Mantar İnfeksiyonlarında Mikrobiyolojik Tanı Dr Dilek Yeşim Metin Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Bornova-İzmir
Mantar infeksiyonları Bağışık sistemi normal konak Bağışık sistemi baskılı konak Yüzeyel infeksiyon Fırsatçı, sistemik infeksiyon
Riskli hasta sayısı İnvazif mantar enf Nadir türler
Sistemik mantar infeksiyonları-etkenler Maya mantarları Küf mantarları A-spergillus Candida türleri Trichosporon spp Cryptococcus neoformans Blastoscizomyces capitatus Malassezia spp Rhodotorula rubra Sacchoromyces cerevisia Z-ygomycetes Aspergillus türleri Zygomycetes türleri Fusarium spp Scedosporium apiospermum Paecilomyces spp Trichoderma spp Acremonium spp Scopulariopsis spp Arthrographis spp Chaetomium spp Schizophyllum spp
Bağışık baskılı hastalarda mikrobiyolojik tanı zor!! Genel durum bozuk ve örnek alımı zor Klinik silik, odak belirsiz Enfeksiyonun laboratuvar göstergeleri yok Mikroorganizmalar çeşitli ve zor ürüyor Mikroskopi yorumlaması zor Etken mantarsa tanı daha da zor!!!
Tanı Klinik Mikrobiyoloji Histopatoloji Radyoloji DM ve kültür Yardımcı tanı testleri Duyarlılık testleri
Mantar infeksiyonlarının tanısına yönelik Mikoloji Laboratuvarına gelen örnekler... Antifungal tedavi öncesi alınmalıdır!!!!! & Anaerobik transport besiyerleri kullanılmamalı!!!!
Mantar kültürü için örnek alma kriterleri, bakteri kültürü ile büyük benzerlik göstermekte! Örnek miktarı; Mantar kültürü > bakteri kültürü Üreme şansını artırır!!!
Mikoloji laboratuvarına gelen örnekler Yüzeyel örnekler Deri, kıl, tırnak kazıntı ve sürüntüleri & Sistemik infeksiyon örnekleri Kan Solunum yolu örnekleri (!) Steril boşluk sıvıları Doku biyopsileri BOS İdrar (!) Steril bölgelerden alınan örnekler invazif mantar hastalıklarının tanısı için ÖNEMLİDİR!
Laboratuvar Tanı 1. Konvansiyonel yöntemler a. Direkt mikroskobik inceleme Direkt örnek bakısı KOH preperatı ile örnek değerlendirme Gram boyası Kalkoflor beyazı ile floresan mikroskobik değerlendirme Çini mürekkebi b. Kültür 2. Serolojik testler a. Antijen arama testleri Galaktomannan (1,3) B-D glukan Mannan b. Antikor arama testleri 3. Moleküler yöntemler 4. Duyarlılık testleri
Laboratuvar Tanı Direkt mikroskobik inceleme Kültür sonuçlarının değerlendirilmesinde yardımcı
Bağışık sistemi baskılanmış hastada mikroskobi daha iyi sonuç verir Fakat mikroskobi ile kültürü karşılaştıran çalışmalar yapılmamıştır BAL örneklerinde mikroskobik değerlendirme > kültür & Mantar infeksiyonu için daha erken tanı! Bochennek K., Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2006; 12:199-201
Laboratuvar Tanı Kültür Altın standart Cins ve tür düzeyinde tanımlama Türe özgü olası direnci belirleme Antifungal duyarlılık testi
Mikroskobik inceleme ve kültürde duyarlılık neden istenilen düzeyde değil? Uygun örnek alınmasındaki zorluklar Örnekteki mantar miktarı azlığı??? Üreme olan örneklerde değerlendirme Bilgi ve deneyim eksikliği
Kültür Enfeksiyon odağına ait belirtiler yoksa Enfeksiyon odaklarına kolay ulaşılamıyorsa Sistemik mikoz şüpheli hastada ilk incelenecek örnek KAN KÜLTÜRÜ
Kültür KAN KÜLTÜRÜ Lizis santrifügasyon yöntemi altın standart Otomatize kan kültür sistemleri Bactec (BD Diagnostic system, Sparks, Md.) BacT/Alert (biomérieux, Marcy l Etoile, France) Otomatize sistemlerin performansı, lizis santrifügasyon ile uyumlu Current Drug Targets, 2006; 7: 513-22
Kısıtlayıcı durumlar Kan Kültürü Kandidemili olgularda duyarlılığı %50 Fusarium dışındaki küflerde çok düşük!
Kültür Solunum örnekleri en basit ve en ucuz örnek BALGAM!!!!! Sürüntü örnekleri (Boğaz, burun, nazofarinks, tonsil) DTA, TTA BAL BASP Plevra sıvısı Akciğer Biyopsisi
Kültür bağışık sistemi baskılanmış hastalarda en ideal örnek BAL!!! bir küf mantarına bağlı alt solunum yolu enfeksiyonu şüphesinde en uygun örnek!!! DOKU > BAL > DTA > BALGAM
Kısıtlayıcı durumlar Solunum örnekleri Kontaminasyon? Kolonizasyon? İnfeksiyon?
Kısıtlayıcı durumlar Solunum örnekleri Küfler 3 örnekte aynı etken üremeli!! Mayalar ağız sürüntü örnekleri ile birlikte değerlendirilmeli
İzole edilen Aspergillus un etken kabul edilme kriteri Direkt incelemede hifal elemanların görülmesi & İzole edilen küfle direkt incelemenin uyumu & Aynı plakta birden fazla mantar kolonisinin bulunması & Farklı örneklerde aynı küfün izolasyonu & İzole edilen küfün 37 0 C de üreyebilmesi
Kontaminasyon? Kültür-idrar İzlem Kolonizasyon? KANDİDÜRİ Karar? Üriner sistem enfeksiyonu? Dissemine enfeksiyon? Doz Amfoteresin B
Kültür İdrar YB, organ nakilli, bağışık sistemi baskılı hastalarda tür düzeyinde tanımlanmalı (!) Kandideminin belirtisi (!) Edwards JE. International conference for the development of a concensus on the management and prevention of severe candidal infections. Clin Infect Dis 1997;25:43-49
Kolonizasyon-Enfeksiyon Risk faktörü O Semptom/bulgu O Lökositoz O KOLONİZASYON (?) Piyüri ve lökositoz, idrarda yalancı hif varlığı ÜS enfeksiyonu için kesin tanı kriteri değil Piyüri histolojik olarak kanıtlanmış renal kandidozu olan hastaların %61 inde saptanmış Kozinn PJ et al. Advances in the Diagnosis of Renal Candidiasis J. Urol. 1978
Kolonizasyon-Enfeksiyon >10.000 cfu/ml ÜS enfeksiyonunda anlamlı olduğu ileri sürülmüş kesinlik kazanmamış! Uzun süreli sondası olan hastalarda (=kolonizasyon) Risk faktörlerinin ortadan kaldırılması ile kandidüri düzelebilir Kozinn PJ et al. Advances in the Diagnosis of Renal Candidiasis J. Urol. 1978 Richardson MD, Warnock DW. Fungal infection-diagnosis and management. 2 nd ed. Oxford: Blackwell Science, 1997:78-93; 131-48 Edwards JE. International conference for the devolepment of concensus on themanagement and prevention of severe candidal infections. ClinInfect Dis 1997; 25: 43-59
Kolonizasyon-Enfeksiyon Kantitatif sonuçlar; tür identifikasyonu ile anlamlı! C. albicans, gebeler İYE ile ilişkili bulunmamış! C. glabrata, idrarda saptanması İYE lehine C. tropicalis, 10 3-10 5 cfu/ml İYE ile ilişkili olabilir Ahearn DG, Janach JR, Roth EJ. Speciation and densities of yeasts in human urine specimens. Sabouraudia 1966: 5; 110-119. Hazen KC, Stei J, Darracott C, Breathnach A, May J, Howell SA. Isolation of cholesterol-dependent Candida glabrata from clinical specimens. Diagn Microbiol Infect. 2005: 52; 35-37.
Kontaminasyon Kolonizasyon? Enfeksiyon? Tekrarlayan kültürlerde üremenin devam etmesi Hastanın klinik tablosu
Nasıl değerlendiriyoruz? Kandidürili hastada, kültürdeki yüksek koloni sayıları tek başına enfeksiyon bulgusu olarak kabul edilmemeli! İdrar kültüründe üremesi olan hastanın kültürleri, enfeksiyonu doğrulamak için tekrar edilmeli! İdrar kültürünü değerlendirirken, perianal ve vaginal bulaşı dışlamak için, eş zamanlı kültür değerlendirmesi yapılmalı!
Tanı-Diğer yöntemler Steril örnek alımındaki kısıtlamalar (özellikle pansitopenik hastalarda) Var olan kültürel yöntemlerin zaman alışı Etken mantar izolasyonundaki başarı oranının çok yüksek olmayışı Üreyen etkeni değerlendirmede sorunlar Serolojik yöntemler Moleküler yöntemler
Serolojik Testler Etken Antijen/antikor/enzim/metabolit Klinik örnek C. neoformans Kapsül polisakkarit BOS, serum Aspergillus Galaktomannan (GM) Serum (BAL) (BOS?, idrar?) Tüm mantarlar (Zygomycetes ve C. neoformans hariç!) (1,3) B-D-glukan Plazma/serum Candida Mannan, anti-mannan Serum, BOS Candida D-arabinitol Serum Candida Enolaz Serum
Cryptococcus neoformans antijen testleri Polisakkarit yapıda kapsül antijeni Tüm serotipler için uygun Trichosporon infeksiyonlarında da (+) Titreler genellikle 1/8 BOS, serum Duyarlılık AIDS li olgularda %100 AIDS dışı hastatarda %86-95, özgüllük %93-98
Serolojik yöntemler-galaktomannan Mayıs 2003 FDA onayı Serumda 0.5-1 ng/ml GM saptama Sonuçlar; GMI ile ifade edilmekte Başlangıçta üretici firma Pozitiflik 1.5 ng/ml ABD ve Avrupa da Pozitiflik 0.5-1.5 ng/ml Günümüzde üretici firma, FDA, ABD, Avrupa GMI (+) sınır değeri 0.5 ng/ml
Galaktomannan testinin performansı: Allta yatan hastalığın ciddiyetine (Hematolojik malignite, KİT, SOT) Etkenin invazyonuna (damar duvarı, apse, kavite ) Etkenin türüne (A. fumigatus, diğer) Alınan örnek sıklığına (haftada bir, iki, diğer) Kaç olumlu örneğin olumluluk kabul edileceğine (tek, ardışık iki) göre değişir.
Serolojik yöntemler-galaktomannan Cut-off 1.5 Cutoff; 0.5 189 hasta Kanıtlanmış: 5 Yüksek olasılıklı: 9 Düşük olasılıklı: 26 Duyarlılık; %78.6 Özgüllük; %93.9 PPD; %55 NPD; %97.9 Duyarlılık; %100 Özgüllük; %65.7 Kanıtlanmış invazif Aspergillus sinüzitli 1 olgu GM (-) Lai CC, Hsu HL, Lee LN, Hsueh PR. Assesment of Platelia Aspergillus enzyme immunoassay for the diagnosis of invasive aspergillosis. J Microbiol Immunol Infect 2007: 40; 148-153.
Serolojik yöntemler-galaktomannan Yoğun Bakım hastalarında duyarlılık Serum X BAL; %47 X %100 Serum X BAL; %44 X %89 Meersseman W, Lagrou K, Maertens J, Wilmer A, Hermans G, Vanderschueren S, Spriet I, Verbeken E, Wijngaerden EV. Galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid: a tool for diagnosing aspergillosis in intensive care unit patients. Am J respir Crit Care Med 2008: 177; 27-34 Becker MJ, Lugtenburg EJ, Cornelissen JJ, Van Der SC, Hoogsteden HC, De Marie S. Galactomannan Detection in computerized tomography-based broncho-alveolar lavage fluid and serum in haematological Patients at risk for invasive pulmonary aspergillosis. Br J Haematol 2003: 121; 448-457. BAL da özgüllük; %87 BAL için FDA onayı yok İA riskli hastalarda çalışılması öneriliyor Wheat LJ et al. Diagnosis of invasive aspergillosis by galactomannan antigenemia detection using enzyme immunoassay. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2008; 27: 245-251.
Serolojik yöntemler-galaktomannan Performans benzer 11 IA lu hasta Cutoff 0.5 ve 1 119 akciger nakilli (takip) 66 diger organ nakilli (tanı amaçlı) 56 saglıklı kontrol IA Duyarlılık %81.8 (serum ve BAL) Duyarlılık BAL da daha yüksek! Cut-off 1 iken özgüllük Husain S, Clancy CJ, Nguyen MH, Swartzentruber S, Leather H, LeMonte AM, Durkin MM, Knox KS, Hage CA, Bentsen C, Singh N, Wingard JR, Wheat LJ. Performance characteristics of the Platelia Aspergillus Galactomannan Antigen in Bronchoalveolar Lavage fluid. Clin Vaccine Immunol. 2008: 15; 1760-1763
Serolojik yöntemler-galaktomannan GMI; 0.5 Yanlış pozitif sonuçlar!! Tüm pozitif sonuçlu örnekler; başka bir alikotla tekrarı! & Sonucun ayrıca yeni bir örnekle doğrulanması! & Riskli hastalarda haftada en az 2 kez yapılması!
Kısıtlayıcı durumlar Yalancı (+) erişkinlerde %5 Yalancı (-) Serumların biriktirilmesi
Serolojik yöntemler- 1-3, -D-glukan İnvazif infeksiyonlarda tanıya yardımcı Kolorimetrik, kinetik bir test Fungitel (Glucatell), 2004, FDA onayı Serum, plazma Non-spesifik (!) Zygomycetes ve Cryptococcus dışında çoğu mantar Duyarlılık %100 e yakın, özgüllük %90 Bakteri infeksiyonları sırasında özgüllük %58-%77
Serolojik yöntemler-galaktomannan- 1-3, -D-glukan En az 2 örnekte pozitiflik BG > GM İA: 22 Diğer küf enf: 17 Kandidemi:22 GM: 414 serum BG: 404 serum GM (cut off: 0.5) Duyarlılık (%) Özgüllük (%) PPD (%) NPD (%) A. fumigatus (n:69) 13 99 90 66 A. fumigatus dışı türler (n: 39) 49 99 95 86 Diğer küfler (n: 77) 6 99 83 62 BG (cut off: 80) A. fumigatus (n:69) 61 88 75 79 A. fumigatus dışı türler (n: 39) 64 88 64 88 Diğer küfler (n: 77) 47 88 72 72 Hachem RY, Kontoyiannis DP, Chemaly RF, Jiang Y, Reitzel R, Raad I. Utility of galactomannan enzyme immunoassay and (1,3) -D-glukan in diagnosis of invasive fungal infections: Low sensitivity for Aspergillus fumigatus infection in hematologic malignancy patients. J Clin Microbiol. 2009: 47; 129-133.
Serolojik yöntemler- 1-3, -D-glukan Duyarlılık ; özgüllük 60 pg /ml 80 pg /ml 120 pg /ml %65-100 ; %87-96 %60-100 ; %64-99 %83-88 ; %90 Pickering JW, Sant HW, Bowles CAP, Roberts WL, Woods GL. Evaluation of a (1-3)- -D-glucan assay for diagnosis of invasive fungal infections. J Clin Microbiol 2005; 43:5957-5962. Ostrosky-Zeichner L, Alexander BD, Kett DH, et al. Multicenter clinical evaluation of the (1-3)- -D-glucan assay as an aid to diagnosis of fungal infections in humans. Clin Infect Dis 2005; 41:654-659.
Serolojik yöntemler- 1-3, -D-glukan Hematolojik maligniteli (n: 100) tanı öncesinde %78 hastada BG (+) Ellis M, al-ramadi B, Finkelman M, Hedstrom U, Kristensen J, Ali-Zadeh H, Klingspo L. Assessment of the clinical utility of serial β-d-glucan concentrations in patients with persistent neutropenic fever. J Med Microbiol. 2008: 57; 287 295.
Serolojik yöntemler- 1-3, -D-glukan TOPLAM 279 HASTA İnvaziv enf:117 Kontrol: 162 İA:70 Kandidemi:27 PJ: 20 3 yöntem birlikte; Maliyet Tanısal performans Persat F, Ranque S, Derouin F, Michel-Nguyen A, Picot S, Sulahia A. Contribution of the (1, 3) β-d-glucan Assay for Diagnosis of Invasive Fungal Infections. J Clin Microbiol. 2008:46; 1009 1013.
Serolojik yöntemler- 1-3, -D-glukan Yüzeyel infeksiyon ve kolonizasyonda olumsuz! Fusarium, Trichosporon, Saccharomyces gibi daha nadir görülen etkenlerin ciddi infeksiyonlarında tanı! Antifungal sağaltımdan etkilenmiyor (!) Tarama testi olarak umut verici!
Serolojik yöntemler- mannan Candida infeksiyonlarında! İnvazif infeksiyonla kolonizasyonu ayırt etmede yetersiz! Tek serumla çalışmak yetersiz Nötropenik olmayan hastalarda duyarlılık düşük Antikor ve antijen testleri kombine kullanımı
Sistemik kandidozların serolojik tanısı Antijen ve antikor testlerinin birlikte kullanımı Duyarlılık Özgüllük Mannan % 29-41 % 92-98 Anti-mannan % 47-79 % 88-94 Birlikte % 75-91 % 84-89 Prella M, Bile J, Pugnale M, et al. Early diagnosis of invasive candidiasis with mannan antigenemia and antimannan antibodies. Diagn Microbiol Infect Dis 2005; 51:95-101.
Moleküler yöntemler Çok sayıda çalışma var! DM ve kültüre göre duyarlılıkları yüksek (%63-100) Doku, kan, BAL vb klinik örnek çeşitlerine uygulanabilir SORUN DNA ekstraksiyonu için optimum yöntemi Onay almış standart test yöntemi yok! Arendrup MC, Fisher BT, Zaoutis TE. Invasive fungai infections in the paediatric and neonatal population: diagnostics and management issues. CMI. 2009: 15; 613-624. Xavier MO, Oliveria FM, Severo LC. Laboratory diagnosis of pulmonary mycose. J Bras Pneumol. 2009: 35; 907-919
Duyarlılık Testleri
Riskli hasta sayısı İnvazif mantar inf Nadir türler 2000 1990 1980 1970 1960 1950 Ekinokandinler Yeni azoller AmB lipit formülasyonları Terbinafin Itrakonazol Flukonazol Ketonazol Mikonazol Klotrimazol 5- flusitozin Griseofulvin Amfoterisin B Nistatin Duyarlılık çalışmaları!!!!!!!!!!!
CLSI (Clinical and Laboratory Standarts Institute) Kılavuzları 1992 1998 M27P 2003 M38P 1982 CLSI-AFDT Alt komitesi 1995 M27T 1997 M27A 2002 M27A2 M44P 2004 M44A 2009 M44A2 2002 M38A 2008 M38A2 2008 M44S3 M27A3 2009 M27S3 M51P M51S1
Candida direnç sınır değerleri Antifungal ilaç S S-DD I R M27A2 Flukonazol 8 16-32 - 64 İtrakonazol 0,125 0,25-0,5-1 M27A3-M27S3 Vorikonazol 1 2-4 Caspofungin 2 - - > 2 Anidulafungin 2 - - > 2 Mikafungin 2 - - > 2
Hangi Durumlarda Yapılmalı? İdentifikasyon çok daha önemli! Steril bölgelerden soyutlanan Candida spp. ( özellikle non-albicans türler) için Direnç görülebilme olasılığı olan türler nedeniyle (örn; C. glabrata - flukonazol) Standart sağaltıma yanıt vermeyen tablolarda (örn. Mukozal kandidoz) Klinik yanıtsızlık durumlarında Epidemiyolojik amaçlarla Araştırma amacıyla
Sonuç-1 Mantar infeksiyonlarının Tanısı Tedavisi Önlenmesi ZOR! Konvansiyonel yöntemler altın standart! Yeni serolojik testler konvansiyonel yöntemlerle birlikte kullanılırsa erken tanıya yardımcı olabilir
Sonuç-2 Laboratuvar-klinik işbirliği Çok önemli!!!