T. C. SAĞLIK BAKANLIĞI SÜREYYAPAŞA GÖĞÜS VE KALP-DAMAR HASTALIKLARI EĞİTİM VE ARAŞTIRMA HASTANESİ Şef Doç. Dr. Attila SAYGI HASTANE ÇALIŞANLARINDA LATENT TÜBERKÜLOZ ENFEKSİYONU TANISINDA TÜBERKÜLİN CİLT TESTİ İLE QUANTIFERON-TB GOLD TESTİNİN KARŞILAŞTIRILMASI Uzmanlık Tezi Dr. Vildan ÇAĞLAYAN İstanbul 2006 1
TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimim boyunca değerli bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım her zaman ilgi ve desteğini gördüğüm yanında çalışmaktan onur duyduğum değerli hocam Klinik Şefi Doç. Dr. Attila Saygı ya teşekkür ederim. Eğitimim boyunca bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım Klinik Şefleri Dr. Armağan Hazar, Dr. Melahat Kurutepe, Şef Yardımcıları Dr. Filiz Süngün, Dr. Özlen Tümer, Dr. Gülfem Yurteri, Göğüs Cerrahisi Klinik Şefi Doç. Dr. Bülent Arman a, şef yardımcısı Dr. Canan Dudu ya; Eğitimim sırasında kendilerinden pek çok şey öğrendiğim bugüne gelmemde emek sahibi olan daima hoşgörü ve sevgi gösteren güzel anılarla hatırlayacağım Uz. Dr. Müge Özdemir ve Uz. Dr. Esra Öztürk e; Tez çalışmalarımı beraber yürüttüğüm yardımlarını ve desteğini asla unutamayacağım her zaman yanımda hissettiğim gösterdiği dostluktan onur ve mutluluk duyduğum, birikim ve deneyimlerinden faydalandığım tez danışmanım Uz. Dr. Gül Dabak a; Uz. Dr. Zeliha Arslan, Uz. Dr. Dilek Bandak ve Biyokimya Laboratuar çalışanlarına ve Yeşim İçel e; Tez çalışmam sırasında TCT yaptıran ve kan veren tüm hastane çalışanlarına; Birlikte çalıştığım asistan arkadaşlarıma, başta kliniğimizin hemşireleri olmak üzere tüm servis hemşire ve personeline; Tezime katkılarından dolayı, Kartal Eğitim ve Araştırma Hastanesi Enfeksiyon Hastalıkları Bölümünden Uz. Dr. Öznur Ak a; Kartal Eğitim ve Araştırma Hastanesi Biyokimya Laboratuarı çalışanlarına İç hastalıkları rotasyonumu yaptığım Kartal Eğitim ve Aratırma Hastanesi nden 2. Dahiliye Klinik Şefi Doç. Dr. Birsel Kavaklı, Enfeksiyon Hastalıkları Klinik Şefi Dr. Serdar Özer ve Haseki Hastanesi Radyoloji Klinik Şefi Dr. Murat Ulusoy a Destekleri ve sevgileriyle her zaman yanımda olan yeğenlerime ve aileme; En içten duygularımla teşekkür ederim 2
SİMGELER VE KISALTMALAR ABD: ARB: BCG: CDC: CFP-10: DSÖ: ELISA: ELISPOT: ESAT-6: FDA: GTA: HAİ: HIV: INF-γ: LTBI: NTM: PPD: QTF: QTF-G: RD1 geni: TB: TCT: Amerika Birleşik Devletleri Aside dirençli basil Bacille Calmette Guerin Centers for Disease Control and Prevention Culture filtrate protein Dünya Sağlık Örgütü Enzyme linked immun assay Enzyme linked immunospot Early Secreted Antigenic Target 6kDa protein Food and Drug Administration Geç tipte aşırı duyarlılık Hücre Aracılı İmmünite Human immunodefficiency virus Gamma Interferon Latent tüberküloz enfeksiyonu Nontüberküloz mikobakteri Purified Protein Derivative= Saflaştırılmış protein türevi QuantiFERON-TB QuantiFERON-TB GOLD Region of difference 1 geni Tüberküloz Tüberküloz cilt testi 3
İÇİNDEKİLER GİRİŞ VE AMAÇ..1 GENEL BİLGİLER...3 MATERYAL VE METOD...45 BULGULAR...52 TARTIŞMA..65 SONUÇ VE ÖZET...73 KAYNAKLAR.74 4
GİRİŞ VE AMAÇ Dünya nüfusunun üçte birinin tüberküloz basili ile enfekte olduğu tahmin edilmektedir. 2003 yılında dünyada tahmin edilen tüberkülozlu hasta sayısı 8,8 milyondur (100.000 nüfusta 140) ve 1,7 milyon kişi tüberkülozdan ölmüştür. Küresel insidans, 1990 dan beri artmaktadır; 2002 ile 2003 arasında %5 artmıştır. Ülkemiz için Verem Savaş Daire başkanlığı tarafından Dünya Sağlık Örgütüne (DSÖ) bildirilen (2003 yılı) yeni hasta sayısı 18555 dir. Buna göre ülkemizde tüberküloz (TB) insidansı yüz binde 26 dır (2). TB enfeksiyonu için risk faktörü TB hastası ile temastır, hastane çalışanları da risk altındadır. Amerika Birleşik Devletlerinde (ABD) hastane çalışanlarında tüberküloz oranı 2003 yılında %2,3 ve 2004 yılında %3,2 olarak bildirilmiştir (3). TB olguları ile temas eden sağlıklı kişilerin %5 inde ilk iki yıl içinde aktif TB, %95 inde ise sessiz enfeksiyon yani latent TB enfeksiyonu (LTBI) gelişmektedir. Ayrıca LTBI olgularının %5 i yaşamlarının bir döneminde aktif akciğer tüberkülozuna yakalanmaktadır (4). Latent tüberküloz enfeksiyonu tanısında günümüzde tüberkülin cilt testi (TCT) kullanılmaktadır. Yüzyıl boyunca latent tüberküloz tanısında TCT nin alternatifi yoktu. TCT, Purified Protein Derivative ye (PPD) hipersensivite cevabını ölçüyordu. TCT nin en büyük sınırlaması, PPD de birçok antijen karışımının olması ve M. Tuberculosis, M. Bovis, Bacille Calmette Guerin (BCG) ve nontüberküloz mikobakteri (NTM) ile aynı antijenleri taşımasıydı. Pozitif TCT gerçek M. tüberküloz enfeksiyonunu gösterebildiği gibi BCG veya NTM ye bağlı pozitifliği de gösterebilirdi. Bu sonuçları M. tüberküloza bağlı cevaptan ayırmak kolay değildir ve değişik alt gruplarda pozitiflik değerini seçmek risktir. NTM görülme sıklığının yüksek olduğu ve yüksek BCG aşısı olan popülasyonda TCT nin daha az spesifik olduğu iyi bilinmektedir. Ayrıca bağışıklığı baskılanmış kişilerde anerjiye bağlı olarak, sensivitesi azalabilir ve bu yöntem birçok problem çıkarabilir. Okuma hataları, okuyucular arasındaki değişiklik, eğitimli personel ihtiyacı, testin okunması için kişinin geri dönmesi gereği, pozitif değerin seçimi gibi nedenlerle LTBI tanısı için alternatif tanı yöntemlerine ihtiyaç duyulmuştur (5). Tüberküloz enfeksiyonu tanısında, Early Secreted Antigenic Target 6 kd protein (ESAT 6) ve Culture filtrate protein (CFT-10) adlı proteinlerin tanımlanması büyük bir gelişmedir. Bu proteinler mycobacterium tuberculosis genomunda region of difference 1 (RD1) bölgesinde 5
kodlanmıştır ve BCG ile birçok nontüberküloz mikobakteride bulunmamaktadır (M. kansassii, M. szulgai ve M. marinum hariç). Bunun klinik avantajı; gerçek tüberküloz enfeksiyonunu BCG aşılı kişilerde aşı etkisinden ve NTM enfeksiyonlarının büyük bir çoğunluğundan ayırt edebilmesidir (6). Mycobacterium Bovis ve birçok NTM de bulunmayan, ESAT 6, CFT 10 (Cultere Filtrate Protein 10 kd) ve TB 7,7 antijenleri kullanarak invitro ortamda memory T hücrelerinden salgılanan γ-inf düzeyini ELİSA yöntemi ile ölçen Quantiferon-TB gold testi 2004 yılında FDA onayı almıştır (3, 5). Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (Centers for Disease Control and Prevention CDC) tarafından Sağlık Bakım Kurumlarında Mycobacterium Tuberculosis in Bulaşmayı Önlemeye Yönelik kurallar 2005 yılında ABD de yayınlandı ve burada sağlık çalışanlarında tarama testi olarak Quantiferon TB gold testi önerildi (3). Bizim bu çalışmadaki amacımız, hastane çalışanlarında, TCT ve QTF-G testi kullanarak LTBI sıklığını ölçmek, bu testler arasındaki uyumu belirlemek ve bunların LTBI risk faktörleri ile korelasyonunu saptamaktır. GENEL BİLGİLER MİKROBİYOLOJİ Mycobacterium Yunanca fungus fungus (myces) ve küçük çubuk (bakterion) kelimelerinden türemiştir. İsmin fungus kısmı bu mikroorganizmanın sıvı besi yerlerinde büyüme paterninin mold benzeri olmasından kaynaklanmaktadır ( 7 ). 6
Actinomycetales Mycobacteriaceae Actinomycetaceae Streptomycetaceae Mycobacterium Nocardia Actinomyces Streptomyces NTM M.Leprae M. Tuberculosis complex M. Tuberculosis M. Bovis M. Microti M. Africanum Şekil 1: Mikobakterilerin toksonomik ağacı. Mycobacterium genusu içinde yer alan Mycobacterium tuberculosis complex beş bakteri türü içerir. Bunlar; M. Tuberculosis, M. Bovis, M. Microti, M. africanum, M. Canetti dir (Şekil 1). İnsan M. tuberculosis için tek kaynaktır ve bu mikroorganizma insanlar arasında hastalık yapar. Mikobakteriler gram (+) ya da (-) olarak sınıflandırılamaz. %95 etil alkol ve %3 hidroklorik asit (asit- alkol) mikobakteri hariç tüm bakterileri dekolarize eder. Dolayısı ile asit dirençli basil olarak adlandırılır. Bunun nedeni hücre duvarındaki lipid düzeyinin yüksek olmasıdır. Lipid içeriği gram (+) bakterilerde %0,5, gram (-) bakterilerde %3 iken, mikobakterilerde %25 tir. Basiller Ziehl-Nielsen boyası ile boyanır ve mavi zemin üzerinde kırmızı renkte tek tek ya da gruplar halinde çizgiler oluşturmuş olarak izlenir (8). 7
M. tuberculosis bilinen bakteriler arasında en kompleks yapılı hücre duvarına sahiptir. Biyokimyasal çalışmalar, mikobakteri hücre duvar iskeletinin 3 makro molekülden ibaret olduğunu göstermiştir. Bunlar peptidoglikan, arabinogalaktan ve mikolik asitlerdir. Mikobakteri hücre duvar yapısı Şekil 2 de gösterilmiştir. Şekil 2: Hücre duvarı Peptidoglikan yapı mikobakterilerde hücre duvarının en önemli karekteristiği kemotip-iv peptikoglikan yapıdır. Bu yapı bakteriye şeklini verir, hücre duvarına bütünlük ve sertlik kazandırır. Bu tabakanın üzerinde arabinoz ve galaktozdan oluşan bir polisakkarid olan arabinogalaktan tabakası bulunur. Arabinogalaktanın yapısını oluşturan D-galactofuranoslar ve D- arabinofuranoslar doğada nadir görülür. Arabinogalaktanın zincirlerindeki uç arabinoz birimlerine mikolik asitler bağlanmıştır. Mikolik asitler mikobakterilerde tüm hücre duvarı kuru ağırlığının %50 si ile hücre lipitlerinde %60 ını oluşturur. Mikolik asitler trehalose gibi şekerlere 8
bağlandığında kord faktörü oluştururlar. Virülans ile ilgili olduğu düşünülen bu faktör hücrelerin birbirine dolanmış demetler oluşturarak paralel zincirler halinde üremelerine neden olur. Ayrıca fagositlerin göçünü engelleyip granülom oluşmasını sağlar, toksik etkisi de vardır ( 9). M. tuberculosis in üremesi yavaştır, replikasyon süresi 15 20 saattir. Görünür koloni büyümesi en az 3 hafta genellikle standart kültür ortamlarında 4 6 haftadır. Olumsuz koşullarda oldukça dayanıklıdır ve uzun süre canlı kalabilir (10). TÜBERKÜLOZ TANI YÖNTEMLERİ I-BAKTERİYOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ Tüberkülozun spesifik klinik ve radyolojik bulguları olmadığından ve her zaman doğru sonuç verebilen, kolay uygulanır, ucuz serolojik ve moleküler tanı yöntemleri bulunmadığından, bakteriyolojik tanı yöntemleri dünyanın her yerinde vazgeçilmez yöntemlerdir. Bakteriyolojik muayene, örneklerin direk muayenesi ve kültürü olmak üzere iki şekilde uygulanmaktadır. Direk muayene ucuz, çabuk sonuç veren bir yöntem olması açısından tüberküloz tanısında önemli yer tutar ( 9). a-direk mikroskobik inceleme: M. tuberculosis aranması için alınan materyaller balgam, açlık mide suyu, solunum sistemine ait diğer örnekler (bronş lavajı, bronkoalveolar lavaj, transbronşial biyopsi gibi), idrar, beyin omurilik sıvısı, gayta, doku ve diğer vücut sıvılarıdır. Akciğer tüberkülozunda en sık balgam örneğine başvurulur. Balgam ardı ardına 3 gün, sabah erken saatlerde, steril, geniş ağızlı, kapağı sıkı kapatılabilen plastik kutulara alınmalıdır. Alınan tüm örnekler hızla laboratuara ulaştırılmalıdır. Yaymalar direk materyalden hazırlanabileceği gibi, dekontaminasyon işlemi sonrası örnek santrifüj edildikten sonra (homojenizasyon) teksif hazırlanabilir. Steril bölgelerden alınan materyallere dekontaminasyon işlemi uygulamaya gerek yoktur. Mikobakteriler kimyasal ajanlara daha dayanıklı olduklarından, bu özellikleri kullanılarak dekontaminasyon işlemi gerçekleştirilir. En sık kullanılan yöntem, N-asetil-L-sistein %2 NaOH (NALC NaOH) yöntemidir. NALC 9
disülfid bağlarını kopararak mukolitik etki, NaOH ise dekontaminasyon yapar (11). Hazırlanan yaymalar boyanır. Boyama metodları karbolfuksin ve florokrom metodları olarak ikiye ayrılır. Karbolfuksin metodları; Ehrlich-Ziehl-Neelsen (EZN) ve Kinyoun metodudur. Florokrom metodunda ise preparat Auramin 0 ile boyanır ve flüoresan mikroskopta incelenir. Ehrlich-Ziehl-Neelsen (EZN) metodunda; üzerine materyal alınan lam alevde tespit edilir, üstüne tam örtecek şekilde karbolfuksin boyası konur. Kaynatmadan 3 4 dakika ısıtılır, sonra boya dökülür, %5 asit-alkol ile dekolorize edilir. Distile su ile yıkanır. Metilen mavisi ile 20 30 sn boyanır, distile su ile yıkanır ve kurutulur. Preparatlar 100X imersiyon objektifinde incelenir. Bu işlemler sonunda mikobakteriler mavi zemin üzerinde kırmızı çomaklar halinde görülür. sonuçlardır. Direk balgam mikroskopisinde en önemli sorunlar yanlış pozitif ve yanlış negatif Yanlış pozitif sonuçlar: Balgamdaki yemek artıkları, boya parçacıkları, saprofit aside dirençli bakteriler, atipik mikobakteriler, nokardia, çam poleni, iplikçik, lamdaki çizikler, başka balgamdan bulaşma, imersiyon yağı ile bulaşma, aynı lamın tekrar kullanımı. Yanlış negatif sonuçlar: Balgam toplanmasındaki yetersizlikler, balgam örneklerinin ve boyanmış preparatların uygunsuz korunmaları, homojenize edilmeyen balgamda uygun yerden örnek alınmaması, tekniğe uygunsuz boyama, okuma hataları (12). KÜLTÜR Kültür yöntemleri tüberküloz tanısında halen altın standart olmaya devam etmektedir. Mikobakteri kültür yöntemlerini klasik katı besiyerleri ve hızlı kültür yöntemleri olarak ikiye ayırmak olasıdır. A-KATI BESİYERLERİ Yumurtalı besiyerleri: Besiyerlerinin görünümü opaktır. Patates unu, gliserol, tuz, tam yumurta veya pateses sarısı içermektedir. Bugün en yaygın kullanılan, Lövenstein-Jensen (LJ) besi 10
yeridir. Ayrıca bu grupta Petragani ve American Trudeau Society gibi besiyerleri de bulunmaktadır. Agar bazlı besiyerleri: Middlebrook 7H10 ve Middlebrook 7H11 agar en çok tercih edilenlerdir. Kimyasal içerikleri daha iyi bilinmektedir. B-HIZLI KÜLTÜR YÖNTEMLERİ Hızlı kültür yöntemlerinin esası sıvı besiyerleridir. Sıvı kültürler ile mikobakterilerin saptanması katı besiyerlerinden yapılan klasik kültür yöntemlerine göre daha kısa sürede daha yüksek duyarlılıkta olmaktadır. Otomatize hızlı kültür yöntemleri: MGIT (Mycobacterium Growth İndicator Tube) 960 Sistemi (BD Biosciences, MD, ABD): İçlerinde modifiye Middlebrook 7H9 sıvı besi yeri bulunan tüpler kullanılır. Sistemin esası, tüpün dibindeki silikona gömülü oksijenle bileşik halde bulunan fenetrolin rutenyum klorid pentahidrat adındaki florensan veren bir indikatörün mikobakteri tarafından tüpteki oksijen tüketmesine bağlı olarak serbest kalması sonucu flüoresansın açığa çıkması ve açığa çıkan flüoresansın cihaz tarafından otomatik olarak her 60 dakikada bir sürekli okunmasıdır. BACTEC 460TB Sistemi (BD B iosciences) BACTEC 460 TB sistemi, Middlebrook7H12 (BACTEC 12B) veya Middlebrook 7H13 (BACTEC 13A) sıvı besi yeri ile karbon kaynağı olarak C14 işaretli palmitik asit içeren radyometrik bir sistemdir (13). II. SEROLOJIK TANI YÖNTEMLERİ İmmünolojik tanı için hem klinik örneklerde mikobakteriyel antijenlerin gösterilmesi, hem de bu antijenlere karşı oluşan antikorların saptanmasına çalışılmaktadır. Geliştirilen yöntemler arasında immunodiffüzyon, pasif hemaglütinasyon, ELİSA flüoresan antikor, solid faz radyoimmünoassay bulunmaktadır. Serolojinin yüksek tanı değerine sahip olduğu diğer hastalıklardan farklı olarak, tüberkülozda, klinik kullanım için duyarlı, özgül ve pratik bir yöntem geliştirme çabaları başarısız kalmıştır. Özgüllük konusunda temel sorun, infekte olmak ile hastalık 11
varlığı ayrımının yapılamamasıdır. Daha önce yapılmış olan BCG aşısına bağlı olarak serolojik reaksiyon da sorun oluşturmaktadır. Bu durum, serolojik inceleme gibi basit bir testin yarar sağlayacağı gelişmekte olan ülkelerde özellikle anlamlıdır. Bu gibi ülkelerde nüfusun yaklaşık %40 ında latent tüberküloz infeksiyonu vardır ve önemli sayıda insan M. bovis BCG si ile aşılanmıştır. Diğer önemli bir konu da NTM lere bağlı enfeksiyondan M. tuberculosis enfeksiyonunun ayrımıdır. Tüberkülozun serolojik tanısında hangi antijenin kullanılması gerektiği, sadece antijen tanınması ile sınırlı değildir. Antijen tanınması ile aynı öneme sahip 3 konu daha vardır: 1-Antijen kokteyleri: TB sırasında serumda ortaya çıkan antikorlar tarafından tanınan tek bir antijen veya sık rastlanan bir antijen kombinasyonu olmaması nedeniyle, serolojik tanı testlerinde antijen kokteyleri kullanılmalıdır. Farklı hastalarda, çok az miktarda antikor üretilen immünsüpresyonlu hastalar dahil, çeşitli antikor yanıtları oluşur. Antijen kombinasyonları, bu TB olgularının yakalanma şansını arttırmaktadır. 2- Katı faz: Kokteyl esasına dayanan testlerde solid faz kullanılarak, kokteylde bulunan her antijenin serolojik aktivitesinin tespiti sağlanır. Bu amaca ulaşabilmek için, nitrosellüloz temelli metotlar geliştirilmiştir. 3- Özgül antijen: Çapraz reaksiyon veren epitoplara bağlı yanlış pozitif test sonuçlarından kaçabilmek için, antijenler M. tuberculosis e (veya M. tuberculosis kompleksi) özgül olmalıdır. Ayrıca, tüberkülozun karakteristik özelliği olan heterojen antikor repertuarını karşılayacak şekilde birden fazla antijen seçilmelidir. Panellerdeki antijenlerin seroaktivitesi incelenmiş; 38kd PhoS ve 14 kd alfa kristali ninki en fazla bulunmuştur. Bu iki antijene eklenen diğer antijenler (ESAT 6, MPT64, MPT63, 19 kd lipoprotein, MTSA 10), duyarlılığın artmasını sağlar (14). İmmünolojik tanıda kullanılan testler; a-antijen tespitine dayanan testler: Lipoarabinomannan (LAM), mikobakterinin hücre duvarında bulunan bir lipopolisakkarittir ve doğal mikobakteri infeksiyonu sırasında antikor yanıtını indüklediği biliniyor. 12
b-antikor tespitine dayanan testler: Tüberkülozlu hastaların serumunda mikobakteri antijenlerine karşı oluşan antikorlar monoklonal veya poliklonal antikorlar kullanılarak tespit edilebilir. Çevredeki mikobakterilere çapraz reaksiyonlar nedeniyle yanlış pozitif test sonuçları alınabilmektedir. c-interferon gamma (INF-γ) üretiminin ölçülmesi: TB enfeksiyonunu doğru bir şekilde tespit edebilmek için M. tuberculosis e karşı duyarlılaşmış T lenfositlerinin, in vitro kan testleri ve in vivo deri testleri ile tespit edilmesine dayalı testler geliştirilmiştir. Perifer kandan elde edilen mononükleer hücreler, in vitro şartlarda uyarılır ve duyarlılaşan T lenfositlerinden salınan interferon gama (INF-γ) üretimi ELİSA ile ölçülür. TCT yanıtından sonra, kanda INF-γ tespiti yapan testler (CSL/ QUANTİFERON TB testi) geliştirilmiş ve TB tanısında yayma ve kültür yerine kullanılabileceği bildirilmiştir. Bu testte; M. tuberculosis, M. avium ve M. bovis den elde edilen TCT lerle stimülasyondan sonra, tam kandaki T lenfositleri tarafından üretilen INF-γ ölçülür. INF-γ ELİSA sonuçları ile hasta ve kontrol grubundan elde edilen TCT sonuçları arasında iyi bir korelasyon vardır. QUANTİFERON-TB testinin duyarlılığı %90 ve özgüllüğü %95 98 bulunmuştur Plevra tüberkülozunda, INF-γ duyarlılığının %85,7 ve özgüllüğünün %97,1 olduğu kültür ve plevra biyopsisi ile doğrulanmıştır. HIV pozitif ve negatif hasta sonuçları benzerdir. Rekombinant antijenler kullanılarak BCG aşılılarda etkileşim engellenmiştir. İn vivo deri testlerinden TCT ye alternatif olarak kullanılan ESAT-6 ve CFP 10 gibi antijenler de, INF-γ indüksiyonu amacıyla kullanılmıştır. ESAT-6, özgül bir antijen ve tüberkülozlu hastalarda T lenfositleri tarafından üretilen INF-γ nın güçlü bir indükleyicisidir. M. tuberculosis genomunda RD ile gösterilen farklı bölgeler bulunur, M. bovis genomundaki RD bölgeleri silinmiştir. RD1 bölgesi, tüberküloza bağışıklık yanıtı sırasında ortaya çıkan ESAT 6 salınımını sağlar. ESAT 6 antijeni TB hastalarının T lenfositleri tarafından tanınırken, BCG ile aşılı veya aşısız sağlıklı kişilerin T lenfositlerince tanınamamaktadır. Tedavi edilmeyen hastalara göre tedavi edilen tüberkülozlu hastalarda INF-γ düzeyi artar ve bu durum tüberküloza bağışıklık yanıtını gösterir. Bu nedenle, tüberkülozlu hastaların izlenmesinde faydalı olabilir (14). 13
Şekil 3: Antijen tanıma ve gamma IFN salınımı Seroloji, özellikle klinik ve radyolojik TB bulguları olmayan hastaların hızlı tanısını sağlar. Röntgen bulguları doku hasarından sonra ortaya çıkarken hastalığın başında üretilen antikorlar serolojik olarak erkenden tespit edilebilir. Ayrıca çocuklarda serumun elde edilmesi balgamdan daha kolay olduğu için daha çok tercih edilebilir. Seroloji akciğer dışı TB tanısına da yardım eder. BCG ile aşılılarda gelişen hücresel yanıtlardan da etkilenmemesi önemli bir avantajıdır. Serolojik kitler, humoral yanıt sonunda üretilen antikorları tespit ettiğinden BCG den etkilenmez. Bazı serolojik tanı kitleri kantitatif sonuçlar vermektedir. Tedavi sırasındaki titre değişimleri hastaların izlenmesinde kullanılabilir (14). III. MOLEKÜLER YÖNTEMLER Tüberkülozun moleküler tanısında genellikle nükleik asitteki hedef bölgenin çoğaltılması esasına dayanan yöntemler kullanılmaktadır. 1- Nükleik Asit Hibridizasyon Yöntemleri Nükleik asit hibridizasyon yöntemleri, örnekteki hedef nükleik asit dizisinin, komplementeri olan işaretli bir prob ile birleştirilmesi (hibridizasyon) esasına dayanmaktadır. Böylece mikobakterilerin kromozomal DNA veya ribozomal RNA larının, bunlara özgül olarak bağlanabilen DNA veya RNA probları yardımı ile, tür düzeyinde belirlenmesi sağlanabilmektedir. 14
Bu yöntemlerin özgüllüklerinin çok yüksek olmasına karşın duyarlılıkları fazla yüksek değildir. Prob olarak kullanılan moleküllerin örneğe yeterince bağlanabilmesi için örnekte çok sayıda nükleik asit bulunması gerekmektedir. 2- Nükleik Asit Çoğaltma Yöntemleri Bu yöntemler, aranan etkende bulunan özgül bir nükleik asit dizisinin, saptanması mümkün bir düzeye ulaşana kadar çoğaltılması esasına dayanmaktadır. Hedef nükleik asit dizisi, özgül primerler ve enzim kullanılarak çoğaltıldıktan sonra, çeşitli yöntemler kullanılarak saptanırlar. Nükleik asit çoğaltma yöntemleri ile örnekteki çok az miktardaki mikroorganizmanın saptanabilmesi mümkündür. Ancak bu yöntemler örnekteki inhibitörlerden etkilenebilir ve kontaminasyona duyarlıdır. Bu iki sorun hibridizasyon yöntemlerinde görülmez. A. Nükleik asitte hedef bölgenin çoğaltılması 1- Polimerz Zincir Reaksiyonu (PCR): PCR yöntemi, çoğaltılması istenen DNA örneğinin, DNA replikasyonu için gerekli maddelerle birlikte, üç değişik ısıda bir siklus içerisinde tutulması esasına dayanır. Denatürasyon, birleşme ve replikasyon basamakları sonrasında hedef DNA çoğaltılmış olur. PCR ile M. tuberculosis in balgam, plevral sıvı, abse içeriği, BOS, idrar ve biyopsi materyali gibi klinik örneklerde saptanması mümkündür. PCR ile klinik örneklerde 10 kadar basilin saptanabilmesi mümkün hale gelmiştir. Ancak duyarlılığı bu derece yüksek olan bir yöntemin yalancı pozitif sonuçları da birlikte getirmesi kaçınılmazdır. Örneklerin PCR için hazırlanması sırasında, bakteri ya da eski PCR ürünlerinin bulaşması zaman zaman önemli sorunlar doğurabilmektedir. Yöntemin güvenilirliğinin sağlanabilmesi için örneklerle birlikte mutlaka bir negatif ve bir pozitif kontrol çalışılmalı, sonuçlar klinik bulgular ve diğer laboratuvar yöntemleri ile bir arada değerlendirilmelidir. Çoğaltılan ürünlerin elektroforez yapılmaksızın saptanmasına yönelik olarak yapılan çalışmalar sonucunda, otomatize PCR sistemleri ve real time PCR yöntemleri geliştirilmiştir. 2-Transkripsiyon Bazlı Amplifikasyon (TMA): Tüberküloz tanısında kullanılabilen izotermel bir RNA amplifikasyon yöntemidir. Transkripsiyon bazlı olan bu yöntem, RNA 15
polimeraz ve revers transkriptaz enzimleri yardımıyla RNA çoğaltılması esasına dayanır. RNA nın DNA ya göre daha labil olması nedeniyle, kontaminasyon riski daha düşük, özgüllük daha yüksektir. B. Nükleik asit üzerinde özgül probların çoğaltılması LCR (Ligase Chain Reaction): DNA saptanması amacıyla geliştirilmiş bir prob hibridizasyon-ligasyon yöntemidir. Bu sistem primerlerden amplikon üretmek yerine, termostabil ligaz enzimi yardımıyla prob çoğaltılması esasına dayanır. PCR da olduğu gibi termel döngü cihazına gereksinim vardır. Termostabil ligaz enziminin kullanıldığı LCR ile sadece iki primer boyu kadar uzunlukta amplikonlar elde edilir. Denatürasyon sonrasında kalıp tek zincirli DNA üzerindeki hedef dizilere yan yana yerleşen oligonükleotid problar, termostabil ligaz enzimi yardımı ile birleştirilebilirler (ligasyon). Ligasyona uğramış oligonükleotid çiftleri ve orijinal diziler bir sonraki siklusta kalıp olarak kullanılır ve tekrarlayan sikluslar sonrasında milyarlarca hedef dizi üretilir(15). TÜBERKÜLOZ EPİDEMİYOLOJİ 1-Tüberküloz mortalitesi: Bir toplumda 1 yılda tüberkülozdan ölenlerin oranıdır.uygun tedavi olanaklarının gelişmesi ile birlikte günümüzde tüberküloz mortalitesi çok azalmıştır. 2-Tüberküloz insidansı: Bir toplumda 1 yıl içinde bulunan yeni tüberkülozlu olgu oranıdır. Tüberküloz insidansı, bakteriyolojik incelemenin tanım ve kalitesine, yeni olgu tanımı ve olgu bulma çalışmalarına, kayıt ve ihbar sistemine çok yakından bağlı olduğu için güvenilirliği tartışmaya açıktır. 3- Tüberküloz prevalansı: Belirli bir zamanda bir toplumdaki tüm tüberkülozlu hastaları gösterir. Tüberküloz prevelansının önemi bir toplumdaki infeksiyon kaynaklarının miktarını göstermesidir. 4- Tüberküloz enfeksiyon prevelansı: Tüberküloz enfeksiyonu organizmanın tüberküloz basili ile karşılaşıp buna karşı bir alerjik reakısiyon geliştirmesidir ve bu da BCG aşısı yapılmamış 16
kişilerde TCT pozitifliğine karşılık gelir. Enfeksiyon prevelansı sonuçta toplumdaki basille karşılaşmış olguların oranını, bir başka deyişle enfeksiyon havuzunu gösterir. Ancak BCG aşısının rutin yapıldığı ülkelerde enfeksiyon prevelansını değerlendirmek zordur. 5- Yıllık enfeksiyon riski (YER): Bir toplumda belirli yaş grubundaki tüberküloz basili ile enfekte olmamış kişilerin bir yıl içinde enfekte olma olasılığıdır. Yıllık enfeksiyon riski çalışmaları tüberkülin testi ile yapıldığı ve olgu bulma ve kayıt sistemlerinden etkilenmediği için, tüberküloz prevelans ve insidansından daha kolay ve nesneldir(16). TÜBERKÜLOZ PATOGENEZİ Evre I: Başlangıç Evresi (Birinci Hafta) TB basilinin inhalasyonu ile başlar. İnsanlarda erken dönemdeki lezyonlardan örnek almak pek mümkün olmadığından, erken histopatolojik lezyonlar sadece deney hayvanlarında yapılan çalışmalar ile tanımlanmıştır. Bu evrede alveolar makrofajların mikrobisidal gücü ve basilin virülans özellikleri sonucu belirler. Alveoler makrofajlar basilin akciğere yerleşip yerleşmemesinde belirleyici rol oynar.enfeksiyonun gelişmesine karşı konak direnci ise kısmen genetik kontrol altındadır. Sıçanlarda tüberküloz duyarlılığının otozomal dominant bir gen ( Bcg geni) tarafından kontrol edildiği ve benzer bir uzantının insnalarda ikinci kromozomun uzun kolunda olduğu ileri sürülmüştür. Bcg geni T lenfositlerden bağımsız olarak makrofaj aktivasyon düzeyini belirlemektedir. Evre II: Basillerin Çoğalma ve Yayılma Evresi (2-3. Hafta) (simbiozis) Bu evrede TB basili yaşamak için kendisinin makrofajca alınmasına yardımcı olmak zorundadır. Güçlü virülan basil alveolar makrofaj içinde çoğalır, makrofajı parçalar ve sekrete edilen kemotaktik faktörlerin etkisi ile dolaşımdaki inaktif makrofajların lezyon bölgesine gelmesine neden olur. İnaktif makrofajların sitoplazmalarındaki sitoplazmik vaküoller, basilin çoğalması için ideal bir ortamdır. Bu aşama konak ve basilin tam bir ortak yaşam sergiledikleri dönemdir, her ikisi de birbirine zarar vermemektedir. Basil yüklü makrofajlar, lenfatiklerle bölgesel 17
lenf nodlarına taşınır, burada da kontrol altına alınamazlarsa lenfohematojen yol ile tüm vücuda yayılarak çoğalmaya devam ederler. Çünkü hücresel immün yanıt henüz gelişmemiştir. Evre III: Hücre Aracılı İmmün Yanıt ve Geç Tip Aşırı Duyarlılığın Gelişimi (3 9 hafta) Bu evrede lezyonlardaki basil sayısı hücresel immün yanıt ile yok edilemeyecek kadar fazladır. Gelişen geç tip aşırı duyarlılık yanıtı basillerin logaritmik çoğalmasını durdurur ve oluşan granülomların merkezinde kazeöz nekroz odaklarının gelişmesine yol açar. Bu odaklarda basiller canlılıklarını sürdürebilir, fakat uygun olmayan ortam koşulları nedeniyle artık çoğalamazlar. Kazeöz dokulardaki basillerin bir kısmı ölür, bir kısmı dorman halde kalırlar. Basil çoğalmasının önlenmiş olmasının bedeli doku hasarı olmuştur. Basilin akciğerlerde ilk yerleştiği orta alt akciğer zonlarındaki primer lezyon (Ghon odağı), hiler ve paratrakeal lenfatiklerle birlikte primer kompleksi oluşturur (17). Hücre aracılı immünite (HAİ), geç tip aşırı duyarlılık (GTA) gelişmesi ile ilgili bugünkü kavramsal yaklaşım Şekil 4 ve 5 te gösterilmiştir (18). 18
Şekil 4: Edinsel hücre direnci ve doku hasarı yapan immün yanıtın gelişmesi ile ilgili bugünkü kavrayış 19
Şekil 5: Tüberkülozda erken immün yanıtın bir sonucu olarak aşağıdakiler olur: Tüberküloz immünopatogenezinde temel rol oynadığı düşünülen kemokinler ve sitokinler Tablo 1 da özetle belirtilmiştir. rolleri Tablo 1: Temel sitokinler ve bunların tüberküloz immünite ve patogenezindeki belirgin 20
21
Yukarıda sözü edilen faktörlerin etkisi altında TB basilinin çoğalma yerine/yerlerine çekilen makrofajlar aktif hale gelirler. Aktivasyon, basil çoğalmasını durdurma ya da hücre içi mikropları öldürme yeteneği de dahil değişik morfolojik, biyokimyasal ve fonksiyonel değişiklikleri tanımlamak için kullanılan geniş bir terimdir. Bu olay sonuçta cilde enjekte edilen tüberküloproteinlere gecikmiş tipte aşırı duyarlılık olayına yol açar. Bu TCT temelini oluşturur. TCT primer enfeksiyondan sonra yaklaşık 3 8 hafta içinde genellikle pozitifleşir. Normal konakçıların çoğunda, akciğerdeki primer lezyon ve aynı zamanda mikropların yayıldığı distal yerler edinsel hücresel direnç ya da HAİ etkisi ile sınırlanır. Ancak bazı konakçılar, tüberkülozu kontrol edebilecek immün yanıtı oluşturmada özellikle daha az yeteneklidirler. Bu kişilerde basil yayılması ilerleyici, kesintiye uğramamış bir şekilde görülür, primer infeksiyonu izleyerek haftalar-aylar içerisinde klinik olarak açık TB ile hasta hale gelirler. Primer enfeksiyona dayanabilen bireylerde bir reaktivasyon riski devam etmektedir, bu, değişik doku bölgelerinde canlı basillerin varlıklarını sürdürmesine bağlıdır. Tüberkülozun reaktivasyonunda en sık ve anlamlı yer akciğerlerin apeksleridir. 22
EVRE IV: Hücre Aracılı İmmün ve Geç Tip Aşırı Duyarlılık Yanıtları Arasındaki Karşılıklı Etkileşim İmmün sistemi yeterli kişilerde eğer kazeöz odak erimezse, gelişen süreç hücre aracılı immün yanıt ile durdurulur. Tüberkülin etrafı fibröz bir duvarla çevrilerek ortadaki kazeöz odak koyulaşır ve süreç yaşam boyu durdurulur. Ancak kazeöz odaktan basil kaçışı olur ve basil aktive makrofajlar tarafından tutulup yok edilemezse geç tip aşırı duyarlılık yanıtı tekrarlanarak makrofajlar öldürülmeye devam edilecek, gelişen kazeöz nekroz daha geniş ve şiddetli olacaktır. Gelişen 0,1 1,3 mm çapındaki kazeöz odaklar makrofajlar tarafından hiç iz bırakmadan temizlenir, 2 8 mm çapında olanlar hidrolitik enzimlerle eritilir ve geride fibröz bir doku oluşur, 5 20 mm çapındakiler ise çevresi fibröz bir kapsülle çevrili tüberkülomları oluşturur. Sonuçta immün sistemi yeterli kişilerde basillerin yok edilmesi ile süreç durdurularak, sadece TCT pozitifliği ile primer enfeksiyon ortaya çıkmaktadır. İmmün sistemi baskılanmış kişilerde ise genişleyen kazeöz nekrozların akciğerde doku hasarına neden olduğu ve klinik olarak primer TB geliştiği bildirilmiştir. Evre V: Erime ve Kavite Oluşumu Bu evre genellikle primer enfeksiyon veya hastalık sonrası endojen reaktivasyon ya da eksojen reinfeksiyon sonrası gelişen yetişkin tip akciğer tüberkülozunda görülmektedir. Nadiren primer tüberkülozda hücresel immün yanıt yeteri kadar güçlü olsa bile süreç ilerleyip kavite oluşabilir. Kavite gelişiminin nedeni tam bilinmemekle birlikte lezyon bölgesine gelen makrofajlardan salınan hidrolitik enzimlerin etkisiyle geç tip aşırı duyarlılığın sorumlu olabileceği düşünülmektedir. Son zamanlarda mikobakterilerin makrofajları uyararak matriks metalloproteinazlarının yapımını arttırdıkları ve bu enzimlerin de kollojen I-IV ü harap ederek kavite oluşturdukları ileri sürülmektedir (17). M. TUBERCULOSİS E SPESİFİK ANTİJENLERİN PATOGENEZDEKİ ROLLERİ M. tuberculosis kompleks ine karşı özgül antijen ilk kez Harboe ve arkadaşları tarafından gösterilen 24 kda ağırlığındaki MPT64 antijeni olup M. Bovis ve M tuberculosis kültür filtratlarında gösterilmiş fakat BCG örneklerinde gösterilememiştir (19) Bu gözlem daha sonra PCR hibridizasyon yöntemiyle MPT64 ü kodlayan genin bulunmasını sağlamış ve bu genin bazı BCG alt suşlarında olmadığı bulunmuştur. İnsanlarda yapılan çalışmalarda MPT64 antijeninin orta derecede lenfosit yanıtına yol açtığı ve TB hastalarında düşük oranda cevap alındığı gözlenmiştir 23