ELEKTROKİMYASAL GENOSENSÖR İLE DNA DİZİ TAYİNİ

Transkript

1 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ELEKTROKİMYASAL GENOSENSÖR İLE DNA DİZİ TAYİNİ Analitik Kimya Programı Yüksek Lisans Tezi Eczacı Işıl CİN Danışman Prof. Dr. M. E. Şengün Özsöz İzmir 2007

2

3 III ÖNSÖZ Çalışmalarımdaki değerli katkılarından dolayı başta, Analitik Kimya Anabilim Dalı Başkanı, danışmanım Sayın Prof. Dr. Mehmet Emin Şengün ÖZSÖZ e, Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı Araştırma Görevlisi Sayın Dilşat Özkan ARIKSOYSAL a teşekkür eder, saygılarımı sunarım. Her zaman desteklerini gördüğüm tüm değerli çalışma arkadaşlarıma; manevi desteğini hiçbir zaman esirgemeyen aileme ve Dekim Ecza ve Kimyevi Mad. Tic. San. A.Ş. Yönetim Kurulu Başkanı Sayın Ecz.Tanıl DİNÇSOY a teşekkür ederim. Ecz. Işıl CİN

4 IV İÇİNDEKİLER BÖLÜM I GİRİŞ ve AMAÇ...1 GENEL BİLGİLER Elektrokimya Elektrokimyasal Olaylarda Kütle Aktarım Yolları Elektrokimyasal Tabakalar Voltametri ve Voltametrinin Esasları Voltametride Kullanılan Uyarma Sinyalleri Voltametride Kullanılan Cihazlar Voltametride Kullanılan Çalışma Elektrotları Sıvı Elektrotlar Katı Elektrotlar a. Karbon Elektrotlar a.1. Camsı Karbon Elektrot (GCE) a.2. Perde Baskılı Karbon Elektrotlar (SCPE) a.3. Karbon Pastası Elektrodu a.4. Kalem Grafit Elektrodu b. Metal Elektrotlar...19

5 V Voltametride Kullanılan Referans Elektrotlar a. Referans Elektrot Çeşitleri a.1. Kalomel Referans Elektrot a.2. Gümüş-Gümüş Klorür Referans Elektrot a.3. Civa-Civa(1) sülfat Referans Elektrot Voltamogramlar Voltametrik Akımlar Elektrokimyasal Bir Olayda Faradayik İşlemler ve Nernst Eşitliği Uyarma Sinyallerine Göre Voltametrik Teknikler Dönüşümlü Voltametri (CV) Diferansiyel Puls Voltametrisi Kare Dalga Voltametrisi Biyosensörler İdeal Bir Biyosensörde Olması Gereken Özellikler Biyosensör Çeşitleri Biyosensör Tasarımında Kullanılan Moleküller ve Yapıları Nükleik Asitler ve DNA DNA ile İlgili Bazı Terimlerin Tanımlamaları DNA Baz Dizilerinin Yazılımı ile İlgili Temel Bilgiler İnterkalasyon...45

6 VI Nükleik Asit Hibridizasyonu Replikasyon DNA Biyosensörleri İlaç-DNA Etkileşmesinin DNA Biyosensörleri ile Tayini Elektrot Yüzeyine DNA Bağlama (immobilizasyon) Teknikleri Elektrostatik Bağlanma Kovalent Bağlanma SH (tiyol) Grubu ile İşaretli Oligonükleotidin Altın Elektrot Yüzeyine Afinitesi BÖLÜM II GEREÇ VE YÖNTEM Kullanılan Cihazlar Kullanılan Kimyasal Maddeler DNA ile Etkileşime Giren Maddeler Hakkında Genel Bilgi Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanışı Tampon Çözeltilerin Hazırlanışı ,50 M Asetat Tampon Çözeltisinin Hazırlanışı (ph 4,8) (ACB ) ,02 M Tris HCl Tampon Çözeltisinin Hazırlanışı (ph 7,0) (TBS)...57

7 VII ,05 M Fosfat Tampon Çözeltisinin Hazırlanışı (ph 7,4 ) (PBS) İlaç Stok Çözeltilerinin Hazırlanışı Kullanılan Yöntem Kullanılan Elektrotların Hazırlanışı Karbon Pastası Elektrodunun (CPE) Hazırlanışı Kalem Grafit Elektrot (PGE) Hazırlanışı Dönüşümlü Voltametri Tekniği (CV) kullanılarak Maddelerin Yükseltgenme ve İndirgenme Sinyallerinin Saptanması DNA İmmobilize Edilmiş Kalem Grafit Elektroduna (PGE) Dayalı Tek Kullanımlık Sensör Geliştirilmesine Yönelik Çalışmalar PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyondaki dsdna nın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışma dsdna nın PGE Yüzeyine Farklı Sürelerde İmmobilize Edilmesinin Elektrokimyasal Yanıta Etkisinin İncelenmesine Yönelik Çalışma PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyonlardaki ssdna nın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışma ssdna nın PGE Yüzeyine Farklı Sürelerde İmmobilize Edilmesinin Elektrokimyasal Yanıta Etkisinin İncelenmesine Yönelik Çalışma PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyonlardaki İlaçların Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışma dsdna nın İlaç İle Etkileşimine Dayalı Çalışmalar Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltisi ile Yapılan Çalışmalar...64

8 VIII Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltisi ile Yapılan Çalışmalar Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltisi ile Yapılan Çalışmalar ssdna nın İlaç İle Etkileşimine Dayalı Çalışmalar ph Değişiminin PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen İlaç ve dsdna İle Etkileşmiş olan İlacın Pik Akımına Etkisi ph Değişiminin PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen İlacın Pik Akımına Etkisi ph Değişiminin PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen dsdna İle Etkileşime Giren İlacın Pik Akımına Etkisi...68 BÖLÜM III BULGULAR PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyondaki dsdna nın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışmadan Elde Edilen Bulgular dsdna nın PGE Yüzeyine Farklı Sürelerde İmmobilize Edilmesinin Elektrokimyasal Yanıta Etkisinin İncelenmesine İlişkin Bulgular PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyondaki ssdna nın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışmadan Elde Edilen Bulgular PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyondaki İlacın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışmadan Elde Edilen Bulgular...73

9 IX Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltilerinin, Guanin Yükseltgenme Sinyaline Olan Etkilerinin PGE ile Elektrokimyasal Olarak İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltilerinin, Guanin Yükseltgenme Sinyaline Olan Etkilerinin PGE ile Elektrokimyasal Olarak İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltilerinin, Guanin Yükseltgenme Sinyaline Olan Etkilerinin PGE ile Elektrokimyasal Olarak İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular ssdna nın İlaç İle Etkileşimine Dayalı Çalışmaların İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular ph Değişiminin Etkilerinin İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular ph Değişiminin PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen İlacın Pik Akımına Etkisinin İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular ph Değişiminin; PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen dsdna ile Etkileşime Giren İlacın Pik Akımına Etkisinin İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular...86 BÖLÜM IV TARTIŞMA dsdna ile İlaç Etkileşimlerinin Genel Olarak İncelenmesi...88

10 X BÖLÜM V SONUÇ ve ÖNERİLER...92 ÖZET...94 SUMMARY...95 YARARLANILAN KAYNAKLAR...96 ÖZGEÇMİŞ...112

11 1 BÖLÜM I GİRİŞ ve AMAÇ IUPAC ın, Analitik Kimyada oldukça yaygın kullanım alanı olan elektrokimyasal sensörler (elektrokimyasal algılayıcı sistemler) için yapmış olduğu tanımlama şu şekildedir: Elektrokimyasal sensörler; iyonlara ya da kimyasal bileşiklere seçici ve tersinir bir şekilde cevap veren ve konsantrasyona bağımlı elektriksel sinyaller oluşturan küçültülmüş cihazlardır. (17 ). Bir elektrokimyasal sensörün yapısına; DNA, enzim, hücre, doku, antikor, nükleikasit vb. biyolojik maddeler eklendiği zaman elektrokimyasal sensörlerin yaygın kullanım alanlarından biri olan BiYOSENSÖRLER oluşur (107). Biyosensörler, biyo (biyolojik kökenli) ve sensör (algılayıcı) kelimelerinin birleşmesiyle oluşan, nicel ve nitel analiz yapabilen kompleks cihazlar olarak tanımlanmaktadır. Bir diğer tanımla ise birbiri içine geçmiş, biri biyokimyasal, diğeri elektrokimyasal iki çevirici sistemden oluşan algılayıcı sistemlerdir. Biyokimyasal çeviricilerin çalışma prensibini; analizlenecek madde ile etkileşerek onu tanıma ve bu etkileşme sonucunda oluşan biyokimyasal ürünün vermiş olduğu sinyalin, elektrokimyasal çevirici tarafından okunabilir bir sayısal değere çevrilmesi oluşturmaktadır (22). Biyosensör tasarımında kullanılan nükleik asitlerden oluşmuş tanıma yüzeyleri yani DNA biyosensörleri (DNA nın; analizi yapılacak maddeyle

12 2 etkileşerek onu tanıyan biyolojik materyal olarak kullanıldığı biyosensörlerdir.) Analitik Kimya alanında her geçen gün daha fazla kullanım alanı bulmakta (4,117) ve çip teknolojisine önemli adımlar atılmaktadır (83, 85, 104). Elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin; gelecekte hasta başında yapılacak doktor gözetimindeki analizlerde çok önemli bir rol oynayacağı düşünülmektedir (113). Elektrokimyasal yöntemlerle birlikte, DNA nın nitel ve nicel analizini yapma amacına yönelik tasarlanan biyosensörlerde, tanıma yüzey katmanı olarak DNA kullanılmasına her geçen gün artan bir ilgi bulunmaktadır (7, 10, 14, 15, 42, 46, 94, 96). Tanıma yüzeyi olarak nükleik asit içeren biyosensörler (Genosensörler; gene dayalı sensörler), bu yüzey ile etkileşime giren analitin (karsinojen maddeler, ilaçlar vb.) etkileşim mekanizmasının aydınlatılması veya miktarının tayin edilmesi veya DNA nın baz dizisi belli bölgelerindeki hibridizasyonun saptanması gibi çeşitli amaçlarla kullanılabilir (23, 24, 29, 83). Analitin DNA ile etkileşmesi sonucunda, DNA daki bir bazda meydana gelen veya analitte oluşan değişiklikler sayesinde güvenilir tayinler yapılabilmektedir (52, 57, 69). Günümüzde tanıma yüzeyi olarak DNA nın kullanıldığı biyosensörler genetik ve bulaşıcı hastalıkların hızlı bir şekilde teşhis edilmesine olanak sağlamaktadır. Ayrıca DNA ile etkileşerek ona zarar veren maddelerin saptanmasını da mümkün kılmaktadır. Özellikle de antikanser özellik taşıyan ilaç molekülleri ile DNA nın etkileşmesi ve bu etkileşmenin geliştirilen yeni yöntemlerle tayin edilmesi; yeni ilaç tasarımları için çok büyük önem taşımaktadır (35, 37, 52, 65, 69, 89). Bazı maddelerin (çevresel kirlilik ajanları (42), toksik moleküller, vb.) çift sarmal DNA ile interkalasyon (düzlemsel yapıdaki kimyasal maddenin DNA çift sarmalı arasına girerek yerleşmesi), baza seçimli bağlanma vb. yollarla etkileşimi

13 3 sonucu bir ürünün meydana gelmesi, bu ürüne duyarlı elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin tasarımını getirmiştir (39). Bir kimyasalın ya da metabolitin DNA ile etkileşimi sonrasında DNA da oluşabilecek yan ürünlerin (adduct) kısa zamanda tespiti kanser araştırmalarında çok önemlidir (3, 23, 24, 44). DNA madde etkileşimi sonucunda, çalışmanın özelliklerine bağlı olarak DNA sinyalinde artma veya azalma ya da madde sinyalinde olan değişimler elektrokimyasal yöntemlerle tespit edilebilmektedir. Bu tür tayinlerde; DNA modifiye edilmiş camsı karbon elektrotlar (GCE), karbon pastası elektrotlar (CPE), kalem grafit elektrotlar (PGE), perde baskılı karbon elektrotlar (SCPE), altın perde baskılı karbon elektrotlar (Au-SCPE), altın elektrotlar (AuE) ve asılı civa damla elektrotları (HMDE) kullanılmaktadır. İncelenen maddelerin çok düşük miktarlardaki (mikromolar hatta nanomolar) konsatrasyonlarının dahi, kısa bir biriktirme aşaması sonrası ölçümlerini mümkün kılmaktadır (10, 20, 56, 65, 67, 75, 115, 116, 121). Son yıllarda indikatör kullanılmadan elektrokimyasal DNA biyosensörleri kullanılarak, DNA bazlarından en elektroaktifleri olan Guanin ve Adeninin yükseltgenme sinyallerinden faydalanılarak hibridizasyon tayinlerinde çok büyük gelişmeler kaydedilmiştir. Çeşitli kalıtsal hastalıkların tanısında hiçbir indikatör kullanılmadan DNA hibridizasyon tayini yöntemi ile çalışmalar yapılmaktadır. Bu yöntem J.Wang, E.Palacek, M.Mascini ve arkadaşları tarafından litaratüre geçirilmiştir (45, 61, 73, 78, 92, 99, 100, 107, 110). Günümüzda kan, serum, doku, vücut sıvıları gibi biyolojik materyallerde mutasyon gibi kalıtsal bir olayı simgeleyen DNA dizisinin saptanması ve bu örneklerden hastalık tayinlerinin yapılabiliyor olması tıbbi analizler ve uygulamalarında oldukça önemlidir.

14 4 Nükleik asit tanıma yöntemlerine dayanan elektrokimyasal DNA biyosensörleri, klasik analiz yöntemlerine yeni bir alternatif olup; genetik ve bulaşıcı hastalıkların hızlı, basit ve ucuz yoldan teşhis edilebilmesini, DNA hasar ve etkileşimlerinin saptanabilmesini mümkün kılar. Bazı bulaşıcı ve kalıtımsal hastalıklara neden olan DNA dizilerinin tanımlanması, genomik DNA çiplerinin tasarımı, nükleik asit hibridizasyonuna dayanmaktadır (4, 31, 63). Elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin tasarlanmasındaki ana amaç DNA daki hibridizasyonun tayin edilmesidir (44). Diziye özgün ve seçimli olarak tayin yapabilen DNA biyosensörleri, bir DNA probu içeren kısım ve tanıma olayını ölçülebilir bir sinyale dönüştüren çevirim sisteminden oluşmaktadır (61, 82). Çalışmalarımızda, Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya Anabilim Dalı Araştırma Görevlileri tarafından sentezlenen maddelerin DNA ile etkileşiminin elektrokimyasal biyosensörle tayininde; diferansiyel puls voltametri (DPV) tekniği, elektrot olarak da karbon pastası elektrodu ve kalem grafit elektrot (PGE) kullanıldı. DNA ilaç etkileşimlerinde, etkileşimler çözelti fazında ve elektrot yüzeyinde (DNA modifiye edilmiş elektrot yüzeyinde veya ilaç modifiye edilmiş elektrot yüzeyinde) gerçekleştirildi. Çalışmalarımızda maddenin dsdna ve ssdna ile etkileşim öncesi ve sonrasında, hem DNA daki elektroaktif bazlardan olan guaninin yükseltgenme pik akımındaki değişim hem de maddenin kendine özgü pik akımındaki değişim incelendi. Bu etkileşim sonucunda elektroaktif baza ait pik akımında ve maddenin kendi pik akımında azalma saptandı. Çalışmamız sırasında; kullanılan madde ile DNA nın etkileşme süresi, madde ve DNA konsantrasyonundaki değişimin elektrokimyasal yanıta olan etkisi ve tekrarlanabilirlik gibi deneysel parametreler incelendi. Kalem grafit elektrot

15 5 kullanarak gerçekleştirdiğimiz çalışmanın getirdiği en önemli yarar; PGE nin tek kullanımlık olmasından ötürü tekrarlanabilir sonuçlar alınması oldu. Sonuç olarak, çalışmamızda tasarımını yaptığımız DNA madde etkileşmesine dayalı tek kullanımlık elektrokimyasal biyosensörle maddelerin DNA ile etkileşmesi ve meydana gelen değişiklikler saptanmıştır. Bu çalışmalarımızın amacında; gelecekte yeni antikanser ilaç hedefleme çalışmalarının temelini oluşturmak ve DNA biyoçip teknolojisini oluşturacak olan elektrokimyasal genosensörlerin bir öncüsünü geliştirmiş olmak vardır.

16 6 GENEL BİLGİLER 1. ELEKTROKİMYA Maddeninin, elektrik enerjisi ile etkileşmesi sonucu ortaya çıkan kimyasal ve fiziksel değişiklikler ile kimyasal enerjinin elektrik enerjisine çevrilmesini inceleyen bilim dalı elektrokimya olarak adlandırılır. Elektrokimyasal tepkimeler, yükseltgenme ve indirgenme tepkimeleri olup, elektron paylaşımına veya transferine dayalı kimyasal olaylar sonucu meydana gelirler. Elektrokimyasal tepkimeler; elektrokimyasal hücre adı verilen bir hücrede yürütülür. Elektrokimyasal tepkimenin oluşabilmesi için; analizi yapılacak maddeyi içeren çözelti (elektriksel iletkenliği sağlamak amacıyla çeşitli tampon çözeltiler kullanılır), maddenin kimyasal dönüşüme uğradığı elektrot sistemi (genellikle üçlü elektrot sistemi) ve bu elektrotları birbirine bağlayan bir çevirim sistemi (transducer) gereklidir. Şekil 1: Elektrokimyasal bir hücre şeması ve üçlü elektrot sistemi

17 7 Şekil 2: Analitik Kimya Anabilimdalı çalışma labarotuvarımızda kullandığımız elektrokimyasal bir hücre ve üçlü elektrot sistemi Elektroanalitik kimya, analiz edilecek çözelti bir elektrokimyasal hücrenin parçası olduğu zaman çözeltinin elektrokimyasal özelliklerine uygun bir grup kantitatif analiz yöntemini kapsar. Elektroanalitik yöntemler ile çok düşük tayin sınırlarına ulaşılıp, elektrokimyasal yöntemlerin uygulanabildiği sistemler hakkında, kimyasal reaksiyonların hız ve denge sabitleri, adsorbsiyon, kütle aktarım hızı vb. birçok bilgi elde edilebilmektedir. Elektroanalitik yöntemlerin; diğer analiz yöntemlerine göre bazı üstünlükleri bulunmaktadır. Bu avantajlardan birincisi, elektrokimyasal ölçümlerin çoğu kez bir

18 8 elementin, molekülün veya tepkime sonunda oluşan ürünün özel bir yükseltgenme basamağı için spesifik olması; diğer önemli avantajı ise, kullanılan cihazların diğer yöntemlerde kullanılan cihazlara göre nispeten ucuz olmasıdır (2,13) Elektrokimyasal Olaylarda Kütle Aktarım Yolları: Bir elektrot, sadece elektrot yüzeyindeki çok ince bir çözelti tabakasında etkin olabilmektedir. Ancak faradayik bir akım, ana çözeltiden elektrot yüzeyine reaksiyona giren türlerin devamlı aktarımını gerektirir. Bir elektrokimyasal hücrenin çalışması sırasında iyonlar veya moleküller ana çözeltiden yüzey tabakaya (yani elektrot yüzeyine) veya yüzey tabakadan ana çözeltiye konveksiyon (karıştırma), elektriksel göç ve difüzyon olmak üzere üç yöntem ile aktarılırlar (28). 1-Konveksiyon: Sıcaklık veya yoğunluk farkıyla, elektrot yüzeyinden geçen çözeltinin akışı gibi doğal olarak meydana gelen bir kütle aktarım yolu olmakla beraber aynı zamanda karıştırma ve çalkalama sonucunda ortaya çıkan mekanik hareket ile de meydana gelen kütle aktarımını ifade etmektedir. 2-Elektriksel Göç: İyonlarla, yüklü elektrot arasındaki elektrostatik çekimden kaynaklanan iyonların hareketidir. Yani elektriksel alanın etkisiyle meydana gelen bir aktarım yoludur. Elektriksel göç, elektriksel migrasyon olarak da adlandırılır. 3-Difüzyon: Türlerin derişim farkı nedeniyle yaptıkları harekettir. Yani elektrot yüzeyindeki sıvı film ile çözelti arasındaki derişim farkından dolayı meydana gelen bir kütle aktarımıdır.

19 Elektrokimyasal Tabakalar: Elektrokimyasal ölçüm yapılırken elektrot yüzeyi ile analit sıvısı arasında heterojen tabakalar meydana gelmektedir. Bunun nedeni elektrot, kendisine bitişik olan çözelti tabakasındaki bir türe elektron verebilir veya o tabakadan elektron alabilir. Genel olarak karıştırılan sistemlerdeki heterojen tabakaların bileşimi Şekil 3 te görülmektedir. Şekil 3: Elektrot yüzeyindeki tabakaların şematize olarak gösterilmesi. Türbülent akış tabakası: Elektrottan uzak çözelti yığınında gözlenir. Laminer akış bölgesi: Yüzeye yaklaştığında bir laminer akışa geçiş olur. Laminer akışta sıvı tabakaları elektrot yüzeyine paralel bir yönde birbirleri üzerinde kayarlar. Nernst difüzyon tabakası: Elektrot yüzeyinden δ cm uzaktaki laminer akımın hızı, sıvı ile elektrot arasındaki sürtünmeden dolayı sıfıra yaklaşır ve bunun sonucunda da elektrot çevresindeki ince, durgun bir çözelti tabakası oluşur. Genellikle bu çözelti tabakası, cm kalınlığında olmaktadır.

20 Voltametri ve Voltametrinin Esasları: Bir indikatör veya çalışma elektrodunun polarize olduğu koşullar altında, elektroda uygulanan gerilimin (potansiyelin) bir fonksiyonu olarak akımın ölçülmesine dayanan elektrokimyasal yönteme voltametri adı verilir. Uygulanan gerilimin ölçülen akım değerine karşı çizilen grafiğine de voltamogram denir. Voltametride, herhangi bir maddenin elektrokimyasal davranışını incelemek için elektroda uygulanabilecek gerilim aralığının sınırları, kullanılan çalışma elektrodu, kullanılan çözelti ve elektrolit türlerine bağlıdır. Voltametri, potansiyelin kontrol altında tutulduğu dinamik bir yöntem olup, ara yüzey yöntemleri grubunda olan elektroanalitik bir yöntemdir. Voltametri; Çekoslavak kimyacı Jaroslav Heyrovsky tarafından1920 lerin başında polorografi tekniği üzerinde yapılan çalışmalara dayanarak geliştirilmiştir. Voltametrinin önemli ve özel bir dalı olan hatta temelini oluşturan polorografinin diğer voltametrik yöntemlerden farkı çalışma elektrodu olarak damlayan civa elektrodu (DCE) kullanılmasıdır. Voltametri Analitik Kimya, İnorganik Kimya, Fizikokimya ve Biyokimya bilim dallarında yükseltgenme ve indirgenme reaksiyonlarının, elektrot yüzeyinde meydana gelen elektrot aktarım mekanizmalarının ve yüzeylerde meydana gelen adsorbsiyon olaylarının incelenmesi gibi alanlarda yaygın olarak kullanılan bir elektroanalitik yöntemdir.

21 Voltametride Kullanılan Uyarma Sinyalleri: Voltametride, bir mikroelektrot içeren elektrokimyasal hücreye değiştirilebilir bir potansiyelde uyarma sinyali uygulanır. Bu uyarma sinyalleri karakteristik akım cevaplarını oluşturur. Voltametride en çok kullanılan dört uyarma sinyalinin şematize edilmiş durumları şekil 4 te gösterilmiştir. Bunlar doğrusal taramalı, diferansiyel puls, kare dalga ve üçgen dalga uyarma sinyalleridir. Şekil 4: Voltametride kullanılan uyarma sinyalleri

22 Voltametride Kullanılan Cihazlar: 1-Çalışma elektrodu: Zamanla potansiyeli doğrusal olarak değişen ve yüzeyinde analitin yükseltgendiği veya indirgendiği mikroelektrottur. Bu elektrodun boyutları polarizasyonu artırmak için küçük tutulur. 2-Referans elektrot: Elektrokimyasal analizler sırasında potansiyeli dış ortamdan etkilenmeyen ve analiz süresince potansiyeli sabit kalan elektrottur. Genellikle referans elektrot olarak gümüş/gümüş klorür (Ag/AgCl) veya doymuş kalomel elektrot (DKE) kullanılır. Referans elektrotlar çalışılan maddelere karşı duyarsızdır. 3-Yardımcı elektrot: Sinyal kaynağından gelen elektriğin, çözeltinin içinden geçerek çalışma elektroduna aktarılmasını sağlayan yardımcı (karşıt) elektrottur. Genellikle helezon şeklinde bir platin tel veya bir civa havuzu şeklinde olan yardımcı elektrotlar, çalışma elektrodu ile bir çift oluşturur; fakat ölçülen potansiyelin tayininde rol oynamaz Voltametride Kullanılan Çalışma Elektrotları: Voltametrik reaksiyonlar, çalışma elektroduyla ara yüzey arasında meydana gelmektedir. Bu nedenle elektrot seçimi çok önemlidir. Çalışma elektrodunun yapımında kullanılan iletken malzeme, platin ya da altın gibi inert bir metal; karbon, pirolitik grafit ya da camsı karbon; kalay oksit ya da indiyum oksit gibi yarı-iletken veya bir civa filmi ile kaplanmış bir metal olabilir. Bu elektrotlar biyosensör tasarımı için çeşitli şekil ve büyüklüklerde geliştirilmektedirler. Bu tür elektrotların kullanıldığı voltametrik reaksiyonlarda, potansiyel aralığının tespiti çok önemlidir. Ancak bu potansiyel aralığı, sulu çözeltilerde sadece elektrot malzemesine bağlı olarak değil, aynı zamanda bu elektrotların

23 13 daldırıldığı çözeltinin bileşimine bağlı olarak da değişir. Pozitif potansiyel sınırları genellikle moleküler oksijen verecek şekilde, suyun yükseltgenmesi sonucunda oluşan büyük akımlarca belirlenir. Negatif potansiyel sınırları yine suyun indirgenmesi sonucunda oluşan hidrojenden kaynaklanır. Şekil 5: Kullanılan çalışma ortamına göre çalışma elektrotları için seçilen potansiyel aralıkları. Şekil 5 te de belirtildiği gibi kullanılan çalışma ortamına göre çalışma elektrotları için seçilen potansiyel aralıkları; civa elektrodu için 1 M H 2 SO 4 çalışma ortamında (- 0,8 V) ile (+0,4 V) aralığı ve 1 M KCl çalışma ortamında (- 1,6 V) ile (+0,2 V) aralığıdır. Karbon elektrodu için ise 1M HClO 4 ortamında (+0,2 V) ile (+1,8 V) aralığı ve 0,1 M KCl ortamında (-1,0 V) ile (+1,2 V) aralığıdır Sıvı Elektrotlar: Sadece civa ve gallium oda ısısında sıvı halde bulunmaktadır. Oda ısısında sıvı halde bulunmalarından dolayı bu iki elektrot sıvı elektrot ismini alır. Ancak civa analitik işlemlerde galliuma göre daha çok kullanılmaktadır.

24 14 Analitik İşlemlerde Civa Elektrodun Tercih Edilme Nedenleri; a) Düşük negatif potansiyel aralıklarında çalışılabilmesi yani negatif potansiyel sınırının çok yüksek olması, b) Kolayca oluşturulabilen yeni bir civa damlası ile yeni bir metalik yüzey oluşturulabilmesi, c) Birçok metal iyonunun civa yüzeyinde tersinir reaksiyon verebilmesi yani pek çok metal iyonunun bir civa elektrodunun yüzeyinde amalgam oluşturmak suretiyle tersinir olarak indirgenebilmesidir. Ancak civa elektrodunun bu avantajları yanında dar bir pozitif potansiyel aralığına sahip olması bu metalin anot olarak kullanılmasını sınırlamakta; toksik bir metal olması nedeniyle de kullanımının zahmetli olması gibi sakıncaları bulunmaktadır. Bu sakıncalar civa elektrodun kullanımını sınırlamaktadır. Dört Çeşit Civa Elektrodu Bulunmaktadır: 1- Disk elektrot 2- Asılı civa damla elektrot 3- Damlayan civa elektrot 4- Durgun civa damla elektrot Katı Elektrotlar: Sıvı elektrotların voltametrik analizlerde kullanımının sınırlı olması sebebiyle katı elektrotlar daha geniş bir kullanım alanına sahiptirler. Katı Elektrotların Daha Sık Kullanılma Nedenleri; Geniş bir potansiyel aralığına sahip olmaları, Çeşitli şekillerde modifiye edilebilmeleri, Kullanım alanının daha rahat olması,

25 15 Yüksek sıcaklık ve basınç aralıklarında çalışılmasına imkan vermeleridir a. Karbon Elektrotlar: Karbon elektrotlar özelikle çok ucuz olmaları ve geniş bir potansiyel aralığında çalışılmasına olanak vermesi nedeniyle elektrokimyasal analizlerde sıklıkla kullanılırlar. Ancak karbonun geniş bir yüzeye sahip olması ve bu sebeple organik bileşikler tarafından kolayca kirletilebilir olması dezavantaj oluşturmaktadır. Hidrojen, hidroksil ve karboksil grupları ile karbon yüzeyinde bağlar oluşabilmektedir. Bu fonksiyonel gruplar sayesinde karbon yüzeyine birçok madde tutturulabilir. Dört Çeşit Karbon Elektrot Bulunmaktadır: 1- Camsı karbon elektrot (GCE) 2- Perde baskılı karbon (grafit) elektrot (SCPE) 3- Karbon pastası elektrot 4- Kalem grafit elektrot a.1. Camsı Karbon Elektrot (GCE): Camsı Karbon Elektrot, fenol/formaldehit polimerlerinin veya poliakrilonitrilin 1000 o C 3000 o C arasında, basınç altında karbonizasyona uğratılması ile elde edilir. GCE yüksek yoğunluğa sahip, küçük porlar içeren amorf bir yapıdır. Birbiri içerisine geçmiş, ince, grafite benzer şeritlerden oluşmuştur.

26 16 Şekil 6: GCE nin amorf yapısı GCE, ticari olarak elektrot üretimine uygun olmamasına (kolayca kırılabilir olması ve sert olması) rağmen çok iyi mekanik ve elektriksel özelliklere sahip olması, geniş bir potansiyel aralığı olması, genellikle tekrarlanabilir yüzeyler sağlaması ve kimyasal tepkimelere girmemesi nedeniyle elektroanalitik kimyada sıkça kullanılmaktadır. Camsı karbon elektrotlar; mikrometre boyutlu grafit tozu partiküllerinin, sert ve yapıştırıcı bir madde ile inert bir malzemeden yapılmış olan elektrot gövdesi içerisine sıkıştırılması ile elde edilir. Karbon pastası elektrotlarına göre elektrokimyasal yanıt özellikleri, yüzeyin çok daha pürüzsüz ve düzgün olması nedeniyle daha iyidir. Ayrıca camsı karbon elektrodun fiziksel dayanıklılığı da

27 17 daha fazladır ve CPE de olduğu gibi metal iyonlarının negatif potansiyelde biriktirilmesine ve çeşitli polimerlerin kaplanmasına olanak sağlamaktadır a.2. Perde Baskılı Karbon (grafit) Elektrotlar (SCPE): Tek kullanımlık perde baskılı karbon elektrotlar çok yaygın şekilde kullanılmaktadır. Elektrokimya alanında çok önemli olan karbon elektrotlarının tüm çeşitlerinde yüzeylerinin düzgün bir şekilde hazırlanması oldukça önemlidir. Özellikle biyosensör teknolojisinin geleceği olan DNA mikroçip teknolojisine uygulanabilirliği açısından oldukça başarılı sonuçlar veren bu elektrotlar geleceğin elektrotları olarak gösterilmektedir a.3. Karbon Pastası Elektrodu: Grafit tozunda bulunan karbon moleküllerinin düzlemsel ve aromatik halkalar halinde dizilimleri ve birbirlerine zayıf π bağlarıyla bağlı olması nedeniyle bu tabakalar arasında hızlı bir elektron alışverişi olmaktadır. Şekil 7: Grafit tozunda bulunan karbon atomlarının dizilimi Grafit tozundaki aromatik halkaların aktif oksijen grupları muhteva etmeleri nedeniyle çeşitli foksiyonel guruplar (hidroksil, karbonil, karboksil v.b.) eklenebilir.

28 18 Bu özelliği nedeniyle karbon pastası elektroda bu fonksiyonel grupları içeren yapılar (enzim, antikor v.b.) eklenerek elektrot modifiye edilebilir. Şekil 8: Karbon pastası elektrodu Karbon pastası elektrot; toplam kütlesinin % 70 i oranında grafit ile % 30 u oranında çeşitli organik bağlayıcıların karıştırılması ile hazırlanır. Hazırlanan karışım 2-4 mm çapında teflon ya da camdan yapılmış elektrot gövdesi içerisine sıkıştırılır, elektriksel iletkenliği sağlamak için iletken bir tel gövdenin 2/3 ne kadar yerleştirilerek hazırlanır. Bağlayıcı madde olarak nujol (mineral yağ), parafin yağı, silikon yağı ve bromonaftalen kullanılmaktadır. Bağlayıcı organik sıvı oranı arttıkça, elektron transfer hızı azalmaktadır. Pasta bileşiminin de elektrot aktivitesine büyük etkisi vardır. Karbon pastası elektrodu ucuz olması, hazırlanmasının zahmetsiz oluşu, yüzey yenilenmesinin kolay olması, artık akımların az olması nedeniyle sıklıkla tercih edilmektedir. Ancak karbon pastası elektrot yeterli miktarda organik çözücü içeren çözeltilerde kullanıldığı zaman çözeltide dağılmaktadır. Bu da karbon pastası elektrodun kullanımındaki en büyük sakıncadır.

29 a.4. Kalem Grafit Elektrodu: Son yıllarda tekrarlanabilirliğinin daha iyi olması, daha düşük tayin sınırı, ucuz ve tek kullanımlık olması sebebiyle kalem grafit elektrodun kullanılmasına artan bir ilgi bulunmaktadır (53,118). Şekil 9: Kalem Grafit Elektrot b. Metal Elektrotlar: Bu elektrotlar geniş pozitif potansiyel aralığına ve yüksek elektron transfer kinetiklerine sahiptirler. En sık kullanılan metal elektrot çeşitleri platin ve altın elektrotlardır. Bakır, nikel, radyum gibi çeşitli metaller de değişik analizler için elektrot olarak kullanılabilir. Örneğin bakır ve nikel elektrotlar karbonhidratların ve aminoasitlerin tayininde kullanılmaktadırlar. Kullanılan çözeltinin ph sına bağlı olarak (-0,2 V)-(-0,5 V) aralığında çalışabilirler. Ayrıca metal elektrotlar elektrokimyasal veya kimyasal işlemlere sokularak modifiye edilebilir. Tiyol gruplarının özellikle altın ve platine ilgisi ve yüksek akım cevabı nedeniyle son yıllarda biyosensör teknolojisinde kullanımı artmıştır. Son 10 yıl içerisinde boyutları mikroelektrotlardan daha küçük olan ultramikroelektrotların ve nanoelektrotların tasarımı gerçekleştirilmiştir. Yeni

30 20 tasarlanan bu elektrotların ve karbon fiber elektrotların elektrokimyasal analizlerde kullanımı son yıllarda oldukça artmıştır Voltametride Kullanılan Referans Elektrotlar (Karşılaştırma Elektrotları) (2, 28, 35, 91, 105): Elektrokimyasal çalışmalar sırasında, daldırıldığı çözeltinin bileşiminden etkilenmeyen ve potansiyeli dış ortamdan bağımsız olan elektrotlardır. İdeal Bir Referans Elektrot Şu Özelliklere Sahip Olmalıdır: 1-Belli bir akım aralığında tersinir davranmalıdır. 2-Nernst eşitliğine uymalıdır yani zamanla potansiyeli değişmemelidir. 3-Ufak bir akıma maruz kaldıktan çok kısa bir süre sonra orijinal potansiyeline geri dönebilmelidir. 4-Potansiyelin sıcaklıkla değişim katsayısı küçük olmalıdır yani sıcaklık değişimlerinde çok az bir değişim göstermelidir. 5-Kolay hazırlanabilir olmalıdır. 6-Tekrarlanabilen bir potansiyel değerini hızlı bir şekilde okumalıdır. 7-Polarize edilemeyen bir elektrot olmalıdır a. Referans Elektrot Çeşitleri: a.1. Kalomel Referans Elektrot: Kalomel referans elektrotlar, doygun civa(i)klorür (kalomel) elektrotla temasta olan ve yaygın olarak kullanılan elektrotlardan bir tanesidir. Bu elektrodun potansiyeli, klorür iyonlarının aktifliğine bağlıdır. Hazırlanışının çok kolay olması nedeniyle analitik kimyacılar tarafından çok tercih edilen bir referans elektrottur. Kalomel referans elektrotta,

31 21 Hg 2 Cl 2 (k) + 2e - 2Hg (k) + 2Cl - e (sulu) reaksiyonu gerçekleşir. Böyle bir reaksiyonun potansiyeli ortamdaki klor iyonu konsantrasyonuna bağlıdır. Elektrot kabında çökmüş halde bol miktarda kalomel olmak şartı ile üç kalomel elektrottan söz edilebilir. Bunların verdikleri potansiyel az çok sıcaklığa bağlıdır. Bu elektrotlardan en çok kullanılanı doymuş kalomel elektrottur. Sıcaklıkla potansiyeli diğerlerine göre fazla değişmesine rağmen akım alımlarına karşı çok dayanıklıdır. Doygun kalomel elektrodun (DKE), standart hidrojen elektroda (SHE) karşı 25 0 C de potansiyeli V olarak bulunmuştur a.2. Gümüş-Gümüş Klorür Referans Elektrot: Bu elektrot elektrolitik yoldan gümüş klorür (AgCl) ile kaplanmış bir gümüş (Ag) telin belli konsantrasyondaki klorür (Cl - ) çözeltisine daldırılması ile elde edilir. Gümüş-Gümüş Klorür elektrotta; AgCl (k) + e - Ag (k) +Cl - (sulu) reaksiyonu gerçekleşir a.3. Civa-Civa(1) Sülfat Referans Elektrot: Bu elektrot, doygun kalomel elektroda benzemektedir. Elektrodun potansiyeli, sülfat iyonlarının aktifliği ile tayin edilir Voltamogramlar: Doğrusal taramalı voltamogramlar, çoğunlukla voltametrik dalga adı verilen sigmoidal şekilli (S şeklinde) eğrilerdir. Dik ve keskin bir artıştan sonra gelen sabit akıma sınır akımı veya difüzyon kontrollü akım denir. Sınır akımı i s olarak gösterilir. Bu akım, analitin yani analizlenecek maddenin kütle aktarım yoluyla elektrot yüzeyine taşınmasındaki hızıyla sınırlıdır ve sınır akımı genellikle

32 22 analitin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Sınır akımı aşağıdaki formülle ifade edilebilir: I s = k.c A Bu formülde: İ s sınır akımını C A analit konsantrasyonunu K, sınır akımı sabitini belirtir. Kantitatif doğrusal taramalı voltametri bu ilişkiye dayanır. Akımın, sınır akımın yarısına eşit olduğu potansiyele yarı dalga potansiyeli denir ve E 1/2 ile gösterilir. Sınır akımlarının hızlı bir şekilde elde edilebilmesi için çözelti veya elektrot sürekli hareket halinde olmalı ya da damlayan civa elektrodu gibi bir elektrot kullanılmalıdır. Çözelti veya mikroelektrodun sürekli hareket halinde olduğu doğrusal taramalı voltametriye hidrodinamik voltametri adı verilir. Damlayan civa elektrodunun kullanıldığı voltametriye de polarografi adı verilir. Polarografi ilk bulunan ve kullanılan voltametri tipidir. Hidrodinamik voltametriden; konveksiyonun önlenmiş olması ve elektrot olarak damlayan civa elektrot kullanılması gibi iki temel özelliği ile ayrılır. Konveksiyonun önlenmiş olması sebebiyle, sınır akımları sadece difüzyonla kontrol edilir. Polarografide yani damlayan civa elektrodu içeren bir hücrenin kullanıldığı voltametrideki akım; damlama hızına bağlı olarak periyodik iniş ve çıkışlar gösterir. Damla kapillerden kopunca akım sıfıra düşer ve yeni damlanın yüzey alanı büyümeye başladıkça akım hızla artmaya başlar. Ortalama akım, hipotetik olarak sabit bir akımdır. Ortalama akımı tayin etmek için iniş ve çıkışları süzecek

33 23 elektronik bir filtre kullanmak veya akımın zamanla değişiminin daha küçük olduğu damla süresinin sonunu ölçmek gerekir. Polarografide, hidrodinamik voltametride olduğu gibi, akımın büyüklüğü analitin elektrot yüzeyine taşınma hızı ile sınırlı olduğu zaman, sınır akımları gözlenir. Fakat polarografide tek kütle aktarım şekli difüzyonla kütle aktarımı olduğu için polarografik sınır akımlarına difüzyon akımları da denir. Destek elektrolite ait polarogramın incelenmesi ile ortamda analizlenecek madde yokken bile hücrede artık akım adı verilen küçük bir akımın oluştuğu tespit edilmiştir. Artık akımların oluşma sebepleri olarak safsızlıkların indirgenmesi ve bu safsızlıkların içinde az miktarda çözünmüş oksijen, damıtık sudan gelen ağır metal iyonları ve destek elektrolit olarak kullanılan tuzdaki safsızlıklar sayılabilir. Polarografik yöntemlerde doğruluk ve duyarlık, faradayik olmayan artık akımın büyüklüğüne bağlıdır ve doğru bir sonuç elde etmek için artık akımın etkisini giderme yoluna gidilir. Polarografide ph nın Etkisi: Bazı organik ve inorganik madde reaksiyonları aşağıdaki gibi ifade edilir: R, analitin yükseltgenmiş şekli ve RH n, indirgenmiş şeklini göstermektedir. Bu tip bileşiklerin yarı-dalga potansiyelleri denklemden de anlaşılacağı gibi önemli ölçüde ph ya bağlıdır. ph nın değişimi, reaksiyon sonucunda oluşan ürününün değişmesine bile sebep olabilir. Bu nedenle ortamda tampon çözeltiler kullanılmalıdır. Eğer tampon çözelti kullanılmazsa, elektrot yüzeyindeki çözeltinin

34 24 ph'sı büyük oranda değişebilmektedir. Bu değişimler, reaksiyonun indirgenme potansiyelini etkiler ve iyi bir görünümü olmayan yayvan eğrilerin elde edilmesine neden olur. Ayrıca, özellikle organik maddelerle yapılan polarografide tekrarlanabilir yarı-dalga potansiyelleri ve difüzyon akımları elde etmek için tampon çözelti kullanmak çok önemlidir. Bir Elektrot Sistemine Potansiyel Uygulandığında Oluşan Akımlar: 1-Kapasitif akım 2-Faradayik akım 1-Kapasitif akım (i c ): Bir elektrokimyasal analiz sırasında elektrodun bir elektrolit çözeltisine daldırılması ve negatif yükle yüklenmesiyle, çözeltideki pozitif yüklü iyonlar elektroda doğru çekilir. Bu sayede ara yüzeyde bir gerilim farkı oluşur. Ters işaretli yüklerin ara yüzeyin iki tarafında birikmesi ile bu bölgede bir elektriksel çift tabaka oluşur. Oluşan bu çift tabaka, bir kapasitör gibi davranır. Bu kapasitörü yüklemek için ortamda yükseltgenecek veya indirgenecek madde olmasa dahi bir akım oluşur. Oluşan bu akıma kapasitif akım denir. Kapasitif akım reaksiyona bağlı değildir, sadece sistemden kaynaklanır. Kapasitif akım ne kadar düşük olursa, o kadar doğru ölçüm yapılır. 2-Faradayik akım (i f ): Bir elektrokimyasal analiz sırasında elektrokimyasal hücreye dışarıdan bir gerilim uygulanır. Bu gerilim sonucu elektrotlardan herhangi birinde elektroaktif maddeye ait yükseltgenme indirgenme tepkimeleri oluşur. Bu tepkimeler sonucu oluşan ürün miktarı, kullanılan elektrik miktarıyla doğru orantılıdır. Q = I.t

35 25 Bir devreden t saniyede I amper akım geçirildiğinde kulon cinsinden harcanan elektrik miktarı Q dur. Analizi yapılacak tek bir türe ait maddenin tümünün elektrolizlenebilmesi için gereken elektrik miktarı; Q = n.f.c.v eşitliği ile bulunur. Bu eşitlikte: n: molekül ya da iyon başına tüketilen elektron sayısını F: faraday sabitini (96485 kulon / mol elektron) C: analitin konsantrasyonunu (M) V: hacmi (L) Q: harcanan elektrik miktarını (kulon) belirtir. Bu eşitliğe faraday yasası adı verilir. Analizi yapılacak maddenin kimyasal dönüşümü için harcanan ve yalnızca elektron alış verişine dayanan akıma faradayik akım denir. Kısacası faradayik akım reaksiyondan kaynaklanan yani analiz edilecek maddeden kaynaklanan akımdır. I = I f + I c olduğundan, i c azalırsa duyarlılık artar. Yani bir reaksiyonda meydana gelen akım, faradayik akım ve kapasitif akımın birleşmesiyle oluşmaktadır ve kapasitif akım yani reaksiyona dayalı olmayan akım ne kadar az olursa duyarlılık artar, daha iyi bir sonuç elde edilir. Genellikle 10-3 M ve üstünde; i c < i f dir ve çalışılabilir M da kısmen iyi sonuç alınır M ve altında; i c >> i f olduğu için çalışılamaz.

36 Voltametrik Akımlar: İncelenen bir elektroliz işleminde akım, analitin difüzyon tabakasının dış tarafından elektrot yüzeyine taşınma hızı ile kontrol edilir ve bu hız C A / X ile ifade edilir. Burada X, cm cinsinden elektrottan olan uzaklığı göstermektedir. Düzlemsel bir elektrot için akım I = n.f.d A. ( C A / X ) şeklindedir. Burada: I = t zamanındaki akımı, n= elektrokimyasal tepkimeye giren elektron sayısını, F =Faraday sabitini( kulon / mol elektron), A = elektrot yüzey alanını (cm 2 ) D A = analitin difüzyon katsayısını (cm 2 / sn), C A = analitin konsantrasyonunu (mol /L) göstermektedir. Oluşan difüzyon akımının zamana karşı fonksiyonu cottrell denklemini verir. i = nfacd 1 / 2 π t 1 / 2 1 / 2 Cottrell denklemi analiz esnasında gerçekleşen tepkimelerin difüzyon kontrollü olup olmadığı hakkında bilgi verir Elektrokimyasal Bir Olayda Faradayik İşlemler ve Nernst Eşitliği: Bir elektrokimyasal hücrede çözelti ve elektrot arasındaki yüzeyden akımın iletimi sırasında, elektrotlardan birinde yükseltgenme reaksiyonları olurken diğerinde indirgenme reaksiyonu meydana gelir.

37 27 O + ne - R Bu reaksiyonlarda O ve R, sırasıyla, redoks çiftinin, yükseltgenmiş (oksitlenmiş) ve indirgenmiş (redüklenmiş) şeklini ifade etmektedir. Termodinamik kurallarla kontrol edilen sistemlerde, elektrot potansiyeli, elektroaktif türün elektrot yüzeyindeki derişiminin [C o (0,t) ve C R (0,t)], Nernst denklemine göre saptanmasında kullanılabilir. E = E 0 + 2,3 RT nf log C C 0 R E 0 = Redoks tepkimesi için standart potansiyeli R = İdeal gaz sabitini (8,314 JK -1 mol -1 ) T = Sıcaklığı ( 0 K) n = Reaksiyonda transfer edilen elektron sayısını F = Faraday sabitini (96497 culon / mol elektron) C o ve C r = Tepkimedeki türlerin konsantrasyonunu (mol / L) ifade eder Uyarma Sinyallerine Göre Voltametrik Teknikler: Dönüşümlü Voltametri (CV) : Dönüşümlü voltametri (CV), sürekli değişen potansiyel değerlerine karşı belirli bir potansiyel aralığında ve karıştırılmayan ortamda mikroelektrodun akım cevabı olarak tanımlanabilir. Yani dönüşümlü voltametride gerilimin bir fonksiyonu olarak akım ölçülür. Dönüşümlü voltametride de doğru akımdaki gibi kapasitif akımın en düşük olduğu bölgede çalışılır. Duyarlılık 10-5 M ile sınırlıdır. Çalışılan potansiyel aralığı, yapılan deneyde kullanılan bir veya daha fazla analitin (analizlenecek maddenin) yükseltgenmesinin veya indirgenmesinin meydana

38 28 geldiği potansiyel aralığıdır. Bu potansiyel aralığına çevirici potansiyeller de denir. Şekil 10: Dönüşümlü voltametride kullanılan uyarılma sinyali Şekil 10 da gösterildiği gibi analitin yükseltgenmesi ve indirgenmesi voltamogramda gözlenebilmektedir. Önce potansiyel doğrusal olarak değiştirilir, daha sonra tarama yönü tersine çevrilir ve orjinal değerine geri döner (üçgen dalga şekilli potansiyel). Yani ilk olarak potansiyel bir maksimum değere kadar artar ve daha sonra başlangıç değerine yine doğrusal olarak geri döner. Başlangıç taramasının yönü kullanılan maddenin bileşimine bağlı olarak negatif ya da pozitif olabilir. Dönüşümlü voltamogramların şekli ve yapısında seçilen potansiyel aralığının yanı sıra seçilen tarama hızının, kaç defa tarama yapıldığının da etkisi vardır.

39 29 Şekil 11: a) Dönüşümlü voltametride elektroda uygulanan gerilimin zamana karşıgrafiği b) Dönüşümlü voltametride elde edilen akım-gerilim eğrisi. Kullanılan çözeltiye potansiyel uygulandığında, elektrot yüzeyi uygulanan potansiyele göre pozitif ya da negatif bir karakter gösterir ve çevresindeki çözeltiden elektron alır ya da çözeltiye elektron verir bu da ölçülebilir bir akım oluşmasına neden olur. Çalışma ortamında karıştırma yapılmadığı için elektron transferi elektrot yüzeyi ve çevresinde olur, bu nedenle elektrot çevresindeki madde miktarı zamanla azalır. Sonuç olarak oluşan akım başlangıçta bir pik yapar ve elektrot çevresindeki madde azalmaya başladığında akım piki de azalmaya başlar ve en sonunda başlangıç noktasına geri döner. Bu piklere indirgenme ve yükseltgenme pikleri denir. Bir dönüşümlü voltamogramın en önemli parametreleri; anodik pik potansiyeli E pa, katodik pik potansiyeli E pc, anodik pik akımı İ pa ve katodik pik akımı İ pc dır. Tersinir bir reaksiyon için anodik ve katodik pik akımları mutlak değer olarak yaklaşık olarak eşittir. Pik potansiyelleri farkı 0,0592/n dir. n yarı reaksiyonda yer alan elektron sayısını ifade etmektedir. İ p = pik akımı

40 30 n = transfer edilen elektron sayısı A = elektrot yüzey alanı (cm 2 ) D = türlere ait difüzyon katsayısı (cm 2 / sn) C = türlerin çözelti içerisindeki konsatrasyonları (mm) V = tarama hızı (V / sn) dır. Bir dönüşümlü voltamogramdaki indirgenme ve yükseltgenme arasındaki pik gerilimleri farkı, E p ile ifade edilir. E p =(57/n).mV E p bu değere ne kadar yakın ise, dönüşümlü (reversible); ne kadar uzaksa dönüşümsüz (irreversible) olarak adlandırılır Şekil 12: Klasik dönüşümlü bir voltamogramın önemli parametreleri; anodik pik potansiyeli E pa, katodik pik potansiyeli E pc, anodik pik akımı İ pa ve katodik pik akımı İ pc dir.

41 31 Dönüşümlü voltametri çeşitli şartlar altında elektrokimyasal işlemler hakkında kantitatif bilgiler sağlayan, temel ve teşhise dayalı bir çalışma yöntemidir. Dönüşümlü voltametri miktar tayinine dayalı bir yöntem değildir yani rutin kantitatif analizlerde kullanılmamaktadır. Ancak organik ve metal organik sistemlerde yükseltgenme ve indirgenme işlemlerinin mekanizma ve hız çalışmaları için oldukça önemli bir yöntemdir. Analizlenecek maddenin hangi potansiyelde nasıl davrandığı hakkında bilgi verdiği için, o maddenin hangi potansiyelde optimum cevabı vereceğini gösterir. Bu gibi sebeplerden ötürü, dönüşümlü voltametri yöntemi elektrokimyasal olarak belirtilebilen bir sistemin araştırılması için seçilen ilk yöntemdir Diferansiyel Puls Voltametrisi: Çok duyarlı bir yöntem olan diferansiyel puls voltametrisinde uyarma sinyalleri, doğrusal bir tarama esnasında periyodik pulsların oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Tayin sınırı(yani gözlenebilme sınırı) M arasındadır. Bu sınırlar klasik polarografinin gözlenebilme sınırlarından kat daha düşüktür. Diferansiyel puls polarografisi yöntemi ile yarı dalga potansiyelleri 0,04 0,05 V kadar farklı olan maddeler için bile pik maksimumları elde edilebilmektedir. Fakat normal ve klasik puls polarografilerinde yarı dalga potansiyelleri farkı en az 0,2 V olmalıdır. Diferansiyel puls voltametrisinde, doğrusal bir tarama sırasında çalışma elektroduna periyodik darbeler (örneğin 10 mv luk veya 30 mv luk) uygulanır. Darbe (puls) uygulamadan önce ve sonra olmak üzere iki kez akım ölçülür. Puls başına elde edilen akımdaki fark, doğrusal olarak artan potansiyelin fonksiyonu

42 32 olarak kaydedilir. Elde edilen diferansiyel puls voltamogramı yüksekliği, analizi yapılan maddelerin derişimi ile orantılı akım piklerinden oluşmaktadır. Şekil 13: Diferansiyel puls polarografisi için uyarma sinyalleri: a)analog cihazlarda diferansiyel puls voltametrisi için kullanılan uyarma sinyali b) Dijital cihazlarda diferansiyel puls voltametrisi için kullanılan uyarma sinyali c) Diferansiyel puls voltametrisinde elde edilen bir voltamogram. Yukarıdaki 13-a ve 13-b şekillerinde de görüldüğü gibi iki tane akım ölçümü yapılmaktadır. İlki doğru akım pulsundan önce diğeri de doğru akım pulsundan

43 33 sonra yapılmaktadır. Puls başına akımdaki fark doğrusal olarak artan potansiyelin fonksiyonu olarak kaydedilmektedir. DPV nin yüksek duyarlılığa sahip bir teknik olmasının iki temel etmeni bulunmaktadır. Birinci etmen faradayik akımın yüksek olması, ikinci etmen ise faradayik olmayan yükleme akımının düşük değerde olmasıdır. Diferansiyel puls voltametrisi özellikle ağır metal iyonlarının eser derişimlerinin tayini olmak üzere birçok alanda kullanılmaktadır Kare Dalga Voltametrisi: Kare Dalga Voltametrisi, damlayan civa elektrodu ve kromotografik dedektörler kullanılarak yapılabilen, son derece hızlı ve duyarlı bir puls polarografi tekniğidir. Tayin sınırları 10-7 M ile 10-8 M arasındadır. Voltamogramın tamamı 10 ms den daha az bir sürede elde edilir. Ölçümün son derece hızlı yapılmasından dolayı; analizin kesinliğini artırmak birkaç voltametrik taramanın ortalamasının alınması ile sağlanabilir. Damlayan civa elektrodu ile yapılan taramada ölçüm; damla ömrünün son birkaç saniyesi içinde gerçekleşir. Yani ölçüm yükleme akımı hemen hemen sabitken yapılır. Elde edilen akımlar arasındaki fark ( i), birinci gerilimindeki akımdan, ikinci gerilimindeki akım değeri çıkarılarak bulunur. Tersinir bir indirgenme reaksiyonunda bir pulsun boyutu, ileri tarama sırasında oluşan ürünün geri tarama sırasında yükseltgenmesini sağlamaya yetecek kadar büyüktür. İleri puls bir katodik akımını (i 1 ), geri puls da bir anodik akımını (i 2 ) oluşturur. Genellikle voltamogramı elde etmek için elde edilen akımlar arası fark grafiğe geçirilir. Akımlar arası bu fark konsantrasyonla doğru orantılıdır.

44 34 Şekil 14: Bir kare-dalga voltametrisinde uyarma sinyalinin oluşumu (a) daki uyarma sinyali (b) deki puls taraması ile (c) deki kare-dalga uyarma sinyalini elde edecek şekilde toplanıyor.

45 35 2. BİYOSENSÖRLER Biyosensörler, biyolojik tepkimelerde hedef analitlerin analizi için kullanılan, biyokimyasal ve elektriksel olmak üzere biribiri içine geçmiş iki çeviriciden oluşan küçük algılayıcı cihazlardır. Aslında biyosensör sistemleri üç temel bileşenden oluşmaktadır. Bunlar; 1-selektif (seçici) tanıma mekanizmasına sahip biyomolekül (biyoajan), 2- biyomolekülün incelenen maddeyle etkileşmesi sonucu oluşan fizikokimyasal sinyalleri, elektronik sinyallere dönüştüren çevirici bölüm (elektrokimyasal çevirici) ve 3- elektronik kısımdır. Biyosensörlerdeki biyokimyasal kısım analizlenecek maddeyle etkileşerek onu seçici olarak tanır. Biyosensörlerdeki ikinci kısım olan elektrokimyasal çevirici; tanıma olayını okunabilir (ölçülebilir) bir sayısal değere çevirir. Yani elektrokimyasal kısım; biyoajan-analit etkileşmesi sonucu gerçekleşen fizikokimyasal sinyali elektrik sinyaline dönüştürerek, bu sinyalin daha sonraları güçlenerek okunabilir ve kaydedilebilir bir şekle girmesine öncülük eder (22, 92)..

46 36 Şekil 15: Biyosensörün yapısı 2.1. İdeal Bir Biyosensörde Olması Gereken Özellikler (41): a-seçicilik: Biyoaktif bileşenin seçici olması, girişim yapabilecek türleri içeren karmaşık içerikli ölçüm ortamlarında bile ön işlem yapmaksızın analiz yapılmasını sağlar. Eğer bir biyosensörde yeterli derecede seçicilik mevcut değilse, bunu giderecek ek işlemlerin yapılması gereklidir. Bu yüzden ideal bir biyosensörün sahip olması gereken en önemli özelliklerden biri seçici olmasıdır. b-kullanım ömrü: Biyosensörün kullanım ömrünü kısıtlayan en önemli faktör, biyolojik çeviricinin aktivitesindeki azalmadır. Biyoaktif bileşenin kararlı olması, çok sayıda analize imkan vereceğinden, biyosensörün ekonomik olmasına zemin hazırlar. Biyosensörün kullanım ömrü; biyosensörün kalibrasyon sıklığı, stabilite, tekrarlanabilirlik gibi diğer parametrelerden de etkilenmektedir. c-tekrarlanabilirlik: İdeal bir biyosensör için elektrodun aynı koşullar altında arka arkaya yapılan ölçümlerde birbirine çok yakın hatta hemen hemen aynı sonuçları vermesi istenir. Pratikte bu durumun pek mümkün olmadığı göz

47 37 önünde bulundurularak, yapılan çalışmalarda tekrarlanabilirlik parametresi mutlaka incelenmelidir. Tekrarlanabilirlik ne kadar iyi olursa, biyosensörün uygulamalarının o kadar iyi olduğu ifade edilebilir. d-kalibrasyon Gereksinmesi: İdeal bir biyosensörün hiç kalibrasyona gerek duymaması veya çok az kalibrasyona ihtiyaç duyması istenir. Ancak kalibrasyon gerekliliği pratikte, teorikte planlandığı gibi gerçekleştirilememiştir. Biyosensörler kullanım ömürleri boyunca sıklıkla kalibre edilmelidirler. e-yüksek Duyarlılık: Biyosensöre immobilize edilmiş biyolojik materyalin belirli maddelere karşı yüksek duyarlılık göstermesi, ideal biyosensörün taşıması gereken özelliklerdendir. f-yeterli Düzeyde Tayin Sınırı: Tasarlanan bir biyosensörün tayin sınırının belirli bir konsantrasyon değerinin altında olması gerekmektedir. Belirtilen bu sınır; elektrot yüzeyinin büyüklüğü, biyolojik materyalin tayin edilecek materyale afinitesi (ilgisi), immobilize edilen madde miktarı gibi faktörlerden etkilenir. g-stabilite: Elektrot stabilitesinin (kararlılığının) yüksek olması ideal bir biyosensörde mutlaka olması gereken bir özelliktir. Elektrodun stabilitesi, kullanılan biyolojik materyalin fiziksel dayanıklılığına bağlı olmakla beraber; ph, ısı, nem, ortam, oksijen konsantrasyonu gibi faktörlerden de etkilenmektedir. h-geniş Ölçüm Aralığı: Biyosensör uygulamalarında ölçüm aralığı olarak adlandırılan bölge biyosensörlerden alınan akım-konsatrasyon eğrilerinin lineer olduğu konsatrasyon aralığıdır ve bu aralığın geniş olması istenir. ı-hızlı Cevap Zamanı: Bir biyosensörün cevap zamanı elde edilen akımzaman eğrilerinden anlaşılabilir. Örneğin elde edilen eğride basamakların şekli yayvan ve genişse cevap zamanı uzun (yavaş), tersi söz konusu ise cevap zamanı kısa (hızlı) olarak değerlendirilir.

48 38 i-hızlı Geriye Dönme Zamanı: Geriye dönme zamanı ilk örnekten nekadar süre sonra ikinci örneğin ölçülebileceğini belirler. Yani ilk örneğin ilavesinden sonra sabit akım değeri kısa sürede gözlenebiliyorsa ikinci örnek aynı süre sonra ilave edilebilecektir. j-basitlik ve Ucuzluk: Basit ve ucuz, kullanımı rahat olan biyosensörler ideal biyosensörlerdir. İlk tasarlanan biyosensörlerdeki karmaşık ve pahalı olan yapılar teknolojinin de ilerlemesiyle basitleştirilmiş ve maliyetleri mümkün olduğunca azaltılmıştır. k-küçültülebilirlik ve Sterilize Edilebilirlik: Elektrotların sterilize edilebilmesi ve boyutlarının küçültülebilmesi biyosensör tasarımında oldukça önemlidir. Ancak biyosensör yapısına giren biyolojik materyalin fiziksel dayanıklılığı, sterilizasyonu kısıtlamaktadır Biyosensör Çeşitleri: Biosensörler elektrokimyasal özelliklerine dayanarak; potansiyometrik, amperometrik ve kondüktometrik olarak sınıflandırılabilir. Potansiyometrik Biyosensörler: Çalışma elektrodundaki potansiyelin, referans elektroda göre ölçümüne dayanır. Sisteme net akım geçişi olmadan, elektrot yüzeyine seçici bağlanmanın oluşturduğu yük birikimini izler. Amperometrik Biyosensörler: Biyokimyasal reaksiyonlar sonucu oluşan ürünler çalışma elektrodunda indirgenmesineye veya yükseltgenmeye uğrar. Amperometrik biyosensörlerin çalışma esasını bu reaksiyonlar esnasında oluşan akımın ölçülmesi oluşturur. Bu yöntemde oluşan akım miktarı, moleküllerin elektrot yüzeyine difüzyon hızına dolayısıyla çözelti içindeki derişimlerine bağlıdır.

49 39 Kondüktometrik Biyosensörler: Enzim reaksiyonu sonucunda ortamdaki iyonlarına ayrılabilen türlerin konsatrasyonunda net değişiklikler meydana gelir. Kondüktometrik biyosensörler, biyolojik bileşimin sonucu olarak, metal elektrot çifti arasındaki iletkenlik değişimini ölçer Biyosensör Tasarımında Kullanılan Moleküller ve Yapıları: Nükleik Asitler ve DNA (25, 26, 93): Nükleik asitlerin temel yapısını; belirli tür ve sayıdaki nükleotidin belirli bir diziliş sırasına göre 3-5 fosfodiester bağları ile birbirlerine bağlanarak oluşturdukları polinükleotid zincirler meydana getirir. Bir nükleik asit olan DNA nın temel yapısını ise; çok sayıda deoksiribonükleotid molekülünün, birbirine 3-5 fosfodiester bağı ile kovalent olarak bağlanması sonucu ortaya çıkan polinükleotid zincirler meydana getirir. Fosfodiester bağı ardışık nükleotid şekerlerinin 5 - hidroksil grubunun diğerinin 3 -hidroksil grubuna fosfat köprüsü aracılığı ile bağlanması ile olur. DNA zincirinin ana çatısını bu deoksiriboz fosfat iskeleti oluşturur. Bu iskelet boyunca yerleştirilmiş olan baz dizileri geleneksel olarak zincirin 5 ucundan 3 ucuna doğru yazılır. Yani doğrusal dizi genelde 5 den 3 yönüne doğru ve sıradaki nükleotid bazının simgesi ile okunmaktadır. Örnek olarak CTGA; 5 den 3 yönüne doğru sitozin (C), timin (T), guanin (G), adenin (A) bazları şeklindedir DNA veya RNA da nükleotidler arasında bulunan fosfodiester bağları kimyasal hidroliz ya da enzimatik yolla açılabilir. Hidroliz yapan enzimlere nükleaz denir. Nükleik asit zincirinin iç kısımlarındaki nükleotidleri hidroliz ederek parçalayan enzimlere endonükleaz, iki ucundan parçalayanlara ise ekzonükleaz denilmektedir.

50 40 DNA(deoksiribonükleik asit) moleküllerine ait X ışınları difraksiyon verileri; DNA molekülündeki adenin ve timin bazlarının miktarları ile guanin ve sitozin bazlarının miktarlarının aynı olduğunu göstermiştir. Bu sonuç; Chargaff kuralı olarak adlandırılmış ve A/T = 1 ve G/C = 1 olarak litaratürlere geçmiştir. Chargaff kuralından yola çıkarak Watson, Crick ve Wilkins 1950 yıllarında DNA yapısı için çift zincirli heliks şeklindeki modeli önermişlerdir. Bu modele göre; DNA molekülünün heliks (sarmal) yapıdaki çift zinciri, pürin ve pirimidin bazları arasında yer alan hidrojen bağları tarafından birarada tutulmaktadır. Çift zincirli helikste, bazlar (adenin, guanin, timin ve sitozin) heliksin iç kısmında, fosfat ve şeker omurgası (deoksiriboz) heliksin dış kısmında yer almaktadır. Bunun için bazların bulunduğu heliksin iç kısmı hidrofobik (suyu sevmeyen), fosfat ve şekerin bulunduğu heliksin dış kısmı ise hidrofilik (suyu seven) özelliktedir. Pürin ve pirimidin nükleotidleri arasındaki eşleşmeler A (adenin) karşısında T (timin); G (guanin) karşısında C (sitozin) bulunduğu için son derece spesifiktir. DNA yapısında yer alan bir polinükleotid zinciri daima ikinci zincirin tamamlayıcısı olduğu için; bir zincirdeki baz dizisi verildiğinde ikinci zincirdeki baz dizisini bulmak oldukça kolaydır. DNA molekülündeki pürin ve pirimidin bazları arasında hidrojen bağları bulunmaktadır. Adenin ve timin bazları iki hidrojen bağı ile guanin ve sitozin bazlarıda üç hidrojen bağı ile birbirlerine bağlanmaktadırlar. Bu bazlar şekerlere (deoksiriboz) glikozidik bağlarla, deoksiriboz ve fosfat grupları ise ester bağlarıyla bağlanmaktadırlar. Tüm bu bağlar, meydana gelen heliksin yapısının düzgün olmasını sağlar. Baz, şeker ve fosfattan oluşan üçlü kombinasyon nükleotid adını alır. Nükleotidler taşıdıkları baza göre isimlendirilirler.

51 41 Şekil 16: DNA çift sarmal yapısını oluşturan baz çiftleri arasındaki hidrojen bağları DNA molekülü kendini oluşturan nükleotid sayısına göre büyüklüğü farklılık gösteren, uzun zincir şeklindeki yapılardır. İnsanda bu zincirin uzunluğu yaklaşık iki metredir. Nükleotidler, birbirine fosfat bağlarıyla bağlanarak, şeker ve fosfat kısımlarının birbirini izlediği bir omurgaya sahip polinükleotid zincirlerini oluşturmaktadır. Fosfodiester bağ ve kovalent ester bağları olarak bilinen bu bağlar çok kuvvetlidir. Çok kuvvetli olan bu bağlar DNA molekülünün tek zincirli yapı halindeyken bile kararlı ve dayanıklı olmasını sağlamaktadırlar ve hafif değişikliklerden etkilenmezler. Ancak DNA nın yapısında bulunan hidrojen bağları zayıf bağlar olduğu için DNA nın içinde bulunduğu ortamın ph sı değiştirilirse ya da ortamın ısısı artırılırsa bazlar arasındaki hidrojen bağları etkilenerek çift sarmal yapı açılabilir. Heliks yapısının yarısının açıldığı ısıya DNA nın erime derecesi (T m ), DNA zincirinin tamamen açılarak çift heliks yapısının bozulmasına ise denatürasyon denir. G ve C arasında üç, A ve T arasında iki hidrojen bağı bulunduğundan yüksek konsantrasyonda G ve C taşıyan DNA, yüksek konsantrasyonda A ve T bazlarını içeren DNA ya göre daha yüksek sıcaklıklarda

52 42 denatüre olur. Ilımlı koşularda birbirinden ayrılan DNA zincirlerinin koşullar eskiye döndüğünde tekrar eski haline dönüşmesine renatürasyon adı verilir. Şekil 17: DNA çift sarmal yapısı

53 43 Şekil 18: DNA yapısındaki fonksiyonel grupların kimyasal yapıları Çift sarmal şeklindeki molekülün bir zinciri 5 den 3 yönüne doğru diğeri ise 3 den 5 yönüne doğru olduğu için zincirler ters yönde paraleldir. DNA nın başlıca üç değişik şekli vardır. A, B ve Z olarak adlandırılan bu türlerin çift sarmal yapılarında farklılıklar mevcuttur. DNA heliksinin en sık rastlanan formu klasik B şeklidir. DNA çift sarmalın her iki zinciri pürin ve pirimidin bazlarının arasındaki hidrojen bağları ile birarada tutulmaktadır.

54 DNA ile İlgili Bazı Terimlerin Tanımlamaları(25): DNA Baz Dizilerinin Yazılımı ile İlgili Temel Bilgiler: Oligonükleotid: Birden fazla bazın yan yana gelmesiyle oluşan yapıya oligonükleotid denir. Dinükleotidler: İki bazın yan yana gelmesiyle oluşan yapıya dinükleotid denir. Trinükleotid: Üç bazın yan yana gelmesiyle oluşan yapıya trinükleotid denir. Tekrarlayan Oligonükleotidler: Polimer içindeki tekrarlayan oligonükleotidler, tekrarlayan tek bir bazı, tekrarlayan iki bazı veya üç bazı belirtir. Tekrarlayan mononükleotide poly(a), dinükleotide poly(at), trinükleotide poly(gat) örnek verilebilir. Çift Sarmal Tekrarlayan Polimerler: Nokta ile ayrılarak ifade edilen baz çiftlerinden oluşan ve 5-3 polaritesine sahip polimerlerdir. Mononükleotid gösterilişine, poly(a).poly(t) (poly(da).poly(dt)), dinükleotid gösterilişine poly(at).poly(at), trinükleotid gösterilişine poly(gat). Poly(ATC) örnek verilebilir. Baz Çifti: Birbirinin karşılığı olan iki bazı ifade eder. Baz çiftleri gösterilirken nokta ile ayrılır. Örneğin, A.T veya G.C baz çiftleri gibi. Prob: Baz dizisi belli olan oligonükleotide prob adı verilir. Hedef Dizi (Target): Prob dizisinin karşılığını içeren oligonükleotide denir. Yanlış Eşleşen Dizi (Mismatch): Bir bazı veya birden fazla bazı hedef diziden farklı olan oligonükleotide denir Rastgele Dizi (Non complementary): Hedef diziden tamamen farklı baz dizilimine sahip oligonükleotide denir.

55 İnterkalasyon: Düzlemsel bir halka sistemine sahip olan bazı maddelerin DNA baz çiftleri arasına girerek, güçlü bir şekilde bağlanması olayına interkalasyon adı verilir (5,27). İnterkalasyon olayı; maddenin yapısına bağlı olarak tersinir ya da tersinmez şekilde gerçekleşmektedir (71). İnterkalasyon, DNA'da zincir kırılmasına yol açar. Buna bağlı olarak da DNA sentezini ve DNA'ya bağımlı olarak gerçekleşen RNA sentezini bozmaktadır. Bu maddeler yani interkale olabilen maddeler (interkalatörler) Topoizomeraz (II) enzimini inhibe ederler Nükleik Asit Hibridizasyonu(5): Baz çiftlerinin özel hibridizasyon koşullarına bağlı olarak kararlı bir dubleks molekül oluşturması olayına nükleik asit hibridizasyonu adı verilir. Şekil 19: nükleik asit hibridizasonu

56 46 DNA hibridizasyonunun kinetiği; nükleik asitlerin yapısı, baz kompozisyonu, DNA dizi uzunluğu, tuz konsantrasyonu, sıcaklık, dekstran sülfat, formamit, ph, baz değişimleri, iyonik kuvvet ve viskozite gibi faktörlerden etkilenmektedir. DNA nın erime sıcaklığının 25 C altındaki sıcaklık, hibridizasyon için en uygun sıcaklık olup; hibridizasyon için optimum sıcaklık olarak nitelendirilir Replikasyon: DNA çift sarmalında birbirine zıt yönde uzanan nükleotid zincirleri tam olarak birbirlerinin karşılığıdır. Bu nedenle, sarmal açıldığında zincirlerin her biri yeni bir zincir oluşumu için kalıp olabilmektedir. Bu olaya replikasyon adı verilmektedir. DNA replikasyonunda yeni bir iplik oluşurken diğer iplik aynen kalmaktadır yani DNA replikasyonu semi-konservatiftir. Yeni nükleotidler, zincirin sadece 3 ucuna ardarda bağlanabilmektedir. Bu sebeple DNA replikasyonu, her zaman 5 den 3 yönüne olmaktadır. Yeni DNA nın 5 ucu ise küçük segmentler halinde replike olmaktadır. Replikasyon sırasında, çift sarmal DNA zinciri, DNA Helikaz enzimi ile birbirinden ayrılmaktadır. DNA replikasyonu ipliklerde sadece 5-3 yönünde kesintisiz ilerlemektedir. Diğer iplikte ise yeni DNA bazlık Okazaki fragmanları ile olmaktadır. Okazaki parçalarında replikasyonun başlayabilmesi için, primer kısa bir RNA parçası gerekmektedir. Bu RNA primeri, Primaz tarafından sentezlenmektedir. RNA primeri uzaklaştırıldıktan sonra yeri DNA polimeraz ile doldurulmaktadır. Bu DNA fragmanları, DNA ligaz ile birleştirilmektedir. Replikasyon sırasında hatalar, proof-reading mekanizması ile yok edilmektedir. Bu sistem, yanlış katılmış bazları uzaklaştırıp, yerine doğru olanlarının yerleştirilmesi ile işleyen bir düzeltme sistemidir.

57 47 Şekil 20: Nükleik asit replikasyonu 2.4. DNA Biyosensörleri: DNA biosensörleri, dizisi belli hibrizasyon olaylarının incelenmesinde (75,105) veya DNA ile etkileşime giren analizlenecek maddelerin tayininde kullanılır (11, 97, 99, 105). İncelenen maddelerin tayinleri, bu maddelerin DNA ile etkileşmesi sonucu, DNA daki bir bazın veya incelenen maddenin sinyalindeki değişikliklerden yapılabilir Biyosensör tasarımında kullanılan dizi tanıma yüzeyleri; Analitik Kimya alanında yeni ve ilgi çekicidir (85, 92, 94, 109). Bu tür tanıma yüzeyleri, sahip olduğumuz, bilinen elektrokimyasal biyosensörlere yeni boyutlar kazandıracak ve gelecekte hasta başında veya doktor gözetimindeki analizlerde önemli bir rol oynayacaktır (110).

58 İlaç DNA Etkileşmesinin DNA Biyosensörleri ile Tayini: Tanıma yüzeyi olarak DNA nın kullanıldığı biyosensörlere DNA biyosensörleri denir. Diziye özgün DNA biyosensörleri, bir çevirim sistemi ile beraber DNA probundan oluşmuştur. Nükleik asit tanıma tabakası çok stabil, kolaylıkla oluşturulabilen ve tekrar kullanım için yenilenebilen bir tabakadır. DNA biyosensörlerinin esası, DNA bazlarının hibridizasyonuna dayanır. DNA biyosensörleri (genosensörler) dizisi belli hibridizasyon olaylarının izlenmesinde veya bu yüzey ile etkileşime giren analitlerin (karsinojen maddeler, ilaçlar) tayininde kullanılabilir. Zaten DNA biyosensörlerinin tasarım amacı; gelecekte yeni antibiyotik, antiviral, antitümör ilaç ve antisense oligonükleotidlerine dayalı ilaç hedefleme çalışmalarına katkıda bulunmaktır. Bir Maddenin dsdna ile Etkileşmesi Üç Farklı Şekilde Olmaktadır: 1-) Nükleik asit yapısındaki negatif yüklü şeker fosfat gruplarına elektrostatik bağlanarak dsdna ile etkileşebilir. 2-) DNA çift sarmal yapısının iki oluğuna bağlanarak dsdna ile etkileşebilir. 3-) DNA nın baz çiftleri arasına interkalasyon yaparak dsdna ile etkileşebilir. Yeni sentezlenen küçük moleküllerin DNA ya bağlanması ve onunla etkileşmesi, yeni ilaçların tasarımında olduğu kadar DNA yı algılama yöntemlerinin geliştirilmesinde ve çevreye zararlı maddelerin algılanmasında da önemlidir. İncelenen maddenin, DNA ile etkileşmesi sonucu DNA daki bir bazın ve/veya incelenen maddenin sinyalindeki artış ya da azalmanın gözlenmesi ile tayin yapılabilir. Yani ilaç-dna etkileşimini elektrokimyasal biyosensörle tayin ederken; etkileşim öncesi ve sonrası mevcut ilaç sinyalindeki ve/veya DNA daki

59 49 elektroaktif bazlardan guanin ve adenin sinyalindeki değişim ölçülür ve bu değişime göre ilaç-dna etkileşimi hakkında yorum yapılır. Elektrokimyasal DNA biyosensörleri, aranan hedefin baz dizisinin karşılığı olan baz gibi kısa bir baz dizilimine sahip olan sentetik tek sarmallı DNA oligomerinin, elektrot yüzeyine bağlanmasına dayanmaktadır. Hedefi içeren bir örnek çözeltisine sensörün daldırılması ile elektrot yüzeyinde hibrit oluşur. Elektrokimyasal ölçümlerde hibritin oluştuğu elektrot, elektroaktif bir indikatör içeren çözeltiye daldırılır ve indikatörün hibrite bağlanma düzeyi belirlenir. Hibridizasyon oluşumundan sonra bu hibritle etkileşen indikatörün neden olduğu artan veya azalan elektrokimyasal yanıt, hibridizasyonun tayinine yönelik bir sinyal olarak kabul edilir (36, 37, 38, 65, 73). DNA nın değişik kimyasal maddelerle etkileşmesi ve faklı yöntemlerle bu etkileşimin incelenmesi; çevre kirliliğine yol açan toksik maddelerin tayinlerine yönelik yeni yöntemlerin geliştirilmesi açısından da oldukça önemlidir. Elekrokimyasal DNA biyosensörlerinin geliştirilmesindeki temel aşamalardan birisi prob olarak kullanılacak DNA parçasının elektrot yüzeyine sağlam şekilde tutturulması basamağıdır. Eğer yüzeye probun kolay ve sağlam şekilde tutturulması sağlanırsa, bu probun daha sonra hedefi ile hibridizasyonu daha kolay olacak ve oluşan hibritin çeşitli fiziksel veya kimyasal etkenlerden etkilenip yüzeyden kopması gibi olumsuz etkiler de ortadan kalkacaktır Elektrot Yüzeyine DNA Bağlama (immobilizasyon) Teknikleri: 1) Elektrostatik bağlanma 2) Kovalent bağlanma (Altın elektrotlar ve karbon elektrotlar için)

60 50 3) SH (tiyol) grubu ile işaretli oligonükleotidin, altın elektrot yüzeyine afinitesi Elektrostatik Bağlanma: Elektrot yüzeyine pozitif potansiyel uygulanması, negatif yüklü fosfat omurgasına sahip olan DNA nın yüzeye elektriksel çekim kuvveti sayesinde tutunmasını sağlar (28,40) Kovalent Bağlanma: Altın elektrotlar (solid altın elektrotları, tek kullanımlık perde baskılı altın elektrotlar) ve altın nanopartiküller için ilk olarak 3- merkaptopropionik asit veya L-sistein ile SH gruplarının elektrot yüzeyine tutunması sağlanır SH (tiyol) Grubu ile İşaretli Oligonükleotidin, Altın Elektrot Yüzeyine Afinitesi: Burada SH gruplarının altın metaline olan güçlü afinitesinden yararlanılır. Daha sonra N-Hidroksi süksinimit (NHS) ve etil karbodiimit (ECD) gibi kimyasal ajanlar kullanılarak NH 2 grubu ile işaretli probun, yüzeye güçlü şekilde tutunmasına imkan sağlayan zemin oluşturulur. Bu metod, özellikle altın elektrot için spesifik olan yüzey kaplama metodudur. Şekil 21: Altın elektrot yüzeyinde kimyasal ajanlarla kovalent bağlanma

61 51 Eğer elektrot olarak altın değil de çeşitli karbon (grafit) elektrotlar kullanılırsa bu durumda 3-merkaptopropionik asit gibi bir ajana gereksinim duyulmamaktadır. Sadece kovalent ajanlarla aktive edilen yüzeye, NH 2 grubu ile işaretli prob direkt olarak güçlü şekilde bağlanmaktadır. Şekil 22: Grafit elektrot yüzeyinde kovalent ajanlar yardımıyla NH 2 işaretli DNA probu modifikasyonu. İlaç ve DNA etkileşimleri; elektrot yüzeyinde etkileşim ve çözelti fazında etkileşim olmak üzere iki şekilde yapılabilmektedir.

62 52 Şekil 23: İlaç-DNA etkileşmesine dayalı elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin tasarımının şematik olarak gösterilmesi: A) Çalışma elektrodu yüzeyinde etkileşim a) DNA tutturulmuş elektrot, b) ilaç tutturulmuş elektrot kullanılması ile tayin. B) Çözelti fazında etkileşim. İlaç DNA etkileşiminin, elektrokimyasal DNA biyosensörleri kullanılarak izlenmesinde etkileşim basamağını; elektrodun yıkanması, voltametrik teknikler kullanılarak elektrokimyasal ölçümlerin yapılması ve sinyallerin kıyaslanması aşamaları izlemektedir. Sinyallerin kıyaslanması aşamasında etkileşim öncesi ve/veya sonrası ilaç ve/veya DNA nın voltametrik sinyalinde artma veya azalmanın olup olmadığı tespit edilir.

63 53 BÖLÜM II GEREÇ ve YÖNTEM 2.1. Kullanılan Cihazlar Ölçümler ve deneyler sırasında kullanılan tüm cihaz, donanım ve yazılımlar aşağıda belirtildiği gibidir. Terazi (Sartorious-Analytic A-200) Ses titreşimli temizleyici (Ultrasonic LC 30 H) ph-metre (Schott-Mainz CG 710) Manyetik karıştırıcı ( Elektro-mag ve ARE 2-Velp ) Potansiyostat; AUTOLAB 30 (Eco Chemie, Hollanda) Ag/AgCl elektot ( referans elektrot olarak kullanıldı ) Grafit kalem ucu ( Tombo 0.5 HB ) (Çalışma elektrodu olarak kullanıldı.) Karbon pastası elektrodu ( Çalışma elektrodu olarak kullanıldı.) Platin tel (Yardımcı elektrot olarak kullanıldı.) 2.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler Asetik asit ( %99-100) (Merck) Hidroklorik asit (%37) Sodyum Hidroksit (Merck) (Merck) Dipotasyum mono hidrojen fosfat (Riedel-de Haen) Potasyum dihidrojen fosfat (Riedel-de Haen)

64 54 Trizma hidroklorik asit ( Sigma ) Sodyum klorür (Sigma) Grafit tozu (Fisher ) Mineral yağ (Acheson 38 ) Balık sperminden elde edilen dsdna ( Serva ) Tüm çalışmalarda distile su ve ultrasaf su kullanıldı. Deneysel çalışmalar oda sıcaklığında (25,0 ± 0,5 ) C de gerçekleştirildi DNA ile Etkileşime Giren Maddeler Hakkında Genel Bilgi: Madde 1: Açık Kimyasal Formülü: 5' 6' 4' 7' 3' 1' O O NCH 2 CH 2 SO 2 NH Kapalı Kimyasal Formülü: C 16 H 14 N 2 O 4 S Molekül ağırlığı: 330 g/ mol Kimyasal adlandırma : β-ftalimido-n-feniletansülfonamit Kimyasal özellikleri: Suda güç çözünür. Kloroform, etanol ve metanolde oldukça iyi çözünür. Farmakolojik özellikleri: Roblin ve arkadaşları tarafından 1947 yılında potansiyel antibakteriyel ve antimalaryal bileşikler olarak sentezlenmişlerdir. Ancak yapılan çalışmalarda antikonvülzan etki gösterdikleri, maksimal elektroşok

65 55 ve subkutan pentilentetrazol testine karşı aktivite göstererek geniş bir etki spektrumu çizdikleri tespit edilmiştir. Madde 2: Açık Kimyasal Formülü: 5' 6' 4' 7' 3' 1' O H 3 CO NCH 2 CH 2 SO 2 NH O Kapalı Kimyasal Formülü: C 17 H 16 N 2 O 5 S Molekül ağırlığı: 360 g/ mol Kimyasal adlandırma : β-ftalimido-n-(2-metoksifenil)etansülfonamit Kimyasal özellikleri: Suda güç çözünür. Kloroform, etanol ve metanolde oldukça iyi çözünür Farmokolojik özellikleri: Lider bileşik olarak alınan taurine göre aktivitesi karşılaştırılmıştır. Taurin, santral sinir sisteminin önemli bir inhibitör aminoasitidir. Taurin, deney hayvanı epilepsi modellerinde belirgin bir antikonvülzan aktivite göstermesine karşın, β-ftalimido-n-(2-metoksifenil)etansülfonamit in bu etkisinin oldukça zayıf olduğu tespit edilmiştir. Çalışmalarımızda kullandığımız maddelerin sentezleri ve yapılarının aydınlatılması, Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya Anabilim Dalı nda gerçekleştirilmiştir. Taltrimit türevleri olarak tasarlanan 2-ftalimido-Nfeniletansülfonamit türevlerinin sentezi için β -aminoetansülfonik asit (taurin), asetik asit içerisinde ftalik anhidrit ile potasyum asetat beraberliğinde tepkimeye sokularak β- ftalimido etansülfonik asit potasyum tuzuna çevrilmiştir. Daha sonra β-ftalimido

66 56 etansülfonik asit potasyum tuzu, fosfor pentaklorür ile β-ftalimido etansülfonil klorüre çevrilmiştir ve bu bileşik anilin ya da sübstitüe anilin türevleri ile tepkimeye sokularak, hedef bileşiklerimiz olan β-ftalimido-n-feniletansülfonamit türevlerini vermiştir O O O Potasyum Asetat + H 2 N CH 2 CH 2 SO 3 H N O O CH 2 CH 2 SO 3 K O N CH 2 CH 2 SO 3 K O Fosfor pentaklorür O N CH 2 CH 2 SO 2 Cl O O A N Piridin CH 2 CH 2 SO 2 Cl + NH 2 N O O O CH 2 CH 2 SO 2 NH A 2.4. Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanışı: Tampon Çözeltilerin Hazırlanışı: Tüm tampon çözeltilerin hazırlanışında ultrasaf su kullanıldı. Tampon çözeltiler hazırlandıktan sonra plastik şişelerde, buzdolabında saklandı. İyonik kuvveti sağlamak için tüm tampon çözeltilerin litresine derişimi 0,02 M olacak şekilde 1,168 g NaCl eklendi ,50 M Asetat Tampon Çözeltisinin Hazırlanışı (ph 4,8) (ACB): Kullanılan 0,50 M asetat tampon çözeltisi litresinde 0,2722 g sodyum asetat trihidrat ve 0,1154 ml asetik asit içermektedir. Çözeltinin ph'sının 4,8 değerine ayarlanması; 0,1 N NaOH ve/veya 0,1 N HCl ilavesiyle, ph metre ile ölçülerek gerçekleştirilir.

67 ,02 M Tris HCl Tampon Çözeltisinin Hazırlanışı(pH7,0)(TBS ): 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisi litresinde 3,152 g Trizma HCl içermektedir. İyonik kuvveti sağlamak için tampon çözeltinin litresine derişimi 0,02 M olacak şekilde 1,168 g NaCl eklenir. Çözeltinin ph'sının 7,0 değerine ayarlanması; 0,1 N NaOH ve/veya 0,1 N HCl ilavesiyle, phmetre ile ölçülerek gerçekleştirilir ,05 M Fosfat Tampon Çözeltisinin Hazırlanışı(pH 7,4)(PBS): Ölçümler sırasında kullanılan 0,05 M fosfat tampon çözeltisi litresinde 1,36 g (0,01 mol) KH 2 PO 4 ve 6,96 g (0,04 mol) K 2 HPO 4 içermektedir. Hazırlanan tampon çözeltisinin ph değeri yaklaşık 7,4 olmaktadır. İyonik kuvveti sağlamak için tampon çözeltinin litresine derişimi 0,02 M olacak şekilde 1,168 g NaCl eklenir. Çözeltinin ph sının 7,4 değerine ayarlanması; 0,1 N NaOH ve/veya 0,1 N HCl ilavesiyle, phmetre ile ölçülerek gerçekleştirilir İlaç Stok Çözeltilerinin Hazırlanışı: İlaç stok çözeltileri 1mM konsantrasyonda 10 ml olacak şekilde etanol ile hazırlanır. Stok çözeltilerini bu değerlerde hazırlayabilmek için molekül ağırlığı 330 gr olan toz halindeki maddeden 3,3 mg hassas terazide tartılır ve 10 ml etanolde çözdürülür. Yine benzer yapıdaki molekül ağırlığı 360 gr olan toz halindeki maddeden 3,6 mg hassas terazide tartılır ve 10 ml etanolde çözdürülür. Hazırlanmış olan stok çözeltiler kapağı kapalı olacak şekilde, ışık geçirmeyen şişelerde ve buzdolabında saklanmaktadır. Bu maddeler; Ege Universitesi

68 58 Eczacılık Fakültesi Farmasotik Kimya Anabilimdalı Araştırma Görevlilerince sentezlenmiştir Kullanılan Yöntem: Kullanılan elektrotların temizlenmesi veya aktivasyonu, elektrot yüzeyine dsdna, ssdna ve oligonükleotidlerin modifiye edilmesi, DNA materyalinin madde ile elektrot yüzeyinde ve/veya çözelti bazında etkileşmesine ilişkin basamaklarda, mevcut literatürlerde (3, 50, 66) rapor edilen yol izlenmiştir Kullanılan Elektrotların Hazırlanışı: Karbon Pastası Elektrodunun (CPE) Hazırlanışı: Çalışma elektrodu, çapı 3 mm olan cam borudan hazırlandı. İç kısmında karbon pastası içeren elektrotta, elektriksel iletkenlik bakır tel ile sağlandı. Karbon pastası, grafit tozu ile mineral yağın %70:30 (a/a) oranında homojen bir şekilde karıştırılmasıyla hazırlandı. Elektrot hazırlandıktan sonra yüzeyi, yağlı kağıt ile homojen bir yüzey haline getirildi. Her deneyden önce çalışma elektrodunun yüzeyi yenilendi (24, 36, 77, 78) Kalem Grafit Elektrot (PGE) Hazırlanışı: Çalışmada kullanılan kalem grafit elektrot; Tombo marka 0,5 HB kalem uclarının 3 cm kesilmesi ve kenarlardan 1,5 cm nin kalem içinde kalacak şekilde işaretlenmesiyle hazırlandı.

69 59 Şekil 24: Kalem grafit elektrot hazırlanışı Dönüşümlü Voltametri Tekniği (CV) kullanılarak Maddelerin Yükseltgenme ve İndirgenme Sinyallerinin Saptanması: Stoktaki ilaç çözeltisinden 2 ml alınarak, 2 ml TBS ile karıştırıldı ve sonuçta 0,5 mm konsantrasyonda ilaç çözeltisi elde edildi. Dönüşümlü voltametri tekniği ile önce boş TBS tamponu ile -1 ;+1 V, +1 ;-1 V, +1;+1,4 V, + 1,4 ; - 1,4 V olmak üzere 4 parametrede ölçüm alındı. Daha sonra 0,5 mm ilaç çözeltisi ile aynı parametrelerde ölçümler alındı. Sonuçta başlangıç potansiyeli olarak 1 volt ve bitiş potansiyeli olarak da 0,5 voltun uygun olacağı saptandı ve bu aralıklarda alınan ölçümlerde maddelerin 0.80 volt civarında siklik voltametride sinyali tespit edildi DNA İmmobilize Edilmiş Kalem Grafit Elektrodu İle Tek Kullanımlık Sensör Geliştirilmesine Yönelik Çalışmalar: Islak adsorpsiyon (wet-adsorption) tekniğine göre (29) elektrot yüzeyine immobilize edilen çift sarmal DNA veya tek sarmal DNA nın analizi, diferansiyel puls voltametri tekniğiyle ve tek kullanımlık elektrot ile gerçekleştirildi.

70 PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyondaki dsdna nın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışma: a- PGE Aktivasyonu: Elektrot yüzeyi deney öncesinde 0,5M asetat tampon çözeltisi (ph: 4,8) içine daldırılarak, elektrot yüzeyine 30 saniye süreyle +1,4 V gerilim uygulandı. Böylelikle elektrokimyasal olarak aktivasyon işlemi gerçekleştiridi. b- Yüzeye dsdna Tutturulması: Aktive edilen elektrot yüzeyine, farklı konsantrasyonlardaki dsdna (1µg/ml, 2µg/ml, 4µg/ml, 8µg/ml, 16µg/ml,32 µg/ml) + 0,5 V potansiyelin 120 saniye süre ile karıştırılan ortamda uygulanması yöntemi ile tutturuldu. Elektrotlar, 0,50 M asetat tampon (ph: 4,8) çözeltisine iki defa daldırılıp çıkartılarak yıkandı. c- 0,02 M Tris HCl Tampon Çözeltisi ile Etkileşim: Yüzeyine dsdna tutturulmuş elektrotlar potansiyel uygulanmadan karıştırılan ortamda 2 dakika 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisinin içinde bekletildi. Daha sonra 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisinin içine iki defa daldırılıp çıkartılarak yıkandı. d- Ölçüm: Diferansiyel puls voltametri tekniği kullanılarak +0,80 V tan + 1,40 V a kadar 0,50 M asetat tampon (ph: 4.80) içerisinde ölçüm yapıldı. Bu çalışmada +1,0 V civarında gözlenen guanin bazına ait yükseltgenme sinyali ölçüldü.

71 dsdna nın PGE Yüzeyine Farklı Sürelerde İmmobilize Edilmesinin Elektrokimyasal Yanıta Etkisinin İncelenmesine Yönelik Çalışma: a- PGE Aktivasyonu: Elektrot yüzeyi deney öncesinde 0,5M asetat tampon çözeltisi (ph: 4,8) içine daldırılarak, elektrot yüzeyine 30 saniye süreyle +1,4 V gerilim uyguladı. Böylelikle elektrokimyasal olarak aktivasyon işlemi gerçekleştirildi. b- Yüzeye dsdna Tutturulması: 16 µg/ml dsdna çözeltisinin + 0,5 V potansiyelde ve 7,5; 15; 30 dakika sürelerle karıştırılan ortamda elektrot yüzeyine uygulanması ile dsdna elektrot yüzeyine tutturuldu. Elektrotlar, 0,50 M asetat tampon (ph: 4,8) çözeltisine iki defa daldırılıp çıkartılarak yıkandı. c- 0,02 M Tris HCl Tampon Çözeltisi ile Etkileşim: Yüzeyine dsdna tutturulmuş elektrotlar potansiyel uygulanmadan karıştırılan ortamda 2 dakika 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisinin içinde bekletildi. Daha sonra 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisinin içine iki defa daldırılıp çıkartılarak yıkandı. d- Ölçüm: Diferansiyel puls voltametri tekniği kullanılarak +0,80 V tan + 1,40 V a kadar boş 0,50 M asetat tampon çözeltisi (ph: 4,80) içerisinde ölçüm yapıldı. Bu çalışmada +1,0 V civarında gözlenen guanin bazına ait yükseltgenme sinyali ölçüldü.

72 PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyonlardaki ssdna nın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışma: a- PGE aktivasyonu: Elektrot yüzeyi deney öncesinde 0,5M asetat tampon çözeltisi (ph: 4,8) içine daldırılarak, elektrot yüzeyine 30 saniye süreyle +1,4 V gerilim uygulandı. Böylelikle elektrokimyasal olarak aktivasyon işlemi gerçekleştirildi. b- Yüzeye ssdna tutturulması: Bu çalışmada aktive edilen elektrot yüzeyine farklı konsantrasyonlardaki ssdna (1µg/ml, 2µg/ml, 4µg/ml, 8µg/ml, 16µg/ml,32 µg/ml) + 0,5 V potansiyelin 120 saniye süre ile karıştırılan ortamda uygulanması ile elektrot yüzeyine tutturuldu. Elektrotlar, 0,50 M asetat tampon (ph: 4,8) çözeltisine iki defa daldırılıp çıkartılarak yıkandı. c- 0,02 M Tris HCl Tampon Çözeltisi ile Etkileşim: Yüzeyine ssdna tutturulmuş elektrotlar potansiyel uygulanmadan karıştırılan ortamda iki dakika 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisinin içinde bekletildi. Daha sonra 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisinin içine 2 defa daldırılıp çıkartılarak yıkandı. d- Ölçüm: Diferansiyel puls voltametri tekniği kullanılarak +0,80 V tan + 1,40 V a kadar boş 0,50 M asetat tampon (ph: 4,80) içerisinde ölçüm yapıldı. Bu çalışmada +1,0 V civarında gözlenen guanin bazına ait yükseltgenme sinyali ölçüldü.

73 ssdna nın PGE Yüzeyine Farklı Sürelerde İmmobilize Edilmesinin Elektrokimyasal Yanıta Etkisinin İncelenmesine Yönelik Çalışma: a-pge aktivasyonu: Elektrot yüzeyi deney öncesinde 0,5M asetat tampon çözeltisi (ph: 4,8) içine daldırılarak, elektrot yüzeyine 30 saniye süreyle +1,4 V gerilim uygulandı. Böylelikle elektrokimyasal olarak aktivasyon işlemi gerçekleştirildi. b- Yüzeye ssdna tutturulması: 16 µg/ml ssdna çözeltisinin +0,5 V potansiyelde 7,5; 15; 30 dakika süreyle karıştırılan ortamda uygulanması ile ssdna elektrot yüzeyine tutturuldu. Elektrotlar, 0,50 M asetat tampon (ph: 4,8) çözeltisine iki defa daldırılıp çıkartılarak yıkandı. c- 0,02 M Tris HCl Tampon Çözeltisi ile Etkileşim: Yüzeyine ssdna tutturulmuş elektrotlar potansiyel uygulanmadan karıştırılan ortamda 2 dakika 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisinin içinde bekletildi. Daha sonra 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisinin içine iki defa daldırılıp çıkartılarak yıkandı. d- Ölçüm: Diferansiyel puls voltametri tekniği kullanılarak +0,80 V tan + 1,40 V a kadar boş 0,50 M asetat tampon (ph: 4,80) içerisinde ölçüm yapıldı. Bu çalışmada +1,0 V civarında gözlenen guanin bazına ait yükseltgenme sinyali ölçüldü.

74 PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyonlardaki ilaçların Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışma: a- Kalem Grafit Elektrodunun Aktivasyonu: PGE; 0,05M asetat tamponu çözeltisinde (ph:4,8) +1,4 V uygulanarak 30 saniye süre ile karıştırılmayan sistemde aktive edildi. b- Yüzeyin Asetat Tamponu ile Etkileştirilmesi: Aktivasyonu tamamlanmış olan elektrotlar +0,5 V potansiyelde iki dakika süre ile karıştırılan ortamda 0,50 M Asetat tampon çözeltisinde(ph: 4,8) bekletildi. Elektrotlar, 0,50 M asetat tampon (ph: 4,8) çözeltisine iki defa daldırılıp çıkartılarak yıkandı. c- Yüzeye ilaç Tutturulması: Elektrotlar potansiyel uygulanmadan karıştırılan ortamda iki dakika 25µM, 50µM, 100 µm ilaç çözeltisinin içinde bekletildi. Daha sonra 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisinin içine iki defa daldırılıp çıkartılarak yıkandı. d- Ölçüm: Diferansiyel puls voltametri tekniği kullanılarak +0,80 V tan + 1,40 V a kadar boş 0,50 M asetat tampon (ph: 4,80) içerisinde ölçüm yapıldı. Bu çalışmada +1,0 V civarında gözlenen guanin bazına ait yükseltgenme sinyali ölçüldü dsdna nın İlaç ile Etkileşimine Dayalı Çalışmalar: Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltisi ile Yapılan Çalışmalar: a- Kalem Grafit Elektrodunun Aktivasyonu:

75 65 PGE; 0,05M asetat tamponu çözeltisinde (ph:4,8) +1,4 V uygulanarak 30 saniye süre ile karıştırılmayan sistemde aktive edildi. b- PGE Yüzeyine dsdna İmmobilizasyonu: Yüzeyi aktive edilmiş PGE, asetat tamponu (ph:4,8) içinde hazırlanmış olan 20 ppm konsantrasyondaki dsdna çözeltisine daldırıldı ve iki dakika süreyle 0,5 V potansiyel uygulanan karıştırılan bir ortamda bekletildi. Böylece dsdna elektrot yüzeyine tutturuldu. Elektrot 0,50 M asetat tampon (ph:4,8) çözeltisine iki kere daldırılarak yıkandı. c- İlacın DNA ile Etkileşimi: dsdna immobilize edilmiş PGE, potansiyel uygulanmaksızın iki dakika süreyle karıştırılan ortamda 0,02 M Tris-HCl içerisinde hazırlanmış 5 µm lık, 10 µm lık, 25 µm lık, 50 µm lık, 100 µm lık ilaç çözeltileri içerisinde bekletildi ve elektrot iki kere 0,02 M tris tampon çözeltisi içine daldırılarak yıkandı. d- Ölçüm: Ölçüm +0,6 V ile +1,5 V arasında 30mV/s tarama hızıyla tarama yapılarak asetat tamponu içerisinde gerçekleştirildi. +1,0 V civarında gözlenen guanin bazına ait yükseltgenme sinyalindeki değişim ve 0.75 V civarında gözlenen ilaç sinyalindeki değişim incelendi Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltisi ile Yapılan Çalışmalar: deki yöntem kullanıldı. İlaç konsantrasyonlarıda 25 µm ve 50 µm olarak hazırlandı.

76 Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltisi ile Yapılan Çalışmalar: hazırlandı deki yöntem kullanıldı. İlaç konsantrasyonuda 25 µm olarak ssdna nın İlaç ile Etkileşimine Dayalı Çalışmalar: a- Kalem Grafit Elektrodunun Aktivasyonu: PGE; 0,05M asetat tamponu çözeltisinde +1,4 V uygulanarak 30 saniye süre ile karıştırılmayan sistemde aktive edildi. b- ssdna Hazırlanışı: Asetat tamponu içinde hazırlanmış olan 20 ppm konsantrasyondaki dsdna çözeltisi 100 ml olacak şekilde viallere kondu. Vialler içinde PCR de 95 o C de 10 dakika denatüre edildi ve denatürasyon sonrası 10 dakika buz banyosunda bekletildi. Bu şekilde 20 ppm konsantrasyondaki ssdna hazırlanmış oldu. c- PGE Yüzeyine ssdna İmmobilizasyonu: Yüzeyi aktive edilmiş PGE, asetat tamponu içinde hazırlanmış olan 20 ppm konsantrasyondaki ssdna çözeltisine daldırıldı ve iki dakika süreyle potansiyel uygulanmadan ve karıştırılmadan bekletildi. Böylece ssdna elektrot yüzeyine tutturuldu. Elektrot 0,50 M asetat tampon çözeltisine iki kere daldırılarak yıkandı. d- İlacın DNA ile Etkileşimi: Yüzeyine ssdna tutturulmuş olan kalem grafit elektrotlar potansiyel uygulanmaksızın iki dakika süreyle karıştırılmayan ortamda 0,02 M tris-hcl içerisinde hazırlanmış 25 µm lık ilaç çözeltisi içerisinde bekletildi ve elektrot iki kere 0,02 M tris tampon çözeltisi içine daldırılarak yıkandı.

77 67 e- Ölçüm: +0,6 V ile +1,5 V arasında 30mV/s tarama hızıyla tarama yapılarak asetat tamponu içerisinde ölçüm gerçekleştirildi. +1,0 V civarında gözlenen guanin bazına ait yükseltgenme sinyalindeki değişim ve 0.75 V civarında gözlenen ilaç sinyalindeki değişim incelendi ph Değişiminin PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen İlaç ve dsdna ile Etkileşmiş Olan İlaç Sinyaline Etkisi: Etkisi: ph Değişiminin PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen İlaç Sinyaline a- Kalem Grafit Elektrodunun Aktivasyonu: PGE; 0,5M asetat tamponu çözeltisinde +1,4 V uygulanarak 30 saniye süre ile karıştırılmayan sistemde aktive edildi. b- Yüzeyin Asetat Tamponu ile Etkileştirilmesi: Aktivasyonu tamamlanmış olan elektrotlar +0,5 V potansiyel uygulanan ve iki dakika süre ile karıştırılan ortamda 0,50 M asetat tampon çözeltisinde bekletildi. Elektrotlar, 0,50 M asetat tampon çözeltisine iki defa daldırılıp çıkartılarak yıkandı. c- Yüzeye İlaç Tutturulması: Elektrotlar potansiyel uygulanmadan karıştırılan ortamda iki dakika 25 µm ilaç çözeltisi içinde bekletildi. Daha sonra 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisinin içine iki defa daldırılıp çıkartılarak yıkandı.

78 68 d- Ölçüm: Diferansiyel puls voltametri tekniği kullanılarak +0,80 V tan + 1,40 V a kadar boş 0,50 M asetat tamponu (ph: 4,80); boş 0.05 M fosfat tamponu (ph: 7,4); boş 0.02 M tris HCl tamponu (ph: 7,00) içerisinde üçer ardışık ölçüm yapıldı ph Değişiminin PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen dsdna ile Etkileşime Giren İlaç Sinyaline Etkisi: a- Kalem Grafit Elektrodu(PGE) nun Aktivasyonu: PGE; 0,5M asetat tamponu çözeltisinde (ph:4,8) +1,4 V uygulanarak 30 saniye süre ile karıştırılmayan sistemde aktive edildi. b- Yüzeyin Asetat Tamponu ile Etkileştirilmesi: Yüzeyi aktive edilmiş PGE, asetat tamponu (ph:4,8) içinde hazırlanmış olan 20 ppm konsantrasyondaki dsdna çözeltisine daldırıldı ve iki dakika süreyle 0.5 V potansiyel uygulanan karıştırılan bir ortamda bekletildi. Böylece dsdna elektrot yüzeyine tutturuldu. Elektrot 0,50 M asetat tampon(ph:4,8) çözeltisine iki kere daldırılarak yıkandı. c- Yüzeye İlaç Tutturulması: Elektrotlar potansiyel uygulanmadan karıştırılan ortamda iki dakika 25µM ilaç çözeltisinin içinde bekletildi. Daha sonra 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisinin içine iki defa daldırılıp çıkartılarak yıkandı. d- Ölçüm: Diferansiyel puls voltametri tekniği kullanılarak +0,80 V tan +1,40 V a kadar boş 0,50 M asetat tamponu; boş 0.05 M fosfat tamponu; boş 0.02 M tris HCl tamponu içerisinde üçer ardışık ölçüm yapıldı.

79 69 BÖLÜM III BULGULAR 3.1. PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyondaki dsdna nın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışmalardan Elde Edilen Bulgular: 1-32 µg/ml konsantrasyon aralığındaki dsdna nın tek kullanımlık elektrot ile elektrokimyasal tayini, yöntem de anlatıldığı şekilde yapıldı. Tüm parametrelere ait üçer ardışık ölçüm alındı. Çalışmalarımızda dsdna nın konsantrasyonunda yapılan değişikliğin, guanin sinyalinde nasıl bir değişikliğe sebep olacağını tespit etmek amaçlanmıştır. Şekil 25: Farklı konsantrasyonlarda dsdna immobilize edilmiş PGE ile ölçülen guanin bazına ait diferansiyel puls voltamogramları: a-1 µg/ml, b-2 µg/ml, c- 4µg/ml, d- 8 µg/ml, e- 16 µg/ml, f- 32 µg/ml ds DNA

80 70 Aktive edilmiş PGE yüzeyine değişik konsantrasyonlardaki dsdna immobilizasyon çalışmalarımızda; dsdna konsantrasyonu arttıkça guanin bazına ait yükseltgenme sinyallerinde artma gözlendi. 3.2.dsDNA nın PGE Yüzeyine Farklı Sürelerde İmmobilize Edilmesinin Elektrokimyasal Yanıta Etkisinin İncelenmesine İlişkin Bulgular: Çalışma, yöntem de anlatıldığı gibi uygulandı. Aktive edilmiş PGE yüzeyine 16 µg/ml dsdna immobilize edildikten sonra, tüm parametrelere ait üçer ardışık ölçüm yapıldı. Çalışmalarımızda dsdna nın aktive edilmiş kalem elektroda tutturulma süresinde yapılan değişikliğin, guanin sinyalinde nasıl bir değişikliğe sebep olacağını tespit etmek amaçlanmıştır Şekil 26: dsdna nın PGE yüzeyine farklı sürelerde immobilize edilmesi sonucunda ölçülen guanin bazına ait sinyalleri gösteren histomogram: a-7,5 dakika, b-15 dakika, c-30 dakika.

81 71 Sonuç olarak dsdna nın PGE yüzeyine immobilize edilme süresi arttıkça, ölçülen guanin yükseltgenme sinyalinde artış gözlendi PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyondaki ssdna nın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışmadan Elde Edilen Bulgular: Çalışma, yöntem de anlatıldığı şekilde yapıldı. Tüm parametrelere ait üçer ardışık ölçüm alındı. Deneyimizde ssdna nın konsantrasyonunda yapılan değişikliğin, guanin sinyalinde nasıl bir değişikliğe sebep olacağını tespit etmek amaçlanmıştır. Şekil 27: Farklı konsantrasyonlarda ssdna immobilize edilmiş PGE ile ölçülen guanin bazına ait diferansiyel puls voltamogramları: a-1 µg/ml, b- 2 µg/ml, c- 4 µg/ml, d- 8 µg/ml, e- 16 µg/ml, f- 32 µg/ml ssdna.

82 72 Aktive edilmiş PGE yüzeyine değişik konsantrasyonlardaki ssdna immobilize edildikten sonra guanin bazına ait yükseltgenme sinyalleri ölçüldü. En tekrarlanabilir sonuç, 16 µg/ml konsantrasyondaki ssdna kullanıldığında elde edildi. ssdna konsantrasyonu arttıkça, guanin sinyalinde de artma gözlendi. Aynı dsdna kullanılarak yapılan çalışmada olduğu gibi, ssdna kullanılarak yapılan çalışmada da ssdna konsantrasyonu arttıkça guanin sinyalinde artış gözlendi. Tek sarmal DNA(ssDNA) da guanin bazlarının karşı sarmaldaki sitozin bazlarıyla bağ yapmamış olması ve dolayısıyla yükseltgenmeye daha musait olması nedeniyle, guanin bazına ait pik akımı, çift sarmal DNA(dsDNA) da gözlenen guanin pik akımına kıyasla daha büyüktür. Şekil 28: PGE yüzeyine tutturulmuş 16 µg/ml konsatrasyondaki dsdna ve ssdna nın 1 V civarında gözlenen guanin yükseltgenme pik akımlarına ait diferansiyel puls voltamogramı. a) ssdna daki guanin bazına ait yükseltgenme pik akımı b) dsdna daki guanin bazına ait yükseltgenme pik akımı

83 PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen Farklı Konsantrasyonlardaki İlacın Elektrokimyasal Tayinine Yönelik Çalışmadan Elde Edilen Bulgular: Çalışma, yöntem te anlatıldığı şekilde yapıldı. Tüm parametrelere ait üçer ardışık ölçüm alındı. Çalışmalarımızda kullanılan ilacın konsantrasyonunda yapılan değişikliğin, ilaç sinyalinde nasıl bir değişikliğe sebep olacağını tespit etmek amaçlanmıştır. Şekil 29: PGE yüzeyine tutturulmuş farklı konsantrasyonlardaki ilaç sinyallerine ait diferansiyel puls voltamogramı: a) 25 µm konsantrasyondaki ilaç sinyali b) 50 µm konsantrasyondaki ilaç sinyali c) 100 µm konsantrasyondaki ilaç sinyali

84 74 Şekil 30: PGE yüzetine tutturulmuş farklı konsantrasyonlardaki ilaç sinyallerine ait histomogram a) 25 µm konsantrasyondaki ilaç sinyali b) 50 µm konsantrasyondaki ilaç sinyali c) 100 µm konsantrasyondaki ilaç sinyali. Sonuç olarak, İlaç konsantrasyonu arttıkça 0.75 V civarında gözlenen ilaç sinyallerinde de bir artış olmaktadır Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltilerinin, Guanin Yükseltgenme Pik Akımına Olan Etkilerinin PGE ile Elektrokimyasal Olarak İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular: Çalışma, yöntem de anlatıldığı gibi yapıldı.

85 75 Çalışmalarımızda dsdna ile etkileşimde kullanılan ilacın konsantrasyonunda yapılan değişikliğin; ilacın kendi sinyalinde ve guanin, adenin bazlarının sinyallerinde nasıl bir değişikliğe sebep olacağını tespit etmek amaçlanmıştır Farklı konsantrasyonlarda (5µM, 10µM, 25µM, 50µM, 100µM) hazırlanmış ilaç çözeltilerinin PGE yüzeyine modifiye edilmiş çift sarmal DNA ile etkileşmesi sonucu DNA nın elektroaktif bazı olan guanine ait +1,0 V da gözlenen yükseltgenme pik akımındaki ve ilaç çözeltisinin V civarında gözlenen yükseltgenme pik akımındaki değişime ait elde edilen voltamogram ve histomogram aşağıdaki gibidir. Şekil 31: PGE yüzeyine tutturulmuş 20 µg/ml konsatrasyondaki dsdna nın farklı konsantrasyonlardaki ilaç çözeltisi ile etkileşiminde ilaç sinyalindeki değişiklikleri gösteren diferansiyel puls voltamogramı: (a)5 µm (b)10µm (c)25 µm (d)50 µm (e)100 µm konsantrasyondaki ilaç çözeltisinin dsdna ile etkileşimi sonucu elde edilen sinyali.

86 76 PGE yüzeyine tutturulmuş 20 µg/ml konsatrasyondaki dsdna nın farklı konsantrasyonlardaki ilaç çözeltileri ile etkileşiminde ilaç çözeltisinin konsantrasyonu arttıkça V civarında gözlenen ilaç sinyallerinde de artış olmaktadır. Şekil 32: PGE yüzeyine tutturulmuş 20 µg/ml konsatrasyondaki dsdna nın farklı konsantrasyonlardaki ilaç çözeltileri ile etkileşiminde guanin ve adenin sinyallerindeki değişikliklere ait diferansiyel puls voltamogramı: (a) 50 µm (b) 100 µm (c) 25 µm (d) 10 µm (e) 5 µm konsantrasyondaki ilaç çözeltisinin dsdna ile etkileşimi sonucu elde edilen guanin ve adenin bazlarına ait sinyaller.

87 77 Şekil 33: PGE yüzeyine tutturulmuş 20 µg/ml konsantrasyondaki dsdna nın farklı konsantrasyonlardaki ilaç çözeltileri ile etkileşimi sonucu guanin yükseltgenme pik akımındaki değişikliğe ait histomogram. PGE yüzeyine tutturulmuş 20 µg/ml konsantrasyondaki dsdna nın guanin bazına ait yükseltgenme sinyali ilaç çözeltisi ile etkileşim sonucu, ilaç çözeltisinin konsantrasyonu ile doğru orantılı olarak azalmaktadır. Sonuç olarak ilaç çözeltisinin konsantrasyonu arttıkça, ilaç sinyali artmakta ancak guanin ve adenin bazlarına ait sinyaller azalmaktadır Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltilerinin, Guanin Yükseltgenme Pik Akımına Olan Etkilerinin PGE ile Elektrokimyasal Olarak İncelenmesinden Elde Edilen Bulgular: Çalışma, yöntem de anlatıldığı gibi yapıldı.

88 78 Deneyimizde dsdna ile etkileşimde kullanılan ilacın konsantrasyonunda yapılan değişikliğin; ilacın kendi sinyalinde, DNA nın guanin ve adenin bazlarının sinyallerinde nasıl bir değişikliğe sebep olacağını tespit etmek amaçlanmıştır Farklı konsantrasyonlarda (25 µm, 50 µm,100 µm ) hazırlanmış ilaç çözeltilerinin PGE yüzeyine modifiye edilmiş çift sarmal DNA ile etkileşmesi sonucu DNA nın elektroaktif bazı olan guanine ait +1,0 V da gözlenen yükseltgenme pik akımındaki ve ilaç çözeltisinin V civarında gözlenen yükseltgenme pik akımındaki değişime ait voltamogram ve histomogram aşağıdaki gibidir. Şekil 34: PGE yüzeyine tutturulmuş 20 µg/ml konsatrasyondaki dsdna nın farklı konsantrasyonlardaki ilaç çözeltisi ile etkileşiminde ilaç pik akımındaki değişiklikleri gösteren diferansiyel puls voltamogramı: (a)100 µm (b)50 µm (c)25 µm konsantrasyondaki ilaç çözeltisinin dsdna ile etkileşimi sonucu elde edilen yükseltgenme pik akımı

89 79 Şekil 35: PGE yüzeyine tutturulmuş 20 µg/ml konsatrasyondaki dsdna nın farklı konsantrasyonlardaki ilaç çözeltisi ile etkileşimine ait histogram: (a) 100 µm (b) 50 µm (c)25 µm konsantrasyondaki ilaç çözeltisinin dsdna ile etkileşimi sonucu elde edilen sinyal. Sonuç olarak PGE yüzeyine tutturulmuş 20 µg/ml konsatrasyondaki dsdna ile farklı konsantrasyonlardaki ilaç çözeltisinin etkileşiminde; ilaç çözeltisinin konsantrasyonu arttıkça, ilaç sinyali artmakta ancak guanin ve adenin bazlarına ait sinyaller azalmaktadır Farklı Konsantrasyonlardaki İlaç Çözeltilerinin, Guanin Yükseltgenme Pik Akımına Olan Etkilerinin PGE ile Elektrokimyasal Olarak İncelenmesinden Elde Edilen Bulgular: Çalışma, yöntem te anlatıldığı gibi yapıldı. Çalışmalarımızda dsdna ile etkileşimde kullanılan ilacın konsantrasyonunda yapılan değişikliğin, ilacın kendi pik akımında, DNA nın guanin ve adenin

90 80 bazlarının yükseltgenme pik akımlarında nasıl bir değişikliğe sebep olacağını tespit etmek amaçlanmıştır. 25 µm konsantrasyonda hazırlanmış ilaç çözeltisinin PGE yüzeyine modifiye edilmiş çift sarmal DNA ile etkileşmesinin DNA nın elektroaktif bazı olan guanine ait +1,0 V da gözlenen yükseltgenme pik akımındaki ve ilaç çözeltisinin V civarında gözlenen yükseltgenme pik akımındaki değişime ait voltamogram ve histomogram aşağıdaki gibidir. Şekil 36: PGE yüzeyine tutturulmuş 20 µg/ml konsantrasyondaki dsdna nın 25 µm konsantrasyodaki ilaç çözeltisi ile etkileşimine ait diferansiyel puls voltamogramı: (a) ilaç çözeltisinin dsdna ile etkileşimi sonucu elde edilen yükseltgenme pik akımı (b) ilaç çözeltisinin etkileşim öncesi elde edilen pik akımı (c) dsdna nın etkileşim öncesi elde edilen yükseltgenme pik akımı

91 81 Şekil 37: PGE yüzeyine tutturulmuş 20 µg/ml konsatrasyondaki dsdna nın 25 µm konsantrasyondaki ilaç çözeltisi ile etkileşimine ait histomogram: (a)etkileşim öncesi ilaç (a1) ve dsdna (a2) sinyali (b) 25 µm konsantrasyondaki ilaç çözeltisinin dsdna ile etkileşimi sonucu elde edilen ilaç (b1) ve dsdna (b2) sinyali. Sonuç olarak PGE yüzeyine tutturulmuş 20 µg/ml konsatrasyondaki dsdna ile ilaç çözeltisinin etkileşimi sonucunda, ilaç sinyali de guanin sinyali de azalmaktadır ssdna nın İlaç ile Etkileşimine Dayalı Çalışmaların İncelenmesinden Elde Edilen Bulgular: Çalışmada, yöntem de anlatıldığı gibi yapıldı.

92 82 Şekil 38: 25 µm konsantrasyondaki ilaç çözeltisinin PGE yüzeyinde ssdna ve dsdna ile etkileşimine ait diferansiyel puls voltamogramı. (a) etkileşim öncesi ssdna nın guanin bazına ait yükseltgenme pik akımı (b) etkileşim öncesi dsdna nın guanin bazına ait yükseltgenme pik akımı (c) etkileşim sonrası dsdna nın guanin bazına ait yükseltgenme pik akımı ve ilaç pik akımı (d) etkileşim sonrası dsdna nın guanin bazına ait yükseltgenme pik akımı ve ilaç pik akımı.

93 83 Şekil 39: 25 µm konsantrasyondaki ilaç çözeltisinin PGE yüzeyinde ssdna ve dsdna ile etkileşimine ait histomogram. (1)sırasıyla ilacın dsdna ve ssdna ile etkileşim sonucu oluşan yükseltgenme pik akımı (2)sırasıyla ilacın dsdna ve ssdna ile etkileşimi sonucunda guanin bazına ait yükseltgenme pik akımı. Şekil 40: 25 µm konsantrasyondaki ilaç çözeltisinin PGE yüzeyinde ssdna ve dsdna ile etkileşimine ait diferansiyel puls voltamogramı.

94 84 Şekil 41: 25 µm konsantrasyondaki ilaç çözeltisinin PGE yüzeyinde ssdna ve dsdna ile etkileşiminde; etkileşim öncesi ve sonrası ilaç sinyalindeki değişikliğe ait histomogram. Şekil 42: 25 µm konsantrasyonda hazırlanan ilaç çözeltisinin PGE yüzeyinde ssdna ve dsdna ile etkileşiminde; etkileşim öncesi ve sonrası dsdna ve ssdna nın guanin yükseltgenme pik akımındaki değişikliğe ait histomogram 1) etkileşim öncesi dsdna ve etkileşim sonrası dsdna yükseltgenme pik akımı. 2) etkileşim öncesi ssdna ve etkileşim sonrası ssdna yükseltgenme pik akımı.

95 85 Sonuç olarak; ilacın dsdna ve ssdna ile etkileşimi sonucunda ilaç sinyalinde azalma olmaktadır. Ancak ilacın dsdna ile etkileşim sonrası sinyali, ssdna ile etkileşim sonrası sinyalinden daha yüksek olmaktadır. Bu durum eczacılık fakültesinde sentezlenmiş olan bu ilacın yeni bir interkalatör madde olacağını düşündürmekte olup, bu konu ile ilgili çalışmalar devam etmektedir ph Değişiminin Etkilerinin İncelenmesinde Elde Edilen Bulgular ph Değişiminin PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen ilaç Sinyaline Etkisinin İncelenmesinden Elde Edilen Bulgular: Çalışma, de anlatılan yöntem ile yapıldı. Deneylerimizde ph değişiminin PGE yüzeyine immobilize edilen ilaç sinyalinde nasıl bir değişiklik yaptığının tespiti amaçlanmıştır. Şekil 43: 25 µm konsantrasyonda hazırlanmış olan ilaç çözeltilerinin farklı ph lardaki tampon çözeltiler içerisinde alınmış ölçüm sonuçlarına ait diferansiyel puls voltamogramı.

96 86 Ortam asidik olduğunda yani ph ı 4,8 olan asetat tamponunda alınan ilaç sinyali V civarında olmaktadır. Ancak ph yükseldikçe yani ortam bazikleştikçe ilaç sinyali V civarından V civarına kaymakta ve sinyalin yüksekliği azalmaktadır ph Değişiminin, PGE Yüzeyine İmmobilize Edilen dsdna ile Etkileşime Giren İlaç Sinyali Üzerine Olan Etkisinin İncelenmesinden Elde Edilen Bulgular: Deneyimizde dsdna ile 25 µm konsantrasyondaki ilaç çözeltisinin etkileşimi esnasında çalışma ortamının ph değişiminin, ilaç ve dsdna sinyalinde nasıl bir değişikliğe neden olduğunun tespiti amaçlanmıştır. Şekil 44: Kalem elektrot yüzeyinde dsdna ile etkileşime giren 25 µm ilaç çözeltisinin farklı ph ları olan tampon çözeltiler içinde alınmış ölçüm sonuçlarına ait diferansiyel puls voltamogramı.

97 87 Ölçüm çözeltisinin ph ı arttıkça ilaç, guanin ve adenine ait sinyaller orijinal değerlerinden kaymakta; adenin ve guanin bazına ait yükseltgenme sinyalleri de ph arttıkça azalmaktadırlar..

98 88 BÖLÜM IV TARTIŞMA 4.1. dsdna ile İlaç Etkileşimlerinin Genel Olarak İncelenmesi: Şekil 45: Kalem elektrot yüzeyinde dsdna ile etkileşime giren farklı konsantrasyonlardaki ilaç çözeltilerinin etkileşim sonrası sinyallerine ait diferansiyel puls voltamogramı. Şekil 45 e göre PGE yüzeyine immobilize edilen dsdna ile etkileşen farklı konsantrasyonlardaki ilaç çözeltileri incelendiğinde konsantrasyon arttıkça etkileşim sonrasında da ilaç sinyalinin arttığı tespit edilmiş ve optimum değerler 25 µm konsantrasyonda hazırlanan ilaç çözeltisi ile çalışıldığında elde edilmiştir. Yapılan konsantrasyon çalışmaları sonucunda optimum ilaç konsantrasyonu olarak 25 µm saptanmıştır.

99 89 İlaç DNA etkileşimlerindeki çalışma prosedürü; 29, 79, 89 ve 90 no lu yayınlardaki gibi yapılmış ve elde edilen bulgular bu yayınlar ile desteklenmiştir. Şekil 46: Kalem elektrot yüzeyinde farklı konsantrasyonlardaki ilaç çözeltileri ile etkileşime giren dsdna nın etkileşim sonrası guanin ve adenin bazlarının yükseltgenme pik akımını gösteren diferansiyel puls voltamogramı. Şekil 46 ya göre PGE yüzeyine immobilize edilen dsdna nın farklı konsantrasyonlardaki ilaç çözeltileri ile etkileşimi sonrasında ilaç konsantrasyonu arttıkça guanin ve adenin bazlarının yükseltgenme pik akımlarının azaldığı tespit edilmiş ve optimum değerler 25 µm konsantrasyonda hazırlanan ilaç çözeltisi ile çalışıldığında elde edilmiştir.

100 90 Şekil 47: Kalem elektrot yüzeyinde 25 µm konsantrasyondaki ilaç çözeltisinin dsdna ile etkileşimi sonrası ilaç sinyalini ve guanin bazının yükseltgenme sinyalini gösteren diferansiyel puls voltamogramı. Kalem grafit elektrot ile yapılan guanin bazının yükseltgenmesine dayalı bu çalışmalar literatürlerde karbon elektrot kullanılarak yapılmıştır (9, 10, 14). Kalem grafit elektrot kullanılarak yapılan bu çalışmalar, sözü edilen literatürlere göre daha ucuz ve daha hassas bir çalışma imkanı sağlamıştır. Etkileşimlere genel olarak bakıldığında; kalem grafit elektrot yüzeyinde meydana gelen ilaç ve dsdna etkileşimleri sonrasında dsdna ve ilaç sinyalinde azalma tespit edilmiştir. İlaç konsantrasyonu arttıkça ilaç sinyalinde artış gözlenmiş ancak bu hiçbir zaman tek başına ilacın vermiş olduğu sinyal yüksekliğine ulaşamamıştır. Etkileşimde ilaç konsantrasyonu çok az da olsa guanin ve adenin bazlarının tek başlarına vermiş oldukları sinyallere göre muhakkak bir azalma göstermiş ve ilaç konsantrayonu arttıkça bu azalma daha belirgin hale gelmiştir.

101 91 ssdna ve dsdna ile ilaç etkileşimleri karşılaştırıldığında ilaç ve bazlara ait sinyallerde yine bir düşme tespit edilmiş ancak ssdna ile etkileşim sonrası guanin sinyalinde bir düşüş olmakla beraber bu sinyal dsdna ile etkileşim sonrası elde edilen guanin sinyalinden daha yüksek olmuştur. Bu özelliğinden dolayı yeni bir hibridizasyon indikatörü olduğu saptanmıştır.

102 92 BÖLÜM V SONUÇ VE ÖNERİLER Çalışmalarımızda, yeni sentezlenmiş çeşitli maddelerin DNA ile etkileşmesini tayin etmek amacıyla elektrokimyasal biyosensör tasarımı gerçekleştirildi. Bu amaçla yüzeyine dsdna ve ssdna tutturulmuş kalem grafit elektrodu (PGE) kullanılarak çeşitli maddelerin etkileşim çalışmaları yapıldı. Elektrokimyasal tayin yöntemi olarak diferansiyel puls voltametrisi (DPV) kullanıldı. Bu maddelerin dsdna ve ssdna ile etkileşmesi sonunda DNA nın elektroaktif bazı guaninin oksidasyon pik akımında ve ilacın pik akımında azalma gözlendi. DNA ile etkileşen bu maddelerin voltametrik davranışlarının tayini, kemoterapide kullanılan DNA ya özgü olarak bağlanan moleküllerin dizayn edilmesi ve DNA ya bağlı hasta başı teşhislerinde kullanılan küçültülebilir biyoteknolojik cihazların geliştirilmesinde önemlidir. Gerçekleştirilen bu çalışmaların amacı, yeni sentezlenen bileşiklerin DNA ile etkileşimini tayin ederek madde-dna etkileşim mekanizmalarının aydınlatılmasında kullanılabilecek tek kullanımlık elektrot sistemleri ile kombine, hızlı ve güvenli elektrokimyasal yöntemlerin geliştirilmesidir. Kullanılan yöntem basit ve ucuz maliyetli olup; hızlı ve güvenilir yanıtlar vermektedir. Etkileşim çalışması yapılan maddeler dsdna ve ssdna ile etkileşerek guanin oksidasyon sinyalinde azalmaya neden oldu. Bu azalma dsdna ve ssdna

103 93 ile guanin bazı üzerinden etkileşen bu maddelerin guaninin yükseltgenmesini engellediği şeklinde yorumlanabilir. Sonuç olarak çalışmalarımızda yeni sentezlenmiş maddelerin dsdna ve ssdna ile etkileşmesinin incelenmesi amacıyla; hızlı, güvenilir ve ucuz maliyetle elektrokimyasal tayin yöntemi geliştirilmiştir.

104 94 ÖZET Çalışmamızda; bazı maddelerin çift sarmal DNA ve tek sarmal DNA ile etkileşimi kalem grafit elektrot(pge) kullanılarak incelendi. Elektrokimyasal yöntem olarak diferansiyel puls voltametri tekniği kullanıldı. Çalışılan maddelerin dsdna ve ssdna ile etkileşim sonrasında guanin bazının yükseltgenme sinyalini azalttığı gözlendi. Sonuç olarak çalışmalarımızda yeni sentezlenmiş maddelerin DNA ile etkileşmesinin incelenmesi amacıyla; hızlı, güvenilir ve ucuz maliyetle elektrokimyasal tayin yöntemi geliştirildi. Bu tayin yöntemi, yeni tasarlanan ilaç ve tayin yöntemlerinin geliştirilmesi ve çevre kirliliğine yol açan toksik maddelerin tayinlerine yönelik yeni yöntemlerin geliştirilmesi açısından önemlidir.

105 95 SUMMARY The interaction between different compounds and double stranded DNA was studied by using pencil graphite electrode in this study. Diferential pulse voltammetry was used as an electrochemical method. In all compounds studied here, it was found that there was a decrease at guanine oxidation signal after the interaction between compounds ds/ssdna, As a conclusion, fast, reproducible and inexpensive electrochemical technique was performed in order to study on the detection of interaction between newly synthesized compounds and DNA. It is important due to development of new drugs designed and their analysis and also the development of new techniques that can be used for detection of toxic compounds causing to enviromental pollution.

106 96 YARARLANILAN KAYNAKLAR 1. Alptuzun V, Kapkosa P, Baumann K, Erciyas E, Holzprahe B, Journal of Pharmacy and paharmacology 55, , Analitik Kimyanın Temelleri, Skoog, D. A., West, D.A., Holler, F.J., Çeviri editörleri; Prof. Dr. Esma Kılıç, Prof. Dr. Fitnat Köseoğlu, (1996), Bilim Yayıncılık, 7. Baskı, Barry, J.P., Barry, J.P., Norwood, C., Vouros, P., (1996). Detection and identification of Benzo[a]pyrene diol epoxide adducts to DNA utilizing capillary electrophoresis- electrospray mass spectrometry, Anal. Chem., 68: Barton, J.K., Goldberg, J.M., Kumar, C.V., Turro, N.J., (1986). Binding modes and base spesificity of tris (phenantroline) ruthenium (II) enantiomers with nucleic acids: tunning the stereoselectivity, J. Am. Chem. Soc., 108: Bej, A.K. (1996). Chapter 1: Nucleic acid hybridizations: principles and strategies, Nucleic acid analysis: Principles and Bioapplications; Ed. Dangler,C.A., Wiley-Liss, Inc., s Bertino, J.R. (1992). Antineoplastic Drugs, Textbook of Pharmacology, Smith, C.M. and Reynard, A.M., Section IX - Cancer Chemotheraphy; W. B. Saunders Company, USA;

107 97 7. Brabec, V. (1983). Conformational changes in DNA induced by its adsorption at negatively charged surfaces - The effects of base composition in DNA and the chemical nature of the adsorbent, Bioelectrochem. Bioenerg., 11: Brabec, V., Dryhurst, G. (1978). Electrochemical behaviour ofnatural and biosynthetic polynucleotides at the pyrolytic graphite electrode a new probe for studies of polynucleotide structure and reactions, Electroanal. Chem., 89: Brabec, V., Koudelka, J. (1980). Oxidation of deoxyribonucleic acid at carbon electrodes. The effect of the quality of the deoxyribonucleic acid sample, Bioelectrochem. Bioenerg., 7: Brett, A.M. Oliveira, Macedo, T.R.A., Raimundo, D., Marques, M.H., Serrano, S.H.P. (1998). Voltammetric behaviour of mitoxantrone at a DNA-biosensor, Biosensors and Bioelectronics, 13: Brett, A.M. Oliveira, Serrano, S.H.P., Gutz, I., La-Scalea, M.A., Cruz, M.L. (1997). Voltammetric behaviour of nitroimidazoles at a DNA-biosensor, Electroanalysis, 9: Brett, A.M. Oliveira, Serrano, S.H.P., Macedo, T.A., Raimundo, D., Marques, M. H., La-Scalea, M.A. (1996). Electrochemical determination of Carboplatin in serum using a DNA-modified glassy carbon electrode, Electroanalysis, 8: Brett, C.M.A., Brett, A,M,O. (1992). Electrochemistry, Oxford University Press, 3.baskı

108 Cai, X., Rivas, G., Farias, P. A. M., Shiraishi, H., Wang, J., Palecek, E. (1996). Evaluation of different carbon electrodes for adsorptive stripping analysis of nucleic acids, Electroanalysis, 8 (8-9): Cai, X., Rivas, G., Farias, P.A.M., Shiraishi, H., Wang, J., Fojta, M., Palecek, E. (1996). Trace measurements of plasmid DNAs by adsorptive stripping potentiometry at carbon paste electrodes, Bioelectrochem. Bioenerg., 40: Cai, X., Rivas, G., Shirashi, H., Farias, P., Wang, J., Tomschik, M., Jelen, F., Palecek, E. (1997). Electrochemical analysis of formation of polynucleotide complexes in solution and at electrode surfaces, Anal. Chim. Acta, 344: Camman, K. Lemke, U. Rohen, A. Sander, J. Wilken, H. Winter, B. (1991). Chemical Sensors and Biosensors-Principles and Applications, Angew. Chem. Int. De Engl. 30: Carter, M.T. and Bard, A. J. (1987). Voltammetric studies of the interaction of tris (1,10-phenanthroline) cobalt (III) with DNA, J. Am. Chem. Soc.109: Carter, M. T.Rodriguez, M. Bard, A. J. (1989) Voltammetric studies of the interaction of metal chelates with DNA. 2. Tris chelated complexes of Cobalt (III) and Iron (II) with 1,10-phenantroline and 2, 2 -Bipyridine, J. Am. Chem. Soc. 111: Chiti, G. Marazza, G. Mascini, M. (2001). Electrochemical DNA biosensor for environmental monitoring, Anal. Chim. Acta, 427:

109 Collins, F.S.Patrinos, A. Jordan, E., Chakravarti, A. Gesteland, R. Walters, L. and the members of the DOE and NIH planning groups. (1998). New goals for the U.S. Human Project: , Science, 282: Coulet, P. R. (1991). What is a Biosensor?, Chapter 1; Biosensor principles and applications, Editörler; L.J.Blum, P.R. Coulet, Marcel Dekker Inc., New York, Deforce, D.L.D., Ryniers, F.P.K., Van den Eeckhout, E.G., Lemiere, F. Esmans, E.L.(1996). Analysis of DNA adducts in DNA hydrolysates by capillary zone electrophoresis and capillary zone electrophoresiselectrospray mass spectrometry, Anal. Chem., 68: Denissenko, M.F., Pao, A., Tang, M.S., Pfeifer, G.P. (1996). Preferential formation of Benzo[a]pyrene adducts at lung cancer mutational hotspots in p53, Science, 274: Dervan, P. B. (1986). Design of Sequence-spesific DNA-binding molecules, Science, 232: Dervan, P.B. (1998). Sequence specific recognition of double helical DNA. A synthetic approach, Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol.2: Ed. Eckstein,F. and Lilley, D.M.J., Springer-Verlag, Berlin, s DNA structure and Function; Chapter 1- Introduction to the Structure, properties, and reactions od DNA; Editör, R. R. Sinden, Academic Press, California, 1994, sayfa Enstrümental Analiz, Prof. Dr. Atilla Yıldız ve Prof. Dr. Ömer Genç, Hacettepe Yayınları A-64, 1993, sayfa; Erdem A, Ozsoz M. (2001). Interaction of the anticancer drug epirubicin with DNA, Anal. Chim. Acta, 437:

110 Erdem A., Ozsoz M. (2001). Voltammetry of the anticancer drug mitoxantrone and DNA, Turk. J. Chem, 25: Erdem A. Isabel Pividori M. Del Valle M., Alegret S. (2004). Rigid carbon composites: a new transducing material for label-free electrochemical genosensing, Journal of Electroanalytical Chemistry, 567: Erdem A., Kerman K., Meriç B., Akarca U.S., Ozsoz M. (1999). DNA electrochemical biosensor for the detection of short DNA sequences related to the hepatitis B virus, Electroanalysis, 11: Erdem A., Kerman K., Meriç B., Akarca U.S., Ozsoz M. (2000). Novel hybridization indicator methylene blue for the electrochemical detection of short DNA sequences related to the hepatitis B virus, Anal. Chim. Acta, 422: Erdem A., Ozsoz M. (2002). Electrochemical DNA biosensors based on DNA- Drug interactions, Electroanalysis, 14: Evans; A.(1991). Potentiometry and ISE, ACOL, London, s Farmakoloji - İlaç uygulamalarında temel kavramlar, (1992). 63.Bölüm: Antikanser İlaçlar, Editör, Prof. Dr. İsmet Dökmeci, Nobel Tıp Kitabevleri, Firedman, T., Borown, D.M. (1978). Base specific reactions useful for DNA sequencing: methylene blue sensitized photooxidationof guanine and osmium tetraoxidemodification of thymine, Nucl. Acids Res., 5: Fleisher, M.B., Mei, H.-Y. and Barton, J.K. (1998). Metal complexes which target DNA sites: coupling recognition to reactivity, Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol.2: Ed. Eckstein,F. and Lilley, D.M.J., Springer-Verlag, Berlin, s

111 Fojta M., Havran L., Palecek E. (1997). Chronopotentiometric detection of DNA strand breaks with mercury electrodes modified with supercoiled DNA, Electroanalysis, 9: Gooding J.J. (2002). Electrochemical DNA hybridization biosensors, Electroanal. 14: Hall, E.A.H.(1990). Biosensors, Ch.1: Biosensors in context, Open University Press, İngiltere; s Hibbert, D.B., Gooding, J.J., Erokhin, P.(2002). Kinetics of irreversible adsorption with diffusion: application to biomolecule immobilization, Langmuir, 18: Hodgson, J.,(1998). Shrinking DNA diagnostics to fill the markets of the future, Nature Biotech., 16: Hogue, C.(2000). Identifying carcinogens, Chem.&Eng. News, 76: Hoshino O., in: Cordell A.G. (Ed.), (1998). The alkoloids chemistry and pharmacology, Academic Press, 51: Jelen, F., Erdem A., Palecek, E. (2002). Cyclic voltammetry of echinomycin and its interaction with double-stranded and single-stranded DNA adsorbed at the electrode, Bioelectrochemistry, 55: Jelen, F., Tomschik, M., Palecek, E.(1997). Adsorptive stripping squarewave voltammetry of DNA, J. Electroanal. Chem., 423: Johnston, D. H., Glasgow, K. C., Thorp, H. H. (1995). Electrochemical Measurument of the solvent accessibility of nucleobases using electron transfer between DNA and Metal complexes, J. Am. Chem. Soc., 117:

112 Johnston, D. H., Thorp, H. H.(1996). Cyclic voltammetry studies of polynucleotide binding and oxidation by metal complexes: Homogeneous electron-transfer kinetics, J. Physc. Chem., 100: Johnston, D. H., Welch, T. W., Thorp, H. H. (1996). Electrochemically activated nucleic acid oxidation; Metal Ions in Biological systems, Sigel, A., Sigel, H. (Ed); Vol. 33: Marcel Dekker, Inc, NY; Ju, H., Zhou, J., Cai, C., Chen, H. (1995). The electrochemical behavior of methylene blue at a microclinder carbon fiber electrode, Electroanal., 7: Karadeniz H., Gulmez B., Sahinci F., Erdem A., Irem Kaya G., Unver N., Kivcak B., Ozsoz M. (2003). Disposable electrochemical biosensör for the detection of the interaction between DNA and lycorine based on guanine and adenine signals, J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 33: Kelley, S. O., Barton, J.K. (1997). Electrochemistry of methlene blue bound to a DNA-modified electrode, Bioconjugate Chem., 8: 1997, Kelley, S. O., Holmlin, R. E., Stemp, E.D.A. and Barton, J.K. (1997). Photoinduced electron transfer in Ethidium-modified DNA duplexes: dependence on distance and base stacking, J.Am. Chem. Soc., 119: Kelley, S. O.,Boon, E.M., Barton, J.K., Jackson, N.M., Hill, M.G. (1999). Single-base mismatch detection based on charge transduction through DNA, Nucl. Acids Res., 27:

113 Kerman K., Ozkan D., Kara P., Meric B., Erdem A., Nielsen P. E., Ozsoz M., (2003). Label - free bioelectronic detection of point mutation by using peptide nucleic acid probes and methylene blue, Electroanalysis, 15 (7): Kolakowski, B., Battaglini, F., Lee, Y. S., Giannoula, K., Mikkelsen, S. R. (1996). Comparison of an intercalating dye and an intercalant-enzyme conjugate for DNA detection in a microtiter-based assay, Anal. Chem., 68: Kulys, J., Hansen, H.E., Buch-Rasmussen, T., Wang, J., Ozsoz, M.(1994). Glucose biosensor based on the incorporation of Meldola Blue and glucose oxidase within carbon paste, Anal. Chim Acta, 288: Labuda J., Buckova M., Heilerova L., Caniova-Ziakova A., Brandsteterova E., Mattusch J., Wennrich R. (2002). Voltammetric detection of antioxidative properties of flavanoids using electrically heated DNA modified Carbon Paste Electrode, Sensors, 2: Levision, P.R., Dennis, J.W., Jones, K.D., Philpott, R.W., Taylor, S.L., Grimm, V.(1998). New approaches in the bindingof DNA for clinical applications, Clin. Chem., 44: Liu, J., Abid, S., Hail, M. E., Lee, M. S., Hangeland, J., Zein, N. (1998). Use of affinity capillary electrophoresis for the study of protein and drug interactions, Analyst, 123: Liu,S., Ye, J., He, P. ve Fang, Y. (1996). Voltammetric determination of sequence-spesific DNA by electroactive intercalator on graphite electrode, Anal. Chim. Acta, 335:

114 Lucarelli, F., Palchetti, I., Marazza, G., Mascini, M. (2002). Electrochemical DNA biosensor as a screening tool for the detection of toxicants in water and wastewater samples, Talanta, 56: Lukasova, E., Jelen, F. and Palecek, E. (1982). Electrochemistry of Osmium-Nucleic acid complexes: A probe for single-stranded and distorted double-stranded regions in DNA, Gen. Physiol., Biophys., 1: Marazza, G., Chianella, I., Mascini, M. (1999). Anal. Chim. Acta, 387: Marin, D., Perez, P., Teijeiro, C., Palecek, E. (1998). Interactions of surfaceconfied DNA with acid-activated mitomycin C, Biophysical Chemistry, 75: Mascini, M. (2001). Affinity electrochemical biosensors for the pollution control, Pure Appl. Chem., 73-1: McGown, L. B., Joseph, M. J., Pitner, J. B.,Vonk, G. P. ve Linn, C. P. (1995). The Nucleic acid ligand: A new tool for molecular recognition, Anal. Chem., 67: 663 A-668 A. 69. Mikkelsen, S. R. (1996). Electrochemical biosensors for DNA sequence detection- a review, Electroanalysis, 8 (1): Mikkelsen, S. R. (1994). Sequence-selective DNA Sensors for the diagnosis of inherited diseases (Voltametric), A.B.D Patent no: 5, 312, 527 (05/ 17/1994). 71. Millan, K. M., Mikkelsen, S. R. (1993). Sequence-selective biosensor for DNA Based on electroactive hybridization indicators, Anal. Chem., 65:

115 Millan, K. M., Saraullo, A., Mikkelsen, S. R. (1994). Voltammetric DNA Biosensor for cystic fibrosis based on a modified carbon paste electrode, Anal. Chem., 66: Millan, K. M., Spurmanis, A. J., Mikkelsen, S. R. (1992). Covalent immobilization of DNA onto glassy carbon electrodes, Electroanalysis, 4: Modern Drug Discovery (1999). Milestones of antisense oligonucleotide therapeutics, J.F. Ryan (Ed), Washington DC, 1-2: sayfa Molinier-Jumel, C., Malfoy, B., Reynaud, J. A. and Aubel-Sadron, G. (1978). Electrohemical study of DNA-Anthracyclines interactions, Biochemical and Biophysical Research Communications, 84 (2): Müller, W., Crothers, D. M. (1975).Interactions of heteroaromatic compounds with nucleic acids, Eur. J. Biochem., 54: Ozkan D., Erdem A., Kara P., Kerman K., Gooding J.J., Nielsen P.E., Ozsoz M., (2002), Electrochemical detection of hybridization using peptide nucleic acids and methylene blue on self-assembled alkanethiol monolayer modified gold electrodes, Electrochemistry Communications, 4: Ozkan, D., Karadeniz, H., Erdem, A., Mascini, M., Ozsoz, M. (2004). Electrochemical genosensor for Mitomycin C- DNA interaction based on guanine signal, J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 35: Ozsoz M., Erdem A., Kara P., Kerman K., Ozkan D. (2002). Electrochemical biosensor for the detection of interaction between arsenic trioxide and DNA based on guanine signal, Electroanalysis, 15: Palecek E., Fojta M. (2001). Detecting DNA hybridization and damage, Anal. Chem., 73: 74A.

116 Palecek, E. (1996). From Polarography of DNA to Microanalysis with Nucleic Acid Modified Electrodes, Electroanalysis, 8 (1): Palecek, E. (1994). Probing of DNA structure with osmium tetroxide complexes in vitro and in cells, F. Eckstein and D. M. J. Lilley (Ed), Nucleic acids and Molecular Biology, Vol. 8: Springer-Verlag Berlin, 1994, Palecek, E. (1988). Adsorptive transfer stripping voltammetry: determination of nanogram quantities of DNA immobilized at the electrode surface, Anal. Biochem., 170: Palecek, E. (1988). New trends in electrochemical analysis of nucleic acids, Bioelectrochem. Bioenerg., 20: Palecek, E. (1995). Nucleic acids: electrochemical and immunochemical methods, Encyclopedia of Analytical Science ( Alan Townshend (Ed)), London, Academic press, Vol. 6: Pandey, P. C., Weetall, H. H. (1994). Application of photochemical reaction in electrochemical detection of DNA intercalation, Anal. Chem., 66: Pandey, P. C., Weetall, H. H. (1995). Detection of aromatic compounds based on DNA intercalation using an evanescent wave sensor, Anal. Chem., 67: Pang, D. and Abruna, H. D. (1998). Micromethod for the investigation of the interaction between DNA and redox-active molecules, Anal. Chem., 70: Paz, M. M., Das, A., Tomasz, M. (1999). Mitomycin C linked to DNA minor groove binding and cros-linking properties and in vitro antitumor activity, Bioorganic&Medicinal Chemistry, 7:

117 Perez, P., Teijeiro, C., Marin, D.(1999). Interactions of surface-confined DNA with electroreduced Mitomycin C comparison with acid-activated Mitomycin C, Chemico-Biological Interactions, 117: Pietrzyk, D. J., Frank, C. W. (1979). Analytical Chemistry, 2.Baskı, Academic press: s Pividori, M.I., Merkoçi, A., Alegret, S. (2000). Electrochemical genosensor design: immobilisation of oligonucleotides onto transducer surfaces and detection methods, Biosensors and Bioelectronics, 15: Plambeck, J. A., Lown, J. W. (1984). Electrochemical Studies of antitumor antibiotics: V. An electrochemical method of measurement of the binding of Doxorubicin and Daunorubicin derivatives to DNA, J. Electrochem. Soc., 131 (11): Richardson, C. L., Springfield, G. E. S., Intercalation inhibition assay for compounds that interact with DNA or RNA, Amerikan patent no; 4,257,774 / 24 Mart 1981). 95. Schmeda-Hirschmann, G., Astudillo, L., Bastida, J., Viladomat, F., Codina, C. (2000). DNA binding activity of Amaryllidaceae Alkaloids, Bo. Soc. Chil. Quim. 45: Service, R. F. (1998). New focus: Microchip arrays put DNA on the spot, Science, 282: Steinbach, P. B., Hurtubise, R. J. (2000). Fluorescence of tetrols, tetrols complexed with DNA and benzo[a]pyrene-dna adducts in methanol/water solutions, Appl. Spect., 54: Takenaka, S., Ihara, T., Takagi, M. (1990). Bis-9 acridinyl derivative containing a violegen linker chain: electrochemically active intercalator for

118 108 reversible labelling of DNA, J. Chem. Soc., Chem. Communications, 21: Takeuchi, K. J., Thompson, M. S., Pipes, D. W., Meyer, T. J. (1984). Redox and spectral properties of monooxo polypyridyl complexes of ruthenium and osmium in Aqueous media, Inorg. Chem., 23: Teijeiro, C., Perez, P., Marin, D., Palecek, E. (1995). Cyclic voltammetry of Mitomycin C and DNA, Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 38: Temel Biyokimya 2, (1997). Bölüm 8: Bilgi Kaynağı olan Makromoleküller; Prof. Dr. T. Onat, Prof. Dr. K. Emerk (Ed); Saray Medikal Yayıncılık, 2. Baskı: sayfa Thayer, A. M. (1999). Deciphering Diseases, Chemical & Engineering News, M. Jacobs (Ed), American Chemical Society, North Carolina, The Merck Index, (1989). S. Budavari(Ed), Merck and Co. Inc., 11. baskı (Eleventh edition) Thorp, Holden, H. (1998). Cutting out the middleman: DNA biosensors based on electrochemical oxidation, Trends in Biotechnology, 16: Tomschik, M., Jelen, F., Havran, L., Trnkova, L., Nielsen, P. E., Palecek, E. (1999). Reduction and oxidation of peptide nucleic acid and DNA at mercury and carbon electrodes, J. Electroanal. Chem., 476: Tuite, E., Norden, B. (1994). Sequence-specific interactions of methylene blue with polynucleotides and DNA: A spectroscopic study, J. Am. Chem. Soc., 116: Turner, A. P. F. (1987). Biosensors: Fundamentals and Applications, Turner, A. P. F., Karube, I. and Wilson, G. S. (Ed); Oxford University Press, Oxford, sayfa v-vii.

119 Walkelin G., Laurence P., Waring Michael J. (1976). The binding Echinomycin to Deoxyribonuleic acid. Biochem J, 157: Wang, J. (1997). DNA electrochemical biosensors for environmental monitoring. A Review, Anal. Chim Acta, 347: Wang, A. H. J. (1987). Interactions between antitumor drugs and DNA, Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol.1: (Ed; Eckstein, F., Lilley, D.M.J., Springer-Verlag Berlin Heidelberg - Germany) 111. Wang, J., Cai, X., Rivas, G., Shiraishi, H. (1996). Stripping potentiometric transduction of DNA hybridization processes, Anal. Chim. Acta, 326: Wang, J., Cai, X., Rivas, G., Shiraishi, H., Farias, P. A. M., Dontha, N. (1996). DNA electrochemical biosensor for the detection of short DNA sequences related to the human immunodeficiency virus, Anal. Chem., 68: Wang, J., Fernandes, J. R., Kubota, L. T. (1998). Polishable and renewable DNA hybridization biosensors, Anal. Chem., 70: Wang, J., Kawde, A. N., Erdem, A., Salazar, M. (2001). Magnetic beadbased label-free electrochemical detection of DNA hybridization, Analyst, 126: Wang, J., Ozsoz, M., Cai, X., Rivas, G., Shiraishi, H., Grant, D.H., Chicarro, M., Fernandes, J. R. and Palecek, E. (1998). Interactions of antitumor drug daunomycin with DNA in solution and at the surface, Bioelectrochem. Bioenerg., 45:

120 Wang, J., Rivas, G., Cai, X.,, Shiraishi, H., Farias, A. M. P., Dontha, N., Luo, D. (1996). Accumulation and trace measuruments of phenothiazine drugs at DNA-modified electrodes, Anal. Chim. Acta, 332: Wang, J., Rivas, G., Cai, X., Palecek, E., Nielsen, P., Shiraishi, H., Dontha, N., Luo, D., Parrado, C., Chicharro, M., Farias, P. A. M., Valera, F. S., Grant, D. H., Ozsoz, M., Flair, M. N. (1997). DNA electrochemical biosensors for enviromental monitoring-a review, Anal. Chim. Acta, 347: Wang, J., Rivas, G., Fernandes, J. R., Jiang, M., Paz, J. L. L., Waymire, R., Nielsen, T. W., Getts, R. C. (1998). Adsorption and detection of DNA dendrimers at carbon electrodes, Electroanalysis, 10(8): Wang, J., Rivas, G., Fernandes, J. R., Paz, J. L. L., Jiang, M., Waymire, R. (1998). Indicator-free electrochemical DNA hybridization biosensor, Anal. Chim. Acta, 375: Wang, J., Rivas, G., Luo, D., Cai, X., Valera, F. S., Dontha, N. (1996). DNAmodified electrode for the detection of aromatic amines, Anal. Chem., 68: Wang, J., Rivas, G., Luo, D., Cai, X., Valera, F. S., Dontha, N., Farias, P. A. M., Shiraishi, H. (1996). DNA Biosensor for the detection of hydrazines, Anal. Chem., 68: Wang, J., Rivas, G., Ozsoz, M., Grant, D. H., Cai, X., Parrodo, C. (1997). Microfabricated electrochemical sensor for the detection of radiation-induced DNA damage, Anal. Chem., 69: Ward, D., Reich, E., Goldberg, I.H. (1965), Base specificity in the interaction of polynucleotides with antibiotics drugs, Science, 149:

121 Waring, M.J., Wakelin, L.P. (1974), Echinomycin: A biofunctional intercalating antibiotic, Nature, 252: Wilson, E. K. (1998). Instant DNA detection, Chem.& Eng. News, 76 (21): Xia, C., Guoli, S., Jianhui, J., Ruqin, Y. (1999). Intercalation of Pharmorubicin anticancer drug to DNA studied by cyclic voltammetry with analytical applications, Anal. Lett., 32 (4):

122 112 Ecz. Işıl CİN in Özgeçmişi Doğum Tarihi: 20/06/1981 Doğum Yeri: Balıkesir Yabancı Dil: İngilizce (iyi) Eğitim: İlköğrenimi: Atatürk İlkokulu ( ) Orta öğrenimi: Balıkesir 0rta Okulu ( ) Lise öğrenimi: Balıkesir Süper Lisesi ( ) Lisans Eğitimi: Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi (Eylül 1999 Eylül 2004) Yüksek Lisans Eğitimi: Ege Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Analitik Kimya Anabilim Dalı Yüksek Lisans programı (2007) Katıldığı Kongreler: Yapay Organlar EBİLTEM, Ege Üniversitesi, İzmir, 2004, Hücre Kültürü ve Sunum Yapılan Kongreler: Nano tr III, Bilkent Üniversitesi, Ankara, 2007, Electrochemical Bıosensor for The Interaction of DNA and β-ftalimido-n-feniletansülfonamid