Helicobacter pylori: mikrobiyolojik tan yöntemleri

DERLEME Hacettepe Tıp Dergisi 2004; 35:182-186 Helicobacter pylori: mikrobiyolojik tan yöntemleri Yakut Akyön Y lmaz 1 1 Öğretim Üyesi, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara H elicobacter pylori, insan ve diğer primatların midesine yerleşen spiral şeklinde, gram-negatif, mikroaerofilik bir bakteridir. Bu mikroorganizma vücuda bir defa girdiğinde, tedavi edilmediği takdirde yaşam boyu varlığını devam ettirmektedir. Yapılan ilk çalışmalarda bu bakterinin mide içerisinde normal flora üyesi olarak bulunduğu iddia edilmiştir. Ancak günümüzde insanlarda ve hayvan modellerinde yapılan çalışmalar, H. pylori nin lokal inflamasyona ve sistemik olarak da humoral bağışık yanıta neden olduğunu göstermiştir. Bu nedenle de bu mikroorganizmanın mide içerisinde varlığı normal flora üyesi olamayacağını, patojen bir mikroorganizma olarak kabul edildiğini göstermiştir [1]. Avustralya da patolog olarak çalışan Robin Warren, ilk defa 1979 yılında histopatolojik inceleme için gönderilen gastrik biyopsi örneklerinde kıvrık bakterilerin varlığını gözlemiştir. Bu bakterilerin gastrik mukozada olmayıp, dokuyu örten mukus tabakası içinde bulunduğunu saptamıştır [2]. Barry Marshall, 1981 yılında Warren ile birlikte izolasyon çalışmalarına başlamıştır. İlk önceleri bu mikroorganizma kıvrık ve gram-negatif bir basil şeklinde olduğu için Campylobacter cinsi içinde değerlendirilmiş, bakteriye Campylobacter pyloridis adı verilmiştir [3]. Bu buluşun yayınlanmasıyla birlikte bu konudaki çalışmalar yoğunlaşmış, yapılan tiplendirme çalışmalarında mikroorganizmanın bazı özellikleri nedeniyle Campylobacter cinsi olmadığı ve bakterinin Helicobacter pylori olarak adlandırılması gerektiği vurgulanmıştır. 1984 yılında H. pylori infeksiyonunda gastrik inflamasyon (kronik süperfisyal gastrit) ve polimorfonükleer hücre infiltrasyonu olduğu, yani kronik aktif gastrit oluşturduğu belirlenmiştir. H. pylori nin etyolojik ajan olarak peptik ülser hastalığındaki rolü yapılan çalışmalarla gösterilmiştir [4]. 1994 yılında Amerika Birleşik Devletleri nde Ulusal Sağlık Enstitüsü (National Institutes of Health), H. pylori nin peptik ülser hastalığının başlıca nedeni olduğunu ve infekte olan bireylerin organizmanın eradikasyonu için tedavi edilmesi gerektiğini bildirmiştir [5]. 1991 yılında H. pylori infeksiyonu ile gastrik kanser ilişkisi olduğu yönünde çalışmalar yayınlanmıştır ve 1994 yılında Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) nün bir dalı olan Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı (International Agency for Cancer Research) H. pylori nin insanlarda karsinojen olduğunu bildirmiştir [6]. Kronik H. pylori infeksiyonunun gastrik non-hodgkin lenfomaların ve gastrik mukozada gelişen lenfoid doku lenfomasının (MALToma) gelişiminde rol aldığı saptanmış ve MALT lenfomalı hastalarda H. pylori eradikasyonu ile tümörün gerilediği bildirilmiştir [7-9]. Özet olarak, H. pylori nin gastroduodenal dokuyla ilişkili olarak gastritten ülser ve malignansilere kadar pek çok hastalıkta rolü olduğu bilinmektedir. 182 H ACETTEPE T IP D ERG S

Helicobacter pylori: mikrobiyolojik tan yöntemleri Erken yaşlarda edinilen H. pylori nin tanımlanması için özefagogastroduodenoskopi gerektiren birçok invaziv ve endoskopi gerektirmeyen invaziv olmayan yöntem geliştirilmiştir. NVAZ V YÖNTEMLER H. pylori, özellikle daha az asit içeren bir ortam olmasından dolayı, midede antrum bölgesine, düzensiz yerleşme eğilimindedir. Bu nedenle endoskopi ile alınacak biyopsi örnekleri mümkünse birden fazla ve antrumdan alınmalıdır. Kültür H. pylori kültürde üretilmekte ve tanı için altın standart sayılmaktadır. Bu yöntem en standart, en özgül ve genellikle oldukça duyarlı bir yöntem olarak tanımlanmaktadır [10]. Oksijene duyarlı olan bu bakterinin laboratuvara ulaştırılması ve ekimi uygun koşullarda ve hızlı olmalıdır. Taşıyıcı besiyeri olarak serum fizyolojik ve ticari olarak hazırlanmış besiyerleri kullanılmaktadır. H. pylori kültürünün başarısı biyopsi örneğinin alımıyla ekimi arasındaki süreye ve oksijenle temasına bağlıdır. Bu nedenle alınan örnekler en fazla dört saat içinde ekilmeli, bu süre boyunca +4 C de bekletilmelidir. Örnek hemen ekilemeyecekse -70 C de saklanabilir, bu işlem kültürde üretmeyi %40 azaltacaktır. H. pylori seçici (antibiyotik içeren) ve seçici olmayan besiyerlerinde, mikroaerofilik ortamda 3-10 günde üretilmektedir. %5-10 yalancı negatif sonuç alınmaktadır [11]. Kullanılacak besiyeri beyin-kalp-infüzyon agar [Brain Heart Infusion (BHI)], Columbia agar, Brucella agar gibi zengin besiyerleri olmalı ve kan ya da serumla zenginleştirilmelidir. Mikroaerofil ortam, çeşitli ticari kitler kullanılarak, anaerop kavanozda sağlanabilir. Üreyen suşlar, Gram boyama, üreaz, katalaz, oksidaz reaksiyonlarına göre konvansiyonel yöntemlerle değerlendirilerek tanı konur. Kültürde üretilen H. pylori ye antibiyotik duyarlılık testi uygulanabilir, tiplendirme yapılabilir, bu suşlar -70 C de skim-milk ya da %15-20 gliserol içeren BHI sıvı besiyerinde saklanabilir. Tiplendirme yöntemleri Tablo 1 de gösterilmiştir [12]. Uygulanacak antimikrobiyal duyarlılık testleri The National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) onaylı olan agar dilüsyon ve ülkemizde ve Avrupa ülkelerinde kullanılan E-testtir. Bu testler rutin olarak uygulanmamalı, belirli aralıklarla antibiyotik duyarlılık paternini tanımlamak amacıyla yapılmalıdır. Histopatolojik inceleme Birçok araştırmacı histopatolojik incelemenin H. pylori infeksiyonunun tanısında altın standart olduğunu kabul etmektedir [13]. Bakteri mukus içinde, yüzey epiteline tutunmuş olarak, kriptin içine doğru derinlerde bulunur [11]. Antral biyopsi örneklerinin, rutinde kullanılan hematoksilen-eozinle veya özgüllüğün arttığı Warthin-Starry gümüşleme, akridin-oranj ve modifiye Giemsa ile boyandıktan sonra histopatolojik değerlendirilmesi oldukça iyi sonuçlar vermektedir [14,15]. Histopatolojik inceleme ile gastroduodenal patolojinin düzeyi ve premalign değişiklikler saptanabilir. Monoklonal veya poliklonal floresan anti-h. pylori antikorları- Tablo 1. Helicobacter pylori tiplendirme yöntemleri Fenotipik yöntemler DNA bazlı yöntemler Biyotiplendirme Restriksiyon endonükleaz kesme paternleri Serotiplendirme Geleneksel elektroforez Hemaglutinasyon Pulsed field jel elektroforez Lektin tiplendirme Southern blot hibridizasyon Dış membran protein profili Ribozomal RNA genleri İmmünblotlama Üreaz genleri SDS-PAGE protein profili Rastgele DNA parçaları PCR bağlı RFLP analizi Üreaz geni Flagellin geni Tekrarlayan ekstrajenik sekanslar Arbitrary primer profilleri Plazmid profilleri SDS-PAGE: Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforez, PCR: Polimeraz zincir reaksiyonu, RFLP: Restriksiyon parça uzunluk analizi. Cilt 35 Say 4 2004 183

Akyön Y lmaz nın kullanıldığı immünhistokimyasal boyama tanıda özgül ve duyarlı bir yöntemdir, ancak maliyeti yüksektir [13,16]. Hızlı üreaz testi Endoskopi sırasında alınan antral biyopsi örneklerinden uygulanan hızlı üreaz testi hem ucuz hem de kolay bir tekniktir. H. pylori üreaz aktivitesi ile ortamdaki üreyi amonyak ve bikarbonata parçalar ve ortamın ph sını yükselterek ph indikatörü ile ortamın rengini değiştirir. Pozitif sonuçların %90 ı ilk yarım saatte görülür ve geri kalanlarda ertesi gün okumayı gerektirir [11]. Ticari veya laboratuvarda hazırlanmış hızlı üreaz testleri bulunmaktadır. Moleküler tanı yöntemleri Moleküler yöntemler, özellikle son yıllarda H. pylori ve diğer Helicobacter türlerinin saptanmasında sıklıkla kullanılmaya başlanmıştır [10]. Bu yöntemler tiplendirmede, antibiyotik duyarlılık saptamada ve virülans faktörlerinin belirlenmesinde önem kazanmışlardır. Moleküler yöntemler mide biyopsi örnekleri dışındaki örneklerden de H. pylori ve/veya diğer Helicobacter türlerini saptamak için kullanılabilmektedir. Moleküler bir yöntemle gösterilen Helicobacter in canlı olup olmadığı saptanamaz. Seçilecek DNA ekstraksiyon yöntemi bu testlerin duyarlılığında çok önem taşır. DNA ekstraksiyonunda inhibitörlerin uzaklaştırılması gerekmektedir, doğru yöntem seçilmezse yanlış negatif sonuçlar alınacaktır. NVAZ V OLMAYAN YÖNTEMLER Üre nefes testi Bu testte oral yoldan C 13 veya C 14 (radyoaktif karbon) işaretli üre alımını takiben, 20-30 dakika sonra solunan hava örnekleri toplanmakta ve bunlar daha sonra spektrometrik olarak veya sintillasyon cihazlarında sayılmaktadır. İşaretli üre H. pylori ile infekte kişilerde bakterinin üreaz enzimi ile parçalanır. Oluşan CO 2 solunum havasında saptanmaktadır. Duyarlılığı ve özgüllüğü çok yüksektir. Test, yalancı negatif sonuçlardan kaçınmak üzere antibiyotik veya omeprazol tedavisi sırasında uygulanmamalı, tedavi bitiminden en az bir ay sonra uygulanmalıdır [11]. Serolojik yöntemler 184 Serolojik yöntemler H. pylori tanısında kullanılan yaygın yöntemlerden biridir. Özellikle epidemiyolojik çalışmalarda yararlıdır [11]. Enzim işaretli katı faz immünassay (ELISA) yöntemi en sık kullanılan serolojik yöntemdir [17]. H. pylori infeksiyonu sistemik ve lokal antikor yanıtına neden olur. Özgül IgM antikorlar kısa süreli olarak yükselir, IgG ve IgA infeksiyon süresince artar ve tedavi edilmedikçe yüksek kalır. Tedaviyi izleyen aylarda eradikasyon sağlandıysa IgG ve IgA düzeyleri düşer. IgG düzeyi hiçbir zaman tamamen negatifleşmez. Tedaviye yanıtın değerlendirilmesinde, tedavi öncesi ve tedavi bitiminden itibaren üç-altı ay sonra olacak şekilde iki titrasyonun karşılaştırılması gereklidir [18]. Bu testlerde kullanılacak antijenler çok önemlidir. Genellikle üç tip antijen kullanılmaktadır; 1. Tam hücreler ve tam hücre parçaları gibi ham antijenler, 2. Glisin ekstraktları ve ısı değişken olmayan antijenler gibi hücre parçacıkları, 3. Üreaz ve 120 kda antijen gibi zenginleştirilmiş antijenler [11]. Virülans genlerini saptamaya yönelik serolojik kitler de geliştirilmiştir [19]. Western Blot, immünoblotlama, bakterinin çeşitli bölümlerine karşı oluşan sıvısal bağışık yanıtı saptamada kullanılan oldukça duyarlı ve özgül bir yöntemdir [20]. Serolojik olarak hasta başı testleri, bir damla kan ya da serum ile uygulanabilen veya idrarda IgG saptayan testler geliştirilmiştir ama bunların duyarlılık ve özgüllükleri düşüktür [19,21,22]. Dışkı örnekleri için kullanılan tanı yöntemleri Dışkı kültürü: H. pylori safraya duyarlı bir bakteridir. Dışkı safra asitlerinin yüksek oranda bulunduğu bir ortamdır. Dışkı aynı zamanda anaerop ve fakültatif anaerop bakterilerden oluşan zengin bir normal floraya sahip bir ortamdır. Bütün bu nedenlerden dolayı dışkı kültüründe H. pylori üretmek oldukça zordur. Pasajın çok hızlı olduğu diyareli olgularda dışkıda H. pylori üretilebilmiştir [23]. Dışkı antijen testleri: Ticari olarak hazırlanmış poliklonal ve monoklonal antikor testleri bulunmaktadır. Poliklonal testlerin özgüllüğü oldukça yüksekken, duyarlılığı değişken olarak saptanmıştır [24-26]. Monoklonal testler yüksek duyarlılık ve özgüllük göstermiştir [27]. Hasta başı test olarak geliştirilen monoklonal antikor test sonuçları oldukça duyarlı ve özgül olarak saptanmıştır [28]. Dışkı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR): Dışkı PCR inhibitörleri açısından çok zengindir. Bu nedenle uygulanacak DNA ekstraksiyon yöntemi ve inhibitör uzaklaştırılması dışkıda PCR uygulamasında çok önemlidir. H ACETTEPE T IP D ERG S

Helicobacter pylori: mikrobiyolojik tan yöntemleri Tablo 2. Helicobacter pylori infeksiyonunun varlığını göstermek için kullanılan testler Endoskopi Test Duyarlılık (%)Özgüllük (%) gerekliliği Yorum Histoloji 93-98 95-98 Evet Çok sayıda antral biyopsi örneği gerekir, özel boyalar duyarlılığı arttırır. Kültür 77-95 100 Evet Antibiyotik duyarlılık testleri için ve ayrıntılı tiplendirme için gerekir. Hızlı üreaz testi 89-98 93-98 Evet Endoskopik işlem sırasında tanı için kullanılır. 13 C-UBT* 90-95 90-95 Hayır Canlı bakteri ve infeksiyon varlığını gösterir, tedavi takibinde yararlıdır. 14 C-UBT** 90-95 90-95 Hayır 13 C-UBT ile benzer mekanizma, düşük dozda radyoaktif madde alınımı var, kısa dönemde antibiyotik tedavisinin takibinde kullanılmaz, epidemiyolojik çalışmalar için idealdir. Seroloji 88-95 86-95 Hayır Kısa dönemde antibiyotik tedavisinin takibinde kullanılmaz, epidemiyolojik çalışmalar için idealdir. PCR yöntemleri 85-96 90-100 Evet (biyopsi) H. pylori DNA sının varlığını gösterir, ancak ölü bakterilerde Hayır (tükürük) pozitif sonuç verir, H. pylori suşlarının farklılığını belirlemede kullanılır. Dışkı antijen 90-94 98-99 Hayır İnvaziv olmaması bir avantajdır. testleri (monoklonal) * Üre soluk testi (UBT-Urea Breath Test). Karbon 13 ile işaretlenmiş üre. ** Üre soluk testi (UBT-Urea Breath Test). Karbon 14 ile işaretlenmiş üre. Dışkı filtrasyon yöntemi inhibitörlerin uzaklaştırılmasında kullanılan bir yöntemdir. Polipropilen membran ile süzülen dışkı örneklerinde PCR inhibitörlerine rastlanmamıştır [29]. İmmünmanyetik ayırma bir diğer inhibitör uzaklaştırma yöntemidir. H. pylori yüzey antijenlerine karşı antikorlarla kaplı manyetik boncuklar kullanılır. Dışkıdaki H. pylori basil ve kok formları bu boncuklara yapışır, örnekteki inhibitörler yıkamayla uzaklaştırılır [30]. Biyokimyasal saflaştırma dışkıdan DNA ekstraksiyonu için kullanılan bir başka yöntemdir [31]. Dışkıda H. pylori saptanması için PCR yöntemi kullanılacağı zaman en az iki set primer kullanılması önerilmektedir [32]. Ayrıca, reamplifikasyon, nested PCR yöntemleri dışkıda H. pylori saptanmasında testin duyarlılığını arttıracaktır. SONUÇ Tanı için, H. pylori varlığını göstermeye yönelik, birbirinin alternatifi olabilecek pek çok yöntem vardır (Tablo 2). H. pylori tanısında yöntem tanının konulacağı laboratuvarın koşullarına (alt yapısına), amaçlarına, maliyete ve uzman varlığına bağlı olarak seçilmelidir. Cilt 35 Say 4 2004 Kaynaklar 1. Blaser MJ. Helicobacter pylori: microbiology of a slow bacterial infection. Trends Microbiol 1993; 1:255-60. 2. Warren JR, Marshall BJ. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet 1983; i:1273-5. 3. Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet 1984; i:1311-5. 4. Blaser MJ. Helicobacter pylori and the pathogenesis of gastroduodenal inflammation. J Infect Dis 1990; 161:626-33. 5. NIH Consensus Conference. Helicobacter pylori in peptic ulcer disease. NIH Consensus Development Panel on Helicobacter pylori in peptic ulcer disease. JAMA 1994; 272:65-9. 6. Anonymous. Shistosomes, liver flukes and Helicobacter pylori. Monogr Eval Carcinog Risks Hum 1994; 61:1-241. 7. Parsonnet J, Hansen S, Rodriguez L, et al. Helicobacter pylori infection and gastric lymphoma. N Engl J Med 1994; 330: 1267-71. 8. Eidt S, Stolte M, Fischer R. Helicobacter pylori gastritis and primary non-hodgin s lymphomas. J Clin Pathol 1994; 47:436-9. 9. Bayerdoffer E, Ritter MM, Hatz R, et al. Regression of primary gastric lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue type after cure of Helicobacter pylori infection. Lancet 1995; 345:1591-4. 10. Makristathis A, Hirschl AM, Lehours P, Megraud F. Diagnosis of Helicobacter pylori infection. Helicobacter 2004; Suppl 1. 11. Dunn BE, Cohen H, Blaser MJ. Helicobacter pylori. Clin Microbiol Rev 1997; 10:720-41. 12. Hirmo S, Shumakov Y, Utt M, Wadström T. Genetic heterogenety of Helicobacter pylori and strain typing. In: Moran 185

Akyön Y lmaz AP, O Morain CA (eds). Pathogenesis and host response in Helicobacter pylori infections. Homburg Normed Verlag: International Medical Publishers, 1997; 199-205. 13. Braden B, Caspary WF. Detection of Helicobacter pylori infection: when to perform which test? Ann Med 2001; 33:91-7. 14. el-zimaity HM, Graham DY, al-assi MT, et al. Interobserver variation in the histopathologic assessment of Helicobacter pylori gastritis. Human Pathol 1996; 27:35-41. 15. Genta RM, Graham DY. Comparison of biopsy sites for the histopathologic diagnosis of Helicobacter pylori: a topographic study of H. pylori density and distribution. Gastrointest 1994; 40:342-5. 16. Monteiro L, Doermann HP, Megraud F. Non-serological diagnostic tests for Helicobacter pylori infections. Homburg Normed Verlag: International Medical Publishers, 1997; 215-29. 17. Taylor D, Parsonnet J. Epidemiology and natural history of H. pylori infections. In: Blaser MJ, Smith PF, Ravdin J, Greenberg H, Guerrant RL (eds). Infections of the gastrointestinal tract. New York: Raven Press, 1995; 551-64. 18. Hirschl AM, Rotter ML. Serological tests for monitoring Helicobacter pylori eradication treatment. J Gastroenterol 1996; 31:33-6. 19. Vaira D, Gatta L, Ricci C, Miglioli M. Review article: diagnosis of Helicobacter pylori infection. Aliment Pharmacol Ther 2002; 16(Suppl 1):16-23. 20. Herbrink P, vandoorn LJ. Serological methods for diagnosis of Helicobacter pylori infection and monitoring of erad, ication therapy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000; 19:164-73. 21. Leodolter A, Vaira D, Bazzoli F, et al. European multicentre validation of two new non-invasive tests for the detection of Helicobacter pylori antibodies: urine-based ELISA and rapid urine test. Aliment Pharmacol Ther 2003; 18:927-31. 22. Gatta L, Ricci C, Tampieri A, VairaD. Non-invasive techniques for the diagnosis of Helicobacter pylori infection. Clin Microbiol Infect 2003; 9:489-96. 23. Thomas JE, Gibson GR, Darboe MK, et al. Isolation of Helicobacter pylori from human feces. Lancet 1992; 340:1194-5. 24. de Carvalho Costa Cardinali L, Rocha GA, Rocha AM, et al. Evaluation of [ 13 C] urea breath test and Helicobacter pylori stool antigen test for diagnosis of H. pylori infection in children from a developing country. J Clin Microbiol 2003; 41:3334-5. 25. El-Nasr MS, Elibiary SA, Bastawi MB, et al. Evaluation of a new enzyme immunoassay for the detection of Helicobacter pylori in stool specimens. J Egypt Soc Parasitol 2003; 33:905-15. 26. Zambon CF, Basso D, Navaglia F, et al. Non-invasive diagnosis of Helicobacter pylori infection: simplified 13C-urea breath test, stool antigen testing, or DNA PCR in human feces in a clinical laboratory setting? Clin Biochem 2004; 37:261-7. 27. Koletzko S, Konstantopoulos N, Bosman D, et al. Evaluation of a novel monoclonal enzyme immunoassay for detection for Helicobacter pylori antigen in stool from children. Gut 2003; 25:804-6. 28. Wu IC, Ke HL, Lo YC, et al. Evaluation of a newly developed office-based stool test for detecting Helicobacter pylori: an extensive pilot study. Hepatogastroenterology 2003; 50:1761-5. 29. Cavallini A, Notarnicola M, Berloco P, et al. Use of macroporous polypropylene filter to allow identification of bacteria by PCR in human fecal samples. J Microbiol Methods 2000; 39:265-70. 30. Enroth H, Engstrand L. Immunomagnetic sewparation and PCR for detection of Helicobacter pylori in water and stool specimens. J Clin Microbiol 1995; 33:2162-5. 31. Gramley WA, Asghar A, Frierson HF, Powell SM. Detection of Helicobacter pylori DNA in fecal samples from infected individuals. J Clin Microbiol 1999; 37:2236-40. 32. Kabir S. Detection of Helicobacter pylori in faeces by culture, PCR and enzyme immunoassay. J Med Microbiol 2001; 50: 1021-9. 186 H ACETTEPE T IP D ERG S