan bir 19
tripeptiddir. Sisteindeki amino grubu ile glutamatın karboksil grubu arasında bir peptid bağı bulunmaktadır (Şekil 1-9). 1.2.3.4.1.1 Hücre ve Plazmada Glutatiyon GSH hayvan hücrelerindeki en yaygın, düşük molekül ağırlıklı tiyoldür (0,5-10 mmol/l). Hücredeki GSH nin %85-90 ı sitozolde bulunmakta olup, kalan kısım mitokondri, nükleer matriks ve peroksizomlarda yer almaktadır (181). Safra asidinin 10 mmol/l gibi yüksek sayılabilecek GSH düzeylerine sahip olabilmesinin aksine, GSH nin hücre dışı konsantrasyonları genellikle düşüktür (2-20 µmol/l plazma). Taşıdığı sistein grubu nedeniyle serbest radikaller, ROT ve RNOT gibi elektrofilik molekülller tarafından ve enzim aracısız olarak oksidlenerek GSSG ye dönüştürülmektedir. Protein malnütrisyonu, oksidatif stres ve çeşitli patolojik koşullar tarafından hücre GSH konsantrasyonunu düşürmektedir (181). GSH + 2 GSSG hücredeki total glutatiyon içeriğini ifade etmektedir. Total glutatiyonun yaklaşık olarak % 15 i proteinlere bağlı olarak bulunmaktadır. GSH/GSSG oranı hücredeki redoks düzeyinin bir belirtecidir. GSH/GSSG oranı hücrenin antioksidatif kapasitesini belirleyen temel redoks çifti olmakla birlikte, NADPH/NADP+ ve indirgenmiş/yükseltgenmiş tiyoredoksin oranının da etkili olduğu bilinmektedir (133). Şekil 1-9. Glutatiyon molekünün yapısı ve glutatiyon peroksidazın glutatiyon molekülündeki (SH gruplarındaki) elektronları H 2 O 2 ye aktarması. 20
1.2.3.4.1.2 Glutatiyon Biyosentezi GSH biyosentezi (Şekil 1-10), sitozol enzimleri olan γ-glutamilsistein sentetaz (GSS) ve GSH sentetaz katalizörlüğünde gerçekleşmektedir. Anılan reaksiyonlar neredeyse tüm hücre tiplerinde gerçekleşmekle birlikte, GSH sentezinin gerçekleştiği temel organ karaciğerdir. GSS katalizörlüğünde, glutamattaki karboksil grubu ile sisteindeki amino grubu arasında oluşan peptid bağı molekülün hücre içindeki peptidazlar tarafından hidrolizini engeller. Oluşan γ-glutamilsistein molekülü, γ-glutamilsiklotransferaz enziminin de substratıdır. Ancak hayvan hücrelerinde, GSH sentetaz enziminin daha yüksek afinite ve aktivitesi nedeniyle reaksiyon GSH sentezi yönüne kaymaktadır (97). Memelilerdeki GSS, katalitik olarak aktif bir ağır alt-ünite (73 kda) ve düzenleyici bir hafif alt-üniteden (31 kda) oluşmaktadır (181). Ağır alt-ünite substrat bağlayıcı bölgeleri içerirken, hafif alt-ünite substrat ve inhibitörlere karşı afiniteyi düzenlemektedir. GSS nin glutamat ve sistein için Km değerleri sırasıyla 1,7 ve 0,15 mmol/l dir. Bu değerler karaciğerdeki glutamat ve sistein konsantrasyonuyla paralellik göstermektedir. Allosterik bir enzim olan GSH sentetaz bir homodimerdir (52 kda/alt-ünite) ve γ-glutamilsistein substratının glisine bağlanmasını sağlamaktadır (215). ATP ve glisin için GSH sentetazın Km değerleri sırasıyla 0,04 ve 0,9 mmol/l olup, karaciğerdeki ATP ve glisin konsantrasyonuyla karşılaştırıldığında oldukça düşüktür. Sıçanlarda GSS ve GSH sentetazın alt-üniteleri klonlanarak dizi analizleri yapılmış (97) ve GSH nin de novo sentezinde GSS nin hız sınırlayıcı enzim olduğu gösterilmiştir (181). In vivo GSH biyosentezi ile bilgiler, kullanılan substratların kompartmentalizasyonu ve bu substratların organ ve subselüler düzeylerdeki metabolizmaları nedeniyle sınırlıdır. Bu duruma örnek olarak ince barsak ve böbreklerde GSS oluşumu için kullanılan glutamat kaynağının farklı olması verilebilir. Karaciğerdeki GSH sentezi başat olarak perivenöz hepatositlerde, da az olarak da periportal hücrelerde gerçekleşmektedir (18). Bu nedenle plazma GSH düzeyleri farklı hücrelerde gerçekleşen GSH sentezinin miktarını 21
yansıtmayabilir. Sağlıklı bireylerde GSH nin kullanılma hızı 25 µmol/kg saat olup (182), hücreye alınan sistein miktarının (38,3 µmol/kg saat) % 65 ini oluşturmaktadır. Bu bulgu GSH nin sistein için temel bir taşınma yolu olduğunu göstermektedir. Diyetle alınan sistein miktarı 9 µmol/kg saat düzeyindedir (182). Bu nedenle, endojen GSH sentezi için kullanılan sisteinin büyük bir kısmının hücre içi protein degradasyonu ile karşılandığı düşünülmektedir. γ-glutamil-aa 2 AA Met 5-Oksoprolin ATP 3 ADP+P i KG ZAA ZKA 10 Sistin 19 Arjinin 14 1 Sisteinil-Glisin 20 NAS 18 6 Sistein 3 OTK Glutamat Gln NH 3 11 12 H 2 O KG Ser 21 AA NH 3 NO 4 Glkn-6-P 13 GS-NO Glutatiyon (GSH) ADP +P KS i 15 5 ADP+P i ATP LOOH 17 2H + O 2.- Glisin GSH-KS ATP γ-glutamil-sistein NADP + NADPH+H + 9 H 2 O 2 R R Pentoz yolağı F-6-P Glukoz R-5-P 7 8 16 H 2 O e O 2 LOH GSSG Şekil 1-10. Glutatiyonun sentez edilişi ve kullanılışı. Enzimler: 1) γ-glutamil transpeptidaz, 2) γ-glutamil siklotransferaz, 3) 5-oksoprolinaz, 4) γ-glutamilsistein sentetaz, 5) glutatiyon sentetaz, 6) dipeptidaz, 7) glutatiyon peroksidaz, 8) glutatiyon redüktaz, 9) süperoksid dismutaz, 10) zincir amino asid transaminaz, 11) glutaminaz, 12) glutamat dehidrogenez, 13) glutamine:fruktoz-6-fosfat transaminaz, 14) nitrik oksid sentaz, 15) glutatiyon S-transferaz, 16) NAD(P)H oksidaz ve mitokondri solunum kompleksleri, 17) glikoliz, 18) glutatiyona bağımlı tiyodisülfid, tiyoltransferaz veya enzimatik olmayan reaksiyonlar, 19) transülfürasyon yolağı, 20) deaçilaz, 21) serin hidroksimetiltransferaz. Kısaltmalar: AA, amino asid; ZKA, zincir α-ketoasidler; GlcN-6-P, glukozamin-6-fosfat; GS-NO, glutatiyon-nitrik oksid kompleksi; KG, α-ketoglutarat; LOO -, lipid peroksil radikali; LOOH, lipid peroksid; NAS, N-asetilsistein; OTK, L-2-oksotiyazolidin-4-karboksilat; R, radikal gruplar; R, radikal olmayan gruplar; R-5-P, ribuloz-5-fosfat; X, elektrofilik ksenobiyotikler. 22
Karaciğer hücreleri dışında, eritsositler de oldukça yüksek bir GSH üretim/tüketim hızına sahiptir. Sağlıklı bireylerde kandaki GSH nin tamamının 1,5 gün içinde yenilendiği gösterilmiştir (182). Eritrositler insanlardaki total GSH biyosentezinin yaklaşık % 10 undan sorumludur (182). 1.2.3.4.1.3 GSS ile GSH Sentezinin Düzenlenmesi Oksidatif ve nitrozatif stres, inflamatvar sitokinler, kanser, kemoterapötik ajanlar, iyonize edici radyasyon, GSH yıkımı ve konjugasyonu, prostaglandin A 2, ağır metaller, antioksidanlar ve insülin pek çok hücrede GSS üretimi ya da aktivitesini artırmaktadır (181). Bunların aksine, proteinden fakir diyet, deksametazon, eritropoietin, tümör büyüme faktörü-α, hiperglisemi ve GSS fosforilasyonu, GSS nin üretimini ve aktivitesini azaltır. Oksidatif stres, inflamatuvar sitokinler ve bütiyonin sülfoksimin (BSO) ile oluşturulan GSH sentez inhibisyonu, nükleer faktör-κb aracılığıyla GSS ekspresyonunda upregülasyona neden olmaktadır (181, 283). GSS aktivitesinin, enzimin sülfür grubunun NO donörleri tarafından nitrolanması sonucu azaltması, NO ve GSH metabolizması arasındaki ilişkiye dikkat çekmektedir (181). inos aktivitesine bağlı olarak NO üretiminde meydana gelen artış, nöronlarda ve sitokinler tarafından aktive edilen makrofajlarda GSS inhibisyonuna ve sonuç olarak GSH sentezinde azalmaya neden olmaktadır (34). Bu bağlamda, glukozamin, taurin, fitoestrojenler, polifenoller ve karotenoidler gibi inos ekspresyonunu inhibe edebilen moleküllerin (295), hücre GSH düzeyini azalmasını engelleyebileceği önerilmektedir (294). Yağdan zengin diyet, uzun zincirli doymuş yağ asidleri, düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL), linoleik asid ve demir gibi inos ekspresyonunu ve NO üretimini artıran moleküller ise hücrelerdeki GSH kaybını artırmaktadır (295). 1.2.3.4.1.4 GSH Sentezinin Amino Asidler ile Düzenlenmesi GSH yapısındaki amino asidlerden biri olan sisteinin hücre içindeki düzeyleri, GSH ile taşınan sistein ile karşılaştırıldığında oldukça düşüktür (62). Güncel çalışmalarda sisteinin 23
GSH sentezinde hız sınırlayıcı amino asid olduğu gösterilmiştir (62, 126, 182). Hücrelere sist(e)in alınmasını artıran faktörlerin hücre içi GSH konsantrasyonunu artırdığı bilinmektedir (181). Ayrıca, sistein ya da prekürsörlerinin oral yoldan veya intravenöz olarak verilmesi GSH sentezini artırmakta olup, çeşitli nütrisyonel ve patolojik şatlarda ortaya çıkabilen GSH yetmezliğini engelleyebilmektedir (283). Sistein temelde hepatositlerde, transsülfürasyon yolağı ile metiyonin katabolizması sonucu üretildiğinden, diyetle alınan metiyonin miktarının artırılması in vivo GSH sentezini destekleyebilir (294). Sistein, ekstraselüler sıvılarda okside olarak sistine dönüşmektedir. Bu nedenle sisteinin plazma konsantrasyonu (10-25 µmol/l), sistine göre (50-150 µmol/l) oldukça düşüktür. Sistein ve sistin farklı tipte membran taşıyıcıları ile hücre içine alınabilmektedir (181). Bununla birlikte, hepatositlerin ekstraselüler sistini hücre içine alma yetileri çok sınırlıdır. Karaciğerden salıverilen GSH, hücre membranının dışında sistini sisteine indirgeyerek hepatositler tarafından alınabilmesini sağlamaktadır. Endotel hücreleri gibi diğer hücre tipleri ise sistini hücre içine alma yetisine sahiptir (Şekil 1-10). Hücre içine alınan sistin daha sonra sisteine indirgenmektedir. Hücre içinde ve dışında oluşan glutamat GSH sentezinde kulanılabilmektedir (242). Diyetle alınan glutamat neredeyse tamamen ince barsaklar tarafından kullanıldığı için, plazmada bulunan glutamat temelde de novo sentez edilerek ya da protein yıkımı ile elde edilmektedir. Fosfata bağımlı glutaminaz, prolin-5-karboksilat dehidrogenaz, zincir amino asid transaminaz ve glutamin/fruktoz-6-fosfat transaminaz glutamat üretiminde katalizör enzimlerdir (Şekil 1-10). Bununla birlikte bu enzimlerin önemleri hücre ve doku tiplerine göre değişkenlik gösterebilmektedir. Glutamin enterositler, sinir hücreleri, hepatositler ve lenfositler gibi pek çok hücre tipinde, GSH sentez edilmesinde kullanılan glutamatın prekürsörüdür (131). Parenteral beslenme çözeltilerine glutamin eklenmesi reperfüzyon hasarı, iskemi, asetaminofen toksisitesi, kemoterapi, inflamatuvar stres ve kemik iliği nakli 24