1
Doç. Dr. ABBAS TANER 2
3
Viral Yapı İç genom: genetik bilgiyi saklayan Kapsid: Protein yapısında Kapsomerler denilen protein alt birimlerinin yapılmıştır. Tüm virusler kapsidleri vardır. Zarf: Kapsidi saran membran; Konak hücrenin zarından oluşur. Tüm viruslerin zarfları yok. Zarf içerem iki virus örneği: Influenza virus Human Immunodeficiency Virus (HIV) Unknown source; part of figure 18.2, page 231, Campbell's Biology, 5th Edition 4
Wild Tip (Vahşi tip); Sokak virüsü, orijinal virüs. Doğal olarak enfekte hayvandaki virus: Laboratuvar şartlarında adepte olmuş bir virus değildir. Strain; Aynı virusun farklı çoğrafı lokalizasyon ve hastadan izole edilmiş farklı vahşi tipleri Variant; Fenotip olarak wild tipten farklı 5
Virusların doğal konağı dışında bir canlı sistemde üretilmesi ve seri pasajlar yapılması, onların atenüe olmalarına yol açmaktadır. Atenüasyon, bir virusun üreme yeteneğini yitirmede patojen olma özelliğinin yani virulansının azalmasıdır. Genel anlamda atenüe olmak spontan mutasyona ve seleksiyona uğramaktır. Viruslar genetik yapı olarak DNA veya RNA içermektedir. En küçük virüsların genomu sadece birkaç genden (3-5 adet), en büyük viruslarda 200 den fazla olabilir. 6
Genetik materyalin değişime uğraması, farklı fonksiyonlara sahip viral proteinlerin ortaya çıkmasına yol açar ki, bu durum yeni bir virüs serotipinin oluşması ya da virulansının değişmesine neden olur. Viruslarda en önemli iki mekanizma mutasyon ve rekombinasyon dur. Genetik olarak virüs yapısının ve özelliklerinin değişime uğraması tıbbi açısından büyük önem taşımaktadır. Örneğin yüzeylerinde stabil antijenler taşıyan virusların (polio, kızamık, HBV virusları) neden olduğu hastalıklar aşılama ile kolayca kontrol edilebilirken. Bu virusların mutasyona uğraması ve antijenik yapılatın değişmesi, uygulanan aşıların bir etkisi olmayacaktır. çok sayıda antijenik tipi olan ( rhinovirusları) veya çok sık antijenik değişime uğrayan (influenza A virüsü) virusların aşı ile kontrolü daha zordur. Bazı viruslar tekrarlayan (Herpesviruslar) ya da persistan (retroviruslar) enfeksiyon oluştururlar ve ancak antiviral ilaçlar ile kontrol altına alınabilirler. Persistan (gecmeyen) 7
VİRUSLAR ARASINDA GENETİK DEĞİŞİKLİKLER Viruslarda genetik değişiklikler mekanizmalar; 1- MUTASYON Doğal mutasyonlar İndüklenmiş mutasyonlar Defektif viruslar 2- VİRUSLAR ARASINDA GENETİK İLİŞKİLER Rekombinasyon Genetik karışım Birlikte aktif hale dönüşme Çapraz reaktivasyon 3-VİRUSLAR ARASINDA GENETİK OLMAYAN İLİŞKİLER Fenotipik karışım Genotipik karışım Komplementasyon 4-VİRAL VEKTÖRLER 8
VİRUSLARDA MUTASYON Genlerin nükleotit dizisinde, herhangi bir nedenle meydana gelen ve kalıtsal olan değişiklere mutasyon denir. Mutasyon genotipte kalıtsal değişikliğe yol açar 9
Doğal Mutasyonlar Mutasyonlar kendiliğinden meydana gelir veya mutajenler sonucu oluşur. Genetik materyalde, yani viral nükleik asitte kodlanan bilgide oluşan değişiklikler, fenotipe de etkiler, Viruslar, diğer mikroorganizmalardan daha fazla genetik varyasyonlara açıktırlar. Kullanım alanı; canlı, zayıflatılmış virus içeren aşı üretimi; patojenitelerini yitirmiş, antijenliklerini korumuş virusler elde edilmesinde kullanılır 10
Fiziksel Mutajenler a- Isı b-ph c- Işınlar 1-İyonize ışınlar (X ve gamma) 2-Non-iyonize (UV, 260 nm dalga boyu ışınlar) 3-Mor ötesi ışınlar Kimyasal Mutajenler a- Baz Analogları (5-Bromodeoksiuridin-BrdU, 6-thioguanin, 2-aminopürinler en yaygınları) b- Deaminasyon yapan ajanlar:dna yapısında amino gruplarının kaybına neden olan ajanlar (Nitröz asidi, hidroksil aminler) c- Alkilleyici ajanlar: DNA yapısına alkil grubu takan ajanlar ( Kükürt, Nitrojen mustard, Etilenoksitler) Spontan Viral enfeksiyonlarda çok az sayıda virus partikülünden milyonlarca yeni virus partikülü oluşur. Böylesine büyük popülasyonlarda nükleik asitin kopyalanması sırasında hataların oluşması doğaldır, ki bu hatalar spontan mutasyon olarak tanımlanır. Bu durum tamamen tesadüfi olarak ortaya çıkar ve temelinde çoğunlukla baz yer değişimleri yatar 11
Spontan (kendiliğinden) mutasyonlar; virüs genomunda birikir ve değişikliklere neden olur Spontan mutasyonların oranı, normal koşullar altında, genellikle, çok sınırlı (10-6 -10-8 arası) olmasına karşın, mutajenik maddelerin katılımı ile bu oran çok yükselmektedir (10-3 - 10-4 ) Spontan mutasyon; DNA genomunda 10-8 -10-11 oranında dır (DNA viruslarında mutasyon oranı, neredeyse ökaryotik hücrelere benzerlik gösterir. Bunun nedeni DNA viruslarının replikasyon enzimlerinin (DNA polimeraz) hata düzeltme «proof reading» özelliğinin olmasıdır. ) RNA genomunda bu oran 10-3 -10-4 dur, (RNA viruslarında mutasyon oranı çok daha yüksektir, zira bu virusların replikasyon enzimlerinin «RNA ya bağımlı RNA polimeraz» hata düzeltme yeteneği yoktur) Mutasyonlar sonucunda, orijinallerine göre değişik genotiptik ve fenotipik özellikler gösteren yeni nesiller (mutantlar) meydana gelir. 12
MUTASYON Esas genlerde mutasyon sonucu; Virusun inaktivasyonu Diğer genlerdeki mutasyon; Antiviral ilaç direnci oluşumu, virus patojenitesi veya antijenitesinde değişikliklere sebep olur Önemli fonksiyonlarla ilişkili mutasyonlarda (tutunma, penetrasyon, soyulma, replikasyon, toplama, salınım): virus çoğalmasının yapılmaması ve virusun yok olmasına neden olur Mutasyonların tüm virus populasyonunda kalıcı değil dır Pekçok mutasyon viral proteinler değişmez veya fonksiyonel olarak benzer bir aminoasit aracılığıyla viral protein yapımı sağlanır Sadece, önemli viral fonksiyonları etkilemeyen mutasyonlar virus populasyonunda kalıcı olabilir. 13
İndüklenmiş Mutasyonlar Spontan mutasyonlar kendiliğinden oluşurken indüklenen mutasyonlar mutajen yada çevresel ajanlarla amaçlı olarak mutasyonun teşvik edilmesidir. Spontan mutasyonlar evrimsel çeşitlilik sağlarlar. Spontan mutasyon frekansı oldukça düşüktür bir hücrede yaklaşık 10 5-10 8 hücrede bir görülür. Dolayısıyla daha fazla mutasyon isteniyorsa mutlak indüklemek gerekir. Mutajenlere maruz bırakarak mutasyon üretmeye mutagenez denir ve bu organizmaya da mutagenize organizma denir. 14
En sık kullanılan mutajenler Yüksek enerjili radyasyon Çeşitli kimyasallar Mutajenin dozu nekadar yüksekse mutasyon freakansı da okadar yüksek olur 15
Viral genetik çalışmalarında en çok tercih edilen mutantlar «şarta bağlı ölü mutantlar (conditional lethal mutants)» dır. Yapılan laboratuvar çalışmalarında ısıya duyarlı (temperature sensitive;ts) mutantlar elde edilmiştir. TS mutantlar elde etmek için kimyasal mutajenler ile tek baz üzerinde değişiklik yaparak fonksiyonel proteinde tek bir amino asit değişikliği oluştururlar. Dolaysıyla mutant aminoasidin yer aldığı protein molekülü, düşük ısıda (31 o C) fonksiyon gösterirken, optimal veya üzerindeki ısılarda ( 36 o C) yapısının bozulması nedeniyle işlev yapamamaktadır. Ancak düşük ısıda üreyebilen bu TS mutantlarına karşın, vahşi tıp orijinal virüs her iki ısıda da üreme yeteneğine sahiptir. Vahşı tıp virus Kimyasal mutajenler TS mutan virus 36 o C Yüksek ısıda fonksiyon göstermez. mutant aminoasidin yer aldığı protein molekülü, vahşi tıp orijinal virüs her iki ısıda da üreme yeteneğine sahiptir. Tek baz üzerinde değişiklik yaparak fonksiyonel proteinde tek bir amino asit değişikliği oluştururlar. 31 o C Düşük ısıda fonksiyon gösterir. Bazı virus aşılarının hazırlanmasında, canlı atenüe aşı suşlarının elde edilmesi için «soğuğa adapte (cold adapted) mutantlar» geliştirilmektedir. Bunun en iyi örneği, intranazal sprey olarak uygulanan canlı atenüe influenza aşısıdır. Bu aşı, 25 o C de seri pasajlarla soğuğa adapte edilen influenza virusuna ait H ve N 16 antijenlerini içermektedir.
Defektif Viruslar Defektif bir virus replikasyon için gerekli olan genlerinden bir veya birkaçını kaybetmiş olan virustur. Defektif viruslar replikasyon ve/veya olgunlaşma için kendilerine yardım edecek başka bir kompetant virus (yardımcı virus) gereksinim duyarlar. Doğal defektif viruslar arasında «adenovirus ile ilişkili viruslar (Aadeno-assocciated virus; AAV) Hepatid D virus (HDV), HBV ile birlikte hücreyi enfekte etmesi (koenfeksiyon) gerekiyor. Psödovirionlar: Bu partiküller, hücrede bir araya gelme aşamasında kendi genomu yerine yanlışlıkla konak hücre genomunun rastgele bir parçasını paketlenmektedir. Normal virus görünümünde olan psödovirionlar yeni bir hücreye girebilmelerine rağman replike olamazlar. 17
2- VİRUSLAR ARASINDA GENETİK İLİŞKİLER Rekombinansiyon Bir hücreyi aynı anda enfekte eden iki akraba virus arasında meydana gelen genetik değişimine rekombinasyon adı verilir. Birbirine yakın iki gen arasında rekombinasyon olasılığı daha az iken, birbirinden uzak genler arasında rekombinasyon daha sık meydana gelir. Rekombinasyon; her ikisi aktif (enfektif), birisi aktif diğeri inaktif veya her ikisi de inaktif viruslar arasında gerçekleşebilir. Rekombinasyon sonucunda ortaya çıkan yeni ve farklı virusa rekombinant adı verilir. Rekombinasyonlar genel olarak aynı genusta yer alan akraba viruslar arasında gerçekleşirken nadir durumlarda farklı ailelerdeki viruslar arasında gerçekleşir. Rekombinasyonlar çift iplikçikli RNA genomuna sahip viruslarda daha yüksektir. 18
Virüsler Arası Genetik İlişkiler İn vivo veya in vitro (hücre kültürlerinde) üreyen viruslar arasında veya viruslarla içinde üredikleri hücre DNA'sı arasında oluşan genetik interaksiyonlar sonunda karşılıklı genetik materyal değişimi (intramoleküler genetik değişim), genellikle, rekombinasyon olarak tanımlanmaktadır. Bu olgu sonunda da yeni genetik karakterlerde hibrid virus suşları oluşmaktadır. Bu suşlar, doğal viruslardan bazı yönleri ile farklı oldukları gibi kendisini oluşturan her iki virusa ait genetik materyallere de sahiptirler. 1) Mutasyon 2) Rekombinasyon a) İntramoleküler Rekombinasyon b) Reasorment c) Reaktivasyon 3) Transdüksiyon 19
Üç Tip Rekombinasyon Vardır A. İntramoleküler Rekombinasyon: -Birbirinden farklı ancak yakın ilişkiye sahip iki virusun nükleik asitleri arasında baz dizinlerinin karşlıklı değişimini ifade eder. dsdna larda daha sık görülür. -Bir hücre, genetik olarak birbirine yakın iki virusla koinfekte edildiğinde (örn, HSV-1 ve HSV-2 virusları gibi) viral nukleik asitlerinin sentezleri sırasında karşılıklı gen alış-verişi meydana gelmekte ve oluşan yeni hibrid suşlar, hem tip-1 ve hem de tip-2 HSV'larına ait genetik materyallere sahip olmaktadırlar (intertipik rekombinant viruslar). Diğer DNA viruslarında da (SV-40 ile adenoviruslar) benzer rekombinasyonlar ortaya çıkmaktadırlar. 20
B. Reassorment: Segmentli genoma sahip RNA viruslarının ikili enfeksiyonlarında viruslar arasındaki segment değişimine REASSORMENT denir. (iki virusun aynı anda bir hücreye girmesi durumunda, virusların replikasyon sonrası toparlanmaları aşamasında segment değiştirmesi olayıdır. Bu durum farklı virusların oluşumuna yol açar.) Reassorment türü değişkilikler de yakın ilişkili virus türleri arasında meydana gelir. Bu yeni tipe Reasortant adı verilir. Farklı influenza virus türleri arasında şekillenen reassortment sonucunda antijenik shift adı verilen geniş çaplı değişimler meydana gelir. 21
The 2009 H1N1 virus is a hybrid of swine, avian and human strains Influenza A (H1N1) 22
23
Virus-1 Virus-2 Viral genomların replikasyonu Yeni virusların pariküllerinin oluşması Yeni varyant virus Virus -2 ile aynı genetik yapı Virus -1 ile aynı genetik yapı 24 http://www.ppdictionary.com/viruses/antigenic_shift.jpg
Antijenik Drift Mutasyonların zaman içerisinde birikimi ile ortaya çıkar ve virusta küçük çaplı antijenik değişimlere yol açar. Antikor varlığında (gerek aşı ile olsun gerek daha önceden karşılaşma ile) neuraminidaz hücre üzerinde reseptör gibi davranan sialik aside bağlanamaz, ancak antijenik drift olduğunda neuraminidaz yapısı değişebileceğinden antikorların varlığı koruyucu olmaz. Antijenik Şift Değişimler, segmentli yapıya sahip olan viral genoma reassorment ile başka bir influenza virusunun genom segmentine girmesiyle ortaya çıkar. Bugün korkulan bu değişikliğin kanatlı virüsü ile oluşma ihtimalidir (antijenik şift şeklinde). İnfluenza A (H1N1) HemaglutinasyonA da mutasyon Nokta mutasyon Antijenik drifit İnfluenza A (H2N2) 2 farklı alt tipin aynı hücreyi aynı anda infekte edilmesi HA nin tamamen değişmesi Antijenik şift 25
AŞI Üretiminde Resortment Yeri Parçalı genomu olan ve küçük çocuklarda ciddi diyare etkeni olan Rota virusların yer aldığı Retroviridae ailesine aıttır. İnsan Rotavirus Sığır Rotavirus Familya: Reoviridae 11 segmentli ds RNA viral genom içerirler En sık 1-5 yaş grubunda çocuklarda diyare nedenidir. İnsan-Sığır ressormnet İnsan file:///c:/users/abbastaner/downloads/tipbil30-1-23%20(1).pdf 26
C-Reaktivasyon: Her ikisi de inaktif olan viruslar arasında oluşan rekombinasyon sonucu «birlikte aktif hale dönüşme» (multiplicity reactivation) adı verilen bir olay dır. Farklı genlerden inaktif olan viruslar tek başlarına üreyemedikleri halde gen değişimi (rekombinasyon) ile aktif hale geçer ve üreme yeteneği kazanırlar Virus-1 (inaktif) B A Virus-2 (inaktif) Hücreye giriş ÜREME YOK A b a B Aktif genler İnaktif genler b a Hücreye giriş ÜREME YOK ÜREME VAR A B b a Hücreye giriş b A Virus-1 (inaktif) Virus-2 (inaktif) https://kozmopolitaydinlar.wordpress.com/2011/06/10/viruslarda-mutasyonlar-ve-rekombinasyonlar/ Aktif rekombinant virus) 27
Çapraz reaktivasyon Aynı hücreyi enfekte eden viruslardan birisinin aktif diğerinin inaktif olduğu durumda ise «çapraz reaktivasyon veya işaret kurtarımı» (cross reactivation, marker rescue) adı verilen rekombinasyon ortaya çıkabilir. Oluşan rekombinant viruslar, inaktif virusun bir veya birkaç genini almışlar, yani inaktif virus defektif genden kurtarmışlardır. Virus-1 (Aktif) A b Hücreye giriş ÜREME VAR A b a B Aktif genler İnaktif genler Virus-2 (inaktif) b a Hücreye giriş ÜREME YOK ÜREME VAR A B b a Hücreye giriş b A Virus-1 (Aktif) Virus-2 (İnaktif) Aktif rekombinant virus 28
3.TRANSDÜKSİYON Viruslar aracılığıyla bir hücreye veya bakteriye ait genlerin başka hücreye veya bakteriye aktarılmasıdır. Özellikle fajlar tarafından bakteriyel genetik materyalin transferine olanak sağlaması açısından önemli bir olaydır. 29
1- MUTASYON Doğal mutasyonlar İndüklenmiş mutasyonlar Defektif viruslar 2- VİRUSLAR ARASINDA GENETİK İLİŞKİLER Rekombinasyon Genetik karışım Birlikte aktif hale dönüşme Çapraz reaktivasyon 3-VİRUSLAR ARASINDA GENETİK OLMAYAN İLİŞKİLER Fenotipik karışım Genotipik karışım Komplementasyon 4-VİRAL VEKTÖRLER 30
II.VİRUSLAR ARASINDA GENETİK OLMAYAN ETKİLEŞİMLER Viruslar arasındaki genetik olmayan değişimler translasyon sonrası viral gen ürünlerinin değişmini ifade etmektedir. Bu tür değişimlerin virusların genetiğini değil virus fenotipini ve antijenitesini etkilemesi beklenebilir. 3 Önemli Değişim Söz Konusudur; 1-Komplementasyon : Her biri yalnız olarak hücrelerde üremeyen iki mutant virus aynı hücreyi infekte ettiklerinde birinin replikasyonu için gerekli olan proteinin diğeri kodlayarak her ikisi birlikte aynı hücrede üreyebilirler. Komplementasyon, birbiri ile ilişkili olmayan viruslar, defektif viruslar veya zarflı-zarfsız viruslar arasında görülebilir. Bu olguda, belli bir gen yönünden defektif olmayan bir virusun sağladığı gen ürünü, bu ürünün sentezini kodlamayan defektif virus tarafından kullanılarak kolayca üreyebilmektedir. Bu iki mutant virus arasında gen değişimi olmadığı için, yeni projenilerde de defektif genler bulunmaktadır. Eğer, iki mutant virus, aynı ürünün geni için defektif iseler o zaman her ikisi de üreyemez. 31
Virus-1 (inaktif) X Y Hücreye giriş ÜREME YOK X Y Virus-2 (inaktif) X Y Hücreye giriş ÜREME YOK X Y Hücreden çıkış X Y Virus-1 (inaktif) X Y Virus-2 (inaktif) Hücreye giriş Konak hücrede ürün alışverişi ile üreme var. (Komplementasyon) Komplementasyon. Farklı iki genden (X ve Y) defektif akraba viruslar yalnız başlarına üreyememelerine karşın, beraberce enfekte ettikleri hücrede ürün alış-verişi yaparak üreyebilir ve hücreden çıkabilirler. Genetik bir rekombinasyon olmadığı için hücreden çıkan viruslar yine aynı genden defektiftirler 32
Fenotipik Karışım Fenotipik karışım: Bir hücrenin miks infeksiyonu sonu, bir virusa ait genetik materyalin tümü, diğer virusa ait kapsid veya zarfın içine girebilir (transkapsidasyon). Bazen de, bir virusun kapsid veya zarf materyalleri, diğer virusa ait kapsid veya zarf proteinleri arasında bulunabilirler (fenotipik karışım). Bu son durumda, viral genom etrafında her iki virusa ait proteinden meydana gelen kapsid yer alır.
Genotipik Karışım Bu olay genetik olmayan diğer bir ilişkidir. Burada birden fazla viral genom aynı kapsid içerisine paketlenir (poliploidi ve heteroploidi) Paketlenen genetik materryaller arasında herhangi bir rekombinasyon meydana gelmez. Daha sonraki pasajlarda her genom kendi parental virusunu oluşturur.
4-VİRAL VEKTÖRLER Viral vektörler, belirli bir hücre tipi ya da dokuyu değiştirmek/düzenlemek için uygulanan gen transferinin en etkili yolu olup, hücrelerde tedavi edici (terapötik) genlerin ekspresyonu amacıyla en kolay manipüle edilebilir aracılardır. Yeni aşıların geliştirilmesi ve/veya kalıtsal hastalıkların tedavisi için istenilen genlerin hücrelere taşınmasında birçok virus tipi, kullanılabilirlik ve etkinlik yönünden uzun zamandan bu yana araştırılmaktadır (Tablo-1). Vektör virus (Örn. Adenovirus, Alfavirus) İnfluenza virus genleri HA proteşnini eksprese eden virus vektör aşısı Aşı Viral vektörler kullanılarak hazırlanan influenza virus aşısı. İnfluenza virusunun seçilen gen parçası (hemaglütinin;ha), inasn hücrelerini enfekte eden ancak hastalık oluşturmayan bir viral vektöre yerleştirilir. İnfluenza virusunun HA genini taşıyan vektör doğrudan insana enjekte edilir. Zararsız olan viral vektör immün yanıtın oluşumunu indükleyen HA proteinlerini eksprese eder. 35
Gen tedavisi ile ilgili klinik çalışmalarda kullanılan sıklığı sırasına göre viral vektörler: Adenoviruslar (%24) Retroviruslar (%21) Vaccinia virus (%8) Poksviruslar (%4) HSV (%3) Viral vektörlerin kullanım alanları aşağıdaki gibi dır; Belirli bir gen ürününün bol miktarda üretilerek antijen ya da fonksiyonel protein olarak kullanılması, Viral enfeksiyonlardan korunmada etkin olan nötralizan (koruyucu) antikor sentezini sağlayan proteini (antijen) kodlayan genin vektör aracılığı ile hücrede eksprese edilmesi ve aşı hazırlanması, Kalıtsal hastalıklar ile ilgili hasarlı genlerin, viral vektörlerin taşıdığı sağlam genlerle değiştirilerek genetik defektin ortadan kaldırılması, Bazı kanserlerde malignan hücreler üzerinde toksik etki gösterecek genlerin viral vektörler ile bu hücrelere transfeksiyonu. http://www.niaid.nih.gov/topics/flu/research/vaccineresearch/pages/technologies.aspx 36
Hastalık Amaç Hedef hücreler Vektör virus Uygulandığı ülkeler ADA eksikliği ADA taviyesi Kan Retrovirus İtalya, Hollanda, ABD AIDS Kanser Kistik fibrozis (KF) Ailesel hiperkolesterolemi Fankoni anemisi Onaylanmış Klinik Gen Tedavisi Protokolleri Antijen Sunumu, HIV inaktivasyonu İmmün fonksiyonların artırılması KF Transmembran regülatör enzim takviyesi LDL reseptör takviyesi Kompleman grubu C gen takviyesi Kan, Kemik iliği Retrovirus ABD Kan, Kemik iliği tümör Retrovirus Avusturya, Çin, Fransa, Almanya, Hollanda, ABD Solunum epiteli Adenovirus İngiltere, ABD Karaciğer Retrovirus ABD Kan, Kemik iliği Retrovirus ABD Hemofili B Faktör IX takviyesi Deri fibroblastları Retrovirus Çin Romatoid artrit Sitokin takviyesi Sinovyum Retrovirus ABD ADA: adenozin deaminaz, LDL: Low density lipoprotein 37