Moleküler Patoloji Laboratuarında Kontaminasyon ve Alınacak Önlemler Önder Bozdoğan
Kontaminasyon Hekimden sorma, çekenden sor * *Türk Atasözü
Kontaminasyon Tanım: Sözlük anlamı: kirletme, kirlenme, bulaşma, bulaştırma. Türkçe sözçük: Bulaş? Bilimsel alana ve teknik disipline göre anlam farklılığı. Biyolojik bilimlerde: Biyolojik deneyin sonuçlarını etkileyecek yabancı maddenin deneye karışması: Yabancı madde kimyasal yada biyolojik olabilir.
Moleküler Patoloji Laboratuarında Kontaminasyon Bir PCR reaksiyonuna, genomik DNA, amplikon, dışarıdan DNA karışması, sonucunda ortaya çıkan yalancı pozitif sonuç.
Kontaminasyon Kaynakları Laboratuar personeline ait çeşitli biyolojik materyaller (Saç, tükürük, ter vb.) Çevresel DNA kaynakları (Su, havalandırma). Daha önce incelemesi yapılan biyolojik örnekler ve kalıntıları. Daha önceki deneylere ait amplikonlar.(pcr ürünleri)* Firmalar tarafından kitlerle verilen pozitif kontroller. Kitlerin ve kimyasaların üretimi sırasında üretim hattına giren biyolojik materyaller.
Kontaminasyon Tipleri Örnek kontaminasyonu. Laboratuar (yüzey) kontaminasyonu. Taşıma (carry over) kontaminasyon. Kimyasal(Kit) kontaminasyonu.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu Çok hassas ve verimli bir yöntemdir. Teorik olarak bir DNA molekülü 35. çevrimden sonra sonra >10 9 molekül düzeyine ulaşır. Testin bu kadar etkin olması kontaminasyon sıklığını artıran önemli bir nedendir. Üç aşamada da kontaminasyon olabilir.bu aşamalar. Örnek hazırlama(dna ekstraksiyonu vb) PrePCR PCR amplifikasyon PCR Analiz, ürünün incelenmesi.(jel yürütme, görüntüleme, hibridizasyon vb.) PostPCR. Pre ve post PCR aşamalarının her ikisinde de sterilizasyon önlemleri almak zorunludur.
Real Time PCR, Dean Fraga, Tea Meulia, and Steven Fenster. Current Protocols Essential Laboratory Techniques.2008
Kontaminasyon Hastaların yanlış tanı ve tedavileriyle sonuçlanabilir. Bilimsel çalışmalarda önemli hatalara yol açabilir. Çalışmanın geri çekilmesiyle sonuçlanabilir. Önemli ölçüde maddi kayıplara yol açabilir. Laboratuarın ün kaybına yada resmi olarak hizmet verilmesinin durdurulmasıyla sonuçlanabilir.
Kontaminasyonu engellemeye yönelik yöntemlerde amaç? Kontaminasyona sebep olacak her büyüklükteki DNA fragmanlarını ortadan kaldırmak ancak PCR performansını etkilememek.
Sorunlar PCR yöntemlerinin etkinliği. DNA nın dayanıklı yapısı. Testlerin çok fazla sayıda basamak içermesi. Kontaminasyonu engellemede kullanılan yöntemlerin küçük (<200bp) ve G+C zengin DNA fragmalarına etkinliğinin düşüklüğü. Kullanılan yöntemlerin PCR etkinliğini azaltması. Testin maliyetini artırması.
Kontaminasyonun Saptanması Kontaminasyon bazı durumlarda gözden kaçabilir. Tipik şüphe NTC(No template control) da pozitivite ortaya çıkmasıyla oluşur. Ancak artmış pozitivite oranlarında da şüphelenilmelidir. Wipe test yüzeylerin kontaminasyonunu gösterebilir. Primer dimer oluşumu Syb Green le Real time PCR da kontaminasyon görüntüsü verebilir.!!!
Mekanik önlemler Kimyasal önlemler Diğer UV γ radyasyon. Otoklavlama Urasil N glikosilaz. İsopsoralen, psoralen.+uv Hidroksilamine hidroklorid. Etidyum Monoazid(EMA) Nükleazlar Restriksiyon enzimleri Eğitim Denetim Neler yapılabilir?
Mekanik Önlemler Laboratuarın dizaynı. PCR öncesi PCR PCR sonrası alanlar ayrılmalı. Materyal akışı: Kimyasalların hazırlandığı alandan PCR alanına, PCR alanından analiz alanına yönelik tek yönlü olmalı. Amplikon asla sterilize edilmeden PCR öncesi alanlara ve PCR alanına geri alınmamalıdır. Her alanda ayrı cihazlar ve sarflar bulunmalı. (Pipet setleri,pipet uçları, vorteks, santrifüj vb.) Teknisyenlerin üzerlerinde kirli materyal taşımaları engellenmeli. Gözlükler, değiştirilmeyen eldivenler, giysiler üzerinden amplikon taşınabilir.
Kimyasal Deposu Kimyasal Hazırlama PCR öncesi Mastermiks Kimyasal Hazırlama odası/alanı Örnek Girişi DNA/RNA Çıkarımı PCR Kurulum Örnek Hazırlama odası/alanı PCR PCR Post PCR odası/alanı Ürün Saptama PostPCR http://www.clinicallabconsulting.com/contamination.pdf yararlanılmıştır.
Mekanik Önlemler UV lamba içeren laminar flow kabinlerinde PCR kurulmalıdır. Otomatik pipetleme ve örnek hazırlama cihazları tercih edilmelidir. Sık sık eldiven değiştirilmelidir. Çöp atım kutuları uygun olmalı sık sık değiştirilmelidir. Sıvılar, kitler etiketlenmeli, açılış tarihleri üzerlerine yazılmalıdır. Pipetler "positive displacement tipte olmalıdır. Filtreli pipet uçları kullanılmalıdır. DNAaz ve RNAaz free, steril tek kullanımlık tüpler kullanılmalıdır. Tüplerin tipi, kapak özellikleri kontaminasyonu azaltabilir veya artırabilir. Mikrotüpler açılmadan (Özellikle DNA içeren) hafifçe santrifüjlenmelidir. PCR suyu küçük alikotlara ayrılmalıdır. Ben derin dondurucuda tutuyorum. PCR kurulumunda DNA en son eklenmelidir.
Yüzey Kontaminasyonu
Sodyum hipoklorid (NaClO) Çamaşır suyunun etkin maddesidir. Çamaşır suyunda sıklıkla %3 8 konsantrasyonda bulunur. % 10 luk sodyum hipoklorid. Ucuz etkin bir malzeme. Tüm yüzeylerin temizliğinde, pipetlerin uç kısımlarının silinmesinde kullanılabilir. Silindikten sonra yüzeyler %70 lik alkolle silinmelidir. Nükleik asitlerde oksidatif hasar oluşturur.böylelikle amplikonun veya DNA fragmanının yapısı değişir.
Hidrojen peroksid güçlü oksidizan bir maddedir. DNA elimininasyonu yaptığı bilinmektedir. 2007 yılında patent altına alınmıştır.!!!!! %3 lük konsantrasyonda uygulanmaktadır. Yüzey temizliğinde ve pipet temizliğinde kullanılabilir. Aşındırıcıdır. H 2 0 2
CoPA solusyonu Bakır bis sülfat/h202 solusyonu. Patentli bir solusyondur. US patent no 5858650. Yüzey temizliğindeki etkinliği oldukça yüksektir.
Ticari Ürünler Yüzey, pipet temizliğinde kullanılan ticari ürünlerde mevcuttur. Bu ürünlerin bir kısmı DNAaz ve RNAaz gibi enzimleri de etkisiz hale getirir. RNAaz ı etkisiz hale getiren solüsyonlar RNA ekstraksiyonu sırasında yararlı olabilir. Ticari ürünler sodyum hipoklorid ve hidrojen peroksitle karşılaştırıldığında test sayısı fazla olan merkezlerde maliyeti artırır.
Ultraviyole (254 nm) Sterilizasyonda UVC kullanılır. Etkisi lamba ile sterilize edilecek malzeme arasındaki mesafenin karesiyle ters orantılıdır. DNA da timidin türevleri ve diğer değişiklikler oluşturması önemli etki mekanizmasıdır. Primidin primidin eklentileri(photoadducts) Siklobutilprimidin dimerleri. Bazların oksidasyonu. Tek zincir kırıkları. Çift zincir kırıkları. Sıklıkla 5 20 dk önerilir.yeterli?? Ucuz bir yöntemdir. Ancak 300 bazdan küçük sekanslarda ve G C den zengin sekanslarda etkinliği daha düşük olduğu ileri sürülmüştür. Materyalin kaynaktan uzaklığı da önemlidir. Mümkün oldukça yakın. Kurumuş materyalde etkinliği azalır.
Ultraviyole (254 nm) Pratikte : Çalışma alanı En çok önerilen. Pipet uçları Pipetler Tüpler Plate ler PCR suyu PCR mix(taq polimeraz ve primerler olmadan) Ben uygulamıyorum. UV ile sterilize edilebilir. Kullanırken, kullanıcı için önlemler alınmalıdır. Kabinlerin içerisinde veya tezgahların üzerine konulabilen basit düzeneklerle kullanılabilir. Malzeme sterilizasyonunda UV croslinkerler önerilebilir. Ölçüm yapılarak etkinliklerini saptamak pratik olmadığından, kullanım süresine göre düzenli değişim önerilir.
Otoklavlama Temel olarak mikroorganizmalara etkilidir. Özellikle filtre uçları, pipetler, tüpler vb. sarfların sterilizasyonunda kullanılır. DNA free, steril malzeme kullanılması otoklavlama ihtiyacını ortadan kaldırabilir. Bir çalışmada UV göre daha üstün olduğu gösterilmiştir. (121 o / 2 saat uygulandığında).* Küçük DNA fragmanlarına etki yapabilir. 200bp< Kurumuş biyolojik örneklerde etkinliği düşebilir. *L.A. Gefrides et al. / Forensic Science International: Genetics 4 (2010) 89 94
Taşıma Kontaminasyon ve Kimyasal Kontaminasyonu
Urasil N glycosylase(ung) DNA tamir enzimidir. Görevi sitozinin spontan deaminasyonu sonucu oluşan urasilin DNA dan uzaklaştırılmasını sağlamaktır. Longo(1990) ve takipçileri bu yöntemi ileri sürmüştür. Bugün birden çok ticari kit mevcuttur. Ticari kitlerin köken aldığı bakteri veya canlıya göre optimize edilmesi gereklidir. Amplicon üründe bulunan Urasili etkilemesi mantığına dayanır. Öncelikli kullanım alanı taşıma(carry over) kontaminasyonu önlemektir. http://www.clinicallabconsulting.com/contamination.pdf
Urasil N glycosylase(ung) Enzim oda ısısında aktiftir ve 10 dakika inkubasyon ürünü sterilize eder. İlk siklusta 95 o dereceye ulaşması enzimi büyük oranda inaktifleştirir. Ancak bazı durumlarda enzim tam inaktive edilemediği için son ürünlerin hızlı bir şekilde alınarak 20 de veya +72 de tutulması önerilir. Timinden fakir G+C den zengin sekanslarda etkinliği düşer. Urasil içeren ürünler Southern blot yönteminde ve restriksiyon endonükleazların kullanıldığı tekniklerde sorunlar çıkarabilir. http://www.roche applied science.com/sis/amplification/pcr_amplification_051100.html
Furocoumarinler Psoralen Isopsoralen Journal of Chromatography A 2004; 1055: 135 140.
Furocoumarinler Bitkilerden çıkarılan organik kimyasal ürünlerdir. İki molekül sterilizasyon için kullanılabilir. Psoralen Amplicon analizini etkileyebilir. İsopsoralen UV radyasyonla karşınca DNA ile kovalent bağlarla bağlanırlar. Oldukça etkin bir yöntemdir. Ancak Yöntem optimizasyona ihtiyaç duyar. PCR ı inhibe etme potansiyelleri vardır. Psoralen Amplicon analizini etkileyebilir. Karsinojeniktir. G+C zengin sekanslarda ve kısa sekanslarda(<200bp) etkinliği düşüktür. http://www.clinicallabconsulting.com/contamination.pdf
Primer Hidrolizi Amplikonlarda bulunan riboz residülerinin alkalin hidrolizine dayanıksız olması temel etki mekanizmasıdır. PCR ürünleri 1M NaOH e 30 dakika inkube edilir. Ürünler hidrolize olduğu zaman amplikonun primer bağlanma alanı ortadan kalkar. Böylece yeni PCR la aynı alandan primerlerle çoğaltma yapılamaz. Etkinliği diğer yöntemlere göre daha düşüktür(10 6 ), NaOH katılması sırasında amplicon damlacıkları ortama saçılabilir. G+C zengin ampliconlarda etkindir.
Hidroksilamine Hidroksilamine hidroklorid eklenmesiyle sitozinleri kimyasal olarak modifiye etmesi mantığına dayanır. Ucuz bir yöntemdir. Kısa ve G+C zengin ampliconlara da etkindir. Karsinojeniktir, PCR sonrası analizlerde sorunlar yaratabilir.
Etidyum Monoazid(EMA)/Propidyum Monoazid(PMA) Yeni bir yöntemdir. Görünür ışıkta belirtilen kimyasalların DNA ile kovalen bağlar yapmasına ve böylece PCR da çoğaltılamaması mantığına dayanır. Konsantrasyona dikkat etmek gerekir. Yüksek konsantrasyonlarda PCR ın etkinliğini azaltır. EMA 12.37 μm ve PMA 6.26 μm konsantrasyonu aşmaması önerilmekte.* Klasik PCR ve Teksas Redle işaretli problarda uygulandığı gösterilmiş ancak Syb Green boyasına etkisi bilinmemektedir. *I. Hein et al. / Journal of Microbiological Methods 71 (2007) 336 339
DNAazlar Restriksiyon endonükleazlar denenmiş olmakla beraber her ürün için farklı nükleazların kullanımının zorunluluğu, optimizasyon, inhibisyon sorunları yüzünden yaygın kullanım alanı bulamamıştır. Kullanılabilecek spesifik olmayan DNAazlar: DNAaz I : Özellikle çift zincir DNA yı keser. PCR öncesi 95 0 inaktive edilmesi gereklidir. Bu ısı artışı Taq polimerazın erken aktivasyonu ile sonuçlanabilir ve PCR ın etkinliği düşebilir. Primerlerin dekontaminasyonunda kullanılamaz. hl dsdnaaz: Etkin olarak çift sarmal DNA ya afinite gösterirler. Daha etkin ve daha özgündür. 55 0 de inaktive edilmesi nedeniyle Taq etkinliğine azalması beklenmez. Primerlere önemli bir etki yapmadığına dair deneysel bulgular vardır.
Yöntemlerin Karşılaştırılması
Lalueza Fox C, Champlot S, Berthelot C, Pruvost M, Bennett EA, Grange T, et al. An Efficient Multistrategy DNA Decontamination Procedure of PCR Reagents for Hypersensitive PCR Applications. PLoS ONE 2010;5(9):e13042.
Konuşmacıdan bir kaç deneyim. Real time PCR da ve diğer PCR yöntemlerinde ürüne ek bir işlem yapılmayacaksa 20 30 mikrolitre mineral oil kontaminasyonu azaltır. Real time platelerini kestiğinizde tasaruf edebilirsiniz ancak kontaminasyon artar. Real time platelerde filmle kapatma yerine optical cap içeren kapaklar kontaminasyonu azaltır. Tüpleri seçerken kontaminasyonu engelleyen kapaklı olan ve kaliteli malzeme tercih edilmelidir. Kontaminasyonun yoğunluğu önemlidir. Örn:Real time PCR da pozitif sonuçtan 10 siklus sonra ortaya çıkan kontaminasyon gözardı edilebilir. Fiziki şartları çok iyi olmayan bir laboratuarınız varsa mümkün olduğu kadar az işlem gerektiren yöntemler seçilmelidir. PCR suyu en sık kontamine olan materyaldir, küçük alikotlara ayrılmalı ve dondurulmalıdır. Buz üzerinde çalışmak yerine soğutucu tablalar tercih edilmelidir. Her teknisyene ait bir pipet seti oluşturulmalıdır, bazı teknisyenler kontaminasyona eğilimlidir. Yöneticilere moleküler yöntemlerin özel alanlara ihtiyacı olduğu anlatılmalıdır. Pipet kullanmak bir sanattır ancak öğrenilebilir.
Sonuç Kontaminasyonla az karşılaşmak için: İyi laboratuar uygulamaları, uygun laboratuar ortamı, iyi yetişmiş teknisyen. Pozitif olguların sıklığını takip, negatif ve pozitif kontrol kullanımı. Kalite kontrol uygulamaları ve denetim. Yüzey temizliği. UNG vb. amplicon kontaminasyonunu önleyen yöntemlerin kullanımı. Kapalı sistemler kullanımı.
Hiç bir önlem özenli, dikkatli yapılan bir tekniğin, özenli ve dikkatli çalışan eğitimli bir teknisyenin yerini tutamaz.
Kaynaklar 1. Añez Lingerfelt M, Fox GE, Willson RC. Reduction of DNA contamination in RNA samples for reverse transcriptionpolymerase chain reaction using selective precipitation by compaction agents. Analytical Biochemistry 2009;384(1):79 85. 2. Gefrides LA, Powell MC, Donley MA, Kahn R. UV irradiation and autoclave treatment for elimination of contaminating DNA from laboratory consumables. Forensic Science International: Genetics 2010;4(2):89 94. 3. Hein I, Schneeweiss W, Stanek C, Wagner M. Ethidium monoazide and propidium monoazide for elimination of unspecific DNA background in quantitative universal real time PCR. Journal of Microbiological Methods 2007;71(3):336 39. 4. Lalueza Fox C, Champlot S, Berthelot C, Pruvost M, Bennett EA, Grange T, et al. An Efficient Multistrategy DNA Decontamination Procedure of PCR Reagents for Hypersensitive PCR Applications. PLoS ONE 2010;5(9):e13042. 5. Mohammadi T, Reesink HW, Vandenbroucke Grauls CMJE, Savelkoul PHM. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods 2005;61(2):285 88. 6. Rueckert A, Morgan HW. Removal of contaminating DNA from polymerase chain reaction using ethidium monoazide. Journal of Microbiological Methods 2007;68(3):596 600. 7. Yang Q, Xu J, Qian X, Zhang K, Lei X. Eliminating nucleic acids contaminants by hydrogen peroxide induced free radicals during the preparation of proteins. Biochemical Engineering Journal 2006;29(1 2):23 26. 8. Aslanzadeh J. Preventing PCR amplification carryover contamination in a clinical laboratory. Ann Clin Lab Sci 2004;34(4):389 96.
Sabrınız İçin Teşekkür Ederim