Projenin Adı: ANT KANSOREJEN LAÇLARIN DNA B YOSENSÖRLER YLE KAR ILA TIRILMASI Projenin Amacı: Kemoterapi, kanser hücrelerini yok etmek için anti-kanser (sitotoksik) ilaçların kullanılmasıdır. Kemoterapi, kanser tedavisinde, tek ba ına veya cerrahi i lemle ve/veya radyoterapi ile birlikte uygulanabilir. Kemoterapi, kimyasal madde (ilaç) ve tedavi kelimelerinin birle iminden olu mu tur. Bu tedavide mevcut bulunan yakla ık kırk de i ik ilaçtan seçilen bir veya birkaç ilaç uygulanır. Kemoterapide kullanılan ilaçlar insanlarda denenerek karar verilmektedir. Bizim geli tirdi imiz bu sistemle hastadan alınan küçük bir kan örne i içerisindeki DNA dan ve bu DNA nın ilaç ile etkile imden yararlanılarak ilaç hastaya verilmeden önce ona ne tür bir etki yaptı ı kolayca belirlenebilecektir. Böylelikle canlı denekler veya hücre kültürleri kullanılmadan elektrokimyasal DNA biyosensörleri ile kısa sürede tayini gerçekle tirilebilecektir. Ayrıca sistemimizde elektrot yüzeyi olarak kalem ucu kullanılması di er yöntemlere göre yüksek hassasiyetli, küçültülebilir, ta ınabilir ve tek kullanımlık modellerinin tasarlanabilmesi, ucuz ve dü ük miktarda güç ve ürün gereksinimine sahip olması gibi üstünlükleri bulunmaktadır. Sistemimizin bu üstünlüklerini göstermek amacıyla günümüzde antikanserojen olarak kullanılan Kamptotesin ve Etoposid ilaçlarının DNA üzerinde ne kadar etkili olduklarını canlı denekler kullanmadan elektrokimyasal yolla DNA biyosensörleri yardımıyla tayinlerini gerçekle tirmeyi amaçlıyoruz. 1
1. G R Biyosensörler, biyolojik kaynaklı bir tanıma yüzeyi ile bir fizikokimyasal çevirici sistemden olu an analitik cihazlar olarak tanımlanmaktadır. Biyosensör sistemleri, seçici tanıma mekanizmasına sahip biyomolekül (algılama kısmı), bu biyomolekülün incelenecek maddeyle etkile mesi sonucu olu an fizikokimyasal sinyalleri elektronik sinyallere dönü türebilen çevirici kısım ve elektronik kısım olmak üzere üç temel bile enden olu maktadır [17]. ekil 1: Biyosensörlerin yapısı Biyosensör sistemini olu turan bile enlerden en önemlisi, tayin edilecek maddeye kar ı son derece seçimli fakat tersinir bir ekilde etkile ime giren, biyomolekül kısmıdır. Bu kısım sayesinde biyosensör, kendi spesifik oldu u hedef analiti (analiz edilecek maddeyi) tanıyarak etkile ime girer. Enzimler, mikroorganizmalar, organeller, doku kesitleri, antikorlar ve nükleik asitler sensörlerde biyomolekül olarak kullanılırlar. Bunların içinde en yaygın kullanılanlar enzimler [7], antikorlar [21, 10] ve nükleik asitlerdir [2, 13, 22, 23, 26]. Çevirici kısım, reseptörlerin biyolojik reaksiyonunu ölçülebilir fiziksel bir sinyale dönü türürler ve biyokimyasal reaksiyonun özelli ine göre kullanılırlar. Çevirici kısım, elektrokimyasal, optik, elektriksel, kütle duyarlı, manyetik ve termal sisteme dayalı olabilir [20]. Biyosensörler tıp, tarım, gıda, eczacılık, çevre kirlili i, savunma ve birçok endüstriyel alanda çok önemli rol oynarlar [17, 19]. Günümüzde, kandaki pek çok biyolojik bile enin tayininde, çevreyle ilgili olarak toprak, hava ve sudaki toksiklerin tayinlerinde, ilaç sanayinde, gıda endüstrisinde ve kimyasal ve biyolojik silahların algılanmasında kullanılmak üzere biyosensörler geli tirilmektedir. Biyosensörler en fazla biyomedikal sektörde uygulama imkânı bulmu lardır. Tanıma yüzeyi olarak DNA nın kullanıldı ı biyosensörlere DNA biyosensörleri adı verilir [9, 15, 18, 27]. DNA biyosensörleri, bir çevirim sistemi ile DNA dan olu ur. DNA tanıma yüzeyleri, dizisi belli hibridizasyon olaylarının izlenmesinde [14, 25] veya bu yüzeyle etkile en maddelerin (kanserojen maddeler, ilaçlar vb.) etkile im durumunun aydınlatılması ile 2
maddenin tespiti ve miktar tayini amaçlı çalı malarda kullanılabilir [3, 4, 8, 11, 12, 16, 24, 28]. Bu maddeler, DNA ile; elektrostatik olarak, DNA çift sarmal yapısının küçük ve büyük oluklarına ba lanarak ya da do al yapılı DNA nın baz çiftleri arasına birikerek etkile ebilir [1, 6]. Bunun sonucunda da DNA da bulunan elektroaktif bazların sinyallerinde dü ü e veya yükseli e neden olabilirler. Bu sonuca göre de maddenin DNA ile etkile imi hakkında yorum yapılabilir. Kullanılan klasik yöntemlere alternatif bir yöntem olarak, DNA biyosensörlerinin yüksek hassasiyetli, küçültülebilir olmaları, ta ınabilir ve tek kullanımlık modellerinin tasarlanabilmesi, ucuz olmaları, dü ük miktarda güç ve ürün gereksinimleri olması gibi avantajlarının olması nedeniyle günümüzde DNA biyosensörlerinin kullanımı oldukça artmı tır. DNA biyosensörleri kullanılarak DNA ilaç etkile imleri ba arılı bir ekilde algılanabilmektedir. Bu algılama DNA ya ait elektroaktif bazlar olan guanin/adenin sinyali üzerinden ya da analizi yapılacak ilacın elektrokimyasal sinyali üzerinden sa lanabilir. Bu sinyallerdeki de i imlere göre DNA ilaç etkile imleri hakkında yorumlar yapılabilir [5]. Çalı mamızda, DNA tutturma yüzeyi olarak kalem ucundan yararlanılmı tır ve her bir deneme için bu kalem ucunu de i tirmemiz yeterli olmu tur. Kanser üzerinde etkili olan ilaçlardan, Kamptotesin ve Etoposid üzerinde ara tırmalar yapılmı tır. Bu çalı malarda biyosensör sistemimizde gerekli olacak uygun DNA ve ilaç konsantrasyonları, uygun çözeltiler ve uygun etkile im süreleri elde edilmi tir. ki ilaç için, olu turdu umuz DNA biyosensörleriyle, DNA üzerine etkilerini, konsantrasyon ve süre bakımından kar ıla tırabilmemiz mümkün olmu tur. Tüm bu optimizasyon çalı maları yapıldıktan sonra ilaç-dna etkile imi yakla ık 15dk gibi kısa bir süre içerisinde tespit edilebilmi tir. 3
2. YÖNTEM: 2.1. Kullanılan Çözeltiler ve Hazırlanı ları Stok DNA Çözeltisinin Hazırlanması: Kullanılacak olan balık sperm DNA stok çözeltisi ultra saf su ile 1000 μg/ml (ppm) konsantrasyonunda hazırlandı ve -20 0 C de saklandı. Tampon çözeltisi olarak 0,05 M fosfat tampon çözeltisi (PBS), 0,50 M asetat tampon çözeltisi (ACB), 0,02 M Tris-HCl tampon çözeltisi (TBS) kullanıldı. Tampon çözeltilerinin hazırlanmasında 18 Mega-ohm luk ultra saf su kullanılmı tır. Tamponlar hazırlık sonrasında plastik i elerde, buzdolabında +4 0 C de saklanmı tır. Hazırlanan tampon çözeltilerinin ph larını istenilen de erine getirilebilmesi, hazırlanan 0,1N lik NaOH veya 0,1N lik HCl çözeltilerinin ve ph metre cihazını kullanımıyla gerçekle tirilmi tir. 2.2. Deney Düzene inin ve Elektrotların Hazırlanı ı Diferansiyel puls voltametrisi tekni inden yararlanılarak yapılan bu çalı mada, potansiyostat cihazı olarak μ-autolab tip II (Eco Chemie, Hollanda) ve yazılım programı olarak GPES 4.9 kullanılmı tır. Üçlü elektrot sistemi olarak ise, kalem grafit elektrot çalı ma elektrotu, Ag/AgCl referans elektrot ve platin de kar ıt elektrot olarak kullanılmı tır. Her bir elektrot sisteme metal ba lantılarla ba lanmı ve bu üçlü elektrot sistemin daldırıldı ı ölçüm çözeltisinin hacmi 3 ml, ilaç ve DNA çözeltilerinin hacmi 1,5 ml olacak ekilde ayarlanmı tır. Çevirici kısım Elektronik kısım Biyomolekül Kısım ekil 2: Biyosensörün kısımları 4
Çalı mamızda çalı ma elektrotu olarak kullanılan, kalem grafit elektrotun (Rotring T 0,5 kalem, Tombo HB model 0.5mm uç) 6cm olan grafit uçları deneysel ko ullara uygun olması açısından 3cm boyunda kesildi. Bu 3cm nin 1,5cm lik kısmı i aretlenerek, 1cm lik kısmı çözelti içine daldırılacak ekilde sisteme yerle tirildi. Her bir deneme için en az 3 kalem ucu grafit yüzeyleri olu turularak tek kullanımlık elektrot sistemleri ile tekrarlanabilirlikler sa lanmı oldu. ekil 3: Uç kesme i lemi 2.3. Deneysel Basamaklar ekil 4: Deney basamakları 5
1. Elektrot yüzeyinin aktivasyonu: Hem kullanılan çözeltinin hem de kullanılacak elektrotun temiz olup olmadı ına karar vermek ve buna ek olarak kalem ucunda yer alabilecek her türlü bile i i yükseltgenebilecekleri en son form olan karboksilik asite kadar yükseltgemek için kalem ucuna asetat tamponu içerisinde 60s +1.4V uygulanır. 2. DNA nın yüzeye tutturulması: Bu i lem sırasında belirli konsantrasyonda stok DNA çözeltisinden seyreltilerek hazırlanan DNA, 200s +0.5V uygulanarak daha önce aktive edilmi olan kalem ucu elektrot yüzeyine elektrostatik olarak tutturulur. Yüzeyden tutunmayan DNA ların uzakla tırılması için DNA yı hazırladı ımız bo tampon içerisinde yıkanır. 3. DNA-ilaç etkile imi: Yüzeyine DNA tutturulmu olan elektrot, belirli konsantrasyonda hazırlanmı olan ilaç çözeltisiyle herhangi bir volt uygulamadan belirli bir süre etkile tirilir ve etkile imden sonra ilacın hazırlandı ı tamponda yıkanır. 4. Ölçüm: Tüm bu etkile im basamaklarından sonra asetat tamponu içerisinde ölçüm gerçekle tirilir. Ölçüm aralı ı olarak ilaçların ve DNA nın yükseltgenme sinyalleri dikkate alınarak 0-1.2V aralı ında ölçüm yapılmı tır. 2.4. Uygun DNA Konsantrasyonunun Bulunması Bu çalı mada her iki ilaç için de kullanılacak olan uygun DNA konsantrasyonunu tespit etmek amacıyla, aktivasyon basama ı gerçekle tirildikten sonra, DNA tutturma basama ında uygulanmak üzere 1000ppm (μg/ml) olan stok DNA çözeltimizden 1ppm, 5ppm, 10ppm, 15ppm ve 20ppm olacak ekilde fosfat tamponu içerisinde DNA çözeltileri hazırlanarak +0.5V da 200s karı an ortamda DNA elektrostatik olarak tutturuldu. Fosfat tamponu içerisinde bir kez yıkama i lemi yapıldı ve asetat tamponu içerisinde ölçüm yapıldı. 2.5. Uygun Tampon Çözeltisinin Bulunması Aktivasyon i lem basama ından sonra, +0.5V da 200s karı tırmalı olarak, 10ppm olacak ekilde asetat fosfat tris tamponları içerisinde ayrı ayrı hazırladı ımız DNA elektrot yüzeyine elektrostatik olarak tutturuldu. Daha sonra DNA tutturulan elektrot, DNA nın hazırlandı ı tampon içerisinde bir kez yıkandı. Kamptotesin için 5ppm, Etoposid için 10ppm olacak ekilde asetat fosfat tris tamponları içerisinde ayrı ayrı ilaç çözeltileri hazırlandı. Karı an ortamda herhangi bir volt uygulamaksızın Kamptotesin için 5dk, Etoposid için 12dk yüzeyinde DNA bulunan kalem ucu elektrotun ilaç ile etkile imi gerçekle tirildi. lacın hazırlandı ı tampon içerisinde bir kez yıkandı ve asetat tamponu içerisinde ölçüm yapıldı. 6
2.6. Uygun DNA- laç Etkile im Süresinin Bulunması Bu deneyde sırasıyla aktivasyon i lemi yapıldıktan sonra, 10ppm olacak ekilde fosfat tamponu içerisinde DNA çözeltisinin hazırlandı. +0.5V da 200s, karı an ortamda DNA elektrostatik olarak tutturuldu. Fosfat tampon içerisinde bir kez yıkama i lemi gerçekle tirildi. Kamptotesin için 5ppm, Etoposid için 10ppm olacak ekilde fosfat tamponu içerisinde ilaç çözeltileri hazırlandı. Yüzeyine DNA tutturmu oldu umuz kalem ucu elektrotlar, karı an ortamda herhangi bir volt uygulamaksızın Kamptotesin için 3dk, 5dk ve 7dk, Etoposid için ise 3dk, 5dk, 7dk, 10dk, 12dk ve 15dk olacak ekilde ayrı ayrı ilaç ile etkile tirildi. Fosfat tampon içerisinde bir kez yıkandı ve asetat tamponu içerisinde ölçüm yapıldı. 2.7. Uygun laç Konsantrasyonunun Bulunması Aktivasyon i lemi gerçekle tirildikten sonra, 10ppm olacak ekilde DNA çözeltileri hazırlanarak karı an ortamda +0.5V da 200s elektrostatik olarak DNA tutturuldu. Daha sonra DNA tutturulan elektrot fosfat tamponu içerisinde bir kez yıkandı. Kamptotesin için 1ppm, 5ppm, 10ppm ve 20ppm, Etoposid için 1ppm, 5ppm, 10ppm,15ppm ve 20ppm olacak ekilde fosfat tamponu içerisinde ilaç çözeltileri hazırlandı. Karı an ortamda herhangi bir volt uygulamaksızın Kamptotesin için 5dk, Etoposid için 12dk olacak ekilde ayrı ayrı ilaç ile etkile tirildi. Fosfat tampon içerisinde bir kez yıkandı ve asetat tampon içerisinde ölçüm yapıldı. 2.8. DNA- laç Etkile imi Çalı ması Kamptotesin için; Asetat tamponu içerisinde +1.4V 60 s aktivasyon i lemi yapıldı. 10ppm olacak ekilde fosfat tamponu içerisinde DNA çözeltisi hazırlandı. +0.5V da 200s karı an ortamda DNA elektrostatik olarak tutturuldu. DNA tutturulan kalem ucu elektrotu fosfat tamponu içerisinde bir kez yıkandı. 5ppm olacak ekilde fosfat tamponu içerisinde ilaç çözeltisi hazırlandı. 7
5dk olacak ekilde DNA tutturulan kalem ucu elektrotunun ilaç ile etkile imi gerçekle tirildi. Bir kez fosfat tampon içerisinde yıkandı. Asetat tamponu içerisinde ölçüm yapıldı. Etoposid için; Asetat tamponu içerisinde +1.4V 60 s aktivasyon i lemi yapıldı. 10ppm olacak ekilde fosfat tamponu içerisinde DNA çözeltisi hazırlandı. +0.5V da 200s karı an ortamda DNA elektrostatik olarak tutturuldu. DNA tutturulan kalem ucu elektrotu fosfat tamponu içerisinde bir kez yıkandı. 10ppm olacak ekilde fosfat tamponu içerisinde ilaç çözelti hazırlandı. 12dk olacak ekilde DNA tutturulan kalem ucu elektrotunun ilaç ile etkile imi gerçekle tirildi. Bir kez fosfat tampon içerisinde yıkandı. Asetat tamponu içerisinde ölçüm yapıldı. 8
3. SONUÇLAR: 3.1. Uygun DNA Konsantrasyonunun Bulunması Yapılan çalı malarda guanin sinyaline bakılarak hem Kamptotesin hem de Etoposid için uygun DNA konsantrasyonu, 10ppm den sonra alınan guanin sinyalleri sabitlendi i için 10ppm olarak bulunmu tur. Grafik 1: Uygun bulunan DNA konsantrasyonu 3.2. Uygun Tampon Çözeltisinin Bulunması Her iki ilaç için de uygun tampon çözeltilerinin bulunması, DNA nın ilaçla etkile imden önce ve ilaçla etkile imden sonraki sinyalleri dikkate alınarak karar verilmi tir. Buna göre ilaçla etkile imden sonra en fazla guanin sinyalindeki dü ü her iki ilaç için de fosfat tamponunda (PBS) görülmü tür. Grafik 2: Uygun tampon çözeltisinin bulunması 9
3.3. Uygun DNA- laç Etkile im Süresinin Bulunması Her iki ilaç için yapılan uygun DNA-ilaç etkile im süre çalı masında ilaçla etkile imden sonra en fazla guanin sinyalindeki dü ü dikkate alınarak Kamptotesin için 5dk, Etoposid için ise 12dk oldu u bulunmu tur. Buna göre Kamptotesin Etoposid e göre daha kısa sürede DNA ya etki etmektedir sonucunu çıkarabiliriz. Grafik 3: Kamptotesin için uygun etkile im süresi Grafik 4: Etoposid için uygun etkile im süresi 10
3.4. Uygun laç Konsantrasyonunun Bulunması Her iki ilaç için yapılan uygun ilaç konsantrasyonu çalı masında ilaçla etkile imden sonra en fazla guanin sinyalindeki dü ü dikkate alınarak Kamptotesin için 5ppm, Etoposid için ise 10ppm oldu u bulunmu tur. Buna göre Kamptotesin Etoposid e göre daha dü ük konsantrasyonda DNA ya etki etmektedir sonucunu çıkarabiliriz. Grafik 5: Uygun ilaç konsantrasyonunun bulunması 3.5. DNA- laç Etkile imi Çalı ması Her iki ilaç için de uygun ko ullar belirlendikten sonra olu turdu umuz biyosensörün amacımız için uygun olup olmadı ını bu çalı mayla göstermi olduk. Buna göre her iki ilaç için de uygun konsantrasyonları ve uygun etkile im sürelerini deneyerek DNA daki guanin bazlarındaki dü ü leri gözlemledik. Bunun sonucunda her ne kadar farklı konsantrasyonlarda ve sürelerde etki etseler de her iki ilacında DNA ya etki ederek guanin sinyallerini dü ürdü ünü ve her iki ilacında antikanserojen nitelikte oldu unu göstermi olduk. Bizim burada gösterdi imiz gibi herhangi iki veya daha fazla antikanserojen özellikte oldu u dü ünülen di er ilaçların da kar ıla tırılmasının canlı üzerinde denemeden mümkün olaca ını dü ünmekteyiz. A a ıda bununla ilgili sonuçlar gösterilmi tir. 11
Grafik 6: Kamptotesin için yapılan DNA-ilaç çalı malarındaki ilaç ve guanin sinyallerinin kar ıla tırılması Grafik 7: Etoposid için yapılan DNA-ilaç çalı malarındaki ilaç ve guanin sinyallerinin kar ıla tırılması 12
TARTI MA VE ÖNER LER: Bu proje kapsamında DNA-ilaç etkile imine dayalı bir elektrokimyasal biyosensör yardımıyla antikanserojen özelli i bilinen iki ilaç olan Kamptotesin ve Etoposid, konsantrasyon ve etki süreleri bakımından kar ıla tırıldı. Elektrot olarak kullanılan kalem grafit elektrotunun tek kullanımlık olması ve hazırlanmasının kolay olması çalı maya ayrı bir fayda sa lamı tır. Bizim geli tirdi imiz bu sistemle hastadan alınan küçük bir kan örne i içerisindeki DNA dan ve bu DNA nın ilaç ile etkile imden yararlanılarak ilaç hastaya verilmeden önce ona ne tür bir etki yaptı ı kolayca belirlenebilecektir. Böylelikle canlı denekler veya hücre kültürleri kullanılmadan etkinli ini elektrokimyasal DNA biyosensörleri ile kısa sürede tayini gerçekle tirilebilecektir. Bizim çalı mamızda da yakla ık 15dk gibi kısa bir süre içerisinde tayin gerçekle tirilebilmi tir. Kamptotesin için uygun konsantrasyon 5 g/ml, etkile im süresi 5 dakika olarak tespit edilirken, Etoposid için uygun konsantrasyon ise 10 g/ml, etkile im süresi ise 12 dakika olarak saptanmı tır. Kamptotesin 0,88 V civarında sinyal verirken, Etoposid 0,5 V civarında yükseltgenme sinyali vermi tir. Her ne kadar farklı konsantrasyonlarda ve sürelerde etki etseler de her iki ilacında DNA ya etki ederek guanin sinyallerini dü ürdü ünü ve her iki ilacında antikanserojen nitelikte oldu unu göstermi olduk. Bizim burada gösterdi imiz gibi herhangi iki veya daha fazla antikanserojen özellikte oldu u dü ünülen di er ilaçların da kar ıla tırılmasının canlı üzerinde denemeden mümkün olaca ını dü ünmekteyiz. Bundan sonraki a ama DNA daki guanin bazının sinyalindeki dü meyle hücre kültüründeki hücre ölümüyle orantılı olup olmadı ının hücre kültürleriyle birlikte götürülmesi olabilir. Her iki ilacın da DNA ile etkile imlerinden elde edilen guanin yükseltgenme sinyallerindeki de i iklikler ve ilaçların yükseltgenme sinyalindeki de i iklikler incelendi. Bu de i ikliklere göre her bir ilacın DNA ya etkisi hakkında yorum yapıldı. Kullanılan maddelerin elektrot yüzeyindeki DNA ile etkile mesi sonrasında, DNA nın çift sarmal yapısını bozabilece i veya DNA nın guanin bazına spesifik bir ba lanmanın mümkün olabilece i ve bunun sonucunda sinyalde bir azalma gözlendi i eklinde bir açıklama yapılabilir. laçların kendi sinyallerindeki azalma ise, yapılarında yer alan yükseltegenebilecek gruplara ait bir de i ikli e dayandırılabilir. Geli tirilen yöntemin hızlı, güvenilir ve ucuz maliyetli olması bu alanda daha çok çalı ma yapılmasına dolayısıyla DNA ilaç etkile imi hakkında edinilen bilgilerin daha çok geli mesine olanak sa lamaktadır. DNA ile etkile ime giren maddelerin tayini, DNA hedefli ilaçların geli tirilmesinde büyük önem ta ımaktadır. Çalı mamızın ba ka bir özelli i de antikanserojen madde tayini olmak üzere ilaç tasarımında kullanılabilecek maddelerin aydınlatılmasında önemli bir örnek te kil etmesidir. DNA ile 13
etkile en çe itli maddelerin voltametrik davranı larının tayini, kemoterapide kullanılan DNA ya özgül olarak ba lanan moleküllerin dizayn edilmesi ve DNA ya ba lı hasta ba ı te hislerde kullanılan biyoteknolojik araçların geli tirilmesinde büyük bir önem ta ımaktadır. Gerçekle tirilen bu çalı ma ve gelecekte planlanan çalı maların amacı; DNA hedefli ilaçların ya da yeni bile iklerin DNA ile etkile im türlerinin, elektrokimyasal olarak belirlenmesini sa lamak ve böylece, antikanser ilaç-dna etkile im mekanizmalarının hızlı ve güvenli bir ekilde tanımlanmasına alternatif olabilecek, bu sebeplerden dolayı DNA çip teknolojisine uyarlanabilecek yeni bir yöntem tasarlamaktır. Kullanılan yöntem, basit ve dü ük maliyetli olup, hızlı ve seçimli ekilde yanıt verebilmektedir. Ayrıca kullanılan bu sistem yeni sentezlenecek olan antibiyotik, antiviral, antikanser ilaca dayalı ilaç çalı malarına katkıda bulunmak ve/veya bir ilaç hammadesinin daha duyarlı bir ekilde tayinini yapmak amacıyla, gelecekte piyasaya sürülecek DNA biyoçiplerinin teknolojisini olu turaca ı ümit edilmektedir. TE EKKÜR: Proje çalı malarında bizi destekleyen okul müdürümüz Yavuz KAHRAMAN a, danı man ö retmenimiz Mesut ESEN e, laboratuvar, malzeme ve alan bilgisi bakımından her zaman yardımcı olmaya çalı an Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi ö retim üyelerinden Prof. Dr. Mehmet E. engün ÖZSÖZ e ara tırmalarımıza yapmı oldukları katkılarından dolayı te ekkür ederiz. 14
KAYNAKÇA: 1. Blackburn, G.M., Gait,M.J. (1990). Nucleic Acids in Chemistry and Biology IRL Press, New York, Ch. 8, sayfa 297-332. 2. Collings, A.F., Caruso, F., (1997). Biosensors: recent advances, Reports in Progress in Physics, 60, sayfa 1397-1445. 3. Erdem, A., Kerman, K., Meriç, B., Akarca, U.S., Ozsoz, M. (1999). DNA electrochemical biosensor for the detection of short DNA sequences related to the hepatitis B virus, Electroanalysis, 11, sayfa 586-588. 4. Erdem, A., Kerman, K., Meriç, B., Akarca, U.S., Ozsoz, M. (2000). Novel hybridization indicator methylene blue for the electrochemical detection of short DNA sequences related to the hepatitis B virus, Anal. Chim. Acta, 422, sayfa 139-149. 5. Erdem, A., Ozsoz, M. (2002). Electrochemical DNA biosensors based on DNA- Drug interactions, Electroanalysis, 14, sayfa 965-974. 6. Graves, D. E., and Velea., L.M. (2000). Intercalative Binding of Small Molecules to Nucleic Acids. Curr. Org. Chem. 4, sayfa 915 929. 7. Gorton, L., Csöregi, E., Dominguez, E., Emneus, J., Jonsson-Petterson, G., Makro- Varga, G., Persson, B., (1991). Selective detection in flow analysis based on the combination of immobilized enzymes and chemically modified electrodes, Anal. Chim. Acta, 250, sayfa 203-248. 8. Kelley, S. O., Barton, J.K. (1997). Electrochemistry of methlene blue bound to a DNAmodified electrode, Bioconjugate Chem., 8, sayfa 1997. 9. Kerman, K., Meric, B., Ozkan, D., Kara., P., Erdem, A., Ozsoz M., (2001). Electrochemical DNA biosensor for the determination of Benzo[a]pyrene DNA adducts, Anal. Chim. Acta.,450, sayfa 45-52. 10. Killard, A.J., Smyth, M.R., Grennan, K., Micheli, L., Palleschi, G., (2000). Rapid antibody biosensor assays for environmental analysis, Biochemical Society Transactions, 28-2, sayfa 81-84. 11. Labuda, J., Buckova, M., Heilerova, L., Caniova-Ziakova, A., Brandsteterova, E., Mattusch, J., Wennrich, R. (2002). Voltammetric detection of antioxidative properties of flavanoids using electrically heated DNA modified Carbon Paste Electrode, Sensors, 2: 1-10. 12. Lukasova, E., Jelen, F. and Palecek, E. (1982). Electrochemistry of Osmium-Nucleic acid complexes: A probe for single-stranded and distorted double-stranded regions in DNA, Gen. Physiol., Biophys., 1, sayfa 53-70. 13. McGown, L.B., Joseph, M.J., Pitner,J.B.,Vonk, G.P. ve Linn, C.P., (1995). The Nucleic acid ligand: A new tool for molecular recognition, Anal. Chem., 67, sayfa 663 A- 668 A. 15
14. Meric, B., Kerman, K., Ozkan, D., Kara, P., Ozsoz, M., (2002). Indicator-free DNA biosensor based on adenine and guanine signals, Electroanalysis, 14(18), sayfa 1245-1250. 15. Mikkelsen S.R., (1996). Electrochemical Biosensor for DNA sequence Detection A Review, Electroanalysis, 8(1), sayfa 15-19. 16. Millan, K.M., Mikkelsen, S.R. (1993). Sequence-selective biosensor for DNA Based on electroactive hybridization indicators, Anal. Chem., 65, sayfa 2317-2323. 17. Mutlu, M., (2002). Biyosensörler, Bilim ve Teknik Dergisi, Yeni Ufuklara, Temmuz 2002, sayfa 17 18. Palecek, E., (1988). New trends in electrochemical analysis of nucleic acids, Bioelectrochem. Bioenerg., 20, sayfa 179-194. 19. Rodriguez-Mozaz, S., et al., (2004). Biosensors for environmental applications:future development trends, Pure Appl. Chem., 76 (4), sayfa 723 752. 20. Shin, J. H., Yoon, S. Y., Yoon, I.J., Choi, S.H., Lee, S.D., Nam, H., and Cha, G.S., (1998). Potantiometric Biosensors Using Immobilized Enzyme Layers Mixed With Hydrophilic Polyurethane, Sensors and Actuators B, 50, sayfa 19-26. 21. Vlatakis, G., Andersson, L.I., Müler, R. ve Mosbach, K. (1993). Drug assay using antibody mimics made by molecular imprinting, Nature, 361, sayfa 645 647. 22. Wang, J., Cai, X., Rivas, G., Shiraishi, H., Farias, P.A.M., Dontha, N., (1996). DNA electrochemical biosensor for the detection of short DNA sequences related to the human immunodeficiency virus, Anal. Chem., 68, sayfa 2629-2634. 23. Wang, J., Grant, D.H., Ozsoz, M., Cai, X., Tian, B., Fernandes, J.R., (1997). Adsorptive potentiometric stripping analysis of nucleic acids at mercury electrodes, Anal. Chim. Acta, 349, sayfa 77-79. 24. Wang, J., Kawde, A.N., Erdem, A., Salazar, M. (2001). Magnetic beadbased label-free electrochemical detection of DNA hybridization, Analyst, 126, sayfa 2020-2024. 25. Wang, J., Nielsen, P., Jiang, M., Cai, X., Fernandes, J.R., Grant, D.H., Ozsoz, M., Beglieter, A., Mowat, M., (1997). Mismatch sensitive hybridization detection by peptide nucleic acids immobilized on a quartz crystal microbalance, Anal. Chem., 69, sayfa 5200-5202. 26. Wang, J., Rivas, G., Cai, X., Dontha, N., Shiraishi, H., Luo, D., Valera, F. S., (1997). Sequence-spesific electrochemical biosensing of M. tuberculosis DNA, Anal. Chim. Acta, 337, sayfa 41-48. 27. Wang, J., Rivas, G., Fernandes, J.R., Jiang, M., Paz, J.L.L.,Waymire, R., Nielsen, T.W., Getts, R.C., (1998). Adsorption and detection of DNA dendrimers at carbon electrodes, Electroanalysis, 10(8), sayfa 553-556. 28. Wang, J., Rivas, G., Fernandes, J.R., Paz, J.L.L., Jiang, M., Waymire, R. (1998). Indicator-free electrochemical DNA hybridization biosensor, Anal. Chim. Acta, 375: 197 203. 16