ELEKTROKİMYASAL GENOSENSÖR İLE DNA DİZİ TAYİNİ

Transkript

1 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ELEKTROKİMYASAL GENOSENSÖR İLE DNA DİZİ TAYİNİ Analitik Kimya Programı Yüksek Lisans Tezi Eczacı Işıl CİN Danışman Prof. Dr. M. E. Şengün Özsöz İzmir 2007

2

3 III ÖNSÖZ Çalışmalarımdaki değerli katkılarından dolayı başta, Analitik Kimya Anabilim Dalı Başkanı, danışmanım Sayın Prof. Dr. Mehmet Emin Şengün ÖZSÖZ e, Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı Araştırma Görevlisi Sayın Dilşat Özkan ARIKSOYSAL a teşekkür eder, saygılarımı sunarım. Her zaman desteklerini gördüğüm tüm değerli çalışma arkadaşlarıma; manevi desteğini hiçbir zaman esirgemeyen aileme ve Dekim Ecza ve Kimyevi Mad. Tic. San. A.Ş. Yönetim Kurulu Başkanı Sayın Ecz.Tanıl DİNÇSOY a teşekkür ederim. Ecz. Işıl CİN

4 IV İÇİNDEKİLER BÖLÜM I GİRİŞ ve AMAÇ...1 GENEL BİLGİLER Elektrokimya Elektrokimyasal Olaylarda Kütle Aktarım Yolları Elektrokimyasal Tabakalar Voltametri ve Voltametrinin Esasları Voltametride Kullanılan Uyarma Sinyalleri Voltametride Kullanılan Cihazlar Voltametride Kullanılan Çalışma Elektrotları Sıvı Elektrotlar Katı Elektrotlar a. Karbon Elektrotlar a.1. Camsı Karbon Elektrot (GCE) a.2. Perde Baskılı Karbon Elektrotlar (SCPE) a.3. Karbon Pastası Elektrodu a.4. Kalem Grafit Elektrodu b. Metal Elektrotlar...19

5 V Voltametride Kullanılan Referans Elektrotlar a. Referans Elektrot Çeşitleri a.1. Kalomel Referans Elektrot a.2. Gümüş-Gümüş Klorür Referans Elektrot a.3. Civa-Civa(1) sülfat Referans Elektrot Voltamogramlar Voltametrik Akımlar Elektrokimyasal Bir Olayda Faradayik İşlemler ve Nernst Eşitliği Uyarma Sinyallerine Göre Voltametrik Teknikler Dönüşümlü Voltametri (CV) Diferansiyel Puls Voltametrisi Kare Dalga Voltametrisi Biyosensörler İdeal Bir Biyosensörde Olması Gereken Özellikler Biyosensör Çeşitleri Biyosensör Tasarımında Kullanılan Moleküller ve Yapıları Nükleik Asitler ve DNA DNA ile İlgili Bazı Terimlerin Tanımlamaları DNA Baz Dizilerinin Yazılımı ile İlgili Temel Bilgiler İnterkalasyon...45

6 VI Nükleik Asit Hibridizasyonu Replikasyon DNA Biyosensörleri İlaç-DNA Etkileşmesinin DNA Biyosensörleri ile Tayini Elektrot Yüzeyine DNA Bağlama (immobilizasyon) Teknikleri Elektrostatik Bağlanma Kovalent Bağlanma SH (tiyol) Grubu ile İşaretli Oligonükleotidin Altın Elektrot Yüzeyine Afinitesi BÖLÜM II GEREÇ VE YÖNTEM Kullanılan Cihazlar Kullanılan Kimyasal Maddeler DNA ile Etkileşime Giren Maddeler Hakkında Genel Bilgi Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanışı Tampon Çözeltilerin Hazırlanışı ,50 M Asetat Tampon Çözeltisinin Hazırlanışı (ph 4,8) (ACB ) ,02 M Tris HCl Tampon Çözeltisinin Hazırlanışı (ph 7,0) (TBS)...57

7 VII ,05 M Fosfat Tampon Çözeltisinin Hazırlanışı (ph 7,4 ) (PBS) İlaç Stok Çözeltilerinin Hazırlanışı Kullanılan Yöntem Kullanılan Elektrotların Hazırlanışı Karbon Pastası Elektrodunun (CPE) Hazırlanışı Kalem Grafit Elektrot (PGE) Hazırlanışı Dönüşümlü Voltametri Tekniği (CV) kullanılarak Maddelerin Yükseltgenme ve İndirgenme Sinyallerinin Saptanması DNA İmmobilize Edilmiş Kalem Grafit Elektroduna (PGE) Dayalı Tek Kullanımlık Sensör Geliştirilmesine Yönelik Çalışmalar PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyondaki dsdna nın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışma dsdna nın PGE Yüzeyine Farklı Sürelerde İmmobilize Edilmesinin Elektrokimyasal Yanıta Etkisinin İncelenmesine Yönelik Çalışma PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyonlardaki ssdna nın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışma ssdna nın PGE Yüzeyine Farklı Sürelerde İmmobilize Edilmesinin Elektrokimyasal Yanıta Etkisinin İncelenmesine Yönelik Çalışma PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyonlardaki İlaçların Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışma dsdna nın İlaç İle Etkileşimine Dayalı Çalışmalar Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltisi ile Yapılan Çalışmalar...64

8 VIII Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltisi ile Yapılan Çalışmalar Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltisi ile Yapılan Çalışmalar ssdna nın İlaç İle Etkileşimine Dayalı Çalışmalar ph Değişiminin PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen İlaç ve dsdna İle Etkileşmiş olan İlacın Pik Akımına Etkisi ph Değişiminin PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen İlacın Pik Akımına Etkisi ph Değişiminin PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen dsdna İle Etkileşime Giren İlacın Pik Akımına Etkisi...68 BÖLÜM III BULGULAR PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyondaki dsdna nın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışmadan Elde Edilen Bulgular dsdna nın PGE Yüzeyine Farklı Sürelerde İmmobilize Edilmesinin Elektrokimyasal Yanıta Etkisinin İncelenmesine İlişkin Bulgular PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyondaki ssdna nın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışmadan Elde Edilen Bulgular PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyondaki İlacın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışmadan Elde Edilen Bulgular...73

9 IX Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltilerinin, Guanin Yükseltgenme Sinyaline Olan Etkilerinin PGE ile Elektrokimyasal Olarak İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltilerinin, Guanin Yükseltgenme Sinyaline Olan Etkilerinin PGE ile Elektrokimyasal Olarak İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltilerinin, Guanin Yükseltgenme Sinyaline Olan Etkilerinin PGE ile Elektrokimyasal Olarak İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular ssdna nın İlaç İle Etkileşimine Dayalı Çalışmaların İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular ph Değişiminin Etkilerinin İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular ph Değişiminin PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen İlacın Pik Akımına Etkisinin İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular ph Değişiminin; PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen dsdna ile Etkileşime Giren İlacın Pik Akımına Etkisinin İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular...86 BÖLÜM IV TARTIŞMA dsdna ile İlaç Etkileşimlerinin Genel Olarak İncelenmesi...88

10 X BÖLÜM V SONUÇ ve ÖNERİLER...92 ÖZET...94 SUMMARY...95 YARARLANILAN KAYNAKLAR...96 ÖZGEÇMİŞ...112

11 1 BÖLÜM I GİRİŞ ve AMAÇ IUPAC ın, Analitik Kimyada oldukça yaygın kullanım alanı olan elektrokimyasal sensörler (elektrokimyasal algılayıcı sistemler) için yapmış olduğu tanımlama şu şekildedir: Elektrokimyasal sensörler; iyonlara ya da kimyasal bileşiklere seçici ve tersinir bir şekilde cevap veren ve konsantrasyona bağımlı elektriksel sinyaller oluşturan küçültülmüş cihazlardır. (17 ). Bir elektrokimyasal sensörün yapısına; DNA, enzim, hücre, doku, antikor, nükleikasit vb. biyolojik maddeler eklendiği zaman elektrokimyasal sensörlerin yaygın kullanım alanlarından biri olan BiYOSENSÖRLER oluşur (107). Biyosensörler, biyo (biyolojik kökenli) ve sensör (algılayıcı) kelimelerinin birleşmesiyle oluşan, nicel ve nitel analiz yapabilen kompleks cihazlar olarak tanımlanmaktadır. Bir diğer tanımla ise birbiri içine geçmiş, biri biyokimyasal, diğeri elektrokimyasal iki çevirici sistemden oluşan algılayıcı sistemlerdir. Biyokimyasal çeviricilerin çalışma prensibini; analizlenecek madde ile etkileşerek onu tanıma ve bu etkileşme sonucunda oluşan biyokimyasal ürünün vermiş olduğu sinyalin, elektrokimyasal çevirici tarafından okunabilir bir sayısal değere çevrilmesi oluşturmaktadır (22). Biyosensör tasarımında kullanılan nükleik asitlerden oluşmuş tanıma yüzeyleri yani DNA biyosensörleri (DNA nın; analizi yapılacak maddeyle

12 2 etkileşerek onu tanıyan biyolojik materyal olarak kullanıldığı biyosensörlerdir.) Analitik Kimya alanında her geçen gün daha fazla kullanım alanı bulmakta (4,117) ve çip teknolojisine önemli adımlar atılmaktadır (83, 85, 104). Elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin; gelecekte hasta başında yapılacak doktor gözetimindeki analizlerde çok önemli bir rol oynayacağı düşünülmektedir (113). Elektrokimyasal yöntemlerle birlikte, DNA nın nitel ve nicel analizini yapma amacına yönelik tasarlanan biyosensörlerde, tanıma yüzey katmanı olarak DNA kullanılmasına her geçen gün artan bir ilgi bulunmaktadır (7, 10, 14, 15, 42, 46, 94, 96). Tanıma yüzeyi olarak nükleik asit içeren biyosensörler (Genosensörler; gene dayalı sensörler), bu yüzey ile etkileşime giren analitin (karsinojen maddeler, ilaçlar vb.) etkileşim mekanizmasının aydınlatılması veya miktarının tayin edilmesi veya DNA nın baz dizisi belli bölgelerindeki hibridizasyonun saptanması gibi çeşitli amaçlarla kullanılabilir (23, 24, 29, 83). Analitin DNA ile etkileşmesi sonucunda, DNA daki bir bazda meydana gelen veya analitte oluşan değişiklikler sayesinde güvenilir tayinler yapılabilmektedir (52, 57, 69). Günümüzde tanıma yüzeyi olarak DNA nın kullanıldığı biyosensörler genetik ve bulaşıcı hastalıkların hızlı bir şekilde teşhis edilmesine olanak sağlamaktadır. Ayrıca DNA ile etkileşerek ona zarar veren maddelerin saptanmasını da mümkün kılmaktadır. Özellikle de antikanser özellik taşıyan ilaç molekülleri ile DNA nın etkileşmesi ve bu etkileşmenin geliştirilen yeni yöntemlerle tayin edilmesi; yeni ilaç tasarımları için çok büyük önem taşımaktadır (35, 37, 52, 65, 69, 89). Bazı maddelerin (çevresel kirlilik ajanları (42), toksik moleküller, vb.) çift sarmal DNA ile interkalasyon (düzlemsel yapıdaki kimyasal maddenin DNA çift sarmalı arasına girerek yerleşmesi), baza seçimli bağlanma vb. yollarla etkileşimi

13 3 sonucu bir ürünün meydana gelmesi, bu ürüne duyarlı elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin tasarımını getirmiştir (39). Bir kimyasalın ya da metabolitin DNA ile etkileşimi sonrasında DNA da oluşabilecek yan ürünlerin (adduct) kısa zamanda tespiti kanser araştırmalarında çok önemlidir (3, 23, 24, 44). DNA madde etkileşimi sonucunda, çalışmanın özelliklerine bağlı olarak DNA sinyalinde artma veya azalma ya da madde sinyalinde olan değişimler elektrokimyasal yöntemlerle tespit edilebilmektedir. Bu tür tayinlerde; DNA modifiye edilmiş camsı karbon elektrotlar (GCE), karbon pastası elektrotlar (CPE), kalem grafit elektrotlar (PGE), perde baskılı karbon elektrotlar (SCPE), altın perde baskılı karbon elektrotlar (Au-SCPE), altın elektrotlar (AuE) ve asılı civa damla elektrotları (HMDE) kullanılmaktadır. İncelenen maddelerin çok düşük miktarlardaki (mikromolar hatta nanomolar) konsatrasyonlarının dahi, kısa bir biriktirme aşaması sonrası ölçümlerini mümkün kılmaktadır (10, 20, 56, 65, 67, 75, 115, 116, 121). Son yıllarda indikatör kullanılmadan elektrokimyasal DNA biyosensörleri kullanılarak, DNA bazlarından en elektroaktifleri olan Guanin ve Adeninin yükseltgenme sinyallerinden faydalanılarak hibridizasyon tayinlerinde çok büyük gelişmeler kaydedilmiştir. Çeşitli kalıtsal hastalıkların tanısında hiçbir indikatör kullanılmadan DNA hibridizasyon tayini yöntemi ile çalışmalar yapılmaktadır. Bu yöntem J.Wang, E.Palacek, M.Mascini ve arkadaşları tarafından litaratüre geçirilmiştir (45, 61, 73, 78, 92, 99, 100, 107, 110). Günümüzda kan, serum, doku, vücut sıvıları gibi biyolojik materyallerde mutasyon gibi kalıtsal bir olayı simgeleyen DNA dizisinin saptanması ve bu örneklerden hastalık tayinlerinin yapılabiliyor olması tıbbi analizler ve uygulamalarında oldukça önemlidir.

14 4 Nükleik asit tanıma yöntemlerine dayanan elektrokimyasal DNA biyosensörleri, klasik analiz yöntemlerine yeni bir alternatif olup; genetik ve bulaşıcı hastalıkların hızlı, basit ve ucuz yoldan teşhis edilebilmesini, DNA hasar ve etkileşimlerinin saptanabilmesini mümkün kılar. Bazı bulaşıcı ve kalıtımsal hastalıklara neden olan DNA dizilerinin tanımlanması, genomik DNA çiplerinin tasarımı, nükleik asit hibridizasyonuna dayanmaktadır (4, 31, 63). Elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin tasarlanmasındaki ana amaç DNA daki hibridizasyonun tayin edilmesidir (44). Diziye özgün ve seçimli olarak tayin yapabilen DNA biyosensörleri, bir DNA probu içeren kısım ve tanıma olayını ölçülebilir bir sinyale dönüştüren çevirim sisteminden oluşmaktadır (61, 82). Çalışmalarımızda, Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya Anabilim Dalı Araştırma Görevlileri tarafından sentezlenen maddelerin DNA ile etkileşiminin elektrokimyasal biyosensörle tayininde; diferansiyel puls voltametri (DPV) tekniği, elektrot olarak da karbon pastası elektrodu ve kalem grafit elektrot (PGE) kullanıldı. DNA ilaç etkileşimlerinde, etkileşimler çözelti fazında ve elektrot yüzeyinde (DNA modifiye edilmiş elektrot yüzeyinde veya ilaç modifiye edilmiş elektrot yüzeyinde) gerçekleştirildi. Çalışmalarımızda maddenin dsdna ve ssdna ile etkileşim öncesi ve sonrasında, hem DNA daki elektroaktif bazlardan olan guaninin yükseltgenme pik akımındaki değişim hem de maddenin kendine özgü pik akımındaki değişim incelendi. Bu etkileşim sonucunda elektroaktif baza ait pik akımında ve maddenin kendi pik akımında azalma saptandı. Çalışmamız sırasında; kullanılan madde ile DNA nın etkileşme süresi, madde ve DNA konsantrasyonundaki değişimin elektrokimyasal yanıta olan etkisi ve tekrarlanabilirlik gibi deneysel parametreler incelendi. Kalem grafit elektrot

15 5 kullanarak gerçekleştirdiğimiz çalışmanın getirdiği en önemli yarar; PGE nin tek kullanımlık olmasından ötürü tekrarlanabilir sonuçlar alınması oldu. Sonuç olarak, çalışmamızda tasarımını yaptığımız DNA madde etkileşmesine dayalı tek kullanımlık elektrokimyasal biyosensörle maddelerin DNA ile etkileşmesi ve meydana gelen değişiklikler saptanmıştır. Bu çalışmalarımızın amacında; gelecekte yeni antikanser ilaç hedefleme çalışmalarının temelini oluşturmak ve DNA biyoçip teknolojisini oluşturacak olan elektrokimyasal genosensörlerin bir öncüsünü geliştirmiş olmak vardır.

16 6 GENEL BİLGİLER 1. ELEKTROKİMYA Maddeninin, elektrik enerjisi ile etkileşmesi sonucu ortaya çıkan kimyasal ve fiziksel değişiklikler ile kimyasal enerjinin elektrik enerjisine çevrilmesini inceleyen bilim dalı elektrokimya olarak adlandırılır. Elektrokimyasal tepkimeler, yükseltgenme ve indirgenme tepkimeleri olup, elektron paylaşımına veya transferine dayalı kimyasal olaylar sonucu meydana gelirler. Elektrokimyasal tepkimeler; elektrokimyasal hücre adı verilen bir hücrede yürütülür. Elektrokimyasal tepkimenin oluşabilmesi için; analizi yapılacak maddeyi içeren çözelti (elektriksel iletkenliği sağlamak amacıyla çeşitli tampon çözeltiler kullanılır), maddenin kimyasal dönüşüme uğradığı elektrot sistemi (genellikle üçlü elektrot sistemi) ve bu elektrotları birbirine bağlayan bir çevirim sistemi (transducer) gereklidir. Şekil 1: Elektrokimyasal bir hücre şeması ve üçlü elektrot sistemi

17 7 Şekil 2: Analitik Kimya Anabilimdalı çalışma labarotuvarımızda kullandığımız elektrokimyasal bir hücre ve üçlü elektrot sistemi Elektroanalitik kimya, analiz edilecek çözelti bir elektrokimyasal hücrenin parçası olduğu zaman çözeltinin elektrokimyasal özelliklerine uygun bir grup kantitatif analiz yöntemini kapsar. Elektroanalitik yöntemler ile çok düşük tayin sınırlarına ulaşılıp, elektrokimyasal yöntemlerin uygulanabildiği sistemler hakkında, kimyasal reaksiyonların hız ve denge sabitleri, adsorbsiyon, kütle aktarım hızı vb. birçok bilgi elde edilebilmektedir. Elektroanalitik yöntemlerin; diğer analiz yöntemlerine göre bazı üstünlükleri bulunmaktadır. Bu avantajlardan birincisi, elektrokimyasal ölçümlerin çoğu kez bir

18 8 elementin, molekülün veya tepkime sonunda oluşan ürünün özel bir yükseltgenme basamağı için spesifik olması; diğer önemli avantajı ise, kullanılan cihazların diğer yöntemlerde kullanılan cihazlara göre nispeten ucuz olmasıdır (2,13) Elektrokimyasal Olaylarda Kütle Aktarım Yolları: Bir elektrot, sadece elektrot yüzeyindeki çok ince bir çözelti tabakasında etkin olabilmektedir. Ancak faradayik bir akım, ana çözeltiden elektrot yüzeyine reaksiyona giren türlerin devamlı aktarımını gerektirir. Bir elektrokimyasal hücrenin çalışması sırasında iyonlar veya moleküller ana çözeltiden yüzey tabakaya (yani elektrot yüzeyine) veya yüzey tabakadan ana çözeltiye konveksiyon (karıştırma), elektriksel göç ve difüzyon olmak üzere üç yöntem ile aktarılırlar (28). 1-Konveksiyon: Sıcaklık veya yoğunluk farkıyla, elektrot yüzeyinden geçen çözeltinin akışı gibi doğal olarak meydana gelen bir kütle aktarım yolu olmakla beraber aynı zamanda karıştırma ve çalkalama sonucunda ortaya çıkan mekanik hareket ile de meydana gelen kütle aktarımını ifade etmektedir. 2-Elektriksel Göç: İyonlarla, yüklü elektrot arasındaki elektrostatik çekimden kaynaklanan iyonların hareketidir. Yani elektriksel alanın etkisiyle meydana gelen bir aktarım yoludur. Elektriksel göç, elektriksel migrasyon olarak da adlandırılır. 3-Difüzyon: Türlerin derişim farkı nedeniyle yaptıkları harekettir. Yani elektrot yüzeyindeki sıvı film ile çözelti arasındaki derişim farkından dolayı meydana gelen bir kütle aktarımıdır.

19 Elektrokimyasal Tabakalar: Elektrokimyasal ölçüm yapılırken elektrot yüzeyi ile analit sıvısı arasında heterojen tabakalar meydana gelmektedir. Bunun nedeni elektrot, kendisine bitişik olan çözelti tabakasındaki bir türe elektron verebilir veya o tabakadan elektron alabilir. Genel olarak karıştırılan sistemlerdeki heterojen tabakaların bileşimi Şekil 3 te görülmektedir. Şekil 3: Elektrot yüzeyindeki tabakaların şematize olarak gösterilmesi. Türbülent akış tabakası: Elektrottan uzak çözelti yığınında gözlenir. Laminer akış bölgesi: Yüzeye yaklaştığında bir laminer akışa geçiş olur. Laminer akışta sıvı tabakaları elektrot yüzeyine paralel bir yönde birbirleri üzerinde kayarlar. Nernst difüzyon tabakası: Elektrot yüzeyinden δ cm uzaktaki laminer akımın hızı, sıvı ile elektrot arasındaki sürtünmeden dolayı sıfıra yaklaşır ve bunun sonucunda da elektrot çevresindeki ince, durgun bir çözelti tabakası oluşur. Genellikle bu çözelti tabakası, cm kalınlığında olmaktadır.

20 Voltametri ve Voltametrinin Esasları: Bir indikatör veya çalışma elektrodunun polarize olduğu koşullar altında, elektroda uygulanan gerilimin (potansiyelin) bir fonksiyonu olarak akımın ölçülmesine dayanan elektrokimyasal yönteme voltametri adı verilir. Uygulanan gerilimin ölçülen akım değerine karşı çizilen grafiğine de voltamogram denir. Voltametride, herhangi bir maddenin elektrokimyasal davranışını incelemek için elektroda uygulanabilecek gerilim aralığının sınırları, kullanılan çalışma elektrodu, kullanılan çözelti ve elektrolit türlerine bağlıdır. Voltametri, potansiyelin kontrol altında tutulduğu dinamik bir yöntem olup, ara yüzey yöntemleri grubunda olan elektroanalitik bir yöntemdir. Voltametri; Çekoslavak kimyacı Jaroslav Heyrovsky tarafından1920 lerin başında polorografi tekniği üzerinde yapılan çalışmalara dayanarak geliştirilmiştir. Voltametrinin önemli ve özel bir dalı olan hatta temelini oluşturan polorografinin diğer voltametrik yöntemlerden farkı çalışma elektrodu olarak damlayan civa elektrodu (DCE) kullanılmasıdır. Voltametri Analitik Kimya, İnorganik Kimya, Fizikokimya ve Biyokimya bilim dallarında yükseltgenme ve indirgenme reaksiyonlarının, elektrot yüzeyinde meydana gelen elektrot aktarım mekanizmalarının ve yüzeylerde meydana gelen adsorbsiyon olaylarının incelenmesi gibi alanlarda yaygın olarak kullanılan bir elektroanalitik yöntemdir.

21 Voltametride Kullanılan Uyarma Sinyalleri: Voltametride, bir mikroelektrot içeren elektrokimyasal hücreye değiştirilebilir bir potansiyelde uyarma sinyali uygulanır. Bu uyarma sinyalleri karakteristik akım cevaplarını oluşturur. Voltametride en çok kullanılan dört uyarma sinyalinin şematize edilmiş durumları şekil 4 te gösterilmiştir. Bunlar doğrusal taramalı, diferansiyel puls, kare dalga ve üçgen dalga uyarma sinyalleridir. Şekil 4: Voltametride kullanılan uyarma sinyalleri

22 Voltametride Kullanılan Cihazlar: 1-Çalışma elektrodu: Zamanla potansiyeli doğrusal olarak değişen ve yüzeyinde analitin yükseltgendiği veya indirgendiği mikroelektrottur. Bu elektrodun boyutları polarizasyonu artırmak için küçük tutulur. 2-Referans elektrot: Elektrokimyasal analizler sırasında potansiyeli dış ortamdan etkilenmeyen ve analiz süresince potansiyeli sabit kalan elektrottur. Genellikle referans elektrot olarak gümüş/gümüş klorür (Ag/AgCl) veya doymuş kalomel elektrot (DKE) kullanılır. Referans elektrotlar çalışılan maddelere karşı duyarsızdır. 3-Yardımcı elektrot: Sinyal kaynağından gelen elektriğin, çözeltinin içinden geçerek çalışma elektroduna aktarılmasını sağlayan yardımcı (karşıt) elektrottur. Genellikle helezon şeklinde bir platin tel veya bir civa havuzu şeklinde olan yardımcı elektrotlar, çalışma elektrodu ile bir çift oluşturur; fakat ölçülen potansiyelin tayininde rol oynamaz Voltametride Kullanılan Çalışma Elektrotları: Voltametrik reaksiyonlar, çalışma elektroduyla ara yüzey arasında meydana gelmektedir. Bu nedenle elektrot seçimi çok önemlidir. Çalışma elektrodunun yapımında kullanılan iletken malzeme, platin ya da altın gibi inert bir metal; karbon, pirolitik grafit ya da camsı karbon; kalay oksit ya da indiyum oksit gibi yarı-iletken veya bir civa filmi ile kaplanmış bir metal olabilir. Bu elektrotlar biyosensör tasarımı için çeşitli şekil ve büyüklüklerde geliştirilmektedirler. Bu tür elektrotların kullanıldığı voltametrik reaksiyonlarda, potansiyel aralığının tespiti çok önemlidir. Ancak bu potansiyel aralığı, sulu çözeltilerde sadece elektrot malzemesine bağlı olarak değil, aynı zamanda bu elektrotların

23 13 daldırıldığı çözeltinin bileşimine bağlı olarak da değişir. Pozitif potansiyel sınırları genellikle moleküler oksijen verecek şekilde, suyun yükseltgenmesi sonucunda oluşan büyük akımlarca belirlenir. Negatif potansiyel sınırları yine suyun indirgenmesi sonucunda oluşan hidrojenden kaynaklanır. Şekil 5: Kullanılan çalışma ortamına göre çalışma elektrotları için seçilen potansiyel aralıkları. Şekil 5 te de belirtildiği gibi kullanılan çalışma ortamına göre çalışma elektrotları için seçilen potansiyel aralıkları; civa elektrodu için 1 M H 2 SO 4 çalışma ortamında (- 0,8 V) ile (+0,4 V) aralığı ve 1 M KCl çalışma ortamında (- 1,6 V) ile (+0,2 V) aralığıdır. Karbon elektrodu için ise 1M HClO 4 ortamında (+0,2 V) ile (+1,8 V) aralığı ve 0,1 M KCl ortamında (-1,0 V) ile (+1,2 V) aralığıdır Sıvı Elektrotlar: Sadece civa ve gallium oda ısısında sıvı halde bulunmaktadır. Oda ısısında sıvı halde bulunmalarından dolayı bu iki elektrot sıvı elektrot ismini alır. Ancak civa analitik işlemlerde galliuma göre daha çok kullanılmaktadır.

24 14 Analitik İşlemlerde Civa Elektrodun Tercih Edilme Nedenleri; a) Düşük negatif potansiyel aralıklarında çalışılabilmesi yani negatif potansiyel sınırının çok yüksek olması, b) Kolayca oluşturulabilen yeni bir civa damlası ile yeni bir metalik yüzey oluşturulabilmesi, c) Birçok metal iyonunun civa yüzeyinde tersinir reaksiyon verebilmesi yani pek çok metal iyonunun bir civa elektrodunun yüzeyinde amalgam oluşturmak suretiyle tersinir olarak indirgenebilmesidir. Ancak civa elektrodunun bu avantajları yanında dar bir pozitif potansiyel aralığına sahip olması bu metalin anot olarak kullanılmasını sınırlamakta; toksik bir metal olması nedeniyle de kullanımının zahmetli olması gibi sakıncaları bulunmaktadır. Bu sakıncalar civa elektrodun kullanımını sınırlamaktadır. Dört Çeşit Civa Elektrodu Bulunmaktadır: 1- Disk elektrot 2- Asılı civa damla elektrot 3- Damlayan civa elektrot 4- Durgun civa damla elektrot Katı Elektrotlar: Sıvı elektrotların voltametrik analizlerde kullanımının sınırlı olması sebebiyle katı elektrotlar daha geniş bir kullanım alanına sahiptirler. Katı Elektrotların Daha Sık Kullanılma Nedenleri; Geniş bir potansiyel aralığına sahip olmaları, Çeşitli şekillerde modifiye edilebilmeleri, Kullanım alanının daha rahat olması,

25 15 Yüksek sıcaklık ve basınç aralıklarında çalışılmasına imkan vermeleridir a. Karbon Elektrotlar: Karbon elektrotlar özelikle çok ucuz olmaları ve geniş bir potansiyel aralığında çalışılmasına olanak vermesi nedeniyle elektrokimyasal analizlerde sıklıkla kullanılırlar. Ancak karbonun geniş bir yüzeye sahip olması ve bu sebeple organik bileşikler tarafından kolayca kirletilebilir olması dezavantaj oluşturmaktadır. Hidrojen, hidroksil ve karboksil grupları ile karbon yüzeyinde bağlar oluşabilmektedir. Bu fonksiyonel gruplar sayesinde karbon yüzeyine birçok madde tutturulabilir. Dört Çeşit Karbon Elektrot Bulunmaktadır: 1- Camsı karbon elektrot (GCE) 2- Perde baskılı karbon (grafit) elektrot (SCPE) 3- Karbon pastası elektrot 4- Kalem grafit elektrot a.1. Camsı Karbon Elektrot (GCE): Camsı Karbon Elektrot, fenol/formaldehit polimerlerinin veya poliakrilonitrilin 1000 o C 3000 o C arasında, basınç altında karbonizasyona uğratılması ile elde edilir. GCE yüksek yoğunluğa sahip, küçük porlar içeren amorf bir yapıdır. Birbiri içerisine geçmiş, ince, grafite benzer şeritlerden oluşmuştur.

26 16 Şekil 6: GCE nin amorf yapısı GCE, ticari olarak elektrot üretimine uygun olmamasına (kolayca kırılabilir olması ve sert olması) rağmen çok iyi mekanik ve elektriksel özelliklere sahip olması, geniş bir potansiyel aralığı olması, genellikle tekrarlanabilir yüzeyler sağlaması ve kimyasal tepkimelere girmemesi nedeniyle elektroanalitik kimyada sıkça kullanılmaktadır. Camsı karbon elektrotlar; mikrometre boyutlu grafit tozu partiküllerinin, sert ve yapıştırıcı bir madde ile inert bir malzemeden yapılmış olan elektrot gövdesi içerisine sıkıştırılması ile elde edilir. Karbon pastası elektrotlarına göre elektrokimyasal yanıt özellikleri, yüzeyin çok daha pürüzsüz ve düzgün olması nedeniyle daha iyidir. Ayrıca camsı karbon elektrodun fiziksel dayanıklılığı da

27 17 daha fazladır ve CPE de olduğu gibi metal iyonlarının negatif potansiyelde biriktirilmesine ve çeşitli polimerlerin kaplanmasına olanak sağlamaktadır a.2. Perde Baskılı Karbon (grafit) Elektrotlar (SCPE): Tek kullanımlık perde baskılı karbon elektrotlar çok yaygın şekilde kullanılmaktadır. Elektrokimya alanında çok önemli olan karbon elektrotlarının tüm çeşitlerinde yüzeylerinin düzgün bir şekilde hazırlanması oldukça önemlidir. Özellikle biyosensör teknolojisinin geleceği olan DNA mikroçip teknolojisine uygulanabilirliği açısından oldukça başarılı sonuçlar veren bu elektrotlar geleceğin elektrotları olarak gösterilmektedir a.3. Karbon Pastası Elektrodu: Grafit tozunda bulunan karbon moleküllerinin düzlemsel ve aromatik halkalar halinde dizilimleri ve birbirlerine zayıf π bağlarıyla bağlı olması nedeniyle bu tabakalar arasında hızlı bir elektron alışverişi olmaktadır. Şekil 7: Grafit tozunda bulunan karbon atomlarının dizilimi Grafit tozundaki aromatik halkaların aktif oksijen grupları muhteva etmeleri nedeniyle çeşitli foksiyonel guruplar (hidroksil, karbonil, karboksil v.b.) eklenebilir.

28 18 Bu özelliği nedeniyle karbon pastası elektroda bu fonksiyonel grupları içeren yapılar (enzim, antikor v.b.) eklenerek elektrot modifiye edilebilir. Şekil 8: Karbon pastası elektrodu Karbon pastası elektrot; toplam kütlesinin % 70 i oranında grafit ile % 30 u oranında çeşitli organik bağlayıcıların karıştırılması ile hazırlanır. Hazırlanan karışım 2-4 mm çapında teflon ya da camdan yapılmış elektrot gövdesi içerisine sıkıştırılır, elektriksel iletkenliği sağlamak için iletken bir tel gövdenin 2/3 ne kadar yerleştirilerek hazırlanır. Bağlayıcı madde olarak nujol (mineral yağ), parafin yağı, silikon yağı ve bromonaftalen kullanılmaktadır. Bağlayıcı organik sıvı oranı arttıkça, elektron transfer hızı azalmaktadır. Pasta bileşiminin de elektrot aktivitesine büyük etkisi vardır. Karbon pastası elektrodu ucuz olması, hazırlanmasının zahmetsiz oluşu, yüzey yenilenmesinin kolay olması, artık akımların az olması nedeniyle sıklıkla tercih edilmektedir. Ancak karbon pastası elektrot yeterli miktarda organik çözücü içeren çözeltilerde kullanıldığı zaman çözeltide dağılmaktadır. Bu da karbon pastası elektrodun kullanımındaki en büyük sakıncadır.

29 a.4. Kalem Grafit Elektrodu: Son yıllarda tekrarlanabilirliğinin daha iyi olması, daha düşük tayin sınırı, ucuz ve tek kullanımlık olması sebebiyle kalem grafit elektrodun kullanılmasına artan bir ilgi bulunmaktadır (53,118). Şekil 9: Kalem Grafit Elektrot b. Metal Elektrotlar: Bu elektrotlar geniş pozitif potansiyel aralığına ve yüksek elektron transfer kinetiklerine sahiptirler. En sık kullanılan metal elektrot çeşitleri platin ve altın elektrotlardır. Bakır, nikel, radyum gibi çeşitli metaller de değişik analizler için elektrot olarak kullanılabilir. Örneğin bakır ve nikel elektrotlar karbonhidratların ve aminoasitlerin tayininde kullanılmaktadırlar. Kullanılan çözeltinin ph sına bağlı olarak (-0,2 V)-(-0,5 V) aralığında çalışabilirler. Ayrıca metal elektrotlar elektrokimyasal veya kimyasal işlemlere sokularak modifiye edilebilir. Tiyol gruplarının özellikle altın ve platine ilgisi ve yüksek akım cevabı nedeniyle son yıllarda biyosensör teknolojisinde kullanımı artmıştır. Son 10 yıl içerisinde boyutları mikroelektrotlardan daha küçük olan ultramikroelektrotların ve nanoelektrotların tasarımı gerçekleştirilmiştir. Yeni

30 20 tasarlanan bu elektrotların ve karbon fiber elektrotların elektrokimyasal analizlerde kullanımı son yıllarda oldukça artmıştır Voltametride Kullanılan Referans Elektrotlar (Karşılaştırma Elektrotları) (2, 28, 35, 91, 105): Elektrokimyasal çalışmalar sırasında, daldırıldığı çözeltinin bileşiminden etkilenmeyen ve potansiyeli dış ortamdan bağımsız olan elektrotlardır. İdeal Bir Referans Elektrot Şu Özelliklere Sahip Olmalıdır: 1-Belli bir akım aralığında tersinir davranmalıdır. 2-Nernst eşitliğine uymalıdır yani zamanla potansiyeli değişmemelidir. 3-Ufak bir akıma maruz kaldıktan çok kısa bir süre sonra orijinal potansiyeline geri dönebilmelidir. 4-Potansiyelin sıcaklıkla değişim katsayısı küçük olmalıdır yani sıcaklık değişimlerinde çok az bir değişim göstermelidir. 5-Kolay hazırlanabilir olmalıdır. 6-Tekrarlanabilen bir potansiyel değerini hızlı bir şekilde okumalıdır. 7-Polarize edilemeyen bir elektrot olmalıdır a. Referans Elektrot Çeşitleri: a.1. Kalomel Referans Elektrot: Kalomel referans elektrotlar, doygun civa(i)klorür (kalomel) elektrotla temasta olan ve yaygın olarak kullanılan elektrotlardan bir tanesidir. Bu elektrodun potansiyeli, klorür iyonlarının aktifliğine bağlıdır. Hazırlanışının çok kolay olması nedeniyle analitik kimyacılar tarafından çok tercih edilen bir referans elektrottur. Kalomel referans elektrotta,

31 21 Hg 2 Cl 2 (k) + 2e - 2Hg (k) + 2Cl - e (sulu) reaksiyonu gerçekleşir. Böyle bir reaksiyonun potansiyeli ortamdaki klor iyonu konsantrasyonuna bağlıdır. Elektrot kabında çökmüş halde bol miktarda kalomel olmak şartı ile üç kalomel elektrottan söz edilebilir. Bunların verdikleri potansiyel az çok sıcaklığa bağlıdır. Bu elektrotlardan en çok kullanılanı doymuş kalomel elektrottur. Sıcaklıkla potansiyeli diğerlerine göre fazla değişmesine rağmen akım alımlarına karşı çok dayanıklıdır. Doygun kalomel elektrodun (DKE), standart hidrojen elektroda (SHE) karşı 25 0 C de potansiyeli V olarak bulunmuştur a.2. Gümüş-Gümüş Klorür Referans Elektrot: Bu elektrot elektrolitik yoldan gümüş klorür (AgCl) ile kaplanmış bir gümüş (Ag) telin belli konsantrasyondaki klorür (Cl - ) çözeltisine daldırılması ile elde edilir. Gümüş-Gümüş Klorür elektrotta; AgCl (k) + e - Ag (k) +Cl - (sulu) reaksiyonu gerçekleşir a.3. Civa-Civa(1) Sülfat Referans Elektrot: Bu elektrot, doygun kalomel elektroda benzemektedir. Elektrodun potansiyeli, sülfat iyonlarının aktifliği ile tayin edilir Voltamogramlar: Doğrusal taramalı voltamogramlar, çoğunlukla voltametrik dalga adı verilen sigmoidal şekilli (S şeklinde) eğrilerdir. Dik ve keskin bir artıştan sonra gelen sabit akıma sınır akımı veya difüzyon kontrollü akım denir. Sınır akımı i s olarak gösterilir. Bu akım, analitin yani analizlenecek maddenin kütle aktarım yoluyla elektrot yüzeyine taşınmasındaki hızıyla sınırlıdır ve sınır akımı genellikle

32 22 analitin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Sınır akımı aşağıdaki formülle ifade edilebilir: I s = k.c A Bu formülde: İ s sınır akımını C A analit konsantrasyonunu K, sınır akımı sabitini belirtir. Kantitatif doğrusal taramalı voltametri bu ilişkiye dayanır. Akımın, sınır akımın yarısına eşit olduğu potansiyele yarı dalga potansiyeli denir ve E 1/2 ile gösterilir. Sınır akımlarının hızlı bir şekilde elde edilebilmesi için çözelti veya elektrot sürekli hareket halinde olmalı ya da damlayan civa elektrodu gibi bir elektrot kullanılmalıdır. Çözelti veya mikroelektrodun sürekli hareket halinde olduğu doğrusal taramalı voltametriye hidrodinamik voltametri adı verilir. Damlayan civa elektrodunun kullanıldığı voltametriye de polarografi adı verilir. Polarografi ilk bulunan ve kullanılan voltametri tipidir. Hidrodinamik voltametriden; konveksiyonun önlenmiş olması ve elektrot olarak damlayan civa elektrot kullanılması gibi iki temel özelliği ile ayrılır. Konveksiyonun önlenmiş olması sebebiyle, sınır akımları sadece difüzyonla kontrol edilir. Polarografide yani damlayan civa elektrodu içeren bir hücrenin kullanıldığı voltametrideki akım; damlama hızına bağlı olarak periyodik iniş ve çıkışlar gösterir. Damla kapillerden kopunca akım sıfıra düşer ve yeni damlanın yüzey alanı büyümeye başladıkça akım hızla artmaya başlar. Ortalama akım, hipotetik olarak sabit bir akımdır. Ortalama akımı tayin etmek için iniş ve çıkışları süzecek

33 23 elektronik bir filtre kullanmak veya akımın zamanla değişiminin daha küçük olduğu damla süresinin sonunu ölçmek gerekir. Polarografide, hidrodinamik voltametride olduğu gibi, akımın büyüklüğü analitin elektrot yüzeyine taşınma hızı ile sınırlı olduğu zaman, sınır akımları gözlenir. Fakat polarografide tek kütle aktarım şekli difüzyonla kütle aktarımı olduğu için polarografik sınır akımlarına difüzyon akımları da denir. Destek elektrolite ait polarogramın incelenmesi ile ortamda analizlenecek madde yokken bile hücrede artık akım adı verilen küçük bir akımın oluştuğu tespit edilmiştir. Artık akımların oluşma sebepleri olarak safsızlıkların indirgenmesi ve bu safsızlıkların içinde az miktarda çözünmüş oksijen, damıtık sudan gelen ağır metal iyonları ve destek elektrolit olarak kullanılan tuzdaki safsızlıklar sayılabilir. Polarografik yöntemlerde doğruluk ve duyarlık, faradayik olmayan artık akımın büyüklüğüne bağlıdır ve doğru bir sonuç elde etmek için artık akımın etkisini giderme yoluna gidilir. Polarografide ph nın Etkisi: Bazı organik ve inorganik madde reaksiyonları aşağıdaki gibi ifade edilir: R, analitin yükseltgenmiş şekli ve RH n, indirgenmiş şeklini göstermektedir. Bu tip bileşiklerin yarı-dalga potansiyelleri denklemden de anlaşılacağı gibi önemli ölçüde ph ya bağlıdır. ph nın değişimi, reaksiyon sonucunda oluşan ürününün değişmesine bile sebep olabilir. Bu nedenle ortamda tampon çözeltiler kullanılmalıdır. Eğer tampon çözelti kullanılmazsa, elektrot yüzeyindeki çözeltinin

34 24 ph'sı büyük oranda değişebilmektedir. Bu değişimler, reaksiyonun indirgenme potansiyelini etkiler ve iyi bir görünümü olmayan yayvan eğrilerin elde edilmesine neden olur. Ayrıca, özellikle organik maddelerle yapılan polarografide tekrarlanabilir yarı-dalga potansiyelleri ve difüzyon akımları elde etmek için tampon çözelti kullanmak çok önemlidir. Bir Elektrot Sistemine Potansiyel Uygulandığında Oluşan Akımlar: 1-Kapasitif akım 2-Faradayik akım 1-Kapasitif akım (i c ): Bir elektrokimyasal analiz sırasında elektrodun bir elektrolit çözeltisine daldırılması ve negatif yükle yüklenmesiyle, çözeltideki pozitif yüklü iyonlar elektroda doğru çekilir. Bu sayede ara yüzeyde bir gerilim farkı oluşur. Ters işaretli yüklerin ara yüzeyin iki tarafında birikmesi ile bu bölgede bir elektriksel çift tabaka oluşur. Oluşan bu çift tabaka, bir kapasitör gibi davranır. Bu kapasitörü yüklemek için ortamda yükseltgenecek veya indirgenecek madde olmasa dahi bir akım oluşur. Oluşan bu akıma kapasitif akım denir. Kapasitif akım reaksiyona bağlı değildir, sadece sistemden kaynaklanır. Kapasitif akım ne kadar düşük olursa, o kadar doğru ölçüm yapılır. 2-Faradayik akım (i f ): Bir elektrokimyasal analiz sırasında elektrokimyasal hücreye dışarıdan bir gerilim uygulanır. Bu gerilim sonucu elektrotlardan herhangi birinde elektroaktif maddeye ait yükseltgenme indirgenme tepkimeleri oluşur. Bu tepkimeler sonucu oluşan ürün miktarı, kullanılan elektrik miktarıyla doğru orantılıdır. Q = I.t

35 25 Bir devreden t saniyede I amper akım geçirildiğinde kulon cinsinden harcanan elektrik miktarı Q dur. Analizi yapılacak tek bir türe ait maddenin tümünün elektrolizlenebilmesi için gereken elektrik miktarı; Q = n.f.c.v eşitliği ile bulunur. Bu eşitlikte: n: molekül ya da iyon başına tüketilen elektron sayısını F: faraday sabitini (96485 kulon / mol elektron) C: analitin konsantrasyonunu (M) V: hacmi (L) Q: harcanan elektrik miktarını (kulon) belirtir. Bu eşitliğe faraday yasası adı verilir. Analizi yapılacak maddenin kimyasal dönüşümü için harcanan ve yalnızca elektron alış verişine dayanan akıma faradayik akım denir. Kısacası faradayik akım reaksiyondan kaynaklanan yani analiz edilecek maddeden kaynaklanan akımdır. I = I f + I c olduğundan, i c azalırsa duyarlılık artar. Yani bir reaksiyonda meydana gelen akım, faradayik akım ve kapasitif akımın birleşmesiyle oluşmaktadır ve kapasitif akım yani reaksiyona dayalı olmayan akım ne kadar az olursa duyarlılık artar, daha iyi bir sonuç elde edilir. Genellikle 10-3 M ve üstünde; i c < i f dir ve çalışılabilir M da kısmen iyi sonuç alınır M ve altında; i c >> i f olduğu için çalışılamaz.

36 Voltametrik Akımlar: İncelenen bir elektroliz işleminde akım, analitin difüzyon tabakasının dış tarafından elektrot yüzeyine taşınma hızı ile kontrol edilir ve bu hız C A / X ile ifade edilir. Burada X, cm cinsinden elektrottan olan uzaklığı göstermektedir. Düzlemsel bir elektrot için akım I = n.f.d A. ( C A / X ) şeklindedir. Burada: I = t zamanındaki akımı, n= elektrokimyasal tepkimeye giren elektron sayısını, F =Faraday sabitini( kulon / mol elektron), A = elektrot yüzey alanını (cm 2 ) D A = analitin difüzyon katsayısını (cm 2 / sn), C A = analitin konsantrasyonunu (mol /L) göstermektedir. Oluşan difüzyon akımının zamana karşı fonksiyonu cottrell denklemini verir. i = nfacd 1 / 2 π t 1 / 2 1 / 2 Cottrell denklemi analiz esnasında gerçekleşen tepkimelerin difüzyon kontrollü olup olmadığı hakkında bilgi verir Elektrokimyasal Bir Olayda Faradayik İşlemler ve Nernst Eşitliği: Bir elektrokimyasal hücrede çözelti ve elektrot arasındaki yüzeyden akımın iletimi sırasında, elektrotlardan birinde yükseltgenme reaksiyonları olurken diğerinde indirgenme reaksiyonu meydana gelir.

37 27 O + ne - R Bu reaksiyonlarda O ve R, sırasıyla, redoks çiftinin, yükseltgenmiş (oksitlenmiş) ve indirgenmiş (redüklenmiş) şeklini ifade etmektedir. Termodinamik kurallarla kontrol edilen sistemlerde, elektrot potansiyeli, elektroaktif türün elektrot yüzeyindeki derişiminin [C o (0,t) ve C R (0,t)], Nernst denklemine göre saptanmasında kullanılabilir. E = E 0 + 2,3 RT nf log C C 0 R E 0 = Redoks tepkimesi için standart potansiyeli R = İdeal gaz sabitini (8,314 JK -1 mol -1 ) T = Sıcaklığı ( 0 K) n = Reaksiyonda transfer edilen elektron sayısını F = Faraday sabitini (96497 culon / mol elektron) C o ve C r = Tepkimedeki türlerin konsantrasyonunu (mol / L) ifade eder Uyarma Sinyallerine Göre Voltametrik Teknikler: Dönüşümlü Voltametri (CV) : Dönüşümlü voltametri (CV), sürekli değişen potansiyel değerlerine karşı belirli bir potansiyel aralığında ve karıştırılmayan ortamda mikroelektrodun akım cevabı olarak tanımlanabilir. Yani dönüşümlü voltametride gerilimin bir fonksiyonu olarak akım ölçülür. Dönüşümlü voltametride de doğru akımdaki gibi kapasitif akımın en düşük olduğu bölgede çalışılır. Duyarlılık 10-5 M ile sınırlıdır. Çalışılan potansiyel aralığı, yapılan deneyde kullanılan bir veya daha fazla analitin (analizlenecek maddenin) yükseltgenmesinin veya indirgenmesinin meydana

38 28 geldiği potansiyel aralığıdır. Bu potansiyel aralığına çevirici potansiyeller de denir. Şekil 10: Dönüşümlü voltametride kullanılan uyarılma sinyali Şekil 10 da gösterildiği gibi analitin yükseltgenmesi ve indirgenmesi voltamogramda gözlenebilmektedir. Önce potansiyel doğrusal olarak değiştirilir, daha sonra tarama yönü tersine çevrilir ve orjinal değerine geri döner (üçgen dalga şekilli potansiyel). Yani ilk olarak potansiyel bir maksimum değere kadar artar ve daha sonra başlangıç değerine yine doğrusal olarak geri döner. Başlangıç taramasının yönü kullanılan maddenin bileşimine bağlı olarak negatif ya da pozitif olabilir. Dönüşümlü voltamogramların şekli ve yapısında seçilen potansiyel aralığının yanı sıra seçilen tarama hızının, kaç defa tarama yapıldığının da etkisi vardır.

39 29 Şekil 11: a) Dönüşümlü voltametride elektroda uygulanan gerilimin zamana karşıgrafiği b) Dönüşümlü voltametride elde edilen akım-gerilim eğrisi. Kullanılan çözeltiye potansiyel uygulandığında, elektrot yüzeyi uygulanan potansiyele göre pozitif ya da negatif bir karakter gösterir ve çevresindeki çözeltiden elektron alır ya da çözeltiye elektron verir bu da ölçülebilir bir akım oluşmasına neden olur. Çalışma ortamında karıştırma yapılmadığı için elektron transferi elektrot yüzeyi ve çevresinde olur, bu nedenle elektrot çevresindeki madde miktarı zamanla azalır. Sonuç olarak oluşan akım başlangıçta bir pik yapar ve elektrot çevresindeki madde azalmaya başladığında akım piki de azalmaya başlar ve en sonunda başlangıç noktasına geri döner. Bu piklere indirgenme ve yükseltgenme pikleri denir. Bir dönüşümlü voltamogramın en önemli parametreleri; anodik pik potansiyeli E pa, katodik pik potansiyeli E pc, anodik pik akımı İ pa ve katodik pik akımı İ pc dır. Tersinir bir reaksiyon için anodik ve katodik pik akımları mutlak değer olarak yaklaşık olarak eşittir. Pik potansiyelleri farkı 0,0592/n dir. n yarı reaksiyonda yer alan elektron sayısını ifade etmektedir. İ p = pik akımı

40 30 n = transfer edilen elektron sayısı A = elektrot yüzey alanı (cm 2 ) D = türlere ait difüzyon katsayısı (cm 2 / sn) C = türlerin çözelti içerisindeki konsatrasyonları (mm) V = tarama hızı (V / sn) dır. Bir dönüşümlü voltamogramdaki indirgenme ve yükseltgenme arasındaki pik gerilimleri farkı, E p ile ifade edilir. E p =(57/n).mV E p bu değere ne kadar yakın ise, dönüşümlü (reversible); ne kadar uzaksa dönüşümsüz (irreversible) olarak adlandırılır Şekil 12: Klasik dönüşümlü bir voltamogramın önemli parametreleri; anodik pik potansiyeli E pa, katodik pik potansiyeli E pc, anodik pik akımı İ pa ve katodik pik akımı İ pc dir.

41 31 Dönüşümlü voltametri çeşitli şartlar altında elektrokimyasal işlemler hakkında kantitatif bilgiler sağlayan, temel ve teşhise dayalı bir çalışma yöntemidir. Dönüşümlü voltametri miktar tayinine dayalı bir yöntem değildir yani rutin kantitatif analizlerde kullanılmamaktadır. Ancak organik ve metal organik sistemlerde yükseltgenme ve indirgenme işlemlerinin mekanizma ve hız çalışmaları için oldukça önemli bir yöntemdir. Analizlenecek maddenin hangi potansiyelde nasıl davrandığı hakkında bilgi verdiği için, o maddenin hangi potansiyelde optimum cevabı vereceğini gösterir. Bu gibi sebeplerden ötürü, dönüşümlü voltametri yöntemi elektrokimyasal olarak belirtilebilen bir sistemin araştırılması için seçilen ilk yöntemdir Diferansiyel Puls Voltametrisi: Çok duyarlı bir yöntem olan diferansiyel puls voltametrisinde uyarma sinyalleri, doğrusal bir tarama esnasında periyodik pulsların oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Tayin sınırı(yani gözlenebilme sınırı) M arasındadır. Bu sınırlar klasik polarografinin gözlenebilme sınırlarından kat daha düşüktür. Diferansiyel puls polarografisi yöntemi ile yarı dalga potansiyelleri 0,04 0,05 V kadar farklı olan maddeler için bile pik maksimumları elde edilebilmektedir. Fakat normal ve klasik puls polarografilerinde yarı dalga potansiyelleri farkı en az 0,2 V olmalıdır. Diferansiyel puls voltametrisinde, doğrusal bir tarama sırasında çalışma elektroduna periyodik darbeler (örneğin 10 mv luk veya 30 mv luk) uygulanır. Darbe (puls) uygulamadan önce ve sonra olmak üzere iki kez akım ölçülür. Puls başına elde edilen akımdaki fark, doğrusal olarak artan potansiyelin fonksiyonu

42 32 olarak kaydedilir. Elde edilen diferansiyel puls voltamogramı yüksekliği, analizi yapılan maddelerin derişimi ile orantılı akım piklerinden oluşmaktadır. Şekil 13: Diferansiyel puls polarografisi için uyarma sinyalleri: a)analog cihazlarda diferansiyel puls voltametrisi için kullanılan uyarma sinyali b) Dijital cihazlarda diferansiyel puls voltametrisi için kullanılan uyarma sinyali c) Diferansiyel puls voltametrisinde elde edilen bir voltamogram. Yukarıdaki 13-a ve 13-b şekillerinde de görüldüğü gibi iki tane akım ölçümü yapılmaktadır. İlki doğru akım pulsundan önce diğeri de doğru akım pulsundan

43 33 sonra yapılmaktadır. Puls başına akımdaki fark doğrusal olarak artan potansiyelin fonksiyonu olarak kaydedilmektedir. DPV nin yüksek duyarlılığa sahip bir teknik olmasının iki temel etmeni bulunmaktadır. Birinci etmen faradayik akımın yüksek olması, ikinci etmen ise faradayik olmayan yükleme akımının düşük değerde olmasıdır. Diferansiyel puls voltametrisi özellikle ağır metal iyonlarının eser derişimlerinin tayini olmak üzere birçok alanda kullanılmaktadır Kare Dalga Voltametrisi: Kare Dalga Voltametrisi, damlayan civa elektrodu ve kromotografik dedektörler kullanılarak yapılabilen, son derece hızlı ve duyarlı bir puls polarografi tekniğidir. Tayin sınırları 10-7 M ile 10-8 M arasındadır. Voltamogramın tamamı 10 ms den daha az bir sürede elde edilir. Ölçümün son derece hızlı yapılmasından dolayı; analizin kesinliğini artırmak birkaç voltametrik taramanın ortalamasının alınması ile sağlanabilir. Damlayan civa elektrodu ile yapılan taramada ölçüm; damla ömrünün son birkaç saniyesi içinde gerçekleşir. Yani ölçüm yükleme akımı hemen hemen sabitken yapılır. Elde edilen akımlar arasındaki fark ( i), birinci gerilimindeki akımdan, ikinci gerilimindeki akım değeri çıkarılarak bulunur. Tersinir bir indirgenme reaksiyonunda bir pulsun boyutu, ileri tarama sırasında oluşan ürünün geri tarama sırasında yükseltgenmesini sağlamaya yetecek kadar büyüktür. İleri puls bir katodik akımını (i 1 ), geri puls da bir anodik akımını (i 2 ) oluşturur. Genellikle voltamogramı elde etmek için elde edilen akımlar arası fark grafiğe geçirilir. Akımlar arası bu fark konsantrasyonla doğru orantılıdır.

44 34 Şekil 14: Bir kare-dalga voltametrisinde uyarma sinyalinin oluşumu (a) daki uyarma sinyali (b) deki puls taraması ile (c) deki kare-dalga uyarma sinyalini elde edecek şekilde toplanıyor.

45 35 2. BİYOSENSÖRLER Biyosensörler, biyolojik tepkimelerde hedef analitlerin analizi için kullanılan, biyokimyasal ve elektriksel olmak üzere biribiri içine geçmiş iki çeviriciden oluşan küçük algılayıcı cihazlardır. Aslında biyosensör sistemleri üç temel bileşenden oluşmaktadır. Bunlar; 1-selektif (seçici) tanıma mekanizmasına sahip biyomolekül (biyoajan), 2- biyomolekülün incelenen maddeyle etkileşmesi sonucu oluşan fizikokimyasal sinyalleri, elektronik sinyallere dönüştüren çevirici bölüm (elektrokimyasal çevirici) ve 3- elektronik kısımdır. Biyosensörlerdeki biyokimyasal kısım analizlenecek maddeyle etkileşerek onu seçici olarak tanır. Biyosensörlerdeki ikinci kısım olan elektrokimyasal çevirici; tanıma olayını okunabilir (ölçülebilir) bir sayısal değere çevirir. Yani elektrokimyasal kısım; biyoajan-analit etkileşmesi sonucu gerçekleşen fizikokimyasal sinyali elektrik sinyaline dönüştürerek, bu sinyalin daha sonraları güçlenerek okunabilir ve kaydedilebilir bir şekle girmesine öncülük eder (22, 92)..

46 36 Şekil 15: Biyosensörün yapısı 2.1. İdeal Bir Biyosensörde Olması Gereken Özellikler (41): a-seçicilik: Biyoaktif bileşenin seçici olması, girişim yapabilecek türleri içeren karmaşık içerikli ölçüm ortamlarında bile ön işlem yapmaksızın analiz yapılmasını sağlar. Eğer bir biyosensörde yeterli derecede seçicilik mevcut değilse, bunu giderecek ek işlemlerin yapılması gereklidir. Bu yüzden ideal bir biyosensörün sahip olması gereken en önemli özelliklerden biri seçici olmasıdır. b-kullanım ömrü: Biyosensörün kullanım ömrünü kısıtlayan en önemli faktör, biyolojik çeviricinin aktivitesindeki azalmadır. Biyoaktif bileşenin kararlı olması, çok sayıda analize imkan vereceğinden, biyosensörün ekonomik olmasına zemin hazırlar. Biyosensörün kullanım ömrü; biyosensörün kalibrasyon sıklığı, stabilite, tekrarlanabilirlik gibi diğer parametrelerden de etkilenmektedir. c-tekrarlanabilirlik: İdeal bir biyosensör için elektrodun aynı koşullar altında arka arkaya yapılan ölçümlerde birbirine çok yakın hatta hemen hemen aynı sonuçları vermesi istenir. Pratikte bu durumun pek mümkün olmadığı göz

47 37 önünde bulundurularak, yapılan çalışmalarda tekrarlanabilirlik parametresi mutlaka incelenmelidir. Tekrarlanabilirlik ne kadar iyi olursa, biyosensörün uygulamalarının o kadar iyi olduğu ifade edilebilir. d-kalibrasyon Gereksinmesi: İdeal bir biyosensörün hiç kalibrasyona gerek duymaması veya çok az kalibrasyona ihtiyaç duyması istenir. Ancak kalibrasyon gerekliliği pratikte, teorikte planlandığı gibi gerçekleştirilememiştir. Biyosensörler kullanım ömürleri boyunca sıklıkla kalibre edilmelidirler. e-yüksek Duyarlılık: Biyosensöre immobilize edilmiş biyolojik materyalin belirli maddelere karşı yüksek duyarlılık göstermesi, ideal biyosensörün taşıması gereken özelliklerdendir. f-yeterli Düzeyde Tayin Sınırı: Tasarlanan bir biyosensörün tayin sınırının belirli bir konsantrasyon değerinin altında olması gerekmektedir. Belirtilen bu sınır; elektrot yüzeyinin büyüklüğü, biyolojik materyalin tayin edilecek materyale afinitesi (ilgisi), immobilize edilen madde miktarı gibi faktörlerden etkilenir. g-stabilite: Elektrot stabilitesinin (kararlılığının) yüksek olması ideal bir biyosensörde mutlaka olması gereken bir özelliktir. Elektrodun stabilitesi, kullanılan biyolojik materyalin fiziksel dayanıklılığına bağlı olmakla beraber; ph, ısı, nem, ortam, oksijen konsantrasyonu gibi faktörlerden de etkilenmektedir. h-geniş Ölçüm Aralığı: Biyosensör uygulamalarında ölçüm aralığı olarak adlandırılan bölge biyosensörlerden alınan akım-konsatrasyon eğrilerinin lineer olduğu konsatrasyon aralığıdır ve bu aralığın geniş olması istenir. ı-hızlı Cevap Zamanı: Bir biyosensörün cevap zamanı elde edilen akımzaman eğrilerinden anlaşılabilir. Örneğin elde edilen eğride basamakların şekli yayvan ve genişse cevap zamanı uzun (yavaş), tersi söz konusu ise cevap zamanı kısa (hızlı) olarak değerlendirilir.