LEVREK BALIKLARINDA (DICENTRARCHUS LABRAX) PROBİYOTİK OLARAK LACTOBACILLUS RHAMNOSUS KULLANILMASININ PERFORMANS ÜZERİNE ETKİSİ

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ LEVREK BALIKLARINDA (DICENTRARCHUS LABRAX) PROBİYOTİK OLARAK LACTOBACILLUS RHAMNOSUS KULLANILMASININ PERFORMANS ÜZERİNE ETKİSİ Fatma YAMAN ÖZTÜRK MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Ömer M. ESENDAL 2007 - ANKARA

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ LEVREK BALIKLARINDA (DICENTRARCHUS LABRAX) PROBİYOTİK OLARAK LACTOBACILLUS RHAMNOSUS KULLANILMASININ PERFORMANS ÜZERİNE ETKİSİ Fatma YAMAN ÖZTÜRK MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Ömer M. ESENDAL Bu tez, Türkiye Bilimsel ve Teknik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) tarafından TOVAG 104-O-496 proje numarası ile desteklenmiştir. 2007 - ANKARA

İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Çizelgeler i ii iv vi vii viii 1.GİRİŞ 1 1.1. Balıkların Mikroflorası 1 1.1.1. Balık Yumurtalarının Mikroflorası 1 1.1.2. Balıkların Bağırsak Mikroflorası ve Etkili Olan Faktörler 2 1.1.3. Canlı Yemlerin Mikroflorası 5 1.1.4. Bağırsak Mikroflorasında Lactobacillus ların Yeri 7 1.2. Probiyotiklerin Tanımı 9 1.3. Probiyotiklerin Etki Mekanizması 10 1.3.1. Bağırsak Kolonizasyonu ve Geçirgenliği 10 1.3.2. Antagonistik Aktivite 12 1.3.3. Bağışıklığın Uyarılması 16 1.4. Akuatik Hayvanların Sindirim Sisteminin Probiyotikler İçin Uygunluğu 19 1.5. Karasal Hayvan Probiyotiklerinin Balıklarda Kullanımı 21 1.6. Probiyotik Olarak Kullanılan Türler 24 1.6.1. Canlı Yem Kültüründe Probiyotik Olarak Kullanılan Bakteri Türleri 24 1.6.2. Balıklarda Probiyotik Olarak Kullanılan Bakteri ve Maya Türleri 26 1.7. Levrek Yumurtası ve İnkübasyonu 31 1.8. Levrek Yetiştiriciliği ve Yetiştirme Koşulları 31 1.9. Levrek Larvalarının Beslenmesi 32 2. GEREÇ VE YÖNTEM 34 2.1. Gereç 34 2.1.1. Balık Materyali 34 2.1.2. Probiyotik 34 2.1.3. Besiyerleri ve Kimyasallar 34 2.2. Yöntem 35 2.2.1. Larva Yetiştiriciliği 35 2.2.2. Probiyotik Bakteri Üretimi 35 2.2.3 Deneme Gruplarının Oluşturulması 37 2.2.3.1. Birinci Deneme Grubu (Deneme 1) 37 2.2.3.2. İkinci Deneme Grubu (Deneme 2) 37 2.2.3.3. Kontrol Grubu 38 2.2.4. Canlı Yemin Hazırlanması 38 2.2.5. Canlı Yeme Probiyotik İlavesi 38 2.2.6. Bağırsak Florasının Tespiti 39 i

2.2.7. Artemia daki Bakteri Yükünün Tespit Edilmesi 39 2.2.8. Larvalarda Deformasyon Oranının Tespiti 40 2.2.9. İncelenen Parametreler 40 2.2.10. İstatistik Analizler 41 3. BULGULAR 42 3.1. Bağırsak Flora Bulguları 42 3.2. Artemia daki Bakteri Yükü Bulguları 46 3.3. Larval Deformasyon Bulguları 46 3.4. Larval Dönemde Ağırlık Artışı Bulguları 47 3.5. Yavru Dönemdeki Balıkların Aylık Ağırlık Artışı (S.G.R) Bulguları 48 3.6. Yavru Dönemdeki Balıkların Yem Değerlendirme Oranı (F.C.R) 51 Bulguları 3.7. Larval Yaşama Oranı Bulguları 53 3.8. Yavru Dönemdeki Balıkların Yaşama Oranı Bulguları 53 4. TARTIŞMA 55 5. SONUÇ VE ÖNERİLER 64 ÖZET 66 SUMMARY 67 KAYNAKLAR 68 ÖZGEÇMİŞ 76 ii

ÖNSÖZ Dünyadaki gelişimine paralel olarak ülkemizde de balık yetiştiriciliği artan bir ivme ile hızlı bir gelişme göstermektedir. Son yıllarda hızlı nüfus artışının yanı sıra beslenme tarzı değişen dünyada su ürünlerinin insan beslenmesindeki önemi daha çok anlaşılmaya başlanmıştır. Nüfustaki bu artışa paralel olarak karasal alanlarda azalacağından sürekli artış gösteren hayvansal protein açığının kapatılabileceği kaynaklar içinde, balık yetiştiriciliği önem kazanmıştır. Deniz ve iç sulardan avcılık yoluyla elde edilen ürünün dışında yetiştiricilikle de azımsanmayacak miktarda üretim yapılmaktadır. Ülkemizde 2004 verilerine göre 44.115 tonu içsu, 49.895 tonu da deniz balıklarından olmak üzere toplam 94.010 ton ürün yetiştiricilik yoluyla elde edilmiştir. Türkiye son 15-20 yıl içinde deniz kültür balığı üretiminde önemli bir mesafe kat etmiştir. Deniz kültür balığı üretim ve besiciliğinde ekonomik değeri yüksek çipura ve levrek türlerinde, özellikle, levrek yetiştiriciliğinde kayda değer bir üretim çizgisi yakalamıştır. Mevcut 300 ü aşkın deniz kültür balıkçılık tesislerinde, 2004 yılında 46.737 ton çipura ve levrek balığı üretilmiştir. Söz konusu üretimin % 60-70 i ihraç edilmekte, diğer bölümü iç tüketimde pazarlanmaktadır. Bu da ülke protein açığının kapatılmasına az da olsa katkı sağlamaktadır. Su ürünleri yetiştiriciliğinin gelişimine bağlı olarak ortaya çıkan hastalık problemleri ağır ekonomik kayıpları da beraberinde getirmektedir. Bu nedenle hastalığı önleyici ve hastalık direncini arttırıcı metotlar kullanılarak, hastalıklarla mücadelede etkili stratejinin belirlenmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Bakteriyel hastalıklar balık kuluçkahanelerindeki ölüm nedenlerinin başlıcaları olarak görülmektedir. Bakteriyel hastalıkları önlemek ve yem dönüşümünü artırmak için geniş spektrumlu antibiyotikler yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu antibiyotiklerin çiftlik hayvanlarında yoğun olarak kullanımı, antibiyotiklerin dokularda birikmesine ve bağırsaktaki faydalı mikrobiyal popülasyonun azalması gibi normal bağırsak florasının dengesinin bozulmasına, antibiyotiklere dirençli bakteri generasyonlarının oluşmasına neden olmaktadır. Bu tür direnç, diğer türlere de geçebilmekte, mevcut genomun değişimine yol açmakta ya da plazmidler veya bakteriyofajlar aracılığıyla genetik materyalin hücreler arası transferine neden olmaktadır. Akuakültürde patojenlerden ileri gelen hastalıkların sayıca artış gösterdiği görülmektedir. Bu durumu düzeltmek için; daha iyi besleme, su kalitesinin iyileştirilmesi, düşük stoklama yoğunluğu, immünostimülant kullanımı ve aşı iii

uygulamaları gündeme gelmiştir. Larval dönemde balıkların aşılanamaması nedeniyle fırsatçı patojenler çoğalarak mortalite artışına neden olmaktadır. Bu nedenle spesifik olmayan immün sistemin veya bağırsak mikrobiyal florasının geliştirilmesi gereklidir. Yavru balıklar tam olarak immünokompetent değildir ve her zaman aşıya cevap vermemektedir. Ayrıca enjeksiyon yöntemiyle aşılamanın küçük ve çok sayıdaki balığa uygulanması pratik değildir. Bu nedenle larva bakım tanklarında sağlıklı mikrobiyal ortam oluşturmak amacıyla alternatif yöntemler gereklidir. Endüstride kabul gören bu tür yöntemlerden biri potansiyel patojenlerin kontrolü için probiyotik bakteri kullanımıdır. Probiyotik kullanımı; hastalıkların yol açtığı hayvan ölümlerinin azalması yoluyla üretim maliyetinin düşürülmesini sağlarken, antibiyotik kullanımında meydana gelen azalmalarla insan sağlığını riske atmayacak kalitede ürünlerin elde edilmesine olanak tanıyacaktır. Böylece hem iç hem dış pazarların talep ettiği kaliteli ve ucuz ürünler elde edilerek rekabet şansı artırılacaktır. Araştırmanın tüm aşamasını destekleyen danışman hocam Prof. Dr. Ömer M. ESENDAL başta olmak üzere, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Nejat AYDIN ve öğretim üyeleri; Prof. Dr. Müjgan İZGÜR, Prof. Dr. K. Serdar DİKER, Prof. Dr. Hakan YARDIMCI ve Prof. Dr. Mehmet AKAN a, Tez İzleme Komitesi üyesi Prof. Dr. Semih ÖGE ye, istatistik analizlerin gerçekleştirilmesinde yardımlarını esirgemeyen Doç. Dr. Mehmet ORMAN a, denemeler sırasında çalışmaya özveri ile katılan HATKO A.Ş. çalışanlarına ve eşim Engin ÖZTÜRK e teşekkürü bir borç bilirim. Bu tez çalışması Türkiye Bilimsel ve Teknik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) tarafından TOVAG 104-O-496 proje numarası ile desteklenmiştir. iv

SİMGELER ve KISALTMALAR FCR Feed Conversion Ratio (Yem değerlendirme oranları) FTS Fizyolojik tuzlu su KA Kanlı Agar Kob Koloni oluşturan birim MRSA Man, Rogosa and Sharpe Agar PCA Plate Count Agar PDA Potato Dekstroz Agar SGR Specific Qrowth Rate (Spesifik büyüme oranı) TCBSA Thiosulfate-citrate-bile-sucrose Agar VRBA Violet Red Bile Agar v

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1.1. Yemleme rejimine bağlı olarak görülen bakteriyel türler 21 Şekil 3.1. Deneme grupları arasında belirlenen larval deformasyon oranları 47 Şekil 3.2. Gruplara göre ağırlık artışlarının değişimi 48 Şekil 3.3. Balıklarda belirlenen spesifik canlı ağırlık artışı (S.G.R) değişimi 49 Şekil 3.4. Deneme boyunca kafesteki balıklar tarafından tüketilen toplam yem 53 miktarları Şekil 3.5. Balıklarda belirlenen aylık mortalite oranları 54 vi

ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1.1. Probiyotik bakterilerin konakçıda kalma süreleri 12 Çizelge 1.2. Lactobacillus spp. DS-12 in pisi balığının bağırsak florası 15 üzerindeki etkisi Çizelge 1.3 Balıklarda probiyotik olarak kullanılan bakteri türleri 25 Çizelge 1.4. Maya katkılı diyetlerle yemlenen levrek larvalarında yaşama 27 ve deformasyon oranları Çizelge 1.5. Carnobacterium spp. uygulanan balıkların bağırsaklarında ve 30 yetiştirme suyunda tespit edilen bakteri sayıları Çizelge 2.1. Larva yetiştirme periyodunda sağlanan çevresel koşullar 36 Çizelge 2.2. Deneme boyunca larva döneminde uygulanan çalışma 36 takvimi Çizelge 3.1. Deneme gruplarındaki balık larvalarının bağırsak floraları 43 Çizelge 3.2. Toz yem verilen balık larvalarının bağırsak floraları 44 Çizelge 3.3. Artemia larvalarında belirlenen koloni sayıları 46 Çizelge 3.4. Larval deformasyon oranları 47 Çizelge 3.5. Gruplara göre periyodik ağırlık artışlarının aritmetik 47 ortalamaları Çizelge 3.6. Balıklarda belirlenen spesifik canlı ağırlık artışı (S.G.R) 49 Çizelge 3.7. Kafeslerde belirlenen parametreler 50 Çizelge 3.8. Balıklarda aylık olarak belirlenen F.C.R değerleri 51 Çizelge 3.9. Deneme boyunca kafesteki balıklar tarafından tüketilen yem 52 miktarı Çizelge 3.10. Balıklarda belirlenen aylık mortalite oranları 54 vii

1. GİRİŞ 1.1. Balıkların Mikroflorası 1.1.1. Balık Yumurtalarının Mikroflorası Sağlıklı balıklardan elde edilen yumurtaların hemen hemen hepsinin steril olduğu fakat yumurtlama sonrasında yumurta kabuğuna suda bulunan bakteriyel türlerin kolonize olduğu belirtilmiştir (Hansen ve Olafsen, 1999; Ringo ve Birkbeck, 1999). Bakteriyel kolonizasyon yumurtayı ve embriyo gelişimini olumsuz yönde etkilemektedir. Kolonizasyon ile balık yumurtalarının fiziksel yapısı arasında negatif bir korelasyon olduğu belirlenmiştir. Bazı patojenler yumurta kabuğunun zona radiata ve koriyonunu eritmektedir (Olafsen, 2001). Yumurta kabuğundaki glikoproteinler, bakterilerin adhezyon ve kolonizasyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Yumurta yüzeyindeki bakteriyel gelişimin yumurta açılım oranını etkilediği belirtilmiştir. Yumurta kabuğundaki flora tarafından sentezlenen, ekstraselüler proteolitik enzimler, ekzotoksin ve toksik metabolitlerin embriyo gelişimini etkilediği bildirilmiştir (Hansen ve Olafsen, 1999). Düşük yumurta kalitesi larval yetiştirme sistemlerinde ciddi problemlere yol açarak yoğun mortalitelere neden olmaktadır. İntensif inkübasyon teknikleri, bakteriler tarafından yumurtaların hasara uğramasına ve yumurta gelişiminin engellenmesine neden olarak yumurtadan çıkışı, larva sağlığını ve büyümesini etkilemektedir. Yumurta ve larval inkübatördeki mikroflora çiftlik balıklarının kısa ve uzun dönemde sağlıklarının etkilenmesine neden olmaktadır. UV radyasyon, ozonizasyon, membran filtrasyon ve antibiyotik kullanımı gibi çeşitli tekniklerle yumurtalar sterilize edilerek transport sırasında adherent mikrofloranın ve bakteriyel patojenlerin taşınması önlenmektedir. Yumurta epiflorasının uzaklaştırılması ile mikrobiyel heterojenite azalmakta ve yumurtalar fırsatçı bakterilerin kolonizasyonuna uygun hale gelmektedir (Olafsen, 2001). 1

Deniz balığı kuluçkahanelerinde dominant mikroflora % 50 oranında Vibrio, Aeromonas ve Pseudomonas spp. den oluşmaktadır. Balık yumurtalarının mikroflorası yerleşik larval mikrofloranın oluşmasında ve balık sağlığı açısından önemli bir faktör olarak görülmektedir (Hansen ve Olafsen, 1989). 1.1.2. Balıkların Bağırsak Mikroflorası ve Etkili Olan Faktörler Balıklarda sindirim sistemi basit bir tüp şeklindedir, ilk hafta boyunca bağırsak spesifik fonksiyonlarını gerçekleştirmek için uzar, bükülür ve kese halini alır. İlk birkaç gün içinde bağırsak hücreleri çoğalarak yayılır, daha sonra yalnızca bu alanlarda çoğalma devam eder ve mukoza ile kaplanır. Sindirim sisteminin fonksiyonel ve anatomik özellikleri larval gelişim döneminde tamamlanmış olur (Ringo ve Gatesoupe, 1998). Deniz balığı yetiştiriciliğinde, larval dönemin ilk haftalarında larvalarda gastrik sıvı üretimi ve sindirim sistemi gelişmediği için selektif şartlar oluşmamıştır. Yavru ve ergin dönemde sindirim sisteminin tamamı aktif hale gelmekte Vibrio türleri doğrultusunda seleksiyon gerçekleşmektedir. Çipura ve levrek balıklarında 30. güne ulaşıncaya kadar gastrik sıvı tespit edilememiştir (Jöborn ve ark., 1997). Deniz balıklarının bağırsak mikroflorasının özellikleri ve biyolojik önemleri tam olarak bilinmemektedir. Yerleşik bağırsak florasının bazı fonksiyonlarının, beslenme üzerindeki pozitif etkileri ve bakteriyel patojenlerin kolonizasyonuna engel olduğu düşünülmekte, ayrıca patojenik bakteriyel toksinlerin ve metabolitlerin inaktivasyonu, ph ve redoks potansiyelinde değişim, besin ve tutunma bölgeleri için patojenlerle yarışma, spesifik olmayan immün yanıtın uyarılması gibi fonksiyonlarının olduğu da bilinmektedir. Deniz balığı yetiştiriciliğinde yumurtaların inkübasyonu ve açılımı intensif koşullarda yapılmaktadır. Bu sistemde yumurtadan yeni çıkan larvaların sindirim sistemi kısa süre için sterildir. Daha sonra çevrede bulunan bakteriyel populasyonla karşı karşıya gelmektedir (Hansen ve Olafsen, 1989). Balıkların bağırsak florasının su ve yemlerde bulunan bakteriyel türlerin bir yansıması olduğu belirtilmiştir (Blanch ve ark., 1997). Bu mikrofloranın tuzluluk, 2

antibiyotik kullanımı, diyet ve diyet bileşenlerine bağlı olarak değişim gösterdiği belirtilmiştir (Ringo ve ark., 1995). Mikrofloranın dengesi, kullanılan yemler, hayvan fizyolojisi ve immünolojik faktörlerden de etkilenmektedir (Ringo ve Gatesoupe, 1998). Yumurtadan yeni çıkmış balık larvalarının gastrointestinal sistemine ilk olarak kolonize olan bakteriler yumurta epiflorasında ve suda bulunan bakteri türleridir (Hansen ve Olafsen, 1999; Pianas ve ark., 2004). Normal koşullar altında çoğu balık larvası dışarıdan yem almaya başladığında alkali ph nın hakim olduğu mide gelişimi de başlamaktadır (Verreth ve ark., 1992). Yemlemenin başlaması ile yemde ve suda bulunan mikroorganizmalar larval bağırsağa geçmektedir. Balık larvalarında immün sistem gelişmediği için spesifik olmayan savunma mekanizması rol oynamakta olup, ilk bariyeri bağırsak mukozası ve koruyucu bağırsak mikroflorası oluşturmaktadır. Larval aşamada tespit edilen ilk mikrofloranın metamorfozdan sonra balıkların kalıcı florası haline geldiği bilinmektedir (Hansen ve Olafsen, 1999). Deniz balığı larvaları yumurtadan çıktıktan sonra osmoregülasyon nedeniyle su içmeye başlarlar ve bakteriler aktif yemlemenin başlamasından önce sindirim sistemine girerler. Bu dönemde probiyotik bakteri kullanımı ile sindirim sisteminin florasının oluşturulabileceği belirtilmiştir (Olafsen, 2001). Deniz balığı yumurtalarında ve ilk yemleme öncesine kadar larvalarda Cytophaga/Flexibacter/Flavobacterium cinslerinin tespit edildiği, ergin deniz balıklarının bir çok türünde bağırsak florasında baskın türler olarak Vibrio spp., Pseudomonas spp. bulunduğu bildirilmiştir (Bergh ve ark., 1994). Balıkların gastrointestinal mikroflorası üzerinde birçok çalışma yapılmıştır. Balık bağırsağında yaklaşık 10 5 kob/g düzeyinde anaerobik bakteri, 10 8 kob/g düzeyinde aerobik heterotrofik bakteri tespit edilmiştir. Bu sayıların mevsimsel olarak ve gastrointestinal sistemin farklı bölgelerinde değişim gösterdiği bildirilmiştir (Austin ve Al-Zahrani, 1988). 3

Ticari diyetlerle beslenen levrek larvalarında bakteriyel yük 10 9 kob/g (vücut ağırlığı) iken demir tuzları yönünden eksik diyetler kullanıldığında bakteriyel yükün 3x10 8 kob/g olduğu, Artemia kullanıldığında 10 7 kob/g olduğu belirtilmiştir. Demir içeren diyetler kullanıldığında dominant türün Vibrio spp. olduğu bildirilmiştir. Bu Vibrio cinslerinin siderofor, proteaz, fosfolipaz ve amilaz üretebildiği tespit edilmiştir. Konakçı ve bakteri arasındaki interaksiyonda anahtar konu demir varlığıdır. Siderofor üretimi Vibrio anguillarum için önemli bir virülens faktörüdür. Bazı yararlı türlerin probiyotik olarak seçiminde siderofor üretimi dikkate alınmaktadır (Gatesoupe ve ark., 1997). Ringo ve ark. (1995), birçok balık bağırsağından izole ettiği bakteriyel türlerin aerobik yada anaerobik mikroorganizmalar olduğunu belirtmiştir. Genellikle, balık bağırsaklarından izole edilen bakteriyel türlerin yetiştirme ortamından alınan su örneklerinde de bulunduğu bildirilmektedir (Hansen ve ark., 1992; Gatesoupe, 1999). Sağlıklı deniz balığı türlerinin bağırsak floralarından izole edilen bakteriler içerisinde en büyük taksonomik grubu Vibrio, Pseudomonas ve Achromobacter oluşturmakta, bu grupları Micrococcus, Bacillus ve Enterobacteriaceae takip etmektedir (Vine ve ark., 2004). İntensif yetiştirme koşullarında larval yaşama oranı yüksek oranda değişkenlik göstermektedir. Balık bağırsağına ilk kolonizasyon konakçı sağlığı ve gelişimi açısından büyük öneme sahiptir (Ringo ve Vadstein, 1998). İki haftalık levrek balığı larvalarında görülen mortalite sırasında, bağırsakta yüksek düzeyde V. anguillarum ile düşük sayıda diğer Vibrio türleri tespit edilirken Vibrio dışında bakteri türü izole edilmediği belirtilmiştir. V. anguillarum larva, yavru ve ergin dönemdeki deniz balıkları için potansiyel bir risktir. Deniz balığı larvalarının bağırsaklarında V. anguillarum dominant hale geldiğinde hastalık oluştuğu tespit edilmiştir (Grisez ve ark., 1997). 4

Larval yetiştirme periyodunda V. anguillarum ve Vibrio alginolyticus önemli bir role sahiptir. Rotiferlerle yemlenen balıklarda V. anguillarum, Artemia ile yemlenen balıklarda ise V. alginolyticus un hastalıkların ortaya çıkmasından sorumlu tutulan bakteriler olduğu belirtilmiştir (Grisez ve ark., 1997). Larval gelişim aşamasının sonuna kadar Artemia larvaları ile yemlenen çipura ve levrek balıklarının bağırsaklarında Vibrio proteolyticus, Vibrio harveyi ve V. alginolyticus tespit edildiği ve V. alginolyticus un dominant tür olduğu bildirilmiştir (Grisez ve ark., 1997). Gatesoupe (1990), V. alginolyticus sayısındaki artış ile larval yaşama oranı arasında pozitif bir korelasyon olduğunu belirtmiştir. Hayvanların sindirim sisteminde bulunan bazı yararlı bakterilerin mevcudiyetinin, sistemi zararlı bakterilerin üremesini engelleyerek koruduğu düşünülmektedir. Buna karşın balıkların gastrointestinal sistemindeki mikrofloranın rolü tam olarak belirlenememiştir. Ancak balığın beslenme, büyüme ve hastalıklara karşı dayanıklılığında gastrointestinal floranın etkili olduğu bildirilmiştir (Ringo ve Gatesoupe, 1998). 1.1.3. Canlı Yemlerin Mikroflorası Son yıllarda çipura ve levrek balıklarının üretimi hızla artış göstermiş olup, deniz balıkları üretimindeki larval aşamanın çok kritik bir periyot olduğu bilinmektedir. Yumurta kesesinin emiliminden sonra deniz balığı larvaları canlı yem ile beslenmeye başlarlar. Canlı yem olarak kullanılan en iyi tür Artemia spp dir. Larval gelişim aşaması sonlandığında yani metamorfozdan sonra yavru dönemi başlar ve canlı yem yerini kurutulmuş ticari yemlere bırakır (Grisez ve ark., 1997). Artemia lar üretim açısından uygunluğu ve biyokimyasal bileşimi nedeniyle balık larva kültürlerinde yoğun olarak kullanılmaktadır (Verschuere ve ark., 1999). İlk yemleme sırasında kullanılan Artemia larvalarının, balık larvaların gelişimi ve yaşama oranı üzerinde etkili olduğu belirtilmiştir (Olsen ve ark., 2000a). Artemia 5

larvaları balık larvaları için gerekli esansiyel yağ asitlerini karşılamaktadır (Olsen ve ark., 1999). Besin maddeleri, aşılar, antimikrobiyel maddeler ve probiyotik gibi canlı bakteriyel katkıların aktarılmasında vektör olarak kullanılmaktadırlar (Makridis ve ark., 2000). Deniz balığı türlerinde ilk yemleme sırasında yüksek mortalite oranları görülmektedir. Bunun nedeni olarak bakteriyel problemler ve yemler gösterilmektedir. Fırsatçı bakteriyel patojenlerin çoğalma oranı, obligat patojenik bakterilerden daha yüksektir. Bakterilerin en önemli kaynağının canlı yemler olduğu ve bakteri sayısı ile larval mortalite arasında bir korelasyon olduğu bildirilmiştir. Genellikle, canlı yemlerde bulunan bakteriler hemolitik aktivite göstermektedir (Olsen ve ark., 2000b). Artemia larvaları kültüre alınan organizmaların çoğu için en önemli besin kaynaklarından biri olarak kabul edilmektedir. Artemia larvalarının patojenik bakterilerin özellikle de Vibrio spp. nin en önemli kaynağı olduğu belirtilmiş olup, Artemia lardan yapılan ekimlerde TCBS Agar üzerinde 1x10 6-9x10 6 kob/ml düzeyinde Vibrio spp. geliştiği belirtilmiştir. Artemia ların 24 saatlik kuluçka döneminde Vibrio spp. nin dominant hale geldiği belirtilmiştir. Kistlerin açılımı ile kuluçka suyunda organik maddeler ve gliserol artmaktadır. Gliserol Vibrio spp. tarafından kullanılan organik bir maddedir. Başlangıçtaki populasyon yoğunluğu çok düşük olmasına rağmen gliserol nedeniyle Vibrio spp. dominant hale gelmektedir (Lopez-Torres ve Lizarraga-Partida, 2001). Lopez-Torres ve Lizarraga-Partida (2001), 26 ticari Artemia kisti üzerinde yürüttüğü çalışmada, Artemia kistlerinde 10 6 ile 10 8 kob/ml düzeyinde bakteri tespit edildiğini bildirmişlerdir. Bu araştırmacılar, TCBS Agar üzerinden izole ettiği 617 izolattan % 94 ünün Gram pozitif ve yalnızca % 6 sının Gram negatif bakteri türü olduğunu bildirmişlerdir. Artemia daki toplam aerobik heterotrofik bakteri sayısını tespit etmek amacıyla seawater agar ve TCBS Agara ekim yapılmıştır. Seawater nutrient agara yapılan 6

ekimde koloni sayısı 3,8x10 3 ile 8,1x10 3, TCBS deki koloni sayısının ise 9,4x10 2 ile 4,3x10 3 kob/ml düzeyinde olduğu tespit edilmiştir (Hameed ve Balasubramanian, 2000). Olsen ve ark. (2000b), A. franciscana da toplam bakteri sayısını 24,000 ± 10,700 kob/adet (ortalama ± STD) olarak belirlemiş olup, toplam sayının % 58 inin Vibrio ve % 10 nunun hemolitik bakterilerden oluştuğunu belirtmişlerdir. Ticari Artemia larvalarının kuluçka suyundan Gram pozitif ve Gram negatif çomaklar, Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus, Aeromonas cinsleri izole edilirken, kurutulmuş kistlerden Gram pozitif ve Gram negatif çomaklar, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Erwinia herbicola izole edildiği belirtilmiştir (Orozco-Medina ve ark., 2002). Artemia larvaları ağır bakteriyel yük taşımakta olup, yetiştirme sistemlerinde patojen bakterilerin taşınmasında en önemli vektörler olarak kabul edilmektedir (Muroga ve ark., 1987; Nicolas ve ark., 1989). Artemia daki bakteriyel yükün kontrol altına alınarak, kültür sistemlerinde kullanılmadan önce tehlikeli bakteriyel infeksiyonların minimize edilmesi gereklidir. Bu amaçla tatlı su banyoları, kimyasal dezenfeksiyon, ultraviole radyasyon uygulaması ve dondurma işlemi yapılmaktadır. Antibiyotik kullanımı ile mikroorganizmalarda antibiyotiklere direnç oluşmakta, bu direncin patojenik türlere geçmesi ve hastalıkların tedavisi amacıyla kullanılan antibiyotiklerin etkinliğinin azalmasıyla sonuçlanmaktadır (Gomez-Gil ve ark., 1994; Gatesoupe, 2002; Tolomei ve ark., 2004). 1.1.4. Balık Bağırsak Mikroflorasında Lactobacillus ların Yeri Laktik asit bakterileri Gram pozitif, genellikle hareketsiz, spor oluşturmayan kok veya basil formlu, çoğu aerotolerant anaerob, katalaz ve oksidaz negatif bakterilerdir. Laktik asit bakterilerinin farklı türleri, endotermik hayvanların (fare, domuz, kuş ve insan) gastrointestinal sisteminde yaygın olarak bulunmaktadır. Endotermik hayvanlardaki laktik asit bakterileri ile ilgili çok sayıda araştırma bulunmasına rağmen, balığın bağırsak florasında laktik asit bakterilerinin varlığıyla ilgili çok az 7

sayıda araştırma bulunmaktadır. Besiyerindeki glikoz eksikliği ve inkübasyon ısısı gibi sınırlayıcı faktörler nedeniyle balıklardan nadiren laktik asit bakterilerinin izole edildiği belirtilmiştir. Laktik asit bakterilerinin gelişimi için vitamin, aminoasit, ayrıca, karbon ve enerji kaynağı olarak karbonhidrat ilavesi de gerekmektedir (Ringo ve Gatesoupe, 1998). Laktik asit bakterileri, tatlı su balıklarını da içeren çeşitli omurgalı hayvanların gastrointestinal sisteminde yaygın olarak bulunmaktadır. Deniz balıkları ve salmonidlerde Lactobacillus ların varlığı tespit edilmiş olup diğer tatlı su balıkları ile ilgili az sayıda araştırma bulunmaktadır (Ringo ve Gatesoupe, 1998). Deniz balıklarının bağırsaklarında 2x10 3 kob/g düzeyinde Lactobacillus spp. tespit edildiği bildirilmiştir (Jöborn ve ark., 1997). Sağlıklı balıkların gastrointestinal sistemin normal mikroflorasında Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus ve Carnobacterium cinsleri tespit edilmiştir. Tuzluluk, stres, kromik oksit gibi besinsel ya da çevresel faktörler tarafından etkilenen sindirim sistemindeki laktik asit bakterilerinin populasyon düzeyi tam olarak bilinmemektedir. Balık sindirim sisteminden probiyotik özelliğe sahip laktik asit bakterilerinin izole edildiği de belirtilmiştir (Ringo ve Gatesoupe, 1998). Atlantik morina balığının sindirim sistemi, deri ve solungaçlarından laktik asit bakterisi izole edildiği belirtilmiştir. Larva, yavru ve yetişkin dönemdeki ringa (Clupea harengus), Cyprinidae, Escocidae, ve Percidae balık türlerinin normal floralarının bir bölümünü laktik asit bakterilerinin oluşturduğu belirtilmiştir (Ringo ve Gatesoupe, 1998). Laktik asit bakterileri larva ve ergin balıkların normal bağırsak florasında dominant halde olmamasına rağmen, bazı araştırmalarda balık yavrularında laktik asit bakterisinin yapay dominantlığı sağlanmıştır. Laktik asit bakterisinin yüksek dozda ilave edilmesi bağırsak mikrobiyel flora içeriğinin geçici olarak değişimine neden olmuştur. Bakteri ilavesinin kesilmesinden birkaç gün sonra probiyotik bakterinin 8

sayısının hızla azaldığı bildirilmiştir (Jöborn ve ark., 1997; Ringo ve Gatesoupe, 1998). 1.2. Probiyotiklerin Tanımı İnsan ve hayvanlarda patojen mikroorganizmaların bağırsak epitel hücrelerine tutunarak çoğalmalarını engelleyen ve ürettikleri antimikrobiyal metabolitlerle bu mikroorganizmaların üremelerini baskılayan, insan veya hayvanlarda yerleşik mikrofloranın özelliklerini geliştirerek konakçıya faydalı etkileri olan, sağlığın geliştirilmesi ve yem dönüşümünün arttırılmasını sağlayarak pozitif etkiler oluşturan canlı tek ya da karışık mikroorganizma kültürleri probiyotik olarak tanımlanmaktadır (Byun ve ark., 1997; Gatesoupe, 1999). Probiyotiklerin keşfinden uzun süre önce, mikroorganizmalar gıdaların korunması için kullanılmış ve bu deneysel yöntemler insan sağlığını geliştirmeye katkı sağlamıştır. Bu yüzyılın başlarında laktik asit bakterisi, diğer mikroorganizmaların zararlı etkisini baskıladığı görüşüyle insan bağırsağına implante edilmiştir. Probiyotiklerin modern kavramı sadece 25 yıl önce formüle edilmiştir. Probiyotik tanımı farklı şekillerde kullanılmıştır ve ilk olarak Bir protozoon tarafından üretilen ve diğerinin üremesini düzenleyen maddeleri tanımlamak amacıyla kullanılmıştır. 1974 yılında probiyotikler Bağırsak mikrobiyal dengesine katkı sağlayan organizma ve maddeler" olarak ifade edilmiştir (Sissons, 1989). Ancak bu tanımlama antibiyotikler ve kısa zincirli yağ asitlerini de içerdiğinden daha kesin bir tanımlama getirilerek Konakçı hayvanın sindirim sisteminin mikrobiyel dengesini geliştirerek onu yararlı bir biçimde etkileyen canlı mikrobiyel yem takviyesi olarak sınırlandırılmıştır. Bağırsağın mikrobiyal dengesi üzerindeki etkinin birçok durumda gösterilmediği tespit edilerek Sağlığı geliştirmek amacıyla diyet takviyesi olarak verilen mikrobiyal hücreler olarak kabul edilmiştir (Ringo ve Gatesoupe, 1998). Gatesoupe probiyotikleri Sağlığı geliştirmek amacı ile mikrobiyel hücrelerin sindirim sistemine girebilecek ve canlı kalabilecek şekilde düzenlenmesi olarak tanımlamıştır. Gram ve ark. (1999) tanımlamayı Konakçı hayvanın mikrobiyel 9

dengesini olumlu yönde etkileyen canlı mikrobiyel takviye olarak değiştirmiştir. Bu tanımlamalar başlangıçta çiftlik hayvanları ve insanlara uyarlanmıştır. Günümüzde probiyotikler akuakültürde de kullanıldığı için bu tanımlamaların modifiye edilmesi gerekmektedir (Gatesoupe, 1999; Gomez-Gil ve ark., 2000). 1.3. Probiyotiklerin Etki Mekanizması Probiyotiklerin faydalı etkisi, spesifik organizma gruplarına karşı direkt antagonistik etki nedeniyle sayının azaltılması, metabolizma üzerine olan etkileri ya da immün sistemin uyarılması şeklinde gerçekleşir (Fuller, 1989). Probiyotikler, inhibitör bileşikler üreterek, kimyasallar ya da mevcut enerji kaynakları, makro veya mikro besin kaynakları ve tutunma bölgeleri için yarışarak ya da immün yanıtı arttırarak etkili olmaktadır (Smoragiewiez ve ark., 1993). Probiyotiklerin etkili olabilmesi için bazı özelliklerin göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Probiyotik olarak kullanılan bakteriler patojenik ve toksijenik olmamalıdır (Fuller, 1989). Probiyotik bakteriler ya yeme ya da kültür suyuna katılmalı ve bağırsakta kolayca koloni oluşturabilmelidir. Sindirim sisteminde salgılanan safra ile proteolitik ve hidrolitik enzimlere dayanıklı olmalı ve uzun süre canlılığını koruyabilmelidir (Nikoskelainen ve ark., 2001; Fuller, 1989). 1.3.1. Bağırsak Kolonizasyonu ve Geçirgenliği Probiyotikler, infeksiyonları çeşitli etki mekanizmaları yoluyla kontrol altına almaktadır. Bu mekanizmalardan en etkili olanı, enteropatojenlerin konakçının bağırsak sisteminde kolonize olmasını önlemek amacıyla bağırsak epitel yüzeyindeki tutunma bölgeleri için rekabet oluşturulmasıdır (Sönmez ve ark., 1999). 10

Probiyotiklerin gastrointestinal sistem epitellerine tutunma ve kolonizasyonu istenilen en önemli iki özelliktir. Probiyotiklerin tutunan türleri intestinal kanalda uzun süre kalabilmekte ve tutunamayan türlere oranla metabolik ve immünomodülatör etkilerini daha iyi gösterebilmektedir. Tutunma aynı zamanda intestinal epiteldeki patojen bakteri ile rekabet sonucu dışlama sağlamaktadır. İn vitro ortamda patojenlerin tutunma özelliğinin baskılanmasında hem canlı hem de ısı ile inaktive edilmiş L. acidophilus etkili olmuştur. Konakçı spesifitesinin probiyotik bakterilerin istenilen bir özelliği olarak düşünülmesine rağmen, tür spesifikliği tartışılmaktadır. Bununla beraber yapılan çalışmaların bir çoğunda türler arası farklılık üzerinde durulmamış birçok probiyotik ürün farklı türdeki hayvanlarda kullanılmıştır (Anonim, 2006). Çoğalma oranının atılma oranından daha yüksek olduğu durumlarda, bakterilerin bağırsakta uzun süre kalabilecekleri ve bu şekilde bağırsak sisteminde kolonize olabilecekleri belirtilmiştir (Ringo ve Gatesoupe, 1998). Probiyotik hücreler yüksek dozda sürekli ya da kısmen sürekli olarak verildiğinde geçişken bakteri de etken olabilir. Bu nedenle pratikte bağırsakta probiyotiğin kalışını değerlendirmek gereklidir (Çizelge 1.1) (Gatesoupe, 1999). Laktik asit bakterileri yemlere ilave edilerek kullanıldığında konakçının sindirim sisteminde kolonize olmakta fakat yemlemenin kesilmesinden sonra birkaç gün içinde bağırsaktan atılmaktadır (Lidbeck ve Nord, 1993). İnsanlarda kullanılan 6 laktik asit bakterisi L. rhamnosus ATCC 53103, L. casei Shirota, L. bulgaricus, L. rhamnosus LC 705, Bifidobacterium lactis Bb12 ve L. johnsonii La1 ve hayvanlar için kullanılan Enterococcus faecium balıklarda probiyotik olarak kullanılmıştır. İnsanlar için güvenli olduğu bilinen bu türler özellikle seçilmiştir. Mukozal adhezyon, mukozal penetrasyon, patojen gelişimini inhibe etme ve balık safrasına direnç özellikleri dikkate alınarak bu türler seçilmiştir. Patojenik türler olarak da V. anguillarum, A. salmonicida ve Flavobacterium psychrophilum kullanılmıştır. L. casei Shirota hariç tüm laktik asit bakterilerinin 11

balık safrasına tölerans gösterdiği, L. rhamnosus ATCC 53103 ve L. bulgaricus un balık mukusuna diğer türlere kıyasla daha iyi penetre olduğu tespit edilmiştir (Nikoskelainen ve ark., 2001). İnsan probiyotik bakterilerinin özellikle L. rhamnosus ATCC 53103, L. bulgaricus, L. johnsonii La1, and B. lactis Bb12 balık mukusuna çok iyi tutunabildiği belirtilmiştir (Owehand ve ark., 1999). Çizelge 1.1. Probiyotik bakterilerin konakçıda kalma süreleri (Gatesoupe, 1999). Bakteri türü Konakçı Konakçıda kalma süresi Bağırsak bakterisi Kalkan (S. maximus) (J) 7 gün (15 o C) A. media İstiridye (Crassostrea gigas) (L) 2 gün (20 o C) Aeromonas spp. Kalkan (S. maximus) (L) 14 gün (15-20 o C) Bacillus spp. Karides (P. monodon) (Y) n.d. Carnobacterium divergens Morina balığı (Gadus morhua) (L) 9 gün (8 o C) Carnobacterium spp. Gökkuşağı alabalığı (O. mykiss) (Y) 4 gün (11 o C) Lactobacillus spp. Par. olivaceus (Y) n.d. Vibrio alginolyticus Somon (S. salar) (Y) 21 günde (15 o C) Vibrio pelagius Kalkan (S. maximus) (L) 14 günde (17-20 o C) Debaryomyces hansenii Gökkuşağı alabalığı (O. mykiss) (Y) 30 günde (15 o C) Rhodotorula glutinis Gökkuşağı alabalığı (O. mykiss) (Y) 65 günde (8 o C) Y: yavru, L: larva, n.d. tespit edilemedi 1.3.2. Antagonistik Aktivite Probiyotik bakterilerin özelliklerinden birisi patojenlere karşı antagonizmdir. Antagonizm işaretleri organik asit, hidrojen peroksit, siderophor gibi antimikrobiyel maddelerdir (Ashraf, 2000). Konakçı bağırsak sisteminde bakteriler tarafından üretilen inhibitör maddelerin varlığı fırsatçı patojenlerin çoğalmasını engelleyen önemli bir bariyerdir. Genellikle, bakterilerin antibakteriyel etkisi, antibiyotik, bakteriyosin, siderophor, lizozim, proteaz, hidrojen peroksit üretimi sonucu gerçekleşmektedir. Bunun dışında organik 12

asit üretimi ile ph değerinde meydana gelen değişimler, amonyak ve diasetil formasyonu da antibakteriyel etki göstermektedir (Sugita ve ark., 1997; Vanderbergh, 1993). Larva ve ergin balık bağırsağından izole edilen bakterilerin, balık patojenik bakterilerine karşı antimikrobiyel maddeler ürettiği bildirilmiştir (Bergh, 1995). Morina, salmon ve tilapya balıklarının sindirim sisteminde inhibitör maddeler üreten bakterilerin varlığı tespit edilmiştir (Westerdahl ve ark., 1991). Ayrıca deniz balıklarının bağırsaklarından antibakteriyel maddeler üreten bakterilerin de izole edildiği bildirilmiştir (Sugita ve ark., 1996). Deniz bakterileri arasında antagonizm yaygın olarak görülmektedir. Örneğin; zooplanktonlardan izole edilen bakterilerin % 60 ından fazlası bakteriyolitiktir. Süngerlerden izole edilenlerin % 75 kadarı antibakteriyel bileşenler üretirler. Deniz antagonistik türleri, Pseudomonas, Alteromonas ve Vibrio cinslerinin üyeleridir. Antibakteriyel aktivite tatlı su biyotasında da mevcuttur. C. divergens, Lactobacillus spp. gibi bazı laktik asit bakterileri balık patojenlerine antagonistik etki gösterir. Vibrio ve Aeromonas ın patojenik türleri in vitro deneylerin çoğunda hedef alınmıştır. Bunların dışında Edwardsiella tarda, E. seriolicida, P. piscicida, Y. ruckeri de test edilmiştir. Bazı bakteriler virüslere karşı etkili olup viral hastalıkların biyokontrolünde kullanılmaktadır. Bu etkinin sadece antibiyotikler tarafından düzenlenmediğini bilmek önemlidir. Burada organik asitler, hidrojen peroksit ve sideroforlar gibi bir çok engelleyici madde mevcuttur. Bu tür bileşenler nedeniyle inhibisyon büyük ölçüde deneysel şartlara bağlıdır. Bunlar in vivo ve in vitro ortamda farklılık göstermektedir. Bu nedenle in vitro ortamda görülen antagonizm, aday probiyotik seçimi için yeterli bir kriter olmadığı gibi, türleri çıkarmak için de antagonizmin olmaması yeterli değildir (Gatesoupe, 1999). Sugita ve ark. (2002), deniz ve tatlı su balıklarından izole edilen bağırsak bakterilerinin % 1-10 unun balık patojenik bakterilerine karşı antibakteriyel aktivite gösterdiğini ve balıklarda probiyotik olarak kullanılabileceğini belirtmişlerdir. 13

Deniz bakterilerinin büyük çoğunluğunun V. parahaemolyticus a karşı bakteriyolitik enzimler ürettiği belirtilmiştir (Verschuere ve ark., 2000b). Mikroorganizmaların hemen hemen hepsi büyümek için demire gereksinim duyarlar. Levrek larvalarının diyetlerinden demir eksiltildiğinde, balıkların büyüme ve yaşama oranı üzerinde olumsuz bir etki oluşmadığı fakat larvalardaki bakteriyel yük ve mikrofloradaki çeşitliliğin önemli düzeyde azaldığı tespit edilmiştir. V. anguillarum u da içeren birçok patojen yüksek düzeyde demire gereksinim duymaktadır. Bu bakteri ile yapılan değişim denemelerinde, salmon balıklarında mortalite artışı ile diyetlerdeki demir içeriği arasında doğrusal bir ilişki olduğu tespit edilmiştir (Gatesoupe ve ark., 1997). Siderofor üreten Pseudomonas fluorescens türlerinin biyolojik kontrol ajanı olarak başarıyla kullanılabildiği bildirilmiştir. Bu bakterilerin inhibitör aktivitelerinin, antibiyotik, hidrojen siyanid ve siderofor üretimi nedeniyle gerçekleştiği belirtilmiştir (Mazzola ve ark., 1992; Shanahan ve ark., 1992). Siderofor, serbest demir için yüksek affiniteye sahip düşük moleküler ağırlıklı bileşiklerdir (Verschuere ve ark., 2000a). Siderofor üretimi ile P. fluorescens ın koruyuculuğu arasında bir korelasyon bulunmaktadır. Bu olayda serbest demir için yarışma rol oynamaktadır (Gram ve ark., 1999). Laktik asit bakterileri, diğer bakterilerin üremesini inhibe eden ürettiği bileşikler sayesinde intestinal kas tabakasında hızla çoğalarak patojenik bakterilere karşı ilk savunma bariyerini oluşturmaktadır (Gildberg ve ark., 1995). Sağlıklı balıkların doğal bağırsak florasının bir kısmını laktik asit bakterileri oluşturmaktadır. Laktik asit bakterilerinin çeşitli Gram pozitif ve Gram negatif bakteriler üzerindeki inhibisyon etkisi iyi bilinmektedir. Bu inhibisyon, bakteriler tarafından üretilen organik asit, hidrojen peroksit ve bakteriyosin benzeri bileşiklerden kaynaklanmaktadır. Yakın türler arasında inhibisyon etkisine sahip olan bakteriyosinler, bakterisidal veya bakteriyostatik peptidlerdir (Lewus ve ark., 1991; Aydın, 2002). 14

Lactobacillus spp. DS-12 nin, balık patojeni olan Edwardsiella tarda, Pasteurella piscicida, A. hydrophila ve V. anguillarum a karşı antibakteriyel aktivite gösterirken Pseudomonas spp. ve Streptococcus faecalis için aynı etkiyi göstermediği belirtilmiştir. Bu bakteri türünün % 10 NaCl ve % 10 safrada geliştiği, ph 3.0 de 90 dakika canlı kalabildiği belirtilmiştir. Yemleme denemelerinden 1 ay sonra oral yolla bakteri uygulanan grup ile kontrol grubu arasında bağırsak florasında farklılıklar tespit edilmiş olup kontrol grubunda Lactobacillus spp. belirlenememiştir. Hemolitik bakteri sayısı her iki grupta aynı olmakla beraber Lactobacillus spp. DS-12 ile muamele edilen grupta mukoid koloniler tespit edilememiştir (Çizelge 1.2). Benzer bir çalışma buzağılarda yürütülmüştür. L. acidophilus içeren sütlerle beslenen buzağılarda Lactobacillus sayısında artış tespit edilirken dışkıdaki koliform grubu sayısında azalma olduğu bildirilmiştir. Lactobacillus spp. DS-12 içeren yemlerin kullanıldığı gruptaki balıklarda ağırlık artışı kontrol grubundan daha yüksek olarak tespit edilmiştir (P < 0,05). Sonuç olarak Lactobacillus spp. DS-12 in, antibakteriyel aktivite göstermesi, safra tuzlarına ve aside dirençli olması nedeniyle pisi balıklarında probiyotik olarak kullanılabileceği belirtilmiştir (Byun ve ark., 1997). Probiyotik olarak L. rhamnosus kullanımı ile gökkuşağı alabalığı ve kalkan balıklarında A. salmonicida, V. anguillarum ve Flavobacterium psychrophilum gelişiminin inhibe edildiği bildirilmiştir (Nikoskelainen ve ark., 2001). Çizelge 1.2. Lactobacillus spp. DS-12 in pisi balığının bağırsak florası üzerindeki etkisi (Byun ve ark., 1997). Mikroorganizma Kontrol Lactobacillus spp. DS-12 (ortalama ± SD) (ortalama ± SD) Enterobacteriaceae 4,3 ± 0,21 (5/5) 4,8 ± 0,40 (5/5) Gram negatif kok 4,6 ± 0,20 (5/5) 4,3 ± 0,00 (5/5) Lactobacillus ND b (0/5) 7,0 ± 0,54 (3/5) Clostridium ND (0/5) 4,3 (1/5) Maya 4,6 ± 0,21 (5/5) 4,3 (1/5) Hemolitik bakteri 5,8 ± 0,53 (2/5) 5,1 (1/5) Mukoid koloni formu 4,8 (1/5) ND (0/5) Aerobik 8,5 ± 0,87 (5/5) 7,3 ± 0,47 (5/5) Anaerobik 7,6 ± 0,96 (5/5) 6,6 ± 0,62 (5/5) ND: 10 3 kob/g ın altındakiler tespit edilemedi 15

1.3.3. Bağışıklığın Uyarılması Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmaların humoral immün sistemden ziyade, hücresel immün sistem üzerinde etkili olduğu, özellikle, lenfosit ve makrofaj sayısında artışa neden olduğu bildirilmiştir (Irianto ve Austin, 2002). Balıklarda probiyotik olarak kullanılan bakterilerin immün yanıt üzerinde etkili olduğu, özellikle, lizozim ve komplement aktivitesinde artış, fagositik hücrelerin aktivasyonu, mukozal ve sistemik antikor üretiminde artış ile birlikte doğal katil hücrelerin aktivitesinin uyarımının sağlandığı belirtilmiştir (Matsuzaki ve Chin, 2000; Miettinen ve ark., 1996; Panigrahi ve ark., 2004). Buna rağmen spesifik patojenik bakteri ile muameleden sonra probiyotik bakterinin sistemik immünite üzerindeki etkisi tam olarak bilinmemektedir (Pirarat ve ark., 2006). Probiyotiklerin oral yolla uygulanması, özellikle, bağırsakla ilgili lenfoid dokular üzerinde etkili olmaktadır. Probiyotikler tarafından düzenli sinyaller oluşturularak konakçı immünitesinin uyarımı ile patojenlere karşı koruyucu etki düzeyinin artış gösterdiği belirtilmiştir. Balıklarda in vitro hücresel etki lökosit göçünün artışı, fagositosis ve antibakteriyel etkinin artışı şeklinde gerçekleşmektedir (Panigrahi ve ark., 2007). Laktik asit bakterilerinin spesifik olmayan savunma sisteminin gelişimindeki immünomodülatör rolü memelilerde iyi bilinmesine rağmen balıklarda bu konuyla ilgili fazla bilgi mevcut değildir (Villamil ve ark., 2002). Gökkuşağı alabalıklarında L. rhamnosus JCM 1136 suşunun yem katkısı olarak kullanımının immün yanıt ve bağırsak flora kompozisyonu üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla canlı formdaki L. rhamnosus JCM 1136 suşu 10 9 ve 10 11 kob/g olacak şekilde ticari yemlere ilave edilmiş ve 30 gün boyunca gökkuşağı alabalıkları bu yemlerle yemlenmiştir. Yemleme süresince midede probiyotik bakteri tespit edilemezken bağırsaktaki probiyotik bakteri oranı artış göstermiştir. Probiyotik uygulanan gruplardaki serum lizozim ve komplement aktivitesi ve lökositlerin 16

fagositik aktivitesi kontrol grubuna kıyasla önemli düzeyde yüksek bulunmuştur (P < 0,05). Gökkuşağı alabalıklarında probiyotik organizmaların immüno-regülatör rolü olduğu tespit edilmiştir (Panigrahi ve ark., 2004). İnsanlarda probiyotik olarak kullanılan L. rhamnosus ATCC 53103 suşunun balıkların immün sistemi üzerindeki etkisi araştırılmıştır. L. rhamnosus ATCC 53103 iki hafta süreyle gökkuşağı alabalığı yemlerine 7,9x10 4 (LAB4), 2,1x10 6 (LAB6), 2,8x10 8 (LAB8), 1,9x10 10 (LAB10) ve 9,7x10 10 (LAB11) kob/g olacak şekilde ilave edilmiştir. 1, 2, 3 ve 4 hafta süreyle kan ve mukus örnekleri alınmış, yemleme periyodu boyunca yetiştirme suyu ve balık bağırsağında yüksek düzeyde bu bakteri tespit edilmiştir. İkinci haftanın sonunda kan hücrelerinin komplement aktivitesinin önemli düzeyde artış gösterdiği belirlenmiştir. Sonuç olarak L. rhamnosus ATCC 53103 suşunun probiyotik olarak kullanımının gökkuşağı alabalıklarının immün parametrelerinde artışa neden olduğu tespit edilmiştir (Nikoskelainen ve ark., 2003). L. rhamnosus, Enterococcus faecium ve Bacillus subtilis in lökositlerin süperoksid anyon üretimi ve serum komplement aktivitesi gibi spesifik olmayan immün parametreler üzerine olan etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla gökkuşağı alabalıkları 10 9 kob/g düzeyinde dondurularak kurutulmuş formda L. rhamnosus, E. faecium ve B. subtilis içeren diyetler ile 45 gün boyunca yemlenmiştir. Probiyotik olarak E. faecium ve B. subtilis kullanılan deneme gruplarında komplement aktivitesi kontrol grubuna kıyasla önemli düzeyde yüksek bulunmuştur. Lökositlerin süperoksid anyon üretimi probiyotik uygulanan gruplarda, özellikle de, E. faecium da önemli düzeyde yüksek bulunmuştur (Panigrahi ve ark., 2007). Tilapya (Oreochromis niloticus) balıklarında E. tarda infeksiyonuna karşı L. rhamnosus un koruyucu etkisi araştırılmıştır. Kümülatif mortalitenin probiyotik ilave edilen grupta kontrol grubuna kıyasla önemli düzeyde düşük olduğu belirlenmiştir. Probiyotik uygulanan grupta alternatif komplement aktivitesi önemli düzeyde yüksek bulunmuştur (Pirarat ve ark., 2006). 17

Çipura balıklarının bağırsaklarından izole edilen Lactobacillus fructivorans (AS17B) ve insan dışkısından izole edilen Lactobacillus plantarum (906) un Artemia salina, Brachionus plicatilis ve ticari yemlere ilave edilerek çipura balıklarının gelişimi üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Probiyotik katkılı yemlerin erken dönemde kullanımı ile çipura balığı bağırsağındaki Ig + hücrelerinin ve asidofilik granülositlerin sayısının artış gösterdiği tespit edilmiştir. Sonuç olarak, probiyotiklerin bağırsak immün sistemi üzerindeki uyarıcı etkisi ile yaşama oranı arasında bir korelasyon olduğu belirlenmiştir (Pıcchıettı ve ark., 2007). Lactobacillus delbrueckii spp. lactis ve B. subtilis in tek tek yada kombine olarak kullanımının çipura balıklarının hücresel immün yanıtı üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla, 10 7 kob/g L. delbrueckii spp. lactis, 10 7 kob/g B. subtilis ve 0,5x10 7 kob/g L. delbrueckii spp. lactis, ve 0,5x10 7 kob/g B. subtilis karışımı yemlere ilave edilerek çipura balıkları 3 hafta süreyle bu yemlerle yemlenmiştir. Hücresel immün yanıt parametreleri olan lökosit peroksidaz içeriği, fagositosis, respiratory burst aktivitesi ve sitotoksitesi araştırılmıştır. Baş böbrek lökositlerinin peroksidaz içeriği 3. haftada tüm gruplarda önemli düzeyde azalma gösterirken, baş böbrek lökositlerinin respiratory burst aktivitesinde deneme boyunca değişiklik tespit edilememiştir. Buna rağmen, fagositik aktivite yemlemeden 2 hafta sonra tek başına bakteri ilave edilen diyetlerin kullanıldığı deneme gruplarında, sitotoksik aktivite ise, bakteri karışımının uygulandığı deneme grubunda önemli düzeyde artış göstermiştir (Salinas ve ark., 2005). Yüksek stok yoğunluğu, elleme ve düşük su kalitesi nedeniyle balıklarda stres oluşmaktadır. Bu stresörler balıkların plazma kortizol düzeyi üzerinde etkili olmaktadır. Kortikosteroid hormonu immün sistem üzerinde olumsuz etkiler oluşturmaktadır. Kortikosteroid hormon düzeyi daha düşük olan hayvanlarda daha yüksek büyüme oranı tespit edildiği belirlenmiştir (Carnevalı ve ark., 2006). Laktik asit bakterisi Lactobacillus delbrueckii delbrueckii nin kısa (25 gün) ve uzun (59 gün) süre kullanımının levrek balıklarının kortizol düzeyi üzerine etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla iki deneme grubu oluşturulmuştur. Birinci deneme 18

grubunda Lactobacillus delbrueckii delbrueckii 10 5 kob/ml konsantrasyonda 11. günden 29. güne kadar rotifer kültürüne ve 30. günden 70. güne kadar Artemia kültürüne ilave edilmiştir. İkinci deneme grubunda aynı konsantrasyondaki bakteri kültürü 30. günden 70. güne kadar Artemia kültürüne ilave edilmiştir. Yetmiş günlük larvalarda kortizol düzeyi birinci deneme grubunda (3,6 ± 0,36 ng/g) kontrol grubuna (5,1 ± 0,47 ng/g) kıyasla daha düşük bulunmuş, ikinci deneme grubunda ise kortikosteroid hormon düzeyi 4,5 ± 0,48 ng/g olarak belirlenmiştir. Yetmiş günlük deneme sonunda vücut ağırlıkları arasında önemli düzeyde farklılıklar tespit edilmiş olup kontrol grubu 47 ± 4,69 mg, birinci deneme grubu 85 ± 5,36 mg, ikinci deneme grubu 60 ± 6,7 mg olarak belirlenmiştir. Probiyotik bakteri kullanımı ile kortizol düzeyinin azaldığı ve vücut ağırlığında artış olduğu belirlenmiştir. Kortizol düzeyinin artışıyla balıklarda büyümenin baskılandığı tespit edilmiştir (Carnevalı ve ark., 2006). 1.4. Akuatik Hayvanların Sindirim Sisteminin Probiyotikler İçin Uygunluğu İnsan ve kara hayvanlarının embriyonik gelişimi amnionda gerçekleşirken birçok balık ve kabuklunun larva hali ilk ontogenetik evrede dış ortama bırakılır. Bu larvalar, yüksek düzeyde sindirim sistemi mikroflorasındaki düzensizliklere maruz kalır. Çünkü bu larvalar sindirim sistemleri ve immün sistemleri tam anlamıyla gelişmediği halde yem almaya başlarlar. Bu nedenle probiyotik uygulamaları özellikle larva döneminde tercih edilmelidir (Vershuere ve ark., 2000b; Gatesoupe, 1999). Tatlı su balıklarının bağırsağında genellikle Aeromonas spp., Pseudomonas spp., ve Flavobacterium/Cytophaga grubunun üyeleri yaygın olarak bulunurken deniz balıklarında çoğunlukla Vibrio, Acinetobacter ve Enterobacteriaceae grubunun üyeleri yer almaktadır. Bunun aksine karasal hayvanların bağırsak mikroflorasında temel olarak Bifidobacteria ve Lactobacillus genusunun üyeleri gibi Gram pozitif bakteriler bulunmaktadır (Pond ve ark., 2006). 19

İnsan ve çiftlik hayvanlarının sindirim sistemi mikroflorasında zorunlu veya fakültatif anaerobik Gram pozitif bakteriler dominanttır. İnsan dışkısında ana bakteriyel gruplar; Bacterioides, Gram pozitif anaerobik koklar, Eubacterium ve Bifidobacterium iken domuz dışkısında öncelikle Streptococcus ve Lactobacillus lar yer almaktadır. Bu mikroflorada dominant veya sub-dominant probiyotik bakteri türleri arasında Bifidobacterium, Lactobacillus ve Streptococcus bulunmaktadır. Bazı otçul tropik balıkların posterior bağırsağında simbiyotik anaerobik bakteriler dominant iken, kabukluların ve diğer balıkların sindirim sisteminde Gram negatif fakültatif anaerobik bakteriler dominanttır. Eklembacaklılarda, deniz balıklarında ve çift kabuklularda en bilinen tür Vibrio ve Pseudomonas tır. Akuatik mikrofloranın özelliğinin bir sonucu olarak akuakültür için en etkili probiyotikler karasal türlerinden farklı olmalıdır (Gatesoupe, 1999). Akuatik hayvanlar poikilotermdir ve mikroflora sıcaklık değişimleri ile değişebilir. Tuzluluk düzeyinin değişmesi de mikroflorayı etkileyebilir (Ringo ve Strom, 1994). Deniz balıkları vücutlarındaki su kaybını önlemek için sürekli su içmek zorundadır. Bu sürekli su akışı onu çevreleyen ortamın etkisini artırır ve bu çift kabuklu, karides larvası ve canlı yem organizmaları gibi filtre ederek yem yiyenlerde gözlenen su akışı gibidir. Bu etki gastrik bariyer olmadığından özellikle larvalarda önemlidir. Bu nedenle akuatik hayvanların bağırsak mikroflorası yem ve sudan gelen mikroorganizmaların alınması ile hızla değişebilir. Çift kabuklularda bulunan mikroflora deniz suyu ve sedimentte bulunanlara çok benzemektedir. Larva ve yavru balıklarda yemin etkisi açıkça gösterilmiştir. Canlı yemlerle alınan bakterinin etkisi özellikle ilk yemleme sırasında önemlidir. Bağırsak mikrobiyal florasındaki dominant türler yemleme rejimine bağlı olarak değişmektedir (Gatesoupe, 1999). Levrek larvalarında 10. günden 20. güne kadar yapılan denemede; ticari diyetler kullanıldığında 10 9 kob/g (vücut ağırlığı), Artemia kullanıldığında 10 7 kob/g, az miktarda demir içeren diyetler kullanıldığında 3x10 8 kob/g bakteriyel yoğunluk tespit edilmiş olup dominant türler bu üç grupta farklılık göstermiştir. Bu gruplardaki bakteriyel türler Şekil 1.1 de gösterilmiştir (Gatesoupe ve ark., 1997). 20