EGE ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ (YÜKSEK LĐSANS TEZĐ) YÜKSEK SICAKLIK VE EKSTREM PH DA DEBARYOMYCES HANSENĐĐ STRAĐNLERĐNĐN BÜYÜMESĐ ÜZERĐNE SODYUMUN ETKĐSĐ Cengiz ÇORBACI Biyoloji Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: 401.01.04 Sunuş Tarihi: 24\04\2008 Tez Danışmanı: Prof. Dr. Füsun B. UÇAR Bornova-Đzmir
II
III Cengiz ÇORBACI tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak sunulan Yüksek Sıcaklık ve Ekstrem ph da Debaryomyces hansenii Strainlerinin Büyümesi Üzerine Sodyumun Etkisi başlıklı bu çalışma E.Ü. Lisansüstü Eğitim ve Öğretim Yönetmeliği ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Eğitim ve Öğretim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan değerlendirilerek savunmaya değer bulunmuş ve 24.04.2008 tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oybirliği/oyçokluğu ile başarılı bulunmuştur. Jüri Üyeleri: Đmza Jüri Başkanı : Prof. Dr. Füsun B. UÇAR... Raportör Üye : Doç. Dr. Mustafa ATEŞ... Üye : Prof. Dr. Abdurrahman Ü. TAMER...
IV
V ÖZET YÜKSEK SICAKLIK VE EKSTREM PH DA DEBARYOMYCES HANSENĐĐ STRAĐNLERĐNĐN BÜYÜMESĐ ÜZERĐNE SODYUMUN ETKĐSĐ ÇORBACI, Cengiz Yüksek Lisans Tezi, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Füsun B. UÇAR Nisan 2008, 186 sayfa Debaryomyces hansenii askomisetik bir mayadır, klasik peynirler ile sucuklarda çok sık rastlanır ve bu ürünlere özel tat sağlaması ile tanınır. Aynı zamanda, besinlerin ve meşrubatların bozunmasına da neden olmaktadır. Bu çalışma da 26 farklı örnekten (peynir, yoğurt, salatalık, sucuk, deniz suyu ve tuzlu su civarı toprak) maya izolasyonu yapılmış ve izole edilen 60 maya izolatından 36 tanesi, D. hansenii (%60) olarak tanılanmıştır. %10 ve %16 NaCl de büyüme, 37 o C de büyüme, izole edildikleri kaynak ve biyokimyasal karakteristikleri dikkate alınarak, 16 tane D. hansenii straininin seçimi yapılmış ve bunların büyümesi üzerine sıcaklık, ph ve artan NaCl konsantrasyonlarının etkisi araştırılmıştır. Ayrıca, D. hansenii NRRL Y- 7624 ve S. cerevisiae NRRL Y-12632 tip türünün büyümesi üzerine de stres faktörlerinin etkisi araştırılmıştır. Denemeler sonunda, D. hansenii strainleri, %14 ile %24 NaCl arasında değişen konsantrasyonlarda tuz stresine, yüksek sıcaklığa ve ekstrem ph derecelerine tolerans gösterebilmişlerdir. Stres faktörlerinin tek tek veya ikili yada üçlü
VI uygulamalarına karşı en yüksek toleransı; 11, 12, 23, 40, 47, 50, 52 ve 56 numaralı strainler göstermişlerdir. Bunların yanı sıra, artan NaCl konsantrasyonları, yüksek sıcaklık veya ekstrem ph, bazı D. hansenii strainleri üzerinde kolonial ve hücresel farklılıklar yaratmıştır. Anahtar Kelimeler: D. hansenii, tuz toleransı, yüksek sıcaklık, ekstrem ph
VII ABSTRACT EFFECT OF SODIUM ON GROWTH OF DEBARYOMYCES HANSENĐĐ STRAINS UNDER HIGH TEMPERATURE AND EXTREM PH CORBACI, Cengiz MSc in Biology Department Supervisor: Prof. Dr. Füsun B. UÇAR April 2008, 186 pages Debaryomyces hansenii is an ascomycetous yeast, it is the yeast most frequently found in traditional cheeses and sausages, with a recognized contribution to special flavours in these products. It is also known to be the causal agent of the spoilage of foods and beverages. In this study, yeasts isolation has been obtained from 26 sources (cheeses, yoghurts, gherkins, sausages, sea water and some earth from the banks of salt water) and 36 out of the 60 isolated yeasts isolates have been identified as D. hansenii (60 %). Growth at 10 % and 16 % NaCl, growth at 37 o C, taking into consideration the sources they have been isolated from and their biochemical characteristics, 16 D. hansenii strains have been selected and the effect of temperature, ph and increasing NaCl concentrations have been studied upon their growth. In addition, upon the growth of D. hansenii NRRL Y-7624 and S. cerevisiae NRRL Y-12632 type species, effect of stress factor has been studied. At the end of study, D. hansenii strains have been found out to tolerate salt stress in concentrations varying between 14 % and 24% NaCl, high temperature
VIII and extreme ph values. To the stress factors of single or double or triple applications; the 11 th, 12 th, 23 rd, 40 th, 47 th, 50 th, 52 nd and 56 th strains have shown the greatest tolerance. Also, increasing NaCl concentrations, high temperature or extreme ph values have created colonial and cellular differentiation on some D. hansenii strains. ph Keywords: D. hansenii, salt tolerance, high temperature, extrem
IX TEŞEKKÜR Tez konumun belirlenip yürütülmesinde bana destek olan ve yardımlarını esirgemeyen kıymetli hocam sayın Prof. Dr. Füsun B. UÇAR a, bilgi ve tecrübelerini benimle paylaşan sayın Araş. Gör. Dr. H. Tansel ÖZTÜRK YALÇIN a ve hiçbir zaman yardımlarını esirgemeyen Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bölümü eğitim elemanlarına ve araştırma görevlilerine, çalışmalarım sırasında bana yardımcı olan tüm arkadaşlarıma en içten dileklerimle teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca tez çalışmam süresince beni maddi-manevi destekleyen ve bulunduğum yere gelmemde büyük emekleri olan kıymetli aileme tüm kalbimle teşekkür ederim.
X
XI ĐÇĐNDEKĐLER Sayfa No ÖZET...V ABSTRACT... VII TEŞEKKÜR...IX ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ...XV ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ... XIX 1. GĐRĐŞ... 1 2. LĐTERATÜR ÖZETĐ... 9 2.1. Maya Taksonomisinin Tarihçesi... 9 2.2. Mayaların Mikrobiyal Ekolojisi... 12 2.3. Konvensiyonel Yöntemlerle Mayaların Tanılanması... 14 2.4. D. hansenii nin Filogeni, Ekoloji, Fizyoloji ve Moleküler Biyolojisi... 17 2.4.1. Filogeni... 17 2.4.2. Ekoloji... 19 2.4.3. Fizyoloji... 21 2.4.4. Moleküler Biyoloji... 24 2.5. D. hansenii nin Biyoteknolojik Proseslerde ki Uygulamaları... 27 2.5.1. Peynir Üretimi... 27 2.5.2. Et Fermentasyonu... 29 2.5.3. Kaliteli (Sağlıklı) Kimyasallar... 32 2.5.4. Litik Enzimler... 33
XII 2.5.5. Alditol Üretimi...36 2.6. Halotolerans...38 2.6.1. Gliserol Üretimi ve Akümülasyonu...38 2.6.2. Katyonların Hücre Đçine Alınımı...42 2.6.3. Hücre Đçinde ki Đyonların Tolere Edilmesi...45 2.6.4. Katyon Ekstrüksiyonu...47 2.6.5. Hog (High Osmolarity Glycerol) Yol Đzi...50 2.7. Gıdalarda Bozunmaya Yol Açan Maya Türleri ve Etkileri...52 2.8. Türkiye de Mayalar ile Đlgili Yapılan Çalışmalar...55 3. MATERYAL VE METOD...57 3.1. Materyal...57 3.1.1. Kullanılan Örnekler...57 3.1.2. Kullanılan Besiyerleri...57 3.1.3. Çözelti, Tampon ve Boyalar...64 3.2. Metod...67 3.2.1. Örneklerin Alınımı...67 3.2.2. D. hansenii Đzolasyonu...67 3.2.3. Đzolatların Tanılanmasında Kullanılan Fizyolojik Testler..68 3.2.4. Đzolatların Tanılanmasında Kullanılan Mikroskobik ve Morfolojik Testler...75 3.2.5. D. hansenii Strainlerinin Stres Faktörlerine Karşı Toleranslarının Belirlenmesi...77 4. BULGULAR...79 4.1. Đzolatların Elde Edilmesi...79 4.2. Đzolatların Fenotipik Tanılanması...80
XIII 4.3. Đzole Edilen Mayaların Sistematik Kategorileri... 91 4.4. Fenotipik Olarak Tanılanan Đzolatların Morfolojik ve Fizyolojik Özellikleri... 92 4.5. Đzolatların Mikroskobik ve Makroskobik Fotoğrafları... 102 4.6. D. hansenii Strainlerinin Stres Faktörlerine Karşı Toleransları... 111 4.6.1. Düşük ve Yüksek ph nın Büyüme Üzerine Etkisi... 112 4.6.2. Yüksek Sıcaklığın Büyüme Üzerine Etkisi... 114 4.6.3. Artan NaCl Konsantrasyonunun Büyüme Üzerine Etkisi 115 4.6.4. Düşük ve Yüksek ph da Büyüme Üzerine Sıcaklığın Etkisi... 117 4.6.5. Düşük ve Yüksek ph da Büyüme Üzerine NaCl ün Etkisi...... 118 4.6.6. Yüksek Sıcaklık Altında Büyüme Üzerine NaCl ün Etkisi...... 119 4.6.7. Yüksek Sıcaklık ve Ekstrem ph da Büyüme Üzerine NaCl ün Etkisi... 121 4.7. Çalışmadan Elde Edilen Diğer Sonuçlar... 135 5. TARTIŞMA... 136 KAYNAKLAR DĐZĐNĐ... 166 ÖZGEÇMĐŞ... 187
XIV
XV ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ Şekil Sayfa Şekil 2.1.D. hansenii de osmotik dengeyi sağlayan önemli transport modelleri (Breuer and Harms, 2006).... 41 Şekil 2.2.D. hansenii de katyon değişimlerinde gerekli olan transport sistemlerinin şematik gösterimi (Prista et al., 2005)... 44 Şekil 4.1.16 numaralı D. hansenii straininin MYGP Broth daki vejetatif hücrelerinin 27 o C de 3 günlük görünümü (1000X)... 102 Şekil 4.2.31 numaralı D. hansenii straininin Asetat Agar da askosporlarının 27 o C de 15 günlük görünümü (1000X)... 103 Şekil 4.3.17 numaralı D. hansenii straininin MYGP Agar da 2 günlük genel koloni görünüşü... 103 Şekil 4.4.D-Glukoz içeren Yeast Extract Broth da 27 o C de 5 günlük fermentasyon testi... 104 Şekil 4.5.Malt Yeast Glukoz Pepton Agar da 27 o C de 10 günlük kolonilerin DBB testi... 104 Şekil 4.6.Fenotipik tanılama testlerinde izolatların ekilmesinde izlenilen sıra... 105 Şekil 4.7.N-Base Agarda 27 o C de kolonilerin 2 günlük görünümü (Negatif kontrol)... 105 Şekil 4.8.D-Glukoz içeren N-Base Agarda 27 o C de kolonilerin 2 günlük görünümü (Pozitif kontrol)... 106 Şekil 4.9.Sükroz içeren N-Base Agarda 27 o C de kolonilerin 2 günlük görünümü... 106 Şekil 4.10.Gliserol içeren N-Base Agarda 27 o C de kolonilerin 2 günlük görünümü... 107
XVI Şekil 4.11.Me-α-D-Glukozid içeren N-Base Agarda 27 o C de kolonilerin 2 günlük görünümü...107 Şekil 4.12.Sellobioz içeren N-Base Agarda 27 o C de kolonilerin 2 günlük görünümü...108 Şekil 4.13.%0,1 Sikloheksimid içeren N-Base Agarda 27 o C de kolonilerin 2 günlük görünümü...108 Şekil 4.14.%0,01 Sikloheksimid içeren N-Base Agarda 27 o C de kolonilerin 2 günlük görünümü...109 Şekil 4.15.%10 NaCl içeren Yeast Ekstrakt Agarda 27 o C de kolonilerin 7 günlük görünümü...109 Şekil 4.16.%16 NaCl içeren Yeast Ekstrakt Agarda 27 o C de kolonilerin 7 günlük görünümü...110 Şekil 4.17.Nitrat içeren C-Base Agarda 27 o C de kolonilerin 2 günlük görünümü...110 Şekil 4.18.9 (I), 11 (II), 14 (III), 21 (IV), 31 (V) numaralı strainler ile birlikte D. hansenii NRRL Y-7624 tip türünün artan ph derecelerinde büyüyen kolonilerinin görünümü...124 Şekil 4.19.9 (I) ve 11 (II) numaralı strainlerin farklı koşullar altında büyüyen kolonilerinin görünümü...125 Şekil 4.20.11 (A) ve 35 (B) numaralı strainilerinin asidik ph da ki hücrelerinin görünümü (1000X)....125 Şekil 4.21.11 (A), 31 (B), 35 (C) ve D. hansenii NRRL Y-7624 tip türünün (D) bazik ph da göstermiş oldukları hücre morfolojileri (1000X)...126 Şekil 4.22.27 ve 37 o C de büyütülmüş 35 numaralı strainin hücrelerinin mikroskop altında ki görünümü (1000X)...127
XVII Şekil 4.23.27 ve 37 o C de büyütülmüş 11 numaralı strainin hücrelerinin mikroskop altında ki görünümü (1000X)... 128 Şekil 4.24.11 (I), 35 (II) ve 21 (III) numaralı D. hansenii strainlerinin 27 ve 37 o C de büyüyen kolonilerinin görünümü... 129 Şekil 4.25.9 (I), 11 (II), 14 (III) ve 35 (IV) numaralı strainlerin optimum sıcaklık ve ph altında %6 ve %12 NaCl de büyüyen kolonilerinin görünümü... 129 Şekil 4.26.21 numaralı straininin artan NaCl konsantrasyonlarında ki hücresel morfolojilerinin görünümü (1000X)... 130 Şekil 4.27.35 numaralı straininin artan NaCl konsantrasyonlarında ki hücresel morfolojilerinin görünümü (1000X)... 130 Şekil 4.28.11 (I) ve 35 (II) numaralı strainlerin 37 o C, asidik ve bazik ph da büyüyen kolonilerinin görünümü... 131 Şekil 4.29.9 (A), 11 (B), 14 (C), 21 (D), 31 (E), 35 (F) ve D. hansenii NRRL Y-7624 tip türünün (G) %12 NaCl ile asidik veya bazik ph içeren ortamda ki büyüyen kolonilerinin görünümü... 131 Şekil 4.30.11 (A), 31 (B) ve 35 (C) numaralı strainlerin 37 o C de %6 ve %12 NaCl lü ortamda büyüyen kolonilerinin görünümü... 132 Şekil 4.31. 14 (I) ve 16 (II) numaralı strainlerin 37 o C de %0 ve %6 NaCl içeren ortamlarda büyüyen kolonilerinin görünümü... 132 Şekil 4.32.11 (A) ve 35 (B) numaralı strainlerinin 37 o C altında belirli konsantrasyonlarda NaCl içeren asidik yada bazik ph lı ortamlarda büyüyen kolonilerinin görünümü... 133 Şekil 4.33.31 numaralı strainin optimum koşul ile sıcaklık ve ph nın bir arada uygulandığı koşulda oluşturduğu hücrelerin görünümü (1000X)... 133
XVIII Şekil 4.34.11 numaralı strainin optimum, tek başına bazik ph ile bazik ph ve tuzun bir arada uygulandığı durumlarda ki hücrelerinin görünümü (1000X)...134 Şekil 4.35.11 numaralı strainin üç parametrenin bir arada uygulandığı durumda ki hücrelerinin görünümü (1000X)...134
XIX ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1.Maya karakterizasyonunda kullanılan geleneksel kriterler (Deak and Beuchat, 1996)... 15 Çizelge 2.2.Maya identifikasyonu için asimilasyon ve fermentasyon testlerinde kullanılan bileşikler... 17 Çizelge 2.3.D. hansenii tarafından substratların asimilasyonu (Kurtzman and Fell, 1998)... 22 Çizelge 4.1.Mayaların izole edildiği kaynaklar ve izolat numaraları... 79 Çizelge 4.2.Đzolatların tanılanmasında kullanılan testler... 82 Çizelge 4.3.Glukozu fermente edemeyen mayaların tayin anahtarı... 84 Çizelge 4.4.Glukozu fermente edebilen mayaların tayin anahtarı... 85 Çizelge 4.5.Mayaların izole edildiği kaynaklara göre genus ve türlerin dağılımı... 89 Çizelge 4.6.Đzole edilen mayaların sistematik kategorileri (Barnett et al., 2000)... 91 Çizelge 4.7.Đzole edilen mayaların sistematik kategorileri (Alexopoulos et al., 1996)... 92 Çizelge 4.8.Fenotipik olarak tanılanan izolatlara ait literatürde verilen özellikler ile morfolojik ve fizyolojik test sonuçlarının karşılaştırılması... 93
XX
1 1. GĐRĐŞ Maya ve benzeri organizmalar funguslar içerisinde homojen olarak dağılmış çok büyük bir gruptur ve bugüne kadar tanımlanmış yaklaşık 1500 maya türü bulunmaktadır (Verachtert and De Mot, 1990; Barnett et al., 2000; Boekhout et al., 2003; Öztürk, 2007). Mayaların taksonomisi moleküler biyolojik yöntemlerin gelişmesine bağlı olarak sürekli değişmektedir. Bu değişimin başlıca nedeni kromozom analizleri ve moleküler biyolojik yöntemlerin yaygınlaşmaya başlamış olmasıdır. Ayrıca maya ve maya taksonomisine ilginin artması da tür sayısının yükselmesine neden olmuştur (Lieckfeldt et al., 1993; Jakobsen and Narvhus, 1996; Öztürk, 2007). Ekmek, bira ve şarabın bulunuşu ile insan toplumu ile ilişki mayaların tarihi hemen hemen sinonimdir. Bu ürünlerin mikrobiyal bilimi, ilk olarak Antonie van Leewenhoek (Hollanda) tarafından maya hücrelerinin gözlenmesiyle birlikle 1600 lü yılların ortalarında başlamıştır. Bu buluşun önemi, 1850 1900 yılları sırasında Pasteur (Fransa) ve Hansen in (Danimarka) klasik çalışmalarına kadar pek önemsenmemiştir. Bilindiği gibi bu iki araştırmacının yaptığı çalışmalar, mikrobiyoloji ve biyokimya disiplinlerinin başlangıcı sayılmaktadır. 1900 lü yılların başında Guilliermond (Fransa) ve Kluyver (Hollanda) tarafından yapılan müteakip çalışmalar, mayaları besin ve meşrubat üretiminde önemli role sahip olan mikroorganizma gruplarından bir tanesi yapmıştır (Fleet, 2006). 1950 lerden bu yana da, birçok klasik tekste besin ve meşrubatlarda mayaların ticari ve sosyal önemi özellikle
2 üzerinde durulan bir konu olmuştur (Deak and Beuchat, 1996; Boekhout and Robert, 2003; Fleet, 2006). Mayalar ticari amaç için kullanılan önemli mikroorganizma gruplarından bir tanesidir. Bilindiği gibi en iyi fermentatif organizmalardır. En iyi bilenen özellikleri alkol üretimi ve ekmek yapımı olsa da, meşrubatların üretiminde, turşu üretiminde, endüstriyel polisakkaritlerin üretiminde, tek hücre proteini üretiminde, lipidlerin üretiminde ve B12 gibi birçok vitaminin üretiminde oldukça kullanışlı organizmalardır (Phaff et al., 1966; Deak, 1995; Jakobsen and Narvhus, 1996; Hierro et al., 2004; Öztürk, 2007). Ayrıca, birçok endüstriyel enzimin, interferonların ve birçok tıbbi ilaç hammaddelerinin üretiminde de kendilerine yer bulmuşlardır (Jakobsen and Narvhus, 1996; Öztürk, 2007). Bunların yanı sıra, ökaryotik hücreler içinde en iyi tanınan ve laboratuar ortamında manipulasyonu en kolay olan organizmalar olmaları sebebi ile en ideal konakçı olma özelliği göstermektedirler. Ticari açıdan bakıldığında benzer şekilde maya hücreleri bakterilere nazaran daha avantajlı görünmektedir. Maya hücrelerinin ürettikleri proteinleri bulundukları ortama salgılama yeteneklerinin de yüksek olması, ticari açıdan önemli bir avantajdır (Hierro et al., 2004; Öztürk, 2007). Fermentasyon, besinlerin güvenli ve kalitesinin korunmasında birkaç yüzyıldır kullanılan oldukça etkili ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Bu rolünün dışında, fermentasyon, besinsel kalitenin gelişmesinde, aroma ve tat üretiminin zenginleştirilmesinde ve besin substratlarının tekstürünün modifiye edilmesinde oldukça önem arz etmektedir. Bütün bu durumlar mikroorganizmalar tarafından
3 yönetilmektedir. Ham materyalde doğal olarak (spontan fermentasyon) veya sonradan eklenerek (inokule fermentasyon) sağlanmaktadır ve kompleks karbohidratların parçalanması ve proteinlerin kolayca sindirilebilir elementlere dönüştürülmesinde önemlidir. Fermentasyon mikroorganizmaları arasından mayalar, şüphesiz önemli mikroorganizma grubudur. Besinlerin fermentasyon proseslerinde kullanılan mayalar, orijinal materyalleri organoleptik, fiziksel ve besinsel olarak modifiye etmektedir ve bu yüzden yüzyıllardır ekmek yapımında ve alkollü meşrubatların üretiminde kullanılmaktadır (Romano et al., 2006). Fermente etler, orta nem dereceli ürünlerdir ve bu ürünlerde mevcut nem oranının düşürülmesi bozunmaya yol açan mikroorganizmaların inhibisyonu için etkili bir stratejidir. Bu ürünler ham materyalden hazırlanan besinlerdir ve bu ürünlerin üretimi için fermentasyon ve kimyasal tuzlama prosesleri gereklidir. Fermentasyon, sucukların tuzlanma fazının kritik bir safhasıdır çünkü bu safhada esas fiziksel, biyokimyasal ve mikrobiyolojik transformasyonlar gerçekleşmektedir (Beriain et al., 1993; Romano et al., 2006). Bu değişimler ham maddenin karakteristiğinden ve işlem koşullarından etkilenmektedir ve sonuçta tat, renk ve tekstür gibi son ürünün organoleptik özelliğine ilave olarak ürünün güvenliği ve korunabilirliği etkilenmektedir. Fermente etlerin üretiminde baskın mikroorganizmalar laktik asit bakterileri, koagülaz negatif stafilakoklar ve mikrokoklardır ama ayrıca küfler ve mayalarda önemli organizmalardır. Taze etlerde mayalar genellikle düşük sayıdadırlar ama düşük sıcaklıkta depolama sırasında sayıları artışa geçer ve ileri ki zamanlarda baskın mikroflora olarak görülürler (Fleet, 2006).
4 Mayalar, mandıra ürünlerinden peynir üretiminde ve ayrıca kefir gibi fermente sütlerin üretiminde de gerekli mikroorganizmalardır. Mayalar, öncelikle ürünlerde tek starter kültür olarak kullanılmaktadır ama bir çok ürünün üretimi hala spontan fermentasyon ile gerçekleşmektedir. Mayalar birçok durumda ikincil starter kültürdür ve aroma üretiminin zenginleştirilmesi veya diğer mikroorganizmaların büyümesini kolaylaştırmak için kullanılmaktadır (Romano et al., 2006). Mandıra ürünlerinin mikrobiyolojisi genellikle laktik asit bakterileri tarafından domine edilmiş olsa da, bazı önemli literatürler, peynir, kefir ve kımız gibi fermente sütlerin üretiminin olgunlaşma safhası sırasında tat ve doku gelişiminde mayaların önemli role sahip olduklarından bahsetmektedirler (Fleet, 1990; Fleet, 2006). Mandıra ürünlerinin üretiminde dominant olan önemli türler; Debaryomyces hansenii, Yarrowia lipoliytica, Kluyveromyces marxianus ve Saccharomyces cerevisiae dır ama Galactomyces geotrichum, Candida zeylanoides ve çeşitli Pichia türleri de ayrıca önemli mikroorganizmalardır (Jakobsen et al., 2002; Fleet, 2006). D. hansenii peynirlerin bütün çeşitlerinde bulunan genel bir türdür. Mandıra ürünlerinin (Deak and Beuchat, 1996) yanı sıra, peynir salamuralarında, peynir kuarkında, yoğurtta ve meyve preparasyonlarında da (Seiler, 1991; Viljoen and Greyling, 1995) oldukça yaygın olduğu rapor edilmiştir. Mayaların diğer önemli bir özelliği de probiyotik uygulamalarının olmasıdır. Günümüzde, probiyotik organizmalar olarak S. cerevisiae
5 türleri dışında ki maya türlerini de kullanmada önemli bir artış yaşanmaktadır. D. hansenii, K. marxianus, Y. lipolytica ve Issatchenkia oritentalis gibi bazı maya türleri yoğurt ve peynirler ile sıklıkla ilişki içerisindedirler (Psomas et al., 2001; Lourens-Hattingh and Viljoen, 2002; Fleet and Balia, 2006). Ayrıca, yüzey özellikleri ve poliamin üretimi uygun olan balık su kültürlerinde D. hansenii potansiyel probiyotik olarak çalışılmaktadır (Gatesoupe, 1999; Tovar et al., 2002; Fleet and Balia, 2006). Besin endüstrisine oldukça yarar sağlayan mayalar ayrıca ekolojik interaksiyonlarda biyolojik ajan olarak da kullanıma açıktır. Bazı funguslar ve bakteriyal grupların bazı üyeleri diğer mikroorganizmalara karşı antagonistik aktivite gösteren ikincil metabolitleri sentezleme ve salgılama kabiliyetine sahiptir (Viljoen, 2006). Ama, pozitif bulgular 20. yüzyılın başlarında açıklanmasına rağmen mayaların benzer metabolitlerin olası üreticileri olmaları üzerine çok az ilgi gösterilmektedir (Hayduck, 1909; Fernbach, 1909; Viljoen den, 2006). Antimikrobiyal bileşikler için kaynak olarak mayaların olası rolüne rağmen sonuçlar sadece besin için rekabetin doğal etkisine dayandırılmaktadır. Bir çalışma da, bakterilere karşı D. hansenii nin antagonistik aktivitesi araştırılmış ve bu maya türünün intraselüler ve ekstraselüler antimikrobiyal bileşikler ürettiği bulunmuş ve bu bileşiklerin Clostridium tyrobutyricum ve Clostridium butyricum bakterilerini inhibe ettiği saptanmıştır (Fatichenti et al., 1983; Viljoen, 2006).
6 Maalesef ki, bu kadar yararlı faliyetlerinin yanı sıra bazen maya aktivitelerin kara yüzüde bulunmaktadır. Bundan 30-40 yıl öncesine kadar mayalarla ilgili yayınlarda, gıda kaynaklı mayaların halk sağlığı için önemli olmadığı, tüketici için tehlikesinin bulunmadığı, hatta fermente gıdalarda (kefir, kımız ve bira gibi) yüksek miktarlarda bulunmasının iyi olacağı söylenmekteydi (Betts et al., 1999; Loureiro and Querol, 1999; Hierro et al., 2004; Öztürk 2007). Fakat 1980 den sonra yapılan çalışmalarda ilk defa, gıda kaynaklı mayaların halk sağlığı ve güvenliği üzerinde durulmaya başlanmıştır. Besin ve meşrubatlarda bozunmaya yol açan mayalar üzerinde oldukça geniş çaplı literatürler bulunmaktadır ve şüphesiz, bu durum problemin büyük bir ticari ve ekonomik öneme sahip olduğunu göstermektedir (Öztürk, 2007). Genellikle, bakteriler ile mayalar arasında bir rekabet yaşanmadıkça mayalar rahatça büyürler ve ürünün bozunmasına neden olurlar. Tipik olarak, yüksek asitli, düşük ph lı besinler, yüksek tuz (%5 den fazla) veya yüksek şekerli (%10 dan fazla) ürünler ve zayıf asitler (örneğin; sorbik, benzoik, asetik) ile korunan ürünler maya bozunmalarına eğimli ürünlerdir. Meyveler, meyve suları, meyve içecekleri, meyve suyu konsantratları, şekerli ve tatlı şuruplar, şekerlemeler, alkollü meşrubatlar, karbonatlı meşrubatlar, salata sosları ile terbiye edilmiş salatalar, tuz ve asit temelli kompostolar, fermente mandıra ürünleri ve fermente veya tuzlu et ürünleri gibi bazı besinler maya bozunmalarının birincil adaylarıdır (Tudor and Board, 1993; Deak and Beuchat, 1996; Fleet, 2006).
7 Barnett et al. (1983) gıdalarda 30 cinse ait 120 ye yakın maya türünün bulunabildiğini belirtmişlerdir. Pitt and Hocking (1985), gıdalarda bozunmaya sebep olan mayalardan en önemlilerinin; Dekkera bruxellensis, Issatchenkia orientalis, Debaryomyces hansenii, Yarrowia lipolytica, Kloeckera apiculata, Saccharomyces cerevisiae, Pichia membranafaciens, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces bisporus, Zygosaccharomyces rouxii, Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis, Candida tropicalis, Candida zeylanoides ve Candida holmii olduğunu rapor etmişlerdir. Endüstri de mayaların neden olduğu bozunmaların ana kaynağı koruyucu içeren gıdalar, zeytin, peynir, mayonez, süt gibi yağ oranı yüksek gıdalar ile sirke, şarap, bira ve ekmek gibi fermente gıdalardır. Oldukça fazla sayıda maya türünün fermentasyon ve gıda sanayiinde istenmeyen kontaminantlar olduğu bilinmektedir. Bu tür mayalar saprofit özellikte olup gıdaların bozunmasına, üretimin istenmeyen şekilde sonuçlanmasına yol açmaktadır. Mayalar oldukça geniş ph aralığında (ph 2-9), düşük su aktivitesinde, düşük sıcaklıklarda, yüksek tuz ve yüksek şeker oranlarında çok rahatlıkla gelişebilmektedirler (Betts et al., 1999; Öztürk, 2007). Aynı zamanda pektin ve diğer kompleks karbohidratları, organik asitleri, proteinleri ve lipitleri de kullanabilmektedirler. Fermente ve düşük ph lı süt ürünlerinde depolama stabilitesini azaltan ve bozunma etmeni dominant mikroorganizmaların Debaryomyces hansenii, Pichia membranifaciens ve Candida holmii olduğu saptanmıştır (Fleet, 1990; Prillinger et al.,1999; Öztürk, 2007).
8 Gıda endüstrisinde en tehlikeli olan mayalar, asit koruyuculara ve osmatik strese dayanıklı olanlardır. Mayalar ya fermentasyon şartlarının kötü olması ya da üretim sonrası kontaminasyondan dolayı gıdaların bozunmasına yol açarlar. Bu bozunmalar; gıdalarda acı tat ve kötü koku oluşumu, bulanıklık, sediment veya pellet oluşumu, gaz oluşturma özellikleri sayesinde bazı gıdalarda istenmeyen gözenekli yapı oluşumu gibi bir takım değişikliklerdir (Fleet, 1990; Loureiro and Querol, 1999; Öztürk, 2007). Bilindiği üzere besinlerin korunma prosedürlerinde birçok fiziksel parametre ile birlikte tuz faktörü ön plana çıkmaktadır. D. hansenii türü yüksek NaCl konsantrasyonlarına adaptasyon mekanizmalarına sahip olduğundan ve ayrıca diğer fiziksel parametreler olan ph ve sıcaklığa toleransının da yüksek olmasından dolayı, çeşitli gıdalarda bozunmaya neden olmaktadır. Belirtilen nedenlerle, bu çalışmada değişik kaynaklardan D. hansenii strainlerinin izolasyonu, identifikasyonu ve elde edilen strainlerin büyümesi üzerine ph, sıcaklık ve tuz parametrelerinin tek tek ve sinerjitik etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.
9 2. LĐTERATÜR ÖZETĐ 2.1. Maya Taksonomisinin Tarihçesi Fermentasyondan sorumlu olan bu organizmalar, 19. yüzyılın başına kadar yaşayan canlılar olarak fark edilememiştir (Öztürk, 2007). 1836 ve 1838 yılları arasında, Charles Cagniard-Latour, Friedrich Kützing ve Theodor Schwann mayaların yaşayan organizma gruplarından bir tanesi olduğunu göstermişler ve Schwann bu grup organizmaların funguslar içerinde yer aldığını belirtmiştir. 1838 de Julius Meyen, S. cerevisiae, S. pomorum ve S. vini yi içeren Saccharomyces genusunu bulmuştur (Barnett, 2004). 1839 da, Schwann mayaların karakteristik özelliklerini tanılarken bir cümlesinde açık bir biçimde askosporları tarif etmektedir; Hücre içerisinde hali hazırda mevcut bulunan ve ana hücrenin patlaması sonucu serbest kalan yeni hücreler yaratılmaktadır. Bu gözlem 1857 yılında Miles Berkeley tarafından da desteklenmiştir (Barnett, 2004). Emil Christian Hansen 1880 li yılların başında saf maya kültürlerinin elde edilmesini sağlayan teknikler geliştirmiş ve bu sayede maya taksonomisinde pratiklik artmıştır. Aynı araştırıcı 19. yüzyılın sonlarına doğru 200 tür hakkında yayın yapmış ve tanılamasını yaptığı 90 tür halen günümüzde bilinmektedir. 1893 ve 1911 yılları arasında askospor oluşturan birçok yeni maya genusu tanılanmıştır. 1893 de Paul Lindner, tomurcuklanma ile değilde fizyon ile çoğalan
10 Schizosaccharomyces pombe yi tanıladığını rapor etmiştir (Barnett, 2004). 1904 de Hansen, Saccharomycetes lerin sistematiği ile ilgili bir yayın yapmış ve bu yayın mayaların sınıflandırılmasında önemli bir basamak oluşturmuştur (Barnett, 2004). 1928 de Guilliermond, 22 genusu kapsayan ve mayaların identifikasyonu için ayırıcı bir anahtar oluşturmuştur. Araştırıcı identifikasyon için, vejetatif hücrelerin görünümü, askosporların varlığı veya yokluğu, eğer varsa sayısı ve şekli ve ayrıca mayaların bazı şekerleri fermente etme kapasitelerini dikkate almıştır (Barnett, 2004). 1931 de, Stelling-Dekker tarafından ilk sınıflandırma çalışması yapılmış ve yayınlanmıştır (Phaff et al., 1966; Barnett, 2004). 1942 de, Diddens in yardımı ile Lodder doktora tezinde bazı anaskosporogenik mayaların sistematiği üzerine çalışmalar yapmış ve çalışmasında kullandığı mayaların çoğunun şekerleri fermente edememesinden dolayı okzonografik metodu kullanarak mayaların karbon kaynaklarını aerobik olarak asimile etme kapasitelerini de test etmiştir (Barnett, 2004). 1951 de Lynferd Wickerham, mayaların ekoloji ve taksonomisini yetersiz bularak bu kategorilerle ilgili çalışmalar yapmış ve asimilasyon ve/veya fermentasyon için test edilen karbon kaynaklarının sayısını 30 a çıkarmıştır (Barnett, 2004; Öztürk, 2007).
11 1952 de, Lodder ve Kreger-van Rij en gelişmiş maya sınıflandırmasını bir kitap altında toplamışlardır (The Yeasts: Taxonomic Study). Bu sınıflandırmayı yaparken de önceki çalışmalarda kullanılan benzer teknikleri kullanmışlardır ve 180 türü 3 familya altında toplamışlardır; askosporogenik olan Endomycetaceae, asporogenik (fungi imperfecti) olan Cryptococcaceae ve basidiomisetik yada fungi imperfecti olan Sporobolomocetaceae (Barnett, 2004). 1970 de Lodder, The Yeasts: a Taxonomic Study nin ikinci baskısını yayınlamıştır. Bu baskı için 4300 strain çalışılmış ve bu strainler 29 genus ve 349 tür altında sınıflandırılmıştır. Lodder, Wickerham ve belki birkaç araştırıcıdan daha etkilenerek karbon kaynaklarının asimilasyon testlerini 30 ila 40 şekere çıkarmış ve 5 ila 13 arasında da şeker fermentasyonu testi kullanmıştır. Bu kitapta toplanan genuslar, Ascomycetes, Ustilaginales, Sporobolomycetaceae ve diğer anaskosporogenik mayalar şeklinde 4 grup altında sınıflandırılmıştır (Barnett, 2004). 1979 yılında Alexopoulos ve Mims, mayaları askomisetik, basidiomisetik ve deuteromisetik mayalar adı altında üç grupta incelemişlerdir. Askomisetik mayaları, Ascomycetes sınıfı, Hemiascomycetidae alt sınıfı, Endomycetales ordosu ve Saccharomycetaceae familyası altında, basidiomisetik mayaları ise Ustilaginales ordosu ve Ustilaginaceae familyası altında incelemişlerdir (Alexopoulos et al., 1996).
12 1984 yılında Kreger-van Rij, 1998 yılında Kurtzman, Fell ve diğer 36 araştırmacı tarafından The Yeasts: Taxonomic Study kitabının üçüncü ve dördüncü baskısı yapılmış ama birkaç küçük ayrıntı dışında ilk iki baskı temel alınmıştır (Barnett, 2004). Alexopoulos et al. (1996), moleküler biyolojik yöntemlerin gelişmesine bağlı olarak yaptıkları sistemaktikte bazı değişiklikler yapmışlardır. Askomisetik mayalar tekrar Saccharomycetales ordosu ve Saccharomycetaceae familyası altında incelenmekle beraber, bazı genuslar aynı ordo altında farklı familyalara sokulmuştur. Daha önce yapılan sistematikte Saccharomycetales ordosunda yer almayan bazı mayalar bu ordo içerisine alınmıştır. Barnett et al. (2000), Askomisetik mayaları, Archiascomycetes, Saccharomycetes ve Hemiascomycetes sınıfları altında toplarken Basidiomisetik mayaları Hymenomycetes, Urediniomycetes ve Ustilaginomycetes sınıfları altında toplamıştır. Tez kapsamındaki izole edilen türlerin sistematiği de hem Alexopoulos et al. (1996) hem de Barnett et al. (2000) göre yapılmıştır. 2.2. Mayaların Mikrobiyal Ekolojisi Sıcaklık, su aktivitesi, ph, mevcut O 2, besin maddelerinin bulunması, inhibitörlerin varlığı gibi birçok çevresel faktör mayaların büyümesini etkilemektedir. Mayaların optimum büyüme sıcaklığı 24-48 o C arasında olduğundan dolayı büyük çoğunluğu (%98) mezofil olarak dikkate alınmaktadır. Çevresel faktörler mayaların büyüme sıcaklığını etkilemektedir. Solüt konsantrasyonunda bir artış veya su aktivitesinde
13 bir düşüş organizmanın optimum büyüme sıcaklığında 2-6 o C kadar artışa neden olmaktadır (Deak, 2006; Öztürk, 2007). Mikroorganizmanın metabolik aktivitesi için suyun bulunması (Aw) gıdalardaki mikroorganizmaların büyümesini etkileyen en önemli faktörlerden biridir. Su aktivitesi çözelti konsantrasyonuna göre değişmektedir. Tuz ve şeker toleransı ile sükroz ve glukoz toleransı arasında farklılıklar vardır. Mayaların büyük çoğunluğu aynı su aktivitesinde tuza göre şekerin daha yüksek konsantrasyonlarına tolerans gösterebilmektedir. Gıdalarda bozunmaya neden olan mayaların büyük çoğunluğu minumum 0,90-0,95 arasındaki su aktivitesinde büyüyebilmektedirler. Az sayıda osmotolerant maya genuslarına dahil türler oldukça düşük bir su aktivitesinde büyüyebilmektedir. Örneğin, Zygsaccharomyces rouxii, 0,62 gibi düşük su aktivitesine sahip yüksek şekerli gıdalarda büyüyebilen osmotolerant bir mayadır (Deak, 2006; Öztürk, 2007). Gıdaların mikrobiyal ekolojisinde önemli bir diğer faktör ph dır. Mayaların çoğu 3 ila 10 arasındaki ph değerlerini tolere edebilir ve optimum ph aralıkları 4.5 dan 6.5 a kadar değişebilmektedir. ph ya olan tolerans, asitin türüne bağlıdır. Genellikle organik asitler inorganik asitlerden daha inhibitör etkiye sahiptir (Öztürk, 2007). Mayanın canlılığını sürdürebilmesi ve büyüyebilmesi için hücrenin plazma membranına karşı bir proton gradiyenti oluşturarak intraselüler ph yı 6.5 civarında tutması gerekmektedir. Asit tolerant türler düşük ph lı çevrelerde protonları hücre dışına aktif olarak pompalayan aktif
14 transport sistemine sahiptir. Etanol konsantrasyonu membran geçirgenliğini etkiler ve bu nedenle maya hücrelerinin hücre içi ph larını da etkilemektedir (Loureiro and Querol, 1999; Deak, 2006; Öztürk, 2007). 2.3. Konvensiyonel Yöntemlerle Mayaların Tanılanması 50 yılı aşkın süredir mayalar; morfolojik, biyokimyasal, fizyolojik ve üreme karakteristikleri göz önüne alınarak sınıflandırılmaktadır. Bu özelliklerine bağlı olarak mikroskobik, kültürel ve biyokimyasal testler geliştirilmiştir (Loureiro and Querol, 1999; Hierro et al., 2004; Öztürk, 2007). Askomisetik, Basidiomisetik ve imperfect mayaların morfolojik özellikleri, tanılamanın ilk basamağında mikroskobik testlerle belirlenir. Hücre şekli, gerçek ve/veya pseudohif oluşturup oluşturmaması, eşeysiz çoğalmanın tomurcuklanma ile mi yoksa fizyonla mı gerçekleştiği, DBB testi, sporların yapısı, yüzey özellikleri, sayısı ve şekli mikroskobik karakteristikler arasında incelenmektedir (Cosentino et al., 2001; Vaughan-Martini, 2003; Öztürk, 2007). Deak and Beuchat (1996) tarafından mayaların karakterizasyonunda kullanılan geleneksel kriterler Çizelge 2.1 de özetlenmiştir. Sporların varlığı ve yokluğu ile şekilleri, konjugasyon tipi ve tomurcuklanma, boyut ve hücrenin şekli, hif ve/veya pseudohifin oluşumu, besiyerindeki koloni morfolojisi, karbon kaynaklarının fermentasyonu, karbon ve azot kaynakları üzerinde büyüyebilme, vitamin gereksinimlerinin belirlenmesi, çeşitli sıcaklıklar ile yüksek şeker ve tuz
15 konsantrasyonlarında büyüyebilme, üre hidrolizi ve antibiyotiklere dirençlilik, bugün kullanılan tipik identifikasyon prosedürlerindeki en genel testlerdendir (Loureiro and Querol, 1999; Barnett et al., 1983, 2000; Cosentino et al., 2001; Kurtzman and Robnett, 2003; Öztürk, 2007). Çizelge 2.1.Maya karakterizasyonunda kullanılan geleneksel kriterler (Deak and Beuchat, 1996) Morfolojik Testler Fizyolojik Testler Biyokimyasal Testler Eşeyli üreme Konjugasyon tipi Sporangiosporların şekli Basidiosporların oluşumu Eşeysiz üreme Tomurcuklanma Fizyon Arthroconidia Ballistoconidia Mikroskobik büyüme Hücrelerin şekli ve boyu Gerçek hif veya pseudohif Klamidosporlar Mikroskobik büyüme Besiyerindeki koloniler Sıvı kültürler Şekerlerin fermentasyonu Karbon kaynaklarının asimilasyonu Azot kaynaklarının asimilasyonu Vitamin gereksinimleri Nişasta oluşumu Büyüme sıcaklığı Asetik asit üretimi Sikloheksimide dirençlilik DBB reaksiyonu Üreaz reaksiyonu Coenzim Q tipi DNA baz kompozisyonu DNA dizi homolojisi
16 Genel olarak tanılamada çok fazla önemi olmayan kültürel testler içerisindeki en değerli parametreler, kolonilerin ürettiği pigmentler (sarı, kırmızı, pembe, turuncu, kahverengi gibi) ile koloninin tekstürüdür (düz, mukoid, gibi) (Öztürk, 20007). Geleneksel tanılamada kullanılan tekniklerin son grubunu biyokimyasal testler oluşturmaktadır. Mikroskobik karakterizasyonu takiben yapılan bu testler, taksonomistler tarafından mikroskobik gözlemlerle birlikte kullanılmaktadır (Verachtert and De Mot, 1990; Öztürk, 2007). 1990 yılında Kurtzman ve ark., bu grup içerisindeki en önemli testlerin, şekerlerin fermentasyonu ile karbon ve azot kaynaklarının asimilasyonu olduğunu belirtmişlerdir. Bu araştırmacılara göre Çizelge 2.2 de gösterilen bileşiklerden, Glukoz, Galaktoz, Maltoz, Me-α-D-Glukozid, Sellobioz, Melibioz, Sükroz, Melezitoz, Rafinoz ve Ksiloz, hem asimilasyon hem de fermentasyon testlerinde kullanılan karbon kaynaklarıdır (Kurtzman, 1990; Verachtert and De Mot, 1990; Wolf, 1996; Barnett et al., 1983, 2000; Boekhout et al., 2003; Öztürk, 2007).
17 Çizelge 2.2.Maya identifikasyonu için asimilasyon ve fermentasyon testlerinde kullanılan bileşikler Bileşik Grubu Bileşik Adı Heksozlar D-glukoz, D-galaktoz, L-ramnoz, L-sorboz Pentozlar D-ksiloz, D-riboz, L-arabinoz, D-arabinoz Disakkaritler sükroz, maltoz, sellobioz, trehaloz, laktoz, melibioz Trisakkaritler rafinoz, melezitoz Polisakkaritler çözünür nişasta, inulin Glukozidler α-me-d-glukozid, arbutin, salisin Organik asitler süksinat, sitrat, DL-lactat, D-glukonat, D-glukuronat, D-galakturonat, 2-keto-D-glukonat,5-keto-D-glukonat Alkoller eritritol, ribitol(adonitol), D-mannitol, myo-inositol, metanol, etanol, gliserol, propan 1,2diol, butan 2,3 diol, galaktitol(dulcitol), D-glusitol(sorbitol), ksilitol Diğer bileşikler Glukano-δ-lakton, D-glukozamin-HCl, N-asetil D- glukozamin, dekan, hegzadekan 2.4. D. hansenii nin Filogeni, Ekoloji, Fizyoloji ve Moleküler Biyolojisi 2.4.1. Filogeni Bütün Debaryomyces türleri perfect, multilateral tomurcuklanmayla vejetatif olarak çoğalan haploid mayalardır. Genellikle pseudomiselyum oluşturmazlar ama bazen türlere bağlı olarak ilkel veya arasıra iyi gelişmiş pseudomiselyum görünebilmektedir. Hücre
18 ile tomurcuk arasında ki heterogamik konjugasyon genellikle askus formasyonundan önce gelmektedir. Ayrıca izogamik konjugasyonda görülmektedir. Askosporlar, küreye benzer, küresel, ovoidal veya mercek biçimindedir ve düzgün yada siğilli çepere sahiptirler. Genellikle her askusta bir veya iki spor bulunmaktadır ama bazı türlerde bu sayı dört spora kadar çıkmaktadır (Kurtzman and Fell, 1998). Debaryomyces genusun üyeleri fizyolojik olarak fermentasyon kapasitelerinin ya çok az ya da hiç olmaması, nitratı asimile edememeleri ve kemotaksonomik olarak koenzim Q-9 u ifade edememeleri ile karakterize olurlar. %10 NaCl ve %5 glukoz konsantrasyonlarında büyüme yetenekleri ile diğer askomisetik mayalardan ayrılırlar (Kurtzman and Fell, 1998). D. hansenii türü iki varyeteden oluşmaktadır: D. hansenii var. hansenii (anomorf: Candida famata) ve D. hansenii var. fabryi (anamorf: Candida famata). Bu iki varyete, 26 S rrna genlerinde ki sequens farklılıkları, glukoz-6-fosfat dehidrogenaz enzimlerinin elektroforetik hareketliliğinde ki farklılıkları ve maksimum büyüme sıcaklıklarında ki farklılıklar ile birbirinden ayrılırlar (Breuer and Harms, 2006). Corredor et al. (2003) pulse-field gel electrophoresis deki (PFGE) farklılığın da varyeteler arasında ki ayırımda kullanılabileceğini savunmaktadırlar. Bilindiği gibi bu yöntem ile uzunluğa bağlı olarak DNA nın uzun zinciri ayrılabilmektedir. Karyotip analizinde bu aracı kullanarak D. hansenii strainleri genomik organizasyon seviyesinde farklı işaretler vermişlerdir. Bu iki varyetenin gözlenen kromozomal uzunluk polimorfizmi bu iki varyetedeki tekrarlanan sequenslerin yada kromozomal yeniden
19 düzenleme sayılarının farklı olmasından kaynaklanmaktadır. Birçok araştırıcı tarafından yapılan çalışmalar da, D. hansenii var. fabryi, D. hansenii var. hansenii den farklı taksonda değerlendirilmektedir (Nakase and Suzuki, 1985; Prillinger et al., 1999). Karşıt olarak, Petersen and Jespersen (2004) tarafından yapılan PFGE analiz sonucunun bu iki varyeteyi farklı gruplara ayırabileceği savunulmamaktadır ama bu analizin D. hansenii strainlerinin tiplendirilmesinde güçlü bir araç olduğunu kabul etmektedirler. Romano et al. (1996) bu iki grubun, uygun primerler yardımı ile mitokondriyal DNA RFLP ve RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) analizleri kullanılarak ayrılabileceğini bulmuşlardır. 2.4.2. Ekoloji D. hansenii, osmo-, halo- ve kserotolerant bir mayadır. Pichia guilliermondi, Yarrowia lipolytica ve Candida parapsilosis gibi düşük su aktiviteli çeşitli besinlerde kontaminant olarak bilinmektedir. %25 NaCl yada %18 gliserol içeren ortamlarda büyüyebilmektedir (Breuer and Harms, 2006). Ayrıca, van Uden and Fell (1968) ve Wong et al. (1982) tarafından hastalık meydana getirdiği saptanmış, Kurtzman and Fell (1998) tarafından ise enfeksiyonlarla ilişkili olduğu bulunmuştur. D. hansenii bazı toksinleri sentezleme yada tolere edilme kapasitesine sahiptir. Toksin sentezi biyoteknolojik araştırmalar için önemlidir çünkü istenmeyen organizmaların kontrolünde bu toksinler kullanılabilir. Gunge et al. (1993) tarafından D. hansenii nin myocin adı verilen bir toksini salgıladığı rapor edilmiştir ve bu toksin bazı maya
20 türleri üzerinde oldukça etkilidir. Ayrıca bu toksinin aktivitesinin sadece NaCl veya KCl gibi tuzların varlığında göründüğü de saptanmıştır. Toksini kodlayan genin 3 pdhl plazmitinden birinde lokalize olduğunu söyleyen önceki çalışmaların aksine killer fenotipin pdhl plazmitleriyle bir ilişkisi yoktur. pdhl1 plazmiti Kluyveromyces lactis killer toksininin alfa subunitine benzer proteini kodlayan DNA fragmentini taşımaktadır. Rapor edildiği gibi, D. hansenii 37 o C de patojenik mayalara karşı aktivitesi stabil killer toksin üretmektedir. Đnsan vücut sıcaklığında stabil aktiviteye sahip maya killer toksini, medikal uygulamalar için oldukça önemlidir (Breuer and Harms, 2006). Llorente et al. (1997) ve Marqina et al. (2001) tarafından yapılan çalışmalarda killer toksinin letal aktivitesinin NaCl varlığında daha da arttığı gözlenmiştir. Marquina et al. (2001), toksin üretiminin optimum koşullarını da araştırmışlar ve kültür ortamında dimetilsulfoksit gibi katkı maddeleri ve non-iyonik deterjanların varlığının toksin üretimini gözle görülür bir şekilde artırdığını bulmuşlardır. Toksin salgılanmasının büyümeyle ilişkili bir cevap olduğu bulunmuş ve erken stasyonel fazda titre pik yapmıştır. Santos et al. (2002), killer toksinin hücre duvarı bağlanma bölgesi olarak (1-6)-β-D-glukanı identifiye etmişlerdir. Tüm bunların yanı sıra, D. hansenii ayrıca C. zeylanoides ve Trichosporon cutaneum tarafından üretilen killer toksinlere de direnç göstermektedir (Breuer and Harms, 2006). D. hansenii nin diğer ilginç bir özelliği, etkili bir biyosit olan klorin dioksite (ClO 2 ) karşı yüksek tolerans göstermesidir. Bu dirençlilik sayesinde, 0.3 mg/l ClO 2 içeren steril olmayan ortamlarda istenmeyen
21 mikroorganizmaların kontrolü sağlanabilmektedir (Breuer and Harms, 2006). D. hansenii antimikrobiyal ajan olan penconazole oldukça dirençli, benomil ve sikloheksimide ise orta derecede direnç göstermektedir. Đlave olarak, D. hansenii nin 5-fluorocytosine karşı minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) değeri C. albicans ile aynı iken, fluconazole ve amphotericin B nin MIC değeri C. albicans dan daha yüksektir. Dirençliliğin aktif efflux proteinlerinin (AEP) bu ajanları hücre dışına çıkarması ile sağlandığı düşünülmektedir (Breuer and Harms, 2006). 2.4.3. Fizyoloji D. hansenii, birçok dikkate değer özellik göstermektedir. %10 NaCl veya %5 glukozda büyüme yeteneğinin yanı sıra Debaryomyces karbon substratlarının geniş bir kısmını asimile edebilmektedir (Çizelge 2.3). C. albicans, Pichia angusta veya Pichia pastoris gibi diğer biyoteknolojik öneme sahip mayaların aksine D. hansenii gözle görülebilir bir şekilde n-alkanları da kullanabilmektedir ve melibioz, rafinoz, çözünür nişasta ve inositolü asimile edebilmektedir. Diğer biyoteknolojik öneme sahip olan Y. lipolytica, n-parafinleri asimile edebilmektedir ama %10 NaCl veya %5 glukoz içeren ortamlarda üreyemez. D. hansenii ayrıca, kültivasyonda kullanılan birçok substratın yüksek konsantrasyonlarına karşı da toleranslıdır. Oksijenin yokluğunda zayıf üreme göstermektedir ve glukozun varlığında naftalin ve benzo(a)preni birlikle metabolize edebilmektedir (Breuer and Harms, 2006).
22 Çizelge 2.3.D. hansenii tarafından substratların asimilasyonu (Kurtzman and Fell, 1998) Glukoz + N-Asetil-D-Glukozamin v Galaktoz + Metanol L-Sorboz v Etanol +/w Sükroz + Gliserol + Maltoz + Eritritol v Sellobioz + Ribitol + Trehaloz + Galaktitol v Laktoz v D-Mannitol + Melibioz v D-Glusitol +/w Rafinoz + α-metil-d-glukosit + Melezitoz v Salisin +/w Đnulin v D-Glukonat +/w Nişasta v DL-Laktat v D-Ksiloz + Süksinat + L-Arabinoz +/w Sitrat v D-Arabinoz v Đnositol D-Riboz v Hekzadekan v L-Ramnoz v Nitrat D-Glukozamin v Nitrit v 2-keto-D-Glukonat + 5-keto-D-glukonat v Sakkarat +, pozitif; w, zayıf; v, değişken;, negatif Glukoz, galaktoz, sükroz, maltoz, rafinoz ve trehalozun fermentasyonu D. hansenii tarafından zayıftır ve laktoz fermentasyonu gözlenmemektedir. Bu durum, anaerobik büyümenin zayıf olduğunun bir göstergesidir. Nitrat kullanılamazken nitrit asimile edilebilmektedir. D. hansenii nin optimum büyüme sıcaklığının 20-25 o C olduğu bilinmektedir ama 5-10 o C hatta 0 o C de de büyüdüğü rapor edilmiştir (Breuer and Harms, 2006).
23 Sitokrom c oksidazın yanı sıra D. hansenii ikinci bir oksidaza sahiptir ve bu oksidaz, elektron transfer zincirinde terminal oksidaz olarak görev almaktadır. Bu alternatif oksidaz, siyanit ve antimisin A dan etkilenmez, salisilhidroksamik aside ise duyarlıdır. Siyanit resistant solunum yol izinin rolü mayalarda aynıdır ve D. hansenii de de açıklandığı gibi enerji dönüşümüne katkı sağlamaktadır (Breuer and Harms, 2006). Oleageniklik; lipitleri sentezleme, akümüle etme veya depolama anlamına gelmektedir. D. hansenii gibi bazı mikrobiyal türler lipitleri üretme ve akümüle etme kapasitelerine sahiptir. Lipitleri akümüle etme kapasitesi 600 maya türünden 30 kadarında olduğu saptanmıştır. Henüz bunun için resmi bir tanımlama olmasa da mikroorganizmalar kendi ağırlıklarının %20-25 inden daha fazlasını akümüle edebilmektedirler. Bakteriler hariç mayalar, küfler ve ökaryotik algler için lipit akümülasyonunun biyokimyasal tanımında ATP:sitrat liaz (EC 2.3.3.8) enziminin varlığı temel alınmıştır. Bu enzim sitoplazma da sitrattan yağ asidi biyosentezinin anahtar substratı olan asetil-coa yı oluşturur. Oleagenik mikroorganizmalar sitratı malat-sitrat translokaz sistemiyle mitokondriden sitoplazmaya transport ederler ve burada sitrat, ATP-sitrat liaz enzimi tarafından asetil-coa ya parçalanır. Oleagenik olmayan organizmalar bu enzime sahip değildirler ve sitoplazmada asetil-coa üretiminden yoksundurlar. ATP-sitrat liaz enzimi kuşkusuz lipid akümülasyonu için kritik enzimdir ama lipidlerin depolanmasında sadece bir enzim bu metabolizmayı kontrol edemez. Bu olayda önemli olan diğer enzim malat dehidrogenaz (E.C.1.1.1.40) enzimidir ve bu enzimde akümüle olan aşırı lipid miktarını kontrol etmektedir. Bu enzimde
24 D.hansenii de mevcuttur ve başarılı bir şekilde lipid akümülasyonu kontrol edilebilmektedir. Eğer bu konu üzerinde daha çok durulursa, lipidlerin kimyasal üretimlerine karşı alternatif biyoteknolojik üretimler gerçekleştirilmiş olabilecektir (Breuer and Harms, 2006). D. hansenii genellikle non-patojenik olarak bilinmektedir ama klinik izolatlarda çok nadir değildir (Breuer and Harms, 2006) ve D. hansenii tarafından kemik enfeksiyonları olduğu rapor edilmiştir (Wong et al., 1982). Mattsson et al. (1999), D. hansenii taşıyıcısı olarak yabani bir güvercin tanımlamışlardır ve bu maya immun sistemi baskılanmış veya zayıf olan hastalarda subkutonik çıbanlara, osteitislere ve keratitise sebep olmaktadır. Đlave olarak, Yamamoto et al. (2002), 65 yaşında ki bir kadında bu mayanın geçici alerjik alveolitise sebep olduğunu rapor etmişlerdir. 2.4.4. Moleküler Biyoloji D. hansenii üzerine moleküler biyoloji çalışmaları çok azdır. Çoğu straini haploid, çiftleşme çok nadirdir ve diploid faz somatogamik otogami ile askus oluşturmak için geçici bir süredir (Breuer and Harms, 2006). D. hansenii nin genomu Génolevures projesi kapsamında aydınlatılmıştır. Bu projede, S. cerevisiae ve 14 tane maya türü karşılaştırılmıştır. Çalışılan hemiaskomisetler içinde D. hansenii nin halotolerant olması, C. albicans ve diğer patojenik mayalarla ilişkili olması ve çoğunlukla tuzlanmış günlük ürünler gibi besinlerde bulunması nedeniyle tam genom analizinin yapılmasına karar verilmiştir.
25 Génolevures projesi bize multiselüler organizmaların diğer filumları ile kullanışlı karşılaştırmalar yapmamızı sağlamıştır. Örneğin, türe spesifik ve sınıf spesifik genlerin dağılımı, fonksiyonel familyalar içinde ki genlerin dağılımı, ayrım oranı ve kromozom shuffling mekanizmaları hakkında ki bilgilerimizin çoğu bu proje sayesinde aydınlatılmıştır (Breuer and Harms, 2006). D. hansenii strainleri arasında ki kromozom polimorfizmi ve genetik çeşitliliğin PFGE temelli araştırılması üzerine bir çalışmada, Petersen and Jespersen (2004), D. hansenii strainlerinin kromozomal düzenlemelerinin heterogenik olduğunu göstermişlerdir. Kromozom bant sayıları 5 ila 10 arasında varyasyon göstermiş ve çoğunlukla aynı kromozom sayısının 6 olduğu bulunmuştur. 6 kromozoma sahip olan strainlerde toplam genom büyüklüğünde de bir varyasyon görülmüştür (9.4-12.6 Mb). D. hansenii de kodon kullanımı üniversal genetik koddan sapmaktadır. Normalde lösin kodlayan CUG kodonu D. hansenii de serini kodlar ve bu okunma Candida genusunun 10 türünde tanımlandığı gibi özel bir tek kopyalı trna-ser (CAG) tarafından olmaktadır. Lösin kodonunun üniversal olmayan kullanımı, 10 Candida türü ile moleküler filogeni açısından ilişkili olduğunu göstermektedir. Çalışılan bazı Candida türleri telemorf türlerdir ve C. famata nın telemorfu D. hansenii dir (Breuer and Harms, 2006). Génolevures projesi D. hansenii nin bazı nadir özelliklere sahip olduğunu göstermiştir. Đlk olarak çalışılan mayalar içerisinde D. hansenii,
26 birlikte transcribe olan trna gen çiftlerinin potansiyel olarak en geniş sayılarına sahiptir. C. galabrata, K. lactis ve S. cerevisiae tam olarak 42 trna setini kullanırken, D. hansenii 43 adet trna seti kullanmaktadır. D. hansenii de trna tiplerinin toplam sayısı 43 dür ve toplam 205 trna genine sahiptir. Bundan başka, genomunun %79.2 si ve saptanmış 6906 kodlama sequensi ile Génolevures araştırmasında çalışılmış bütün mayalar içerisinden D. hansenii en yüksek kodlama kapasitesine sahiptir. Ayrıca, ortalama %49.2 ile en çok lüzumsuz genoma sahip bir mayadır ve S. cerevisiae da bu oran %40 civarıdır. Gen lüzumsuzluğu, organizmanın bilinen en son atasında da bulunan, korunmuş gen familyalarını temsil eden genlerin varlığı olarak tanımlanmaktadır. (Breuer and Harms, 2006). Đki araştırma grubu D. hansenii de linear plazmitlerin varlığını tespit etmişler ve onları pdhl1 (8.4 kb), pdhl2 (9.2 kb), pdhl3 (15.0 kb), pdh1a ve B olarak tanımlamışlardır. Ayrıca, bu plazmitlerin stabilitelerinin osmotik baskıya göre değiştiğini de saptamışlardır. Hücreler NaCl içermeyen ortamlarda büyütüldüklerinde, plazmitler ortadan kaybolurken, çeşitli konsantrasyonlarda tuz, gliserol veya sorbitol içeren ortamlarda plazmitler stabilitelerini korumaktadırlar (Breuer and Harms, 2006). Fukuda et al. (2004), plazmitlerin tuza bağımlılığını büyüme sıcaklığı ile ilişkilendirmiştir. Osmotik basınç olmaksızın 25 o C de büyüyen hücrelerde ki plazmitlerin stabil olduğu ama 30-35 o C arasında ki sıcaklıkta ve osmalaritenin 0.3 M NaCl den az olduğu durumlarda aşamalı bir şekilde plazmitlerin stabilitelerinin yok olduğu görülmüştür. Bu durum, stabilizasyon prosesinde stres proteinlerinin ve/veya yüksek gliserol seviyelerinin gerekli olduğu