Kromatografi Nedir? Kromatografi, bir karışımda bulunan bileşenlerin birbirinden ayrılmasını gerçekleştiren ve bu sayede kalitatif ve kantitatif analizlerinin yapıldığı yöntemlerin genel adıdır. Bu yöntemlerde çalışma düzeneği temel olarak iki bileşenden oluşur. Bu bileşenlere sabit faz (stationary phase) ve hareketli faz ya da mobil faz (mobile phase) adı verilir. Mobil fazın içerisinde yer alan bileşenler, sabit faza ait dolgu maddesiyle etkileşmeleri sebebiyle, bir miktar tutulurlar. Bu tutulma, örnekteki farklı bileşenler için farklı miktarlarda olur. Böylece bileşenler sabit fazın sonlarına doğru, farklı hızlarda ilerledikleri için, birbirinden ayrılmış vaziyette sabit fazı farklı zamanlarda terkederler. Bu şekilde sabit fazdan çıkan bileşenlerin derişimleri uygun bir biçimde ölçülür ve zamana veya mobil fazın kullanılan hacmine karşı y-ekseninde işaretlenerek kromatogram denilen grafikler elde edilir. 1903: Russian botanist Mikhail Tswett Adsorpsiyon kolon kromatografi tekniğine göre bitki pigmentlerini ayırmıştır Cam bir kolonu kalsiyum karbonat ve alumina ile doldurmuş Saf çözelti ile örnek kolana dökülmüş Dikey konumdaki kolon içerisinde örnek hareket ettikçe, farklı renkte bantlar oluşur. Örnek içindeki renk maddelerinin ayrımı gerçekleşmiştir. Kromatografi Latince kökenli color writing kelimelerinden türetilmiştir. Ayrıca, Tswett kelimesi rusçada renk anlamına gelmektedir. HPLC Enjektör HPLC donanımını oluşturan enjektör örneğin sabit faz (kolon) öncesinde mobil faza enjekte edilmesi için kullanılır. Elle kumanda edilen manuel ve bilgisayar kumandalı oto-enjektörler olmak üzere 2 çeşidi bulunmaktadır. - Manuel Enjektörler(Manuel Injector): Örneğin enjekte edilebilmesi için enjektör önce doldurma pozisyonuna (load position) getirilerek örnek, isteğe göre seçilebilen sabit hacimli, loop içerisine doldurulur. Loop a doldurulan örnek hacmi loop sabit hacmini geçerse, fazla olan kısım dışarıya otomatik olarak atılır. Daha sonra enjektörün kolu enjeksiyon pozisyonuna (inject position) getirilerek örnek mobil faz içerisine enjekte edilmiş olur. Kullanılan loop hacimleri çok değişken olup genellikle 1
5 ml 5 ml aralığında değişir. Loop hacmi küçüldükçe tekrarlanabilirlik adına yapılan hata oranı da büyümektedir. - Oto-enjektörler(Autosampler): 2 tip oto-enjektör mevcuttur. Bunlar XY tipi ve carousel tipidir. XY tipinde enjektör hareketli olup belirtilen koordinatlara giderek örneği şişesinden çekmekte ve loop vasıtasıyla mobil faza enjekte etmektedir. Bunun için seçilen örneklere ait bilgilerin, gerekli yazılım kullanılarak, önceden bilgi işlemciye girilmesi gerekmektedir. Carousel tipinde ise örnekler dönen, dairesel şekilli bir taşıyıcı vasıtasıyla sabit bir enjektörün altına taşınmaktadır. Kolon Modern HPLC donanımının 4 temel yapı taşından birisi olan kolon, karmaşık örneklerde bileşenlerin birbirinden iyi çözünürlükle ayırımından sorumlu sabit fazdır. Kolon imalatında yapı materyali olarak 316 paslanmaz çelik, TEFLON, cam veya PEEK en sık tercih edilenlerdir. Kolonun ayırım gücü ve performansı yapıldığı materyalden çok, iç yüzeyine yapılan kaplamada kullanılan malzemenin kimyasal ve fiziksel özelliklerinden etkilenmektedir. Kullanılan bu tür kaplama malzemeleri çok çeşitli olup, kullanılacak mobil fazın ve uygulanacak HPLC metodunun özelliklerine ve analizi yapılacak örneğin bilinen kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre seçilmelidir. Seçilecek kolonun HPLC uygulamasında kullanılacak akış hızı ve dolayısıyla oluşacak basınca dayanıklı olmasına dikkat edilmelidir. Birçok analitik kolonun iç çapı 2-5 mm aralığında değişmektedir. Kolon iç çapı arttıkça akış hızı ve iç doldurma hacmi artmakta ama oluşacak piklerin çözünürlüğü dolayısıyla duyarlılık azalmaktadır. Kolonların boyları (uzunluğu) çok çeşitli olup genellikle 30-300 mm aralığında değişmektedir. Kolon uzunluğu arttıkça örnek bileşenlerinin ayırımı daha iyi olmakta fakat analiz süresi uzadığı için daha fazla mobil faz harcanmaktadır. Kolon boyutlarının tanımlanmasına uluslararası standartlar getirilmiştir. Buna göre önce mm cinsinden uzunluk ve çap yazılmakta, bunu firma adı, sabit faz türü, AO türünden poroz yüzey çapı ve mm cinsinden partikül büyüklüğü izlemektedir. Örneğin, 250/4,6 Nucleosil C18 100 5 yazıldığında, kolonun 250 mm uzunluk ve 4,6 mm iç çapa sahip olduğu anlaşılmaktadır. Kolonun firması (markası) Nuclesoil olup, sabit faz türü normal fazda kullanılan bir tür olan C18 dir. Poroz yüzey çapı 100 AO olup, dolgu materyaline ait partikül büyüklüğü 5 µm dir. Yüksek basınçta yapılan kromatografide, sisteme verilmeden önce, hareketli fazın içerisindeki çözünmüş gazlar uzaklaştırılmalıdır; aksi halde sistemin düşük basınçlı kısmı olan dedektörde, çözünmüş gazlar (özellikle hava) kabarcık oluşturur. Bu durum, dedektörden çok hatalı değerler alınmasına neden olur. Hareketli fazdan gaz uzaklaştırma işlemi ısıtma veya vakum uygulayarak olur.10-60 ml/h akış hızını elde etmek için hareketli faza uygulanan basınç, 30-400 atm arasında değişir. SK koşulları iyi ayarlandığında, kolonda birbirinden ayrılan maddeler taşıyıcı faz ile birlikte ölçüm birimi olan dedektöre gelirler. Dedektör maddenin derişimi ile doğru orantılı bir özelliğini ölçmelidir. Bu amaçla; Absorbans Dedektörü, Floresans Dedektörü, Kırılma İndisi Dedektörü, Elektrokimyasal Dedektör ve İletkenlik Dedektörü kullanılabilir. Absorbans dedektörleri, akış hücrelerinden geçen sıvının -sabit ya da istenilen değere ayarlanabilir dalga boyundaki- ışığı absorpsiyonunu ölçerler. Floresans dedektörler, belli bir dalga boyunda ışığı absorpladıktan sonra başka bir dalga boyunda ışın yayan yani florasans özellik gösteren maddelerin yaydığı ışık şiddetini ölçerler. Kırılma indisi dedektörleri ise akış hücrelerinden geçen akımın kırılma indisini ölçerler. Absorbans dedektörü 2
kullanılırken seçilen dalga boyunun, ışığın % 90 ının absorplandığı dalga boyu olarak tanımlanan, çözücü uv-cut off değerinden yüksek olmamasına dikkat edilmelidir. Bu durum, özellikle düşük dalga boylarında absorpsiyon yapan örnekler için önemlidir. Akış hücresine gelen madde derişimi ve/veya cinsi değiştiğinde dedektör sinyalinde değişiklik olur. Kaydedici, zamana göre dedektörden gelen sinyali (voltaj değişimini) kaydeder. HPLC Sistem Türleri A) Isocratic sistem (tek pompa, tek solvent, solvent karışım olabilir, ayırım yetersizdir) B) Düşük basınçlı gradient sistem (tek pompa, max 4 farklı mobil faz, karışma pompadan önce) C) Yüksek basınçlı gradient sistem (2 yada 3 pompa, 2 yada 3 farklı mobil faz, karışma pompadan sonra) 3
4
Karbonhidrat Analizi HPLC sistemi kullanılarak mono ve oligosakkaritler ile hidroliz işlemi gerçekleştirilmiş polisakkaritlerin kalitatif ve kantitatif analizleri gerçekleştirilebilir. Bu yöntem ile hızlı sonuç alınabilmekte ve örnekte yüksek konsantrasyonlarda şeker bulunması halinde çalışılabilmektedir. Ayrıca yüksek düzeyde kesinlik ve doğruluk söz konusudur. Analiz edilecek örnek, gaz kromatografisinde olduğu gibi türevlendirme işlemine gereksinim duyulmazken, enjeksiyon öncesinde mikrofiltreden (0.45µ) geçirilmelidir. HPLC de ayırım, örneğin yatışkın (sabit) ve hareketli (mobil) fazlar arasındaki etkileşimlerine bağlı olarak gerçekleşir. Bu bağlamda, kullanılan yatışkın ve mobil fazın özelliklerine bağlı olarak da sistem farklı şekillerde isimlendirilebilir. Aşağıda karbonhidrat analizleri için kullanılabilecek bu sistemlere kısaca değinilmiştir. 5
Özellik Yağ-çözünür olanlar Geniş kullanım alanı Moleküler ağırlık dağılımı, protein ayrımı İyonik bileşenleri ayrımı Enzim ve proteinlerin saflaştırılması Normal faz kromatografisinde yatışkın faz polar karakterde olup, ayırım mobil fazın polaritesindeki artışa bağlı olarak gerçekleşir. Karbonhidratların HPLC ile analizlerinde yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Silikajel yüzeyine çeşitli şekillerde amino grupları bağlanması ile hazırlanan kolonlar (amino kolon) yatışkın faz olarak kullanılır. Hareketli faz olarak da genellikle asetonitril-su (%50-85 asetonitril) karışımı, karbonhidrat ayrımında etkili bir şekilde kullanılabilir. Ayırım sırası monosakkaritler ve şeker alkolleri, disakkaritler ve oligosakkaritler şeklindedir. Bu kolonların en önemli dezavantajı, indirgen şekerlerin yatışkın fazdaki amino grupları ile reaksiyona girme eğilimi ve bunun sonucu olarak kolon performansının zamanla azalmasıdır. Bu olumsuzluğu kısmen engellemek için ise az miktarda çözünür amin bileşiği modifiye edici ajan olarak hareketli faz içerisine ilave edilir. Modifiye edici bu ajanların en az iki amino grubu olup, bunlardan bir tanesi silikajel yüzeyine adsorbsiyon için gereklidir. Diğerleri ise karbonhidrat analizi için serbest kalmalıdır. Modifiye edici ajan hareketli faz içerisinde yer aldığından, kolon sürekli olarak rejenere edilmelidir. Interaction : Adsorption Packing materials : Polar ex. Silica gel Silica-NH2 Silica-CN Silica-OH Mobile phase : Non-polar ex. n-hex/ch2cl2 iso-oct/ipa iso-oct/acoet Sample : Fat-soluble, Different polarity 6
Ters faz kromatografisinde yatışkın faz hidrofobik karakterde, hareketli faz ise büyük oranda sudur. Hidrofobik yatışkın faz, C18 yada fenil kolonlar olabilir. Karbonhidrat analizinde bu yöntemin en önemli dezavantajı, monosakkaritlerin kısa alıkonma süreleri dolayısıyla ayırımın iyi olmamasıdır. Sodyum klorür vb tuzların ilavesi ile alıkonma süreleri uzatılarak, yöntem monosakkkarit analizi açısından daha uygun hale getirilebilir. Ters faz kromatografisi ile karbonhidrat analizinde anomerlerin varlığı dolayısıyla pikler üst üste gelebilir. Mobil faza amin ilave edilerek anomerizasyonun (mutarotaston) hızlandırılması ile bu problemin önlenmesi sağlanır. Ancak kısa süreli alıkonma süresi dolayısıyla ayırım negatif etkilenir. Interaction : Hydrophobic Packing materials : Non-polar ex. Silica-C18 Silica-C8 Polymer Mobile phase : Polar ex. MeOH/H2O CH3CN/H2O MeOH/Buffer sol. 7
Sample : Having different length of carbon chain 8
9
Boyut eleme kromatografisi (Size-Exclusion Chromatography, SEC), özellikle yüksek mol kütleli türlere uygulanabilen güçlü bir tekniktir. Bu yöntemin ana uygulamalarından biri, büyük polimer veya doğal ürünlerin mol kütlelerinin veya mol kütlesi dağılımlarının hızlı bir şekilde tayinidir. SEC, karbonhidrat araştırmalarında, polisakkaritlerin moleküler kütle dağılımlarını belirlemede en çok kullanılan yöntemlerdendir. Son yılllarda karbonhidrat analizleri için popularitesi artan bir yöntem olan yüksek performanslı anyon değiştirme kromatografisinde (HPAEC) anyonik karakterde bir yatışkın faz ile yüksek ph değerine sahip bir hareketli faz kullanılmaktadır. Yüksek alkali ortamlarda (ph 10-14) karbonhidratların hidroksil grupları iyonize olurlar ve böylece şekerlerin anyon değiştirme reçineleri ile ayrılması sağlanır. Mono ve disakkaritlerin ayrılmasında hareketli faz olarak sodyum hidroksit, daha yüksek moleküllü karbonhidratlarda ise iyonik gerilimi arttırmak amacıyla sodyum asetat içeren çözeltiler kullanılır. Anyon değiştirme kromatografisi genellikle elektrokimyasal dedektörlerle birlikte kullanılır. Şekil 3.1 de bu yöntemle elde edilmiş örnek bir kromatogram gösterilmektedir. 10
Şekil 3.1. HPAEC ile bazı şekerlerin ayırımını gösteren örnek kromatogram Katyon değiştirme kromatografisinde mikroporoz yapıda polimerik reçineler yatışkın faz olarak kullanılır. Yapılmak istenen ayrıma bağlı olarak reçine, çeşitli metal iyonları ile yüklenir. Bu amaçla genellikle Ca2+, Pb2+ yada Ag+ kullanılır. Mobil faz olarak ise çeşitli oranda (genellikle <%40) metanol ve/veya asetonitril gibi organik çözelti içeren su kullanılır. Ayırım işlemi yüksek sıcaklıklarda (>80 C) gerçekleştirilir. Böylelikle yatışkın ve hareketli faz arasındaki kütle transfer hızının arttırılması ile kolon verimi yükselir ve daha iyi ayırım sağlanır. Katyon değiştirme reçineleri ile karbonhidrat ayırımı azalan molekül ağırlık sırasına göre gerçekleşir. Buna göre polimerizasyon derecesi 3 den büyük olan oligosakkaritler ilk ayrılır. Bunu trisakkaritler, disakkaritler, monosakkaritler ve alditoller izler. Bu yöntemin en önemli avantajı monosakkaritlerin iyi bir şekilde ayrılabilmesidir (Şekil 3.2). 11
Şekil 3.2. Katyon değiştirme kromatografisi ile elma suyundaki şekerlerin ayırımı [Ca-form kolon (Interaction CHO-620; 30 x 0.65 cm; 90 C); hareketli faz, saf su (0.5 ml/dak); refraktif indeksdedektör] 12
Karbonhidrat analizlerinde kullanılan başlıca dedektörler ise refraktif indeks ve elektrokimyasal dedektörlerdir. Refraktif indeks dedektörler, karbonhidrat analizlerinde yaygın olarak kullanılırlar. Refraktif indeks ölçümleri geniş karbonhidrat konsantrasyonlarında lineer sonuç verip evrensel olarak tüm karbonhidratlara uygulanabilirken, bu dedektörlerin bazı dezavantajları da vardır. Refraktif indeks fiziksel bir özellik olduğundan akış koşullarının, basınç ve sıcaklığın değişimine karşı oldukça duyarlıdır. Modern HPLC ekipmanları ve sıcaklık kontrollü dedektörler bu olumsuz değişimlerden 13
kaynaklanan problemleri minimize edebilirler. Bununla birlikte refraktif indeks dedektörlerin en önemli sınırlayıcı faktörleri gradyen ayırım uygulanamaması ve düşük konsantrasyonlara karşı duyarlı olmamalarıdır. Elektrokimyasal dedektörler ise vurgulu amperometrik dedektör (Pulsed Amperometric Dedector, PAD) olarak da adlandırılırlar ve yaygın olarak anyon değiştirme kromatografisi ile birlikte kullanılırlar. Amperometrik ölçümler, elektrottaki bileşenin indirgenme yada yükseltgenmesi sonucu akımda meydana gelen değişimin belirlenmesi temelinde gerçekleştirilir. Vurgulu amperometrik dedektörlerde, karbonhidrat oksidasyonu sonucu akımda meydana gelen değişim altın yada platin elektrotta ölçülür. Bu dedektörlerin avantajları çok düşük tespit limitleri yanında gradyen ayrıma da uygun olması, dolayısıyla da ayırım koşullarının optimizasyonunda daha esnek çalışılabilmesine olanak sağlamasıdır. 14
Post-kolon türevlendirme işlemi ile de karbonhidrat analizi gerçekleştirilebilir. Bu sistemde öncelikle, ilave edilen çeşitli ajanlarla renkli bileşikler oluşturulur ve bunların konsantrasyonları da UV yada floresans dedektörlerle ölçülür. 15
3.1.2.1. Gerekli Ekipman ve Çözeltiler Glukoz, fruktoz ve sakaroz standart çözeltileri: Glukoz, fruktoz ve sakaroz stok çözeltileri, çeşitli konsantrasyonlarda deiyonize su içerisinde hazırlanır. Stok çözeltilerden deiyonize su ile seyreltilerek uygun konsantrasyonlarda standart çözeltiler elde olunur. HPLC sistemine enjeksiyonun ardından elde edilen piklerin alanları veya yükseklikleri belirlenir. Kalibrasyon eğrileri, konsantrasyona karşılık pik alanı yada yüksekliği baz alınarak hazırlanır (Şekil 3.3). 3.1.2.2. Meyvelerde ve meyve suyunda şeker analizi Meyveler 1:1 oranında su ile karıştırılıp homojenize ve filtre edildikten sonra, meyve suyu örnekleri ise direkt olarak 0.45 μm filtreden geçirilerek, aynı koşullarda HPLC kolonuna enjekte edilir. Alıkonma süreleri kıyaslanarak tanımlanan herbir şekerin pik alanları belirlenir ve pik alanı x 16
konsantrasyon grafiklerinden konsantrasyon değerleri hesaplanır (Şekil 3.3). Meyvelerdeki şeker mikarının belirlenmesinde seyreltmeler de dikkate alınmalıdır. A4 Pik alanı A3 Ax A2 C1 C2 Cx C3 Konsantrasyon (%) C4 Şekil 3.3. Konsantrasyona karşı pik alanının grafiğe geçirilmesiyle elde edilen kalibrasyon eğrisi 17
18
Glukoz ALAN (konsantrasyon) glukoz Sakaroz (konsantrasyon) ALAN sakaroz Fruktoz (konsantrasyon) ALAN fruktoz % 0,1 292009 % 0,1 113045 % 0,1 248679 % 0,05 145651 % 0,05 60062 % 0,05 122754 % 0,025 77870 % 0,025 29583 % 0,025 66178 % 0,01 31564 % 0,01 12804 % 0,01 26665 Elma Suyu 1 83766 Elma Suyu 1 12567 Elma Suyu 1 192636 Elma Suyu 2 73635 Elma Suyu 2 11309 Elma Suyu 2 170732 19
350000 y = 3E+06x + 3605,8 R² = 0,9997 300000 250000 200000 150000 100000 GLUKOZ 50000 0 0 0,02 300000 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 y = 2E+06x + 2603 R² = 0,9996 250000 200000 FRUKTOZ 150000 100000 50000 0 0 120000 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 SAKAROZ y = 1E+06x + 2275,4 R² = 0,9991 100000 80000 60000 40000 20000 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 20
glukoz 0,1 0,05 0,025 0,01 Elma suyu1 Elma suyu2 0,025 *100 2,50% glukozala n sakaroz sakarozalan fruktoz fruktozalan 292009 0,1 113045 0,1 248679 145651 0,05 60062 0,05 122754 77870 0,025 29583 0,025 66178 31564 0,01 12804 0,01 26665 83766 Elma suyu1 73635 Elma suyu2 78700,5 0,009 *100 0,90% 12567 Elma suyu1 11309 Elma suyu2 11938 0,090 *100 9% 192636 170732 181684 Sonuçlar: SAKAROZ: % 2.5, GLUKOZ: % 0.9, FRUKTOZ: % 9. 100 g meyve suyunda 2.5 g sakaroz, 0.9 g glukoz ve 9 g fruktoz vardır. 21